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Mastocytes, basophiles, éosinophiles Analyse des marqueurs biologiques
REVUE FRAN(~AISE D ALLERGOLOGIE
ET D'IMMUNOLOGIE CLINIQUE
Mastocytes, basophiles, 6osinophiles Analyse des marqueurs biologiques L. P R I N
RI~SUMI~
SUMMARY
L'accbs aux immunodosages a permis le ddveloppement d'anaIyses de nombreux m6diateurs de la rdaction allergique issus de mastocytes, des basophiles ou des dosinophiles ; analyses r6alis6es dans le sang, dans les liquides biologiques ou dans [es surnageants de cellules activdes. Certains de ces m6diateurs ne permettent pas de ddfinir l'implication prdcise d'un type cellulaire (histamine, LTC4, cytokines...), d'autres sont plus spdcifiques (tryptase rnastocytaire, prot6ine cationique de l'6osinophile ou ECP...). Ces explorations prennent surtout en compte la phase effectrice de la r6action d'hypersensibilit6 d6pendante d'IgE. Elles permettent d'identifier des marqueurs potentiels d'activit6 de la maladie allergique et peuvent ainsi 6tre utiles pour juger de l'efficacit6 d'un traitement. D'autres techniques, en pleine 6volution, caractdrisent le phdnotype membranaire (exemple de l'analyse des marqueurs d'activation et/ou de l'expression des moldcules d'adh6sion par cytomdtrie de flux) ou l'6tat fonctionnel de la cellule (exemple du profil de synthbse de cytokines 6valu6 par immunomarquage, hybridation in situ, RT-PCR quantitative...). Ces nouvefles approches devraient permettre de mieux appr6hender, pour mieux les maitriser, les niveaux d'activation cellulaire et la s6quence des 6v6nements impliqu6s dans la gen6se, l'entretien et l'amplification de la rdaction allergique.
Mast cells, basophils, eosinophils. Analysis of laboratory markers. - Access to immunoassays has allowed the development of analyses of many mediators of the allergic reaction derived from mast cells, basophils or eosinophils; analyses performed in blood, biological fluids or activated cell supernatants. Some of these mediators cannot indicate the precise implication of a given cell type (histamine, LTC4, cytokines, etc.), while others are more specific (mast cell tryptase, eosinophil cationic protein (ECP), etc.). These investigations essentially explore the effector phase of the IgG-dependent hypersertsitivity reaction. They allow identification of potential activity markers of allergic disease and can therefore be useful to assess the efficacy of treatment. Other techniques, currently under development, characterize the membrane phenotype (e.g. analysis of activation markers and/or expression of adhesion molecules by flow cytometry) or the functional state of the cell (e.g. cytokine synthesis profile evaluated by immunolabelling,in situ hybridization, quantitative RT-PCR, etc.). These new approaches appear to provide a better understanding and control of the levels of cell activation and the sequence of events involved in the pathogenesis, maintenance and amplification of the allergic reaction.
INTRODUCTION Les p r o g r b s e n m a t i b r e d e r e c h e r c h e a l l e r g o l o g i q u e o n t 6t6 ~t l ' o r i g i n e d u d 6 v e l o p p e m e n t r 6 c e n t de n o m b r e u s e s m 6 t h o d e s d ' e x p l o r a t i o n s . D e v a n t ce f o i s o n n e m e n t , il i m p o r t e d e f a i r e la p a r t e n t r e les e x a m e n s q u i a p p o r t e n t u n e i n f o r m a t i o n r 6 e l l e m e n t u t i l e p o u r le d i a g n o s t i c o u la p r i s e d e d6ci-
Unit6 d'Immunologie, CHU Amiens, Place Victor-Pauchet 80054 AMIENSCedex. Tirds Rpart : Dr L. Prin.
s i o n t h 6 r a p e u t i q u e et les e x a m e n s , e n c o u r s d e v a l i d a t i o n , d o n t l ' i n d i c a t i o n d o i t e n c o r e 6tre rdserv6e a u x p r o t o c o l e s d e r e c h e r c h e c l i n i q u e . L a valid a t i o n d ' u n e x a m e n r e p o s e g la fois s u r d e s crit6res techniques (contr61e de q u a l i t 6 des m6thodes d'analyse, signification du param6tre b i o l o g i q u e ) et s u r u n e m i s e / ~ l " 6 p r e u v e p a r d e s 6tudes cliniques rationnelles.
PRIN L. - Mastocytes, basophiles, eosinophiles, analyse des marqueurs biologiques. Rev. fr. Allergol., 1996, 36 (8), 889-896.
© Expansion Scientifique Frangaise, 1996
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Pour la pratique clinique, les explorations qui t6moignent d'une activation du mastocyte, du basophile ou de l'6osinophile, ne se justifient que si l'enqu4te allergologique (anamn6se, tests cutan6s, recherche des anticorps IgE sp6cifiques d'allerg6nes) a 6t6 d6faillante (cas 6ventuel des allergies m6dicamenteuses). Ces explorations compl6mentaires sont n6anmoins indispensables p o u r mieux appr6hender le r61e de ces cellules dans la r6ponse allergique. Elles peuvent participer ~ toutes les 6tapes de la r6action d'hypersensibilit6 (pr6sentation antig6nique, r6gulation de la synth6se locale des anticorps de classe IgE, g6n4ration de m6diateurs pro-inflammatoires...). Les m6canismes mol6culaires d'activation membranaire sont surtout bien d o c u m e n t 6 s p o u r les r6cepteurs de forte affinit6 pour la portion Fc des IgE (FcCRI) ; r6cepteurs identifi6s depuis longtemps sur le basophile et le mastocyte et plus r6cemment sur l'6osinophile humain [ 16]. L'agr6gation de ces r6cepteurs initie une cascade d'6v6nements intracellulaires qui vont modifier le ph6notype membranaire, favoriser l'exocytose des granules ou la s6cr6tion de leurs composants, g6n6rer la synth6se de m6diateurs lipidiques ou prot6iques., Ces cellules ~ont aussi sensibles 1 action de nombreux autres stimuli (chemokines, cytokines, anaphylatoxines, neuropeptides...). Nous tenterons de pr6ciser la valeur et les limites des tests utilis6s p o u r appr6cier ces 6tats d'activation.
