La importancia de garantizar la calidad y minimizar los riesgos de contaminación en el análisis genético forense

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REML-178; No. of Pages 6 Rev Esp Med Legal. 2016;xxx(xx):xxx---xxx

REVISTA ESPAÑOLA DE

MEDICINA LEGAL www.elsevier.es/mlegal

REVISIÓN

La importancia de garantizar la calidad y minimizar los riesgos de contaminación en el análisis genético forense Manuel Crespillo Márquez a,∗ , Óscar García Fernández b , Miguel R. Paredes Herrera a y Juan A. Luque Gutiérrez a a b

Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses, Barcelona, Espa˜ na Unidad de Ciencias Forenses, Genética Forense-Policía Científica-Ertzaintza, Erandio (Vizcaya), Espa˜ na

Recibido el 2 de mayo de 2016; aceptado el 24 de mayo de 2016

PALABRAS CLAVE ADN; Contaminación; Acreditación; Laboratorio forense; ISO 17025

KEYWORDS DNA; Contamination; Accreditation; Forensic laboratory; ISO 17025



Resumen La alta sensibilidad conseguida en los análisis genéticos de interés forense permite obtener perfiles genéticos procedentes de mínimas trazas de material biológico depositado sobre los indicios, antes o incluso después de los hechos investigados. La contaminación de los indicios biológicos de manera accidental y la interpretación errónea de los resultados genéticos tienen importantes consecuencias con la consiguiente repercusión en el proceso judicial. Minimizar y detectar la presencia de contaminaciones accidentales que se pueden generar durante algunas de las fases de recogida o análisis genético es una prioridad para los laboratorios de análisis genéticos. El presente artículo revisa el marco normativo, así como los estándares de calidad nacionales e internacionales aplicables al ámbito de la genética forense que tienen como objetivo garantizar la calidad de la prueba pericial y la fiabilidad de las conclusiones emitidas en los informes periciales. © 2016 Asociaci´ on Nacional de M´ edicos Forenses. Publicado por Elsevier Espa˜ na, S.L.U. Todos los derechos reservados.

The importance of ensuring quality and minimising the risks of contamination in genetics forensic analysis Abstract The high sensitivity achieved in genetic analysis of forensic interest allows to obtain genetic profiles from minimal traces of biological material deposited on the evidence before or even subsequent to the events under investigation. Accidental contamination of biological evidence and erroneous interpretation of genetic findings have important implications with the consequent impact on the judicial process. Minimising and detecting the presence of accidental

Autor para correspondencia. Correo electrónico: [email protected] (M. Crespillo Márquez).

http://dx.doi.org/10.1016/j.reml.2016.05.002 0377-4732/© 2016 Asociaci´ on Nacional de M´ edicos Forenses. Publicado por Elsevier Espa˜ na, S.L.U. Todos los derechos reservados.

Cómo citar este artículo: Crespillo Márquez M, et al. La importancia de garantizar la calidad y minimizar los riesgos de contaminación en el análisis genético forense. Rev Esp Med Legal. 2016. http://dx.doi.org/10.1016/j.reml.2016.05.002

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M. Crespillo Márquez et al. contamination that may be generated during some phases of collection of samples or genetic analysis are a priority for forensic genetics laboratories. This article reviews legislation and national and international standards applicable to field of forensic genetics, which aim to ensure the quality of expert evidence and the reliability of the conclusions reached in the expert reports. © 2016 Asociaci´ on Nacional de M´ edicos Forenses. Published by Elsevier Espa˜ na, S.L.U. All rights reserved.

Introducción

Marco normativo

La tecnología y metodología que actualmente se emplea en los laboratorios que llevan a cabo análisis genéticos con fines identificativos ofrece un altísimo grado de sensibilidad, al tiempo que un gran poder de discriminación. La amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction -PCR-) [1] de los kits de última generación1 , que incluyen mejoras en el dise˜ no de sus primers y en la composición del buffer y posibilitan de esta manera un mejor rendimiento ante la presencia de inhibidores, la escasa cantidad de ADN necesario, o su degradación, la alta sensibilidad y precisión de los sistemas de cuantificación de ADN (real-time PCR), así como los secuenciadores de ADN utilizados en la actualidad, hacen posible la obtención de perfiles genéticos con valor identificativo a partir de unas cuantas células depositadas sobre un vestigio biológico. Potencialmente, es posible amplificar y, por tanto, obtener información identificativa a partir de unas 15-20 células (aproximadamente 100 pg)2,3 con las que se consigue, gracias a la combinación de tan solo 21 marcadores short tandem repeats, valores de discriminación superiores al 99,9999999%4 . Sin embargo, paradójicamente, la alta sensibilidad conseguida puede constituir un hándicap para el resultado final del análisis. La reacción de PCR permite la obtención de millones de copias de ADN a partir de unas pocas moléculas iniciales. Sin embargo, la reacción química no distingue entre el ADN procedente de células propias del fluido objeto de investigación y, por tanto, relacionadas con los hechos investigados, del ADN que accidentalmente y de manera ajena a los hechos, haya sido depositado sobre el indicio objeto de estudio. Cuando la transferencia de material biológico al indicio se produce posteriormente al momento en el que ocurren los hechos, una vez el proceso de investigación pericial se inicia, se habla de contaminación5 , la cual puede tener distintos orígenes y producirse mediante distintos mecanismos6 . Los resultados obtenidos como consecuencia de una contaminación pueden ocasionar una interpretación errónea del laboratorio, que emitirá conclusiones equivocadas, con importantes repercusiones en el curso de la investigación criminal, así como en el proceso judicial7,8 . En el presente artículo se revisan los aspectos más relevantes con relación al fenómeno de la contaminación, la transcendencia de esta y la normativa, legislación y estándares nacionales e internacionales que permiten minimizar la contaminación, así como su detección.

Con el fin de garantizar la calidad, autenticidad y la seguridad de los resultados emitidos por los laboratorios que llevan a cabo análisis genéticos en cualquiera de los países miembros de la Unión Europea, el Consejo de Europa aprobó la Decisión marco 2009/905/JAI, de 30 de noviembre de 20099 sobre acreditación de prestadores de servicios forenses que llevan a cabo actividades de laboratorio. Se recoge, entre los objetivos del acuerdo, la acreditación bajo la norma EN ISO/IEC 1702510 de aquellos laboratorios con actividad en el ámbito de la genética forense, y se estableció para ello el 30 de noviembre de 2013 como fecha límite para el cumplimiento de dicho acuerdo. Por otra parte, en Espa˜ na, la aprobación de la LO 10/2007, de 8 de octubre, reguladora de la base de datos policial sobre identificadores obtenidos a partir del ADN11 supuso un punto de inflexión en la calidad de la pericia en materia de análisis genéticos. La ley, en su artículo 5, dispone que «solo podrán realizar análisis del ADN con fines de identificación genética los laboratorios acreditados a tal fin por la Comisio´ n Nacional para el Uso Forense del ADN (CNUFADN) que superen los controles periódicos de calidad a que deban someterse». El Real Decreto 1977/2008 en su artículo 3 regula, como una de las funciones de la CNUFADN «la acreditación de los laboratorios que estén facultados para contrastar perfiles genéticos en la investigación y persecución de delitos y la identificación de cadáveres o averiguación de personas desaparecidas» y, por su parte, el artículo 8 establece el procedimiento de evaluación de los laboratorios que llevan a cabo análisis de ADN con fines de identificación forense12 . El acuerdo adoptado por parte de la CNUFADN sobre acreditación y control de calidad de los laboratorios de genética forense (aprobado con fecha 21/07/2009)13 recoge 2 requisitos para asegurar la calidad y fiabilidad de los análisis genéticos realizados por los laboratorios de genética forense. Por un lado, la necesidad de participar anualmente y superar alguno de los ejercicios de control externos interlaboratorio organizados por entidades científicas internacionales (Grupo de habla espa˜ nola y portuguesa [GHEP] o European Network Forensic Sciences Laboratories [ENFSI]) y como segundo requisito, el laboratorio debe someterse a la evaluación de la Entidad Nacional de Acreditación (ENAC) con el fin de acreditar su competencia técnica, acorde con lo establecido en la norma EN ISO/IEC 17025. La CNUFADN solicita anualmente información relativa al estado de la acreditación a todos los laboratorios espa˜ noles que desarrollan su actividad en el ámbito de la genética forense emitiendo dictámenes periciales a los tribunales de

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Importancia de la calidad en los análisis genéticos con interés forense justicia y, tras la evaluación de la información aportada, se edita un catálogo de laboratorios que cumplen con dicho acuerdo y que es publicado en el portal web de la CNUFADN, quedando así acreditados por la CNUFADN. En la última memoria publicada correspondiente al a˜ no 201414 , el número de laboratorios espa˜ noles que cumplían el acuerdo era de 18, pertenecientes sobre todo al ámbito público (14) y, en menor medida, al privado (4).

Tabla 2

3 Ejemplos de mecanismos de contaminación

Mecanismo

Ejemplo

Contacto directo

Tocar sin guantes evidencias o material de laboratorio utilizado en los análisis Empaquetar varias evidencias con presencia de fluidos en el mismo envase primario Estornudar, toser e incluso hablar cerca de una evidencia o material de laboratorio utilizado en los análisis Transportar material amplificado a zonas pre-PCR Uso de material fungible contaminado en la fase de manufacturación Empleo del mismo utensilio (guantes, tijeras. . .) para el procesado de distintas evidencias

Aerosoles

El concepto de la contaminación biológica y su repercusión La transferencia de ADN se puede producir entre personas, personas y objetos, personas y superficies, objetos y superficies o entre objetos. Esta transferencia puede acontecer en distintos momentos, y los mecanismos y fuentes son diversos. La transferencia de material genético puede producirse, antes, durante o posteriormente a los hechos investigados. En los 2 primeros escenarios, la transferencia de ADN se produce por un mecanismo ajeno a los hechos o de manera inherente a los propios hechos investigados y, por tanto, se trata de una transferencia inevitable. Sin embargo, cuando esta se produce tras haber ocurrido los hechos investigados, es evitable y habitualmente se produce de manera accidental: en este caso hablamos de una contaminación (tabla 1[b]). Puede ocurrir en distintos momentos: durante

Tabla 1 Ejemplos de procesos que pueden provocar mezcla de material genético en distintas fases de los hechos investigados Tiempo

Ejemplo

Antes de los hechos

Compartir un cigarrillo El uso compartido del picaporte de una puerta de la misma vivienda Compartir una prenda de ropa Estrechar las manos Compartir el uso de un cuchillo en la misma vivienda En casos de agresiones múltiples, restos de sangre mezclados, procedentes de diferentes individuos Restos de semen procedentes de varios agresores Restos celulares de un agresor en las u˜ nas de una víctima Restos de semen de un agresor en cavidades de una víctima de agresión sexual Método de recogida y embalaje inadecuado de las muestras Aportación accidental de material biológico por parte del personal implicado en la recogida o en el análisis de las evidencias. Uso de material fungible contaminado con material biológico Metodología de análisis inadecuada

Durante los hechos

Posteriormente a los hechos

Transferencia secundaria

la fase de recogida de indicios, en el transporte de las muestras o en la realización de los análisis en el propio laboratorio. Los mecanismos de producción de la contaminación son también variados, e incluyen desde el contacto directo hasta la transferencia por medio de aerosoles o mediante la intervención de agentes trasmisores (ya sean objetos o personas)15---19 (tabla 2). Por último, las fuentes de la transferencia son variadas, e incluyen al personal implicado en la recogida y envío de muestras, el personal encargado de los análisis, así como el material empleado en las fase de recogida, envío y análisis de las evidencias (embalajes, material fungible o reactivos)20 . No debe olvidarse, como una fuente más, la transferencia accidental de material genético entre muestras o extractos de ADN (DNA carry-over), que puede producirse en el laboratorio en alguna de las fases del análisis como consecuencia del procedimiento inadecuado en el flujo de trabajo o en la manipulación de las muestras. Desde el punto de vista práctico y a efectos interpretativos, una transferencia de ADN puede ocasionar la aparición de perfiles mezcla, que se manifiestan mediante la aparición de más de 2 alelos en 2 o más marcadores short tandem repeats21 . El impacto que la contaminación puede tener en la interpretación final de los resultados genéticos y, por tanto, en las conclusiones de un dictamen pericial, es variable22 . En algunas ocasiones, si la cantidad de material biológico contaminante es escasa, puede no ser detectada a pesar del bajo límite de sensibilidad de los equipos de análisis utilizados actualmente por los laboratorios forenses. Adicionalmente, cuando existe una importante desproporción entre el contribuyente celular mayoritario depositado en el indicio y el material contaminante, la reacción de PCR favorece la amplificación del componente mayoritario en detrimento del minoritario (contaminante)23 , y hacen que este último pueda pasar totalmente desapercibido para el laboratorio. En las situaciones descritas, el perfil contaminante no tiene ningún efecto práctico y, por tanto, no existe una trascendencia real sobre las conclusiones finales tras la valoración del perfil genético. Sin embargo, cuando el aporte al indicio de material exógeno y ajeno a los hechos

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adquiere una magnitud que es detectable por el laboratorio, las consecuencias pueden tener especial relevancia. No obstante, dependiendo del grado de contaminación y de otras variables analíticas propias de cada laboratorio (p. ej.: metodología utilizada, kits utilizados, sensibilidad de los equipos de detección, criterios internos de evaluación de perfiles) las situaciones pueden ser diferentes. La contaminación dificulta o imposibilita la interpretación de un perfil genético. Sin embargo, hay un escenario especialmente grave que merece ser se˜ nalado y acontece principalmente sobre aquellos indicios que contienen una escasa cantidad o calidad de ADN: son situaciones en las que el perfil genético correspondiente al componente contaminante prevalece de manera clara sobre cualquier otro perfil procedente del indicio. En este supuesto, el laboratorio puede interpretar una falsa exclusión sobre la participación de una determinada persona investigada, a tenor de la falta de su contribución genética en el perfil de ADN obtenido y, de manera concatenada, la ficticia inclusión de otro participante en los hechos (contaminante). Es lo que se denomina the hidden perpetrator effect5 . Por otro lado, el registro de estos perfiles, producto de una contaminación, en las bases de datos de ADN puede generar asociaciones erróneas, con importante impacto en la investigación de los hechos. Para evitar y detectar cualquier tipo de contaminación, es fundamental el establecimiento de unos protocolos de trabajo y medidas de control que garanticen la autenticidad de los resultados obtenidos.

Estándares técnicos de calidad En la actualidad la mayoría de los laboratorios que llevan a cabo análisis genético con interés forense en Europa y EE. UU. se encuentran acreditados según la norma EN ISO/IEC 17025. Esta establece los requisitos generales en materia de calidad que permiten asegurar la competencia técnica de los laboratorios de ensayo y calibración. La norma recoge principalmente 2 bloques de requisitos: los referidos a aspectos vinculados a la gestión del laboratorio (organización, sistema de gestión de calidad, control de pedidos, control de documentos. . .) y aquellos relacionados con aspectos de tipo técnico (cualificación del personal, instalaciones y condiciones ambientales, métodos de ensayo y calibración y validación de métodos, equipos, trazabilidad de las medidas, muestreo, manipulación de objetos de ensayo y calibración, aseguramiento de la calidad de los resultados de ensayos y calibraciones e informe de los resultados). Posiblemente, la infraestructura y los criterios en materia de calidad que los laboratorios de genética forense han implementado en al última década supera al de otras muchas disciplinas forenses. La participación activa de diferentes grupos científicos de estandarización en Europa y en EE. UU. han contribuido de manera decisiva a esta labor (European Network of Forensic Science Institutes [ENFSI], Forensic Science Regulator [FSR], Scientific Working Group on DNA Analysis Methods [SWGDAM], European DNA Profiling Group [EDNAP], Grupo de Habla Espa˜ nola y Portuguesa de la International Society of Forensic Genetics [GHEP-ISFG]). Durante la última década se han emitido numerosas recomendaciones y guías, algunas de las cuales se han convertido en estándares de calidad.

Algunas de estas recomendaciones se centran en la fase de recogida de las muestras e indicios biológicos en el lugar de los hechos24 , sobre el cuerpo de la víctima o en las operaciones de exhumación25 , que indudablemente constituye el primer paso para poder establecer la garantía final del resultado genético. Otro bloque de recomendaciones desarrollan las medidas encaminadas a minimizar y detectar procesos de contaminación durante alguna de las fases del análisis genético de las muestras en el laboratorio, considerando aspectos como el dise˜ no y distribución del laboratorio, procedimiento y sistemática de análisis, mecanismos y controles de calidad y trazabilidad de la contaminación26,27 . Por otro lado, la aparición de perfiles genéticos repetitivos, relacionando distintos casos sin aparente conexión en distintos países de Europa, EE. UU. y Nueva Zelanda, algunos de ellos de importante relevancia mediática (p. ej. Heilbronn phantom)28,29 hicieron que en 2010 algunos grupos de estandarización científicos (ENFSI, SWGDAM y el Biology Specialist Advisory Group [BSAG]) publicaran un documento en el que se instaba a las empresas manufacturadoras de fungibles y reactivos a adoptar medidas que permitieran garantizar la ausencia de trazas de material biológico en los productos que fabricaban y suministraban a los laboratorios forenses30 . En el a˜ no 2016, la International Organization for Standardization (ISO) aprobó un nuevo estándar (ISO 18385:2016)31 cuyo objetivo es minimizar el riesgo de contaminación humana en productos utilizados para la recolección, almacenamiento y análisis de material biológico en análisis forenses. Minimizar y detectar la presencia de contaminaciones accidentales que se pueden generar durante algunas de las fases de recogida o análisis genético de los indicios se ha convertido en una prioridad para los laboratorios de análisis genéticos. Esto permite garantizar la calidad de la prueba pericial, asegurar la autenticidad de los resultados finales y la veracidad de las conclusiones emitidas en el dictamen judicial.

Minimizar la contaminación - Formación: Asegurar la formación del personal implicado en cualquiera de las fases del análisis genético (incluyendo las fases iniciales de registro y recepción de indicios) en aspectos relativos a los procedimientos y mecanismos de trabajo en el laboratorio, así como al impacto y repercusión de unos hábitos inadecuados, resulta imprescindible para evitar contaminaciones y garantizar los resultados finales del análisis. - Distribución y dise˜ no del laboratorio: El dise˜ no correcto del laboratorio constituye una pieza clave a la hora de minimizar el riesgo de contaminación en el laboratorio. Los laboratorios prestan especial atención a la separación física entre la zona post-PCR y la pre-PCR, evitando el trasiego de muestras y material de la zona de post-PCR a la de pre-PCR. Deben garantizarse espacios físicos separados para el procesado y análisis de muestras dubitadas e indubitadas, y evitar la simultaneidad espacial o temporal en el procesado y análisis de muestras con alto y bajo contenido de ADN. Asimismo, los laboratorios disponen de zonas limpias, en las que se realizan operaciones especialmente críticas en el proceso y susceptibles de eventuales contaminaciones (p. ej.: recepción y registro de muestras,

Cómo citar este artículo: Crespillo Márquez M, et al. La importancia de garantizar la calidad y minimizar los riesgos de contaminación en el análisis genético forense. Rev Esp Med Legal. 2016. http://dx.doi.org/10.1016/j.reml.2016.05.002

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Importancia de la calidad en los análisis genéticos con interés forense

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extracción de muestras críticas ----bajo contenido o calidad de ADN----, preparación de reacciones de PCR, preparación de reactivos). Todas las áreas están dotadas del material y de los equipos necesarios que son exclusivos para dichas zonas, y el trabajo en ellas se realiza con el equipo de trabajo de protección individual (bata, guantes, mascarilla). Acceso al laboratorio: Por otra parte, el acceso a los laboratorios debe estar controlado y ser limitado al personal que desempe˜ na su actividad en él, evitando, así, la transferencia accidental a los indicios de material biológico procedente del personal ajeno a la actividad que se desarrolla en el laboratorio. Reactivos y materiales: El empleo del material utilizado para embalaje y remisión de muestras al laboratorio, así como los fungibles, reactivos o kits empleados deben ajustarse a lo establecido en el estándar (ISO 18385:2016). Ejercicios colaborativos/intercomparación: La participación del laboratorio en ejercicios colaborativos o de intercomparación ayudarán a conocer la dinámica de trabajo del propio laboratorio y, en su caso, permitirán corregir aspectos en el flujo de trabajo que puedan resultar deficientes o inadecuados. Automatización: Por último, la automatización de gran parte de los procesos que se realizan en el laboratorio de genética forense es una tendencia cada vez más extendida, que permite reducir el riesgo de contaminación, evitando la mínima interacción entre las muestras y el personal de laboratorio. Al mismo tiempo, la automatización ayuda a optimizar recursos y reducir tiempos de ejecución32 .

Detectar la contaminación Tan importante como evitar eventuales contaminaciones lo es el poder trazar y detectar el origen de dichas contaminaciones con el fin de corregir anomalías en la metodología de análisis y adoptar cambios en la sistemática de trabajo del laboratorio. Se incluyen para ello distintas acciones: - Importancia de los controles negativos: El uso de controles negativos y blancos en las fases de extracción y amplificación del material genético, y su valoración exhaustiva y sistemática, permite identificar la presencia de contaminación achacable a algunos de los reactivos empleados, a deficiencias en la manipulación de las muestras o en la ejecución del procedimiento de trabajo. - Uso de las bases de datos de descarte: Los laboratorios generan bases de datos de descarte que contienen perfiles genéticos procedentes del personal del laboratorio, así como de otro personal que eventualmente pueda acceder al área de trabajo (p. ej.: servicios de limpieza, mantenimiento, seguridad) y personal que de una manera u otra haya podido estar en contacto con las muestras. El uso de las bases de datos de descarte permite, mediante comparación, identificar cualquier contaminación detectable debida a la transferencia de material biológico del personal incluido en dicha base de datos33 . - Gestión informática del laboratorio: El empleo de programas informáticos que gestionan el tratamiento integral de los datos generados en el laboratorio (p. ej.: Laboratory Information Management Systems [LIMS]), permite

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incorporar algoritmos para el registro de las contaminaciones observadas en el laboratorio y, de esta manera, facilitar la trazabilidad sobre su origen y su impacto final. El registro histórico de las contaminaciones observadas en el laboratorio posibilita abordar las posibles fuentes de origen y ayuda a la implantación de medidas correctivas. - Importancia de la validación interna de los métodos empleados: La validación de los métodos empleados le permite al laboratorio conocer las características concretas de los equipos e instrumental propio utilizado, así como detalles relativos al procedimiento técnico empleado. Esta información puede ayudar a detectar eventuales contaminaciones.

Conclusión final Diferentes elementos contribuyen a dotar de validez y rigurosidad a la prueba genética. Todos ellos se complementan y permiten a los laboratorios garantizar la calidad de los informes periciales que son emitidos a los tribunales de justicia. Por un lado, los avances tecnológicos y científicos permiten alcanzar una mayor sensibilidad, rapidez y precisión en los análisis genéticos, con la obtención de más información genética a partir de menos cantidad de muestra, todo ello, en menos tiempo. En este aspecto se está haciendo un permanente e importante esfuerzo por parte de grupos de investigación mundiales y casas comerciales. Por otro lado, el establecimiento de estándares técnicos científicos (p. ej.: marcadores genéticos utilizados, nomenclatura empleada, métodos empleados. . .) constituyen otro elemento necesario: estos contribuyen a utilizar el mismo lenguaje científico y ayudan a los laboratorios forenses a cotejar resultados, independientemente del laboratorio en el que se hayan realizado los análisis, en un momento en el que con más frecuencia se cruzan datos genéticos debido al crecimiento e interoperatividad de las bases de datos de perfiles de ADN con interés criminal. Finalmente, en los últimos a˜ nos, los laboratorios espa˜ noles que llevan a cabo análisis de genética forense han realizado importantes esfuerzos para implantar un sistema de calidad integral, acorde con lo dispuesto en la norma EN ISO/IEC 17025 que, unido a los otros aspectos mencionados anteriormente, permiten ofrecer confianza y garantías sobre la pericia realizada en nuestro país.

Nota de los autores Las ideas, comentarios y opiniones expuestos en el artículo, son realizadas a título personal y no tienen que coincidir necesariamente con el punto de vista o posicionamiento de las instituciones a las que pertenecen.

Conflicto de intereses Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

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Cómo citar este artículo: Crespillo Márquez M, et al. La importancia de garantizar la calidad y minimizar los riesgos de contaminación en el análisis genético forense. Rev Esp Med Legal. 2016. http://dx.doi.org/10.1016/j.reml.2016.05.002