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Déficience en PATCHED1 : une signature de radiosensibilité chez les patients atteints du syndrome de Gorlin ?
S434
CARD 2016
CO32
CO33
Déficience en PATCHED1 : une signature de radiosensibilité chez les patients atteints du syndrome de Gorlin ?
La périlipine 3 est un nouveau partenaire d’ABHD5 et pourrait être impliquée dans le mécanisme de l’ichtyose du syndrome de Dorfman-Chanarin
Adeline Vulin 1,∗ , Sandra Moratille 1 , Jérôme Lamartine 2 , Michèle Martin 1 1 Laboratoire de génomique et radiobiologie de la kératinopoïèse (LGRK), CEA-DRF/Inserm-UMR967, Evry 2 Laboratoire de biologie tissulaire et d’ingénierie thérapeutique (LBTI), CNRS UMR5305, université Lyon I, Lyon, France ∗ Auteur correspondant. Introduction Le syndrome de Gorlin est une maladie autosomale dominante héréditaire caractérisée par un large panel d’anomalies du développement et une prédisposition aux carcinomes basocellulaires (BCC) ainsi qu’à l’apparition de médulloblastomes dans 5 à 10 % des patients. Dans la majorité des cas, la maladie est causée par des mutations hétérozygotes du gène PTCH1 qui est un récepteur transmembranaire de Sonic Hedgehog (SHH) en amont de la voie SHH impliquée dans la régulation du cycle cellulaire, du développement et la cancérogenèse. À ce jour, il n’y a pas de corrélation génotype-phénotype chez les patients et pourtant, leur prédisposition à développer des BCC est variable et leur sensibilité aux agents génotoxiques est toujours débattue. Matériel et méthodes Nous avons caractérisé différentes mutations de fibroblastes PTCH1+/− issus de 7 patients Gorlin par séquenc ¸age et analyses cellulaire et moléculaire. Afin de démontrer le lien direct entre l’expression de PATCHED1 et la radiosensibilité, nous avons utilisé une approche siRNA pour mettre en évidence un effet de dosage de PTCH1 sur la radiosensibilité dans des cellules normales. La radiosensibilité (rayons ␥) a été définie par des essais de survie cellulaire normalisés après des doses d’irradiation en adéquation avec celles pratiquées en clinique. Résultats L’analyse de chaque lignée révèle une déficience très variable en PATCHED1 en corrélation avec le type de mutation. Une perte significative d’expression est nécessaire pour observer des altérations de la voie SHH, une capacité proliférative diminuée et des modifications du cycle cellulaire. Suite à différentes doses d’irradiation, seules les lignées avec une quasi totale absence de PATCHED1 présentent une radiosensibilité significative. Les premiers résultats montrent que le traitement de fibroblastes non mutés avec un siRNA ciblant PTCH1 provoque une diminution significative de l’ARN et de la protéine, et que cette diminution provoque une augmentation de la radiosensibilité. Discussion Nos résultats montrent qu’une forte déficience en protéine PATCHED1 est nécessaire pour conférer une radiosensibilité intrinsèque significative aux cellules de patients Gorlin, accompagnée d’altérations des activités du cycle cellulaire et une sénescence réplicative accélérée. Les résultats obtenus avec des siRNA doivent être reproduits et seront complétés par une approche shRNA et l’utilisation du système CRISPR/Cas9. Si le lien direct entre l’expression de PATCHED1 et la radiosensibilité est confirmé, les patients devraient être pris en charge spécifiquement en fonction de leur type de mutation et de l’expression de la protéine lors des protocoles d’imageries ou de radiothérapie. Mots clés PTCH1 ; Radiosensibilité ; Syndrome de Gorlin Déclaration de liens d’intérêts Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d’intérêts. http://dx.doi.org/10.1016/j.annder.2016.09.084
Benjamin Roussel ∗,1 , A. Levy 2 , C. Prost-Squarcioni 2,3,4 , L. Laroche 4 , P.