LES MASTOCYTES Les mastocytes sont issus de cellules souches h6matopoi6tiques. Diff6rents travaux r6cents ont soulign6 l'importance du facteur de croissance de cellules souches (Stem Cell Factor ou c-kit ligand) p o u r promouvoir l'engagement vers la diff4renciation mastocytaire. I1 existe des pr6curseurs dans le sang mais leur diff6renciation s'ach6ve dans les tissus. Le r61e de l'environnement tissulaire (stroma, fibroblastes) apparait d6terminant dans cette 6tape finale de maturation. On observe des diff6rences morphologiques et fonctionnelles en relation avec la localisation tissulaire de ces cellules (variabilit6 dans l'expression de r6cepteurs m e m b r a n a i r e s et dans le c o n t e n u en prot6ases neutres cytoplasmiques).
Ph6notype membranaire Le r6cepteur pour le Stem Cell Factor (R-SCF ou CD 117) peut @tre identifi6 sur les pr6curseurs sanguins (Cellules CD34 +, CD 117*) mais l'analyse en cytom6trie de flux de ces ceIlules circulantes
n'a pas encore f a r l'objet d'6tudes document6es. Le m a r q u e u r CD 117, fortement exprim6 sur les mastocytes tissulaires, parait 6tre tr6s sp6cifique. I1 peut p e r m e t t r e le d6veloppement ult6rieur d'6tudes histochimiques ou la mise en oeuvre de techniques de purification s61ective (19). Le m a s t o c y t e partage certains m a r q u e u r s de surface avec le basophile (fig. 1), n o t a m m e n t FcCRI mais aussi CD 14 (r6cepteur du LPS), CD54 (r4cepteur de rhinovirus), CD46 (r6cepteur du virus de la rougeole). Les mastocytes sont aussi retrouv6s dans des sites inflammatoires. Ils sont sensibles g l'effet de chemokines ou de cytokines et engagent des contacts avec la cellule endoth6liale (cellules localis6es g proximit6 de petits vaisseaux ou de veinules post-capillaires ; pr6sence dans les zones de surface en contact avec l'environnement) et surtout avec la matrice extra-cellulaire (contacts VLA4-VCAM 1, VLA-5 - Laminine, [~3 integrine-vitronectine). L'identification des mastocytes (m6tachromasie avec les colorants basiques) peut 4tre facilit6e, au niveau tissulaire, en utilisant des techniques d'immunomarquage, avec l'emploi, n o t a m m e n t d'anticorps monoclonaux anti-tryptase. Les sous-populations de mastocytes ont ainsi pu 4tre caract6ris6es en fonction de leur contenu en prot6ases [3].
M6diateurs m a s t o c y t a i r e s Le mastocyte a la capacit6 de lib6rer de nombreux m6diateurs, n o t a m m e n t l'histamine (3pg/cellule) mais aussi des prot6oglycanes (h6parine, chondroYtine sulfate E...), des m6diateurs lipidiques (LTC4, PGD2, PAF-acether...), des cytokines (IL3, IL4, IL5, GM-CSF, IL6, [L8, IL13,TNFc~...) et plus sp6cifiquement des prot6ases neutres (tryptase, chymase, carboxypeptidase, 61astase...). Nous ne disposons pas de m6thode sensible d'analyse pour l'6tude des prot6oglycanes. Cytokines, LTC4, PAF-acether ne sont pas des marqueurs sp4cifiques de l'activation mastocytaire. Le PGD2 est un m6diateur lib6r6 par le mastocvte activ6, par les plaquettes ou les macrophages ~v6olaires. Diff6rentes m6thodes de dosage de la PGD2 ont 6t4 appliqu6es, notamment pour l'analyse d'6chantillons urinaires ou l'6tude de LBA avant et apr6s test de provocation allerg6nique. L'histamine est un m a r q u e u r non sp6cifique lib6r6 par le m a s t o c y t e mais aussi par le basophile activ6. D iff6rents 416ments restrictifs limitent l'int6rOt de son dosage dans la circulation (demi-vie courte, rapide excr6tion urinaire, voles m6taboliques parfois alt6r6es, incidence possible d'aliments ing6r6s, contraintes de pr616vements...). Diff6rentes m6thodes d'analyse ont 6t6 propos6es : des m6thodes fluorim6triques ou des m6thodes plus sensibles et plus sp6cifiques (immunodosages avec m a r q u e u r radioactif) [ 10]. Rev. fr. Allergol.. 1996.36. 8.
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CD45
VLA-4 VLA-5
RII (CD32) "~ Cm (CD35)
LFA-1 CