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Évolution des glycérides et des acides gras durant la croissance et la métamorphose de Tribolium confusum
J. Insect f’hysiol., 1970, Vol. 16,pp. 1845
to 1853.Pergamon Press. Printed in Great Britain
&OLUTION DES GLYCGRIDES ET DES ACIDES GRAS DURANT LA CROISSANCE ET LA METAMORPHOSE DE TRIBOLIUM A. R. BEAUDOIN DCpan:ement
de Biochimie,
FacultC
CONFUSUM” et A. LEMONDE
de MCdecine,
(Received
8 May
Universitk
Lava&
Quebec 10, Canada
1970)
Abstract-Fatty
acid variations of different lipid fractions (total lipids, neutral lipids, phosphatidylcholines, and phosphatidylethanolamines) have been measured during the growth and metamorphosis of Tribolium confusum. Fatty acid composition is not influenced by the diet and is similar to that of other Caleoptera. A relation seems to exist between the degree of saturation of PTC and PTE and the insect metabolic activity. The variations of the glycerides and of the neutral lipids follow the same pattern. INTRODUCTION
LES TRAVAUXde BARLOW(1964), STRONG(1963), FAST (1966) et YOUNG (1967) ont
permis Id’ktablir la composition &n&-ale en acides gras des divers ordres d’insectes. Chez les dip&es, on trouve de fortes teneurs en acide palmitolkique (16C); chez les homoptkes (aphides), ce sont surtout des acides myristique et myristolCique (14C); chez les hy mCnopt&es, on trouve plus souvent des acides gras B courte chaine (12C et moins). A notre connaissance, il n’existe pas de travaux traitant de 1’Cvolution des acides gras dans les diverses classes de lipides durant le dkveloppement postembryonnaire des insectes. Au tours de travaux antkieurs (VILLENEUVE et LEMONDE, 1963; BEAUDOIN et al., 1968), nous avons mesurC les variations des Iipides totaux, des lipides neutres et des divers phospholipides (PL) au tours du dkveloppement (stades larvaire, prkpupe, pupe et d&but du stade adulte) de Tribolium confusum Duval. Nous avons aussi &udiC divers aspects du mktabolisme des PL. Pour compltter ces donnCes, nous avons mesurC les variations des acides gras dans les lipides totaux, les lipides neutres, les phosphatidylcholines (PTC) et les phosphatidylkthanolamines (PTE) d urant la m&me pkriode post-embryonnaire. Nous prCsentons Cgalement les variations des glydrides. MATfiRIELS
ET MBTHODES
Insectes Les insectes utilisCs au tours de ce travail provenaient de cultures conservtes dans un incubateur maintenu g 28 + 1°C et 8 70 f 5% h.r. Les conditions d’Clevage ont &tc d&rites prCcCdemment (CHAUDHARY et LEMONDE, 1962). * Ce travail a CtC exkutt Ottawa, Canada.
avec l’aide financi&re
1845
du Conseil
des Recherches
MCdicales,
A. R. BEAUDOINet A. LEMONDE
1846
Extraction et stfparation des diverses classes de lipides Nous extrayons et nous purifions les lipides totaux selon la methode de FOLCH et al. (1957) et nous separons ensuite les diverses classes de lipides par chromatographie en couches minces selon les techniques d&rites precedemment (BEAUDOIN et LEMONDE, 1970). Dosage des acides gras Lorsque le developpement des plaques est complete, (1) TransestkiJcation. nous localisons les diverses taches de lipides en vaporisant les chromatogrammes avec une solution de 2,7-dichlorofluoresceine a O,l% dans le methanol. Nous exposons les plaques encore humides aux rayons U.V. et nous grattons les diverses bandes qui nous interessent. Nous effectuons la transesterification par la methode de BOWYER et al. (1962). Nous ajoutons a la poudre de silica gel 10 ml d’ime solution d’acide sulfurique a 10% dans le methanol anhydre. La transesterification se fait sous reflux a 90°C durant 1,5 h. Pour eviter l’oxydation, nous ajoutons quelques cristaux d’hydroquinone. Au bout de cette periode, nous diluons le milieu avec de l’eau distill&e et nous extrayons les esters methyl& par trois lavages successifs a l’ether de p&role (10 ml). Apres evaporation sous un courant d’azote, les esters methyl& sont conserves au congelateur dans des ampoules scellees jusqu’au moment de l’analyse. (2) Chromatographie en phase gaxeuse. Nous avons effect& les analyses sur un chromatographe de marque Victoreen de la serie 4000. Cet appareil est CquipC d’un detecteur a ionisation de flamme et d’un enregistreur de marque Westronics (LD 11 B). Les colonnes de verre (6 ft x $ in.) sont remplies d’ilnakrom ABS recouvert d’un polyester de diethylene glycol succinate (DEGS). Les conditions d’operation sont les suivantes : Temperature
:
Pression des manometres : Rotometres : Solvant d’injection : Attenuation approximative:
four, 160°C; port d’injection, 235°C; detecteur, 250°C air, 60 psi (livres par pouce car&) ; helium, 60 psi ; hydrogene, 20 psi air, ouvert ; helium, 2,0 ; hydrogene, 1,6 chloroforme (volume d’environ 3 ~1) lo2 x (4 a 32)
Avant de proceder a l’analyse des Cchantillons, nous avons d’abord etudie les capacites de resolution de la colonne et la reponse du detecteur a l’aide des standards fournis par N.I.H., U.S.A. Nous avons constate que la reponse du detecteur est lineaire jusqu’a des concentrations de l’ordre de 50 pg et que la colonne s&pare efficacement les acides gras insatures. Nous avons ensuite pro&de a I’identification et a l’analyse des Cchantillons. Nous avons estime la proportion relative des constituants en mesurant la surface des pits par des methodes de triangulation.
J!VOLUTI~N DES
GLYCBRIDE~
ET DES ACIDES
GRAS
DANS
TRIBOLIUM
C~NFUSUM
1847
Dosage du glyct+ol des glyckides Apr,b chromatographie en couches minces, nous Cluons les taches selon la methode de SKIPSKI et al. (1967). Les triglycerides sont CluCs par trois lavages avec de: l’ether biethylique. Les mono- et les diglycerides sont Clues avec un melange de chloroforme-methanol (4 : 1). Nous avons saponifie les glycerides et dose le glycerol selon la technique colorimetrique de VAN HANDEL et ZILVERSMITH (1957). Rl?SULTATS
Avant de decrire les r&hats de nos analyses, nous presentons les proportions relatives des acides gras presents dans la farine de ble entier addition&e de levure (regime basal utilise dans les cultures de T. confusum). Nous avons calculC ces valeurs a partir des donnees de ALTMANN et DITTMER (1968). Acide PalmitolCique Palmitique Stearique OlCique LinolCique LinolCnique
% 1,4 19,s 192 12,2 60,4 4,9
On remarque une forte proportion des acides gras g 18 atomes de carbone (18C) (environ 80 pour cent). La teneur de l’acide linoleique est particulierement &levee. Enfin, l’acide palmitique, le principal acide gras sature, constitue 20 pour cent des acides gras totaux. Des essais preliminaires nous ont permis de detecter la presence d’acide gras a courte chaine (6C, SC et 1OC) dans les lipides de T. confusum. Cependant, leurs teneurs &ant negligeables par rapport aux teneurs des acides gras a longue chaine, nous les avons ignores au tours de cette etude. Acides pas des lipides totaux On trouve surtout des acides palmitique, oleique, sttarique et linoleique dans palmitoleique les lipides totaux de T. confumnz. Les acides laurique, myristique, et linolinique y sont en plus faible concentration. Dans les PL il y a aussi de faibles quantitb d’acide hexadecadienoique. Le Tableau 1 decrit les variations des acides gras des lipides totaux au tours 11 y a relativement peu de variations durant la periode larvaire du developpement. etudiee. Chez les prepupes de 14 a 15 jours on note cependant une forte diminution de l’acide palmitique (4 pour cent). Cette diminution se fait au profit des acides oleique et linoleique. Notons que cet age correspond a la periode ou l’insecte commence a utiliser ses reserves lipidiques. Par la suite, aucun changement important ne se produit avant l’bge adulte. Chez l’a.dulte de 4 a 5 jours, on observe une forte baisse des acides insatures et
A. R. BEALJDOINet A. LEMONDE
1848
une hausse des acides palmitique, stearique et myristique. acides gras satures atteint a ce moment presque 50 pour cent. tion de quantites mesurables d’acide linolenique. TABLEAUI-ACIDES
La proportion des 11 y a aussi appari-
GRAS DES LIPIDES TOTAUX*
Distribution (%) Age (jours)
Stade
10-11 11-12 12-13 13-14 14-15 15-16 16-17 17-18 18-19 19-20 20-21 21-22 25-26:
L L L PP PP PP-P P P P P P P-A A
12:ot
14:o
16:0
16:l
18:0
18:l
18:2
18:3
T T T 1,l T T T T T T T T T
T T T T T T T T T T T T 1,O
35,4 35,6 35,6 34,7 30,l 31,4 31,O 31,4 32,0 30,7 31,0 31,6 38,0
T T T 1,l T T T T T 1,2 T T T
6,2 6,l $2 5,2 $4 $2 5,2 5,2 4,7 $7 $1 4,7 8,2
36,4 35,6 41,s 40,s 45,2 44,0 43,8 42,7 43,8 43,l 43,s 43,7 35,4
20,8 19,l 16,7 16,s 17,8 18,7 18,s 19,l 17,8 18,4 18,7 18,4 14,0
T 1,8
* Symboles: L-larve, P-pupe et adulte pharate, PP-prepupe (pupe pharate), A-adulte, T-traces (concentrations inferieures a 1%). t Le premier chiffre indique le nombre d’atomes de carbone et le deuxieme chiffre le nombre de doubles liaisons. : 4-5 jours apres l’emergence.
Acides gras des lipides neutres Les variations que nous observons dans les lipides neutres sont sensiblement les m&mes que dans les lipides totaux. Le Tableau 2 rapporte ces variations. Les acides gras de la sCrie des 18C constituent plus de 60 pour cent des acides gras de cette fraction. Nous observons une 1Cgere diminution de l’acide palmitique tout au long de la metamorphose. Au milieu du stade pupe la teneur de I’acide linoleique baisse brusquement de 25 pour cent. Cette perte est compensee par un gain du m&me ordre au tours de la journee suivante. Chez l’adulte de 4 a 5 jours, la proportion des acides gras satures est beaucoup plus ClevCe. Dans cette fraction, on ne trouve pas d’acide linoleique. Acides gras des phosphatidylcholines Le Tableau 3 expose les resultats que nous avons obtenu avec la fraction des PTC. Les proportions des acides linoleique et stearique sont plus ClevCes dans les PTC que dans les lipides neutres et les proportions des acides oleique et palmitique sont plus faibles. La proportion des acides a Cl8 se maintient constante (environ 80 pour cent). Comme dans la fraction des lipides neutres, on observe au milieu du stade pupe une chute importante de la teneur en acide linoleique
I~LUTION
DES CLYCI?RIDESET DES ACIDES GRAS
DANS
TRIBOLIUM
CONFUSUM
1849
(2.5 pour cent), Cette baisse est compenste au tours de la journke suivante. C’est chez les insectes de 17 A 18 jours que l’on trouve la plus forte teneur en acides gras saturCs (35,5 pour cent) dans les PTC et la plus faible teneur se trouve chez TABLEAU 2-&IDES
GRAS DES LIPIDES NEUTRES*
Distribution Age (jours)
Stade
IO-II II-12 12-13 13-14 14-15 15-16 16-17 17-18 18-19 19-20 20-21 21-22 25-26
L L L PP PP PP-P P P P P P A-P A
12:o T T T T T T T T T T T T T
14:o
16:O
16:l
l&O
l&l
18:2
T 1s T T T T T T T T T T T
37,0 38,6 37,0 36,0 34,4 34,1 33,4 35,4 34,3 32,0 32,8 32,7 37,3
T T T T T T T I,1 I,0 I,4 I,0 T 1,2
5,4 593 4,3 4,3 493 493 4,8 4,8 3,7 4,9
40,s 39,6 44,2 45,4 45,s 45,3 44,6 47,7 45,1 44,2 44,s 45,1 44,8
14,8 14,4 14,o 14,l 14,2 14,4 15.5 IO,3 14,l 16,2 17,o IS,7 9,8
* Les symboles sont expliques dans le Tableau TABLEAU 3-ACIDES
Stade
IO-1 1 II-12 12-13 13-14 14-15 IS-16 16-17 17-18 18-19 19-20 20-21 21-22 25-26
L L L PP PP PP-P P P P P P A-P A
12:O T T T T T I,0 T T T T T T T
4,l 4,4 5,6
1.
GRAS DES PHOSPHATIDYLCHOLINES*
Distribution Age (jours)
(%)
14:0 T T T T T T T T T T T T T
(%)
16:O
16:l
16:2
18:O
18:l
18:2
18:3
17,O 19,9 18,l 18,4 16,2 18,O 19,6 22,s 14,3 IS,5 17,6 17,s 13,s
T 1,3 T T I,3 I,0 T T I,0 1,1 T T I,5
T I,1 T T T T T I,0 T T T T I,7
7,8 5,7 8,s 8,2 8,7 8,s 8,8 13,0 II,7 8,0 7,9 8,1 8,O
14,9 18,l 18,l 15,2 18,l 21,2 22,5 26,2 20,4 21,2 20,8 22,s IS,0
60,O 53,1 54,7 57,3 55,0 50,4 48,0 36,0 51,7 53,5 51,8 50,l 52,4
T 6,8
* Les symboles sont expliques dans le Tableau
1.
A. R. BEAUDOINet A. LEMONDE
1850
les adultes de 4 a 5 jours (21,s pour cent). La teneur de l’acide palmitique diminue fortement au cows des premiers jours de la vie adulte (environ 23 pour cent). La quantite d’acide linolenique qui apparait dans les lipides totaux a l’age adulte provient en grande par-tie des PTC. En effet, chez l’adulte de 4 a 5 jours, la proportion de cet acide atteint presque 7 pour cent. Acides gras des phosphatidyl&hanolamines Les acides gras que nous avons mesures dans les PTE (Tableau 4) sont les m&mes que ceux de la fraction des PTC. On trouve a peu p&s la mCme teneur en acide palmitique dans ces deux groupes de PL. La teneur en acide stearique TABLEAU 4-ACIDES
GRAS DES PHOSPHATIDYL~THANOLAMINES*
Distribution (%) Age (jours)
Stade
10-l 1 11-12 12-13 13-14 14-15 15-16 16-17 17-18 18-19 19-20 20-21 21-22 25-26
L L L PP PP PP-P P P P P P P-A A
14:o
16:0
16:l
16:2
18:0
18:l
18:2
18:3
T T T T T T T T T T T T T
15,s 18,2 19,s 20,8 22,3 24,6 20,O 15,6 21,O 17,3 22,7 22,7 17,4
T T T T T T T T T T T T T
T T T T T T T 1,3 T T T T 1,O
15,l 13,7 13,9 13,9 13,7 13,6 13,8 13,4 13,0 13,0 11,7 8,3 10,3
15,s 15,6 19,3 16,2 22,3 25,l 23,3 20,8 22,l 26,2 30,2 34,2 25,6
53,3 51,l 46,6 48,7 39,s 35,6 41,9 48,s 43,2 42,7 34,s 33,7 44,6
T T
* Les symboles sont expliques dans le Tableau 1. tous les stades des traces d’acide heptadCcano?que.
Nous avons retrouve ZJ
&ant plus ClevCe que dans les PTC, on a done un degre de saturation plus ClevC dans les PTE. Au dix-septieme jour, les variations des teneurs se font a l’inverse des variations observees dans les autres fractions. Ainsi, l’acide palmitique diminue d’environ 2.5 pour cent et l’acide linoleique augmente d’environ 15 pour cent. Au tours des premiers jours du stade adulte, il y a diminution des acides oleique et palmitique au profit de l’acide linoleique. On observe de tres faibles quantites d’acide linolenique chez l’adulte de 4 a 5 jours. Variations des glycbides Les variations du glycerol des triglycerides et des mono- et diglycerides sont d&rites dans le Tableau 5. On observe une augmentation des triglycerides jusqu’au milieu du stade prepupe puis une baisse reguliere jusqu’a l’age adulte. La chute des triglycerides est particulierement accent&e au moment de l’tmergence adulte
BVOLUTION
DES
(18,5 pour cent).
GLYCBRIDES
ET
DES
ACIDSSGRASDANS TRIBOLIUM
Les teneurs des mono-
et diglycerides
1851
CONFUSUM
sont relativement
faibles
par rapport a celles des triglycerides. TABLEAU 5--VARIATIONS DU GLYCdROLDESGLYCRRIDES AU COURSDE LA CROISSANCE ET DE LA ik~AM0RRn0ss DE T. confusum* mg de glyc&ol/lOO g d’insectes (poids frais) Age (jours)
Stade
IO-11 11-12 12-13 13-14 14-15 15-16 16-17 17-18 18-19 19-20 20-21 21-22 25-26
L L L-PP PP PP PP-P P P P P P P-A A
Triglyckrides
Mono- et diglyckrides
937 1517 1651 1696 1634 1537 1483 1446 1398 1327 1300 1060 891
-
29 47 43 40 37 37 42 41 33 32 36 42 37
* Les symboles sont expliquks dans le Tableau I. DISCUSSION Les travaux de FAST (1966), de BARLOW (1964) et de YOUNG (1967) ont montre que les acides palmitique, Chez
oleique et linoleique
predominent
chez les coleopteres.
T. confusum, ces trois acides constituent plus de 90 pour cent des acides gras
totaux.
Nos
KENNINGTON
mesures
concordent
et CANNELL
(1967)
assez bien avec les valeurs
mention&es
et VILLENEUVE et LEMONDE (1963)
par ont
CtudiC cet insecte au stade pupe.
La proportion
lierement
C’est la plus forte teneur qui ait CtC mentionnee
&levee au stade adulte.
de l’acide palmitique
qui
est particu-
pour III-I coleoptere. La composition
en acides gras de cet insecte n’est pas influencee
directement
par les acides gras presents dans son alimentation. Au stade adulte, lorsque l’insecte recommence a se nourrir, la disparite entre la composition de l’insecte et la composition de sa ration tend a s’accentuer. On sait d’autre part qu’aucun acide gras n’est ‘essentiel’ au developpement de cet insecte (LEMONDE et BERNARD, 1951). La (distribution
des acides gras dans les PL
ressemble
a la distribution
que
l’on trouve chez les mammiferes. En effet, les PTE sont constituees dune plus forte proportion d’acide stearique que les PTC et les PTC en ont plus que les lipides neutres. Par contre, les lipides neutres ont une proportion plus Clevte des acides oleique et palmitique que les PL. Nous trouvons les mCmes acides gras
1852
A.
R.
BEAUDOINet A. LEMONDE
dans les PL de T. confusum et Tenebrio molitor (larve) (FAST, 1966). A I’instar de FAST (1966), now avons detect& de I’acide heptadecanoique exclusivement dans les PTE. 11 n’existe qu’une etude des variations des acides gras dans les diverses classes de lipides au tours du developpement. KINSELLA (1966) a suggCrC que durant l’embryogenbe de Periplaneta americana les triglycerides participent de facon importante a la biosynthbe des PL. 11 attribue l’augmentation des acides gras a longue chaine a l’elaboration des tissus nerveux. Nous n’avons pas observe cette derniere particularite chez T. confusum. Au moment de l’emergence, il a aussi observe une chute de 50 pour cent de l’acide linolenique. 11attribue cette diminution a l’elaboration d’une hormone qui permet la separation de la cuticule et des ailes de leurs enveloppes. La liquidite des membranes cellulaires serait reliee a la temperature de transition de ses composants. Ainsi, les membranes cornpokes de PL contenant peu de doubles liaisons montrent moins de liquidite que les membranes contenant des PL fortement insatures. Ce contrble de la liquidite des membranes serait en relation avec les proprietes physiques des molecules qui diffusent (CHAPMAN, 1969). Nos resultats indiquent que le maximum d’insaturation dans les PTC et les PTE se retrouve au stade larvaire (larves de 10 a 11 jours) et au stade adulte (4 a 5 jours). C’est justement a ces deux ages que l’activite metabolique est plus intense. En effet, en plus du metabolisme basal, chez la larve il y a croissance et activite locomotrice. Chez l’adulte, il y a activite locomotrice et maturation sexuelle. Ces resultats indiqueraient done que l’augmentation de l’insaturation des PTC et des PTE correspond a une augmentation des &changes au niveau cellulaire et a une augmentation du metabolisme en general. C’est d’ailleurs a ces deux stades que le consommation de l’oxygene est la plus &levee (MOORJANI, 1969). Les variations du glycerol des triglycerides concordent avec celles des lipides neutres (BEAUDOIN et al., 1968). 11 est difficile d’interpreter les fluctuations du glycerol des mono- et des diglycerides. On sait que ces lipides sont soumis a un turnover continuel. 11s constituent, semble-t-il, la forme de transport des graisses dans l’hemolymphe (GILBERT, 1967). R&sum&-Now avons mesure les variations des acides gras dans diverses classes de lipides (lipides totaux, lipides neutres, phosphatidylcholines et phosphatidylethanolamines) et celles des glycerides au tours de la croissance et de la metamorphose de T. confusum. 1. La distribution des divers acides gras de T. confusum ressemble a celle que l’on trouve chez d’autres coleopteres. Cependant cet insecte se distingue par la teneur t&s ClevCe de l’acide palmitique. 2. La ration alimentaire n’influence pas directement la composition des acides gras de cet insecte. 3. 11 semble exister une relation entre le degre d’insaturation des PTE et des PTC et l’activite metabolique de l’insecte. 4. Les variations des triglycerides sont les m&mes que celles des lipides neutres. Remerciewzents-Nous
d&irons
LAURENT(Ctudiants du Departement cipe aux dosages
des glycerides.
remercier Messieurs GILLES GOULETet de Biologie de la Faculte des Sciences)
LIONEL SAINTqui ont parti-
Bv~LuTI~N DES GLYCfiRIDES ET DES ACIDESGRAS~.41is TRIBOLI~M
CONFUSUM
1853
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to 1853.Pergamon Press. Printed in Great Britain
&OLUTION DES GLYCGRIDES ET DES ACIDES GRAS DURANT LA CROISSANCE ET LA METAMORPHOSE DE TRIBOLIUM A. R. BEAUDOIN DCpan:ement
de Biochimie,
FacultC
CONFUSUM” et A. LEMONDE
de MCdecine,
(Received
8 May
Universitk
Lava&
Quebec 10, Canada
1970)
Abstract-Fatty
acid variations of different lipid fractions (total lipids, neutral lipids, phosphatidylcholines, and phosphatidylethanolamines) have been measured during the growth and metamorphosis of Tribolium confusum. Fatty acid composition is not influenced by the diet and is similar to that of other Caleoptera. A relation seems to exist between the degree of saturation of PTC and PTE and the insect metabolic activity. The variations of the glycerides and of the neutral lipids follow the same pattern. INTRODUCTION
LES TRAVAUXde BARLOW(1964), STRONG(1963), FAST (1966) et YOUNG (1967) ont
permis Id’ktablir la composition &n&-ale en acides gras des divers ordres d’insectes. Chez les dip&es, on trouve de fortes teneurs en acide palmitolkique (16C); chez les homoptkes (aphides), ce sont surtout des acides myristique et myristolCique (14C); chez les hy mCnopt&es, on trouve plus souvent des acides gras B courte chaine (12C et moins). A notre connaissance, il n’existe pas de travaux traitant de 1’Cvolution des acides gras dans les diverses classes de lipides durant le dkveloppement postembryonnaire des insectes. Au tours de travaux antkieurs (VILLENEUVE et LEMONDE, 1963; BEAUDOIN et al., 1968), nous avons mesurC les variations des Iipides totaux, des lipides neutres et des divers phospholipides (PL) au tours du dkveloppement (stades larvaire, prkpupe, pupe et d&but du stade adulte) de Tribolium confusum Duval. Nous avons aussi &udiC divers aspects du mktabolisme des PL. Pour compltter ces donnCes, nous avons mesurC les variations des acides gras dans les lipides totaux, les lipides neutres, les phosphatidylcholines (PTC) et les phosphatidylkthanolamines (PTE) d urant la m&me pkriode post-embryonnaire. Nous prCsentons Cgalement les variations des glydrides. MATfiRIELS
ET MBTHODES
Insectes Les insectes utilisCs au tours de ce travail provenaient de cultures conservtes dans un incubateur maintenu g 28 + 1°C et 8 70 f 5% h.r. Les conditions d’Clevage ont &tc d&rites prCcCdemment (CHAUDHARY et LEMONDE, 1962). * Ce travail a CtC exkutt Ottawa, Canada.
avec l’aide financi&re
1845
du Conseil
des Recherches
MCdicales,
A. R. BEAUDOINet A. LEMONDE
1846
Extraction et stfparation des diverses classes de lipides Nous extrayons et nous purifions les lipides totaux selon la methode de FOLCH et al. (1957) et nous separons ensuite les diverses classes de lipides par chromatographie en couches minces selon les techniques d&rites precedemment (BEAUDOIN et LEMONDE, 1970). Dosage des acides gras Lorsque le developpement des plaques est complete, (1) TransestkiJcation. nous localisons les diverses taches de lipides en vaporisant les chromatogrammes avec une solution de 2,7-dichlorofluoresceine a O,l% dans le methanol. Nous exposons les plaques encore humides aux rayons U.V. et nous grattons les diverses bandes qui nous interessent. Nous effectuons la transesterification par la methode de BOWYER et al. (1962). Nous ajoutons a la poudre de silica gel 10 ml d’ime solution d’acide sulfurique a 10% dans le methanol anhydre. La transesterification se fait sous reflux a 90°C durant 1,5 h. Pour eviter l’oxydation, nous ajoutons quelques cristaux d’hydroquinone. Au bout de cette periode, nous diluons le milieu avec de l’eau distill&e et nous extrayons les esters methyl& par trois lavages successifs a l’ether de p&role (10 ml). Apres evaporation sous un courant d’azote, les esters methyl& sont conserves au congelateur dans des ampoules scellees jusqu’au moment de l’analyse. (2) Chromatographie en phase gaxeuse. Nous avons effect& les analyses sur un chromatographe de marque Victoreen de la serie 4000. Cet appareil est CquipC d’un detecteur a ionisation de flamme et d’un enregistreur de marque Westronics (LD 11 B). Les colonnes de verre (6 ft x $ in.) sont remplies d’ilnakrom ABS recouvert d’un polyester de diethylene glycol succinate (DEGS). Les conditions d’operation sont les suivantes : Temperature
:
Pression des manometres : Rotometres : Solvant d’injection : Attenuation approximative:
four, 160°C; port d’injection, 235°C; detecteur, 250°C air, 60 psi (livres par pouce car&) ; helium, 60 psi ; hydrogene, 20 psi air, ouvert ; helium, 2,0 ; hydrogene, 1,6 chloroforme (volume d’environ 3 ~1) lo2 x (4 a 32)
Avant de proceder a l’analyse des Cchantillons, nous avons d’abord etudie les capacites de resolution de la colonne et la reponse du detecteur a l’aide des standards fournis par N.I.H., U.S.A. Nous avons constate que la reponse du detecteur est lineaire jusqu’a des concentrations de l’ordre de 50 pg et que la colonne s&pare efficacement les acides gras insatures. Nous avons ensuite pro&de a I’identification et a l’analyse des Cchantillons. Nous avons estime la proportion relative des constituants en mesurant la surface des pits par des methodes de triangulation.
J!VOLUTI~N DES
GLYCBRIDE~
ET DES ACIDES
GRAS
DANS
TRIBOLIUM
C~NFUSUM
1847
Dosage du glyct+ol des glyckides Apr,b chromatographie en couches minces, nous Cluons les taches selon la methode de SKIPSKI et al. (1967). Les triglycerides sont CluCs par trois lavages avec de: l’ether biethylique. Les mono- et les diglycerides sont Clues avec un melange de chloroforme-methanol (4 : 1). Nous avons saponifie les glycerides et dose le glycerol selon la technique colorimetrique de VAN HANDEL et ZILVERSMITH (1957). Rl?SULTATS
Avant de decrire les r&hats de nos analyses, nous presentons les proportions relatives des acides gras presents dans la farine de ble entier addition&e de levure (regime basal utilise dans les cultures de T. confusum). Nous avons calculC ces valeurs a partir des donnees de ALTMANN et DITTMER (1968). Acide PalmitolCique Palmitique Stearique OlCique LinolCique LinolCnique
% 1,4 19,s 192 12,2 60,4 4,9
On remarque une forte proportion des acides gras g 18 atomes de carbone (18C) (environ 80 pour cent). La teneur de l’acide linoleique est particulierement &levee. Enfin, l’acide palmitique, le principal acide gras sature, constitue 20 pour cent des acides gras totaux. Des essais preliminaires nous ont permis de detecter la presence d’acide gras a courte chaine (6C, SC et 1OC) dans les lipides de T. confusum. Cependant, leurs teneurs &ant negligeables par rapport aux teneurs des acides gras a longue chaine, nous les avons ignores au tours de cette etude. Acides pas des lipides totaux On trouve surtout des acides palmitique, oleique, sttarique et linoleique dans palmitoleique les lipides totaux de T. confumnz. Les acides laurique, myristique, et linolinique y sont en plus faible concentration. Dans les PL il y a aussi de faibles quantitb d’acide hexadecadienoique. Le Tableau 1 decrit les variations des acides gras des lipides totaux au tours 11 y a relativement peu de variations durant la periode larvaire du developpement. etudiee. Chez les prepupes de 14 a 15 jours on note cependant une forte diminution de l’acide palmitique (4 pour cent). Cette diminution se fait au profit des acides oleique et linoleique. Notons que cet age correspond a la periode ou l’insecte commence a utiliser ses reserves lipidiques. Par la suite, aucun changement important ne se produit avant l’bge adulte. Chez l’a.dulte de 4 a 5 jours, on observe une forte baisse des acides insatures et
A. R. BEALJDOINet A. LEMONDE
1848
une hausse des acides palmitique, stearique et myristique. acides gras satures atteint a ce moment presque 50 pour cent. tion de quantites mesurables d’acide linolenique. TABLEAUI-ACIDES
La proportion des 11 y a aussi appari-
GRAS DES LIPIDES TOTAUX*
Distribution (%) Age (jours)
Stade
10-11 11-12 12-13 13-14 14-15 15-16 16-17 17-18 18-19 19-20 20-21 21-22 25-26:
L L L PP PP PP-P P P P P P P-A A
12:ot
14:o
16:0
16:l
18:0
18:l
18:2
18:3
T T T 1,l T T T T T T T T T
T T T T T T T T T T T T 1,O
35,4 35,6 35,6 34,7 30,l 31,4 31,O 31,4 32,0 30,7 31,0 31,6 38,0
T T T 1,l T T T T T 1,2 T T T
6,2 6,l $2 5,2 $4 $2 5,2 5,2 4,7 $7 $1 4,7 8,2
36,4 35,6 41,s 40,s 45,2 44,0 43,8 42,7 43,8 43,l 43,s 43,7 35,4
20,8 19,l 16,7 16,s 17,8 18,7 18,s 19,l 17,8 18,4 18,7 18,4 14,0
T 1,8
* Symboles: L-larve, P-pupe et adulte pharate, PP-prepupe (pupe pharate), A-adulte, T-traces (concentrations inferieures a 1%). t Le premier chiffre indique le nombre d’atomes de carbone et le deuxieme chiffre le nombre de doubles liaisons. : 4-5 jours apres l’emergence.
Acides gras des lipides neutres Les variations que nous observons dans les lipides neutres sont sensiblement les m&mes que dans les lipides totaux. Le Tableau 2 rapporte ces variations. Les acides gras de la sCrie des 18C constituent plus de 60 pour cent des acides gras de cette fraction. Nous observons une 1Cgere diminution de l’acide palmitique tout au long de la metamorphose. Au milieu du stade pupe la teneur de I’acide linoleique baisse brusquement de 25 pour cent. Cette perte est compensee par un gain du m&me ordre au tours de la journee suivante. Chez l’adulte de 4 a 5 jours, la proportion des acides gras satures est beaucoup plus ClevCe. Dans cette fraction, on ne trouve pas d’acide linoleique. Acides gras des phosphatidylcholines Le Tableau 3 expose les resultats que nous avons obtenu avec la fraction des PTC. Les proportions des acides linoleique et stearique sont plus ClevCes dans les PTC que dans les lipides neutres et les proportions des acides oleique et palmitique sont plus faibles. La proportion des acides a Cl8 se maintient constante (environ 80 pour cent). Comme dans la fraction des lipides neutres, on observe au milieu du stade pupe une chute importante de la teneur en acide linoleique
I~LUTION
DES CLYCI?RIDESET DES ACIDES GRAS
DANS
TRIBOLIUM
CONFUSUM
1849
(2.5 pour cent), Cette baisse est compenste au tours de la journke suivante. C’est chez les insectes de 17 A 18 jours que l’on trouve la plus forte teneur en acides gras saturCs (35,5 pour cent) dans les PTC et la plus faible teneur se trouve chez TABLEAU 2-&IDES
GRAS DES LIPIDES NEUTRES*
Distribution Age (jours)
Stade
IO-II II-12 12-13 13-14 14-15 15-16 16-17 17-18 18-19 19-20 20-21 21-22 25-26
L L L PP PP PP-P P P P P P A-P A
12:o T T T T T T T T T T T T T
14:o
16:O
16:l
l&O
l&l
18:2
T 1s T T T T T T T T T T T
37,0 38,6 37,0 36,0 34,4 34,1 33,4 35,4 34,3 32,0 32,8 32,7 37,3
T T T T T T T I,1 I,0 I,4 I,0 T 1,2
5,4 593 4,3 4,3 493 493 4,8 4,8 3,7 4,9
40,s 39,6 44,2 45,4 45,s 45,3 44,6 47,7 45,1 44,2 44,s 45,1 44,8
14,8 14,4 14,o 14,l 14,2 14,4 15.5 IO,3 14,l 16,2 17,o IS,7 9,8
* Les symboles sont expliques dans le Tableau TABLEAU 3-ACIDES
Stade
IO-1 1 II-12 12-13 13-14 14-15 IS-16 16-17 17-18 18-19 19-20 20-21 21-22 25-26
L L L PP PP PP-P P P P P P A-P A
12:O T T T T T I,0 T T T T T T T
4,l 4,4 5,6
1.
GRAS DES PHOSPHATIDYLCHOLINES*
Distribution Age (jours)
(%)
14:0 T T T T T T T T T T T T T
(%)
16:O
16:l
16:2
18:O
18:l
18:2
18:3
17,O 19,9 18,l 18,4 16,2 18,O 19,6 22,s 14,3 IS,5 17,6 17,s 13,s
T 1,3 T T I,3 I,0 T T I,0 1,1 T T I,5
T I,1 T T T T T I,0 T T T T I,7
7,8 5,7 8,s 8,2 8,7 8,s 8,8 13,0 II,7 8,0 7,9 8,1 8,O
14,9 18,l 18,l 15,2 18,l 21,2 22,5 26,2 20,4 21,2 20,8 22,s IS,0
60,O 53,1 54,7 57,3 55,0 50,4 48,0 36,0 51,7 53,5 51,8 50,l 52,4
T 6,8
* Les symboles sont expliques dans le Tableau
1.
A. R. BEAUDOINet A. LEMONDE
1850
les adultes de 4 a 5 jours (21,s pour cent). La teneur de l’acide palmitique diminue fortement au cows des premiers jours de la vie adulte (environ 23 pour cent). La quantite d’acide linolenique qui apparait dans les lipides totaux a l’age adulte provient en grande par-tie des PTC. En effet, chez l’adulte de 4 a 5 jours, la proportion de cet acide atteint presque 7 pour cent. Acides gras des phosphatidyl&hanolamines Les acides gras que nous avons mesures dans les PTE (Tableau 4) sont les m&mes que ceux de la fraction des PTC. On trouve a peu p&s la mCme teneur en acide palmitique dans ces deux groupes de PL. La teneur en acide stearique TABLEAU 4-ACIDES
GRAS DES PHOSPHATIDYL~THANOLAMINES*
Distribution (%) Age (jours)
Stade
10-l 1 11-12 12-13 13-14 14-15 15-16 16-17 17-18 18-19 19-20 20-21 21-22 25-26
L L L PP PP PP-P P P P P P P-A A
14:o
16:0
16:l
16:2
18:0
18:l
18:2
18:3
T T T T T T T T T T T T T
15,s 18,2 19,s 20,8 22,3 24,6 20,O 15,6 21,O 17,3 22,7 22,7 17,4
T T T T T T T T T T T T T
T T T T T T T 1,3 T T T T 1,O
15,l 13,7 13,9 13,9 13,7 13,6 13,8 13,4 13,0 13,0 11,7 8,3 10,3
15,s 15,6 19,3 16,2 22,3 25,l 23,3 20,8 22,l 26,2 30,2 34,2 25,6
53,3 51,l 46,6 48,7 39,s 35,6 41,9 48,s 43,2 42,7 34,s 33,7 44,6
T T
* Les symboles sont expliques dans le Tableau 1. tous les stades des traces d’acide heptadCcano?que.
Nous avons retrouve ZJ
&ant plus ClevCe que dans les PTC, on a done un degre de saturation plus ClevC dans les PTE. Au dix-septieme jour, les variations des teneurs se font a l’inverse des variations observees dans les autres fractions. Ainsi, l’acide palmitique diminue d’environ 2.5 pour cent et l’acide linoleique augmente d’environ 15 pour cent. Au tours des premiers jours du stade adulte, il y a diminution des acides oleique et palmitique au profit de l’acide linoleique. On observe de tres faibles quantites d’acide linolenique chez l’adulte de 4 a 5 jours. Variations des glycbides Les variations du glycerol des triglycerides et des mono- et diglycerides sont d&rites dans le Tableau 5. On observe une augmentation des triglycerides jusqu’au milieu du stade prepupe puis une baisse reguliere jusqu’a l’age adulte. La chute des triglycerides est particulierement accent&e au moment de l’tmergence adulte
BVOLUTION
DES
(18,5 pour cent).
GLYCBRIDES
ET
DES
ACIDSSGRASDANS TRIBOLIUM
Les teneurs des mono-
et diglycerides
1851
CONFUSUM
sont relativement
faibles
par rapport a celles des triglycerides. TABLEAU 5--VARIATIONS DU GLYCdROLDESGLYCRRIDES AU COURSDE LA CROISSANCE ET DE LA ik~AM0RRn0ss DE T. confusum* mg de glyc&ol/lOO g d’insectes (poids frais) Age (jours)
Stade
IO-11 11-12 12-13 13-14 14-15 15-16 16-17 17-18 18-19 19-20 20-21 21-22 25-26
L L L-PP PP PP PP-P P P P P P P-A A
Triglyckrides
Mono- et diglyckrides
937 1517 1651 1696 1634 1537 1483 1446 1398 1327 1300 1060 891
-
29 47 43 40 37 37 42 41 33 32 36 42 37
* Les symboles sont expliquks dans le Tableau I. DISCUSSION Les travaux de FAST (1966), de BARLOW (1964) et de YOUNG (1967) ont montre que les acides palmitique, Chez
oleique et linoleique
predominent
chez les coleopteres.
T. confusum, ces trois acides constituent plus de 90 pour cent des acides gras
totaux.
Nos
KENNINGTON
mesures
concordent
et CANNELL
(1967)
assez bien avec les valeurs
mention&es
et VILLENEUVE et LEMONDE (1963)
par ont
CtudiC cet insecte au stade pupe.
La proportion
lierement
C’est la plus forte teneur qui ait CtC mentionnee
&levee au stade adulte.
de l’acide palmitique
qui
est particu-
pour III-I coleoptere. La composition
en acides gras de cet insecte n’est pas influencee
directement
par les acides gras presents dans son alimentation. Au stade adulte, lorsque l’insecte recommence a se nourrir, la disparite entre la composition de l’insecte et la composition de sa ration tend a s’accentuer. On sait d’autre part qu’aucun acide gras n’est ‘essentiel’ au developpement de cet insecte (LEMONDE et BERNARD, 1951). La (distribution
des acides gras dans les PL
ressemble
a la distribution
que
l’on trouve chez les mammiferes. En effet, les PTE sont constituees dune plus forte proportion d’acide stearique que les PTC et les PTC en ont plus que les lipides neutres. Par contre, les lipides neutres ont une proportion plus Clevte des acides oleique et palmitique que les PL. Nous trouvons les mCmes acides gras
1852
A.
R.
BEAUDOINet A. LEMONDE
dans les PL de T. confusum et Tenebrio molitor (larve) (FAST, 1966). A I’instar de FAST (1966), now avons detect& de I’acide heptadecanoique exclusivement dans les PTE. 11 n’existe qu’une etude des variations des acides gras dans les diverses classes de lipides au tours du developpement. KINSELLA (1966) a suggCrC que durant l’embryogenbe de Periplaneta americana les triglycerides participent de facon importante a la biosynthbe des PL. 11 attribue l’augmentation des acides gras a longue chaine a l’elaboration des tissus nerveux. Nous n’avons pas observe cette derniere particularite chez T. confusum. Au moment de l’emergence, il a aussi observe une chute de 50 pour cent de l’acide linolenique. 11attribue cette diminution a l’elaboration d’une hormone qui permet la separation de la cuticule et des ailes de leurs enveloppes. La liquidite des membranes cellulaires serait reliee a la temperature de transition de ses composants. Ainsi, les membranes cornpokes de PL contenant peu de doubles liaisons montrent moins de liquidite que les membranes contenant des PL fortement insatures. Ce contrble de la liquidite des membranes serait en relation avec les proprietes physiques des molecules qui diffusent (CHAPMAN, 1969). Nos resultats indiquent que le maximum d’insaturation dans les PTC et les PTE se retrouve au stade larvaire (larves de 10 a 11 jours) et au stade adulte (4 a 5 jours). C’est justement a ces deux ages que l’activite metabolique est plus intense. En effet, en plus du metabolisme basal, chez la larve il y a croissance et activite locomotrice. Chez l’adulte, il y a activite locomotrice et maturation sexuelle. Ces resultats indiqueraient done que l’augmentation de l’insaturation des PTC et des PTE correspond a une augmentation des &changes au niveau cellulaire et a une augmentation du metabolisme en general. C’est d’ailleurs a ces deux stades que le consommation de l’oxygene est la plus &levee (MOORJANI, 1969). Les variations du glycerol des triglycerides concordent avec celles des lipides neutres (BEAUDOIN et al., 1968). 11 est difficile d’interpreter les fluctuations du glycerol des mono- et des diglycerides. On sait que ces lipides sont soumis a un turnover continuel. 11s constituent, semble-t-il, la forme de transport des graisses dans l’hemolymphe (GILBERT, 1967). R&sum&-Now avons mesure les variations des acides gras dans diverses classes de lipides (lipides totaux, lipides neutres, phosphatidylcholines et phosphatidylethanolamines) et celles des glycerides au tours de la croissance et de la metamorphose de T. confusum. 1. La distribution des divers acides gras de T. confusum ressemble a celle que l’on trouve chez d’autres coleopteres. Cependant cet insecte se distingue par la teneur t&s ClevCe de l’acide palmitique. 2. La ration alimentaire n’influence pas directement la composition des acides gras de cet insecte. 3. 11 semble exister une relation entre le degre d’insaturation des PTE et des PTC et l’activite metabolique de l’insecte. 4. Les variations des triglycerides sont les m&mes que celles des lipides neutres. Remerciewzents-Nous
d&irons
LAURENT(Ctudiants du Departement cipe aux dosages
des glycerides.
remercier Messieurs GILLES GOULETet de Biologie de la Faculte des Sciences)
LIONEL SAINTqui ont parti-
Bv~LuTI~N DES GLYCfiRIDES ET DES ACIDESGRAS~.41is TRIBOLI~M
CONFUSUM
1853
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