-O. Schischmanoff 5 , Frédéric Caux 1,4 1 Inserm UMR1125, université Paris 13, Sorbonne-Paris-Cité, France 2 Pathologie, hôpital Avicenne, AP—HP, France 3 Histologie, université Paris 13, Sorbonne-Paris-Cité, France 4 Dermatologie, France 5 Biochimie, hôpital Avicenne, AP—HP, Bobigny, France ∗ Auteur correspondant. Introduction La protéine ABHD5 est un activateur de la lipase ATGL qui hydrolyse les triglycérides. L’altération fonctionnelle d’ABHD5 conduit au niveau cellulaire à une accumulation intracytoplasmique de vacuoles lipidiques et au niveau phénotypique au syndrome de Dorfman-Chanarin (SDC). Le SDC est caractérisé par une érythrodermie ichtyosiforme non bulleuse et est associée à des mutations du gène ABHD5. La protéine ABHD5 interagit avec des protéines du métabolisme des lipides comme les périlipines 1, 2 et 5. Matériel et méthodes Le mécanisme conduisant à l’ichtyose du SDC n’étant pas compris, nous avons cherché de nouveaux partenaires d’ABHD5 qui pourraient expliquer l’anomalie de la différenciation épidermique. Pour cela, une technique de double hybride a été effectué en utilisant comme appât la forme humaine d’ABHD5 et comme banque de proies des ADNc issus d’épiderme reconstitué (Episkin© ). Trois protéines interagissaient avec ABHD5 : les périlipines 1, 2 et 3. L’interaction avec les périlipines 2 et 3 a été confirmée dans une autre banque issue de placenta et deux domaines d’interactions étaient observés pour chaque protéine. Une interaction avec 2 protéines supplémentaires (GORASP2, ATG6) était retrouvée dans la banque placentaire mais absente d’Episkin© . Pour confirmer l’interaction ABHD5-périlipine 3 (PLIN3) in vivo, nous avons réalisé un test de proximité protéique (PLA) sur des cellules HaCaT et de la peau normale. Un signal de PLA était présent dans le cytoplasme des cellules HaCaT et dans les cornéocytes de la couche cornée. Enfin, nous avons vérifié si les mutations d’ABHD5 perturbaient la localisation cellulaire de PLIN3. Des marquages par immunofluorescence de PLIN3 sur la peau de patients atteints de SDC ont été faits. Une absence presque complète de PLIN3 était observée dans l’épiderme des 4 patients testés alors que PLIN3 était localisée normalement dans la peau normale ou d’un patient atteint d’une ichtyose liée à l’X. Résultats Nos résultats suggèrent qu’une perturbation de l’interaction entre ABHD5 et PLIN3 existe dans le SDC. PLIN3 étant impliquée dans le transport vésiculaire par sa liaison à Rab9 et une perturbation du transport des corps lamellaires pouvant provoquer une ichtyose, la perturbation du complexe ABHD5-PLIN3 pourrait être au centre du mécanisme de l’ichtyose du SDC en altérant le transport vésiculaire. Mots clés ABHD5 ; Périlipine 3 ; Syndrome de Dorfman-Chanarin Déclaration de liens d’intérêts Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d’intérêts. http://dx.doi.org/10.1016/j.annder.2016.09.085
CARD 2016
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Déficience en PATCHED1 : une signature de radiosensibilité chez les patients atteints du syndrome de Gorlin ?
La périlipine 3 est un nouveau partenaire d’ABHD5 et pourrait être impliquée dans le mécanisme de l’ichtyose du syndrome de Dorfman-Chanarin
Adeline Vulin 1,∗ , Sandra Moratille 1 , Jérôme Lamartine 2 , Michèle Martin 1 1 Laboratoire de génomique et radiobiologie de la kératinopoïèse (LGRK), CEA-DRF/Inserm-UMR967, Evry 2 Laboratoire de biologie tissulaire et d’ingénierie thérapeutique (LBTI), CNRS UMR5305, université Lyon I, Lyon, France ∗ Auteur correspondant. Introduction Le syndrome de Gorlin est une maladie autosomale dominante héréditaire caractérisée par un large panel d’anomalies du développement et une prédisposition aux carcinomes basocellulaires (BCC) ainsi qu’à l’apparition de médulloblastomes dans 5 à 10 % des patients. Dans la majorité des cas, la maladie est causée par des mutations hétérozygotes du gène PTCH1 qui est un récepteur transmembranaire de Sonic Hedgehog (SHH) en amont de la voie SHH impliquée dans la régulation du cycle cellulaire, du développement et la cancérogenèse. À ce jour, il n’y a pas de corrélation génotype-phénotype chez les patients et pourtant, leur prédisposition à développer des BCC est variable et leur sensibilité aux agents génotoxiques est toujours débattue. Matériel et méthodes Nous avons caractérisé différentes mutations de fibroblastes PTCH1+/− issus de 7 patients Gorlin par séquenc ¸age et analyses cellulaire et moléculaire. Afin de démontrer le lien direct entre l’expression de PATCHED1 et la radiosensibilité, nous avons utilisé une approche siRNA pour mettre en évidence un effet de dosage de PTCH1 sur la radiosensibilité dans des cellules normales. La radiosensibilité (rayons ␥) a été définie par des essais de survie cellulaire normalisés après des doses d’irradiation en adéquation avec celles pratiquées en clinique. Résultats L’analyse de chaque lignée révèle une déficience très variable en PATCHED1 en corrélation avec le type de mutation. Une perte significative d’expression est nécessaire pour observer des altérations de la voie SHH, une capacité proliférative diminuée et des modifications du cycle cellulaire. Suite à différentes doses d’irradiation, seules les lignées avec une quasi totale absence de PATCHED1 présentent une radiosensibilité significative. Les premiers résultats montrent que le traitement de fibroblastes non mutés avec un siRNA ciblant PTCH1 provoque une diminution significative de l’ARN et de la protéine, et que cette diminution provoque une augmentation de la radiosensibilité. Discussion Nos résultats montrent qu’une forte déficience en protéine PATCHED1 est nécessaire pour conférer une radiosensibilité intrinsèque significative aux cellules de patients Gorlin, accompagnée d’altérations des activités du cycle cellulaire et une sénescence réplicative accélérée. Les résultats obtenus avec des siRNA doivent être reproduits et seront complétés par une approche shRNA et l’utilisation du système CRISPR/Cas9. Si le lien direct entre l’expression de PATCHED1 et la radiosensibilité est confirmé, les patients devraient être pris en charge spécifiquement en fonction de leur type de mutation et de l’expression de la protéine lors des protocoles d’imageries ou de radiothérapie. Mots clés PTCH1 ; Radiosensibilité ; Syndrome de Gorlin Déclaration de liens d’intérêts Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d’intérêts. http://dx.doi.org/10.1016/j.annder.2016.09.084
Benjamin Roussel ∗,1 , A. Levy 2 , C. Prost-Squarcioni 2,3,4 , L. Laroche 4 , P.-O. Schischmanoff 5 , Frédéric Caux 1,4 1 Inserm UMR1125, université Paris 13, Sorbonne-Paris-Cité, France 2 Pathologie, hôpital Avicenne, AP—HP, France 3 Histologie, université Paris 13, Sorbonne-Paris-Cité, France 4 Dermatologie, France 5 Biochimie, hôpital Avicenne, AP—HP, Bobigny, France ∗ Auteur correspondant. Introduction La protéine ABHD5 est un activateur de la lipase ATGL qui hydrolyse les triglycérides. L’altération fonctionnelle d’ABHD5 conduit au niveau cellulaire à une accumulation intracytoplasmique de vacuoles lipidiques et au niveau phénotypique au syndrome de Dorfman-Chanarin (SDC). Le SDC est caractérisé par une érythrodermie ichtyosiforme non bulleuse et est associée à des mutations du gène ABHD5. La protéine ABHD5 interagit avec des protéines du métabolisme des lipides comme les périlipines 1, 2 et 5. Matériel et méthodes Le mécanisme conduisant à l’ichtyose du SDC n’étant pas compris, nous avons cherché de nouveaux partenaires d’ABHD5 qui pourraient expliquer l’anomalie de la différenciation épidermique. Pour cela, une technique de double hybride a été effectué en utilisant comme appât la forme humaine d’ABHD5 et comme banque de proies des ADNc issus d’épiderme reconstitué (Episkin© ). Trois protéines interagissaient avec ABHD5 : les périlipines 1, 2 et 3. L’interaction avec les périlipines 2 et 3 a été confirmée dans une autre banque issue de placenta et deux domaines d’interactions étaient observés pour chaque protéine. Une interaction avec 2 protéines supplémentaires (GORASP2, ATG6) était retrouvée dans la banque placentaire mais absente d’Episkin© . Pour confirmer l’interaction ABHD5-périlipine 3 (PLIN3) in vivo, nous avons réalisé un test de proximité protéique (PLA) sur des cellules HaCaT et de la peau normale. Un signal de PLA était présent dans le cytoplasme des cellules HaCaT et dans les cornéocytes de la couche cornée. Enfin, nous avons vérifié si les mutations d’ABHD5 perturbaient la localisation cellulaire de PLIN3. Des marquages par immunofluorescence de PLIN3 sur la peau de patients atteints de SDC ont été faits. Une absence presque complète de PLIN3 était observée dans l’épiderme des 4 patients testés alors que PLIN3 était localisée normalement dans la peau normale ou d’un patient atteint d’une ichtyose liée à l’X. Résultats Nos résultats suggèrent qu’une perturbation de l’interaction entre ABHD5 et PLIN3 existe dans le SDC. PLIN3 étant impliquée dans le transport vésiculaire par sa liaison à Rab9 et une perturbation du transport des corps lamellaires pouvant provoquer une ichtyose, la perturbation du complexe ABHD5-PLIN3 pourrait être au centre du mécanisme de l’ichtyose du SDC en altérant le transport vésiculaire. Mots clés ABHD5 ; Périlipine 3 ; Syndrome de Dorfman-Chanarin Déclaration de liens d’intérêts Les auteurs déclarent ne pas avoir de liens d’intérêts. http://dx.doi.org/10.1016/j.annder.2016.09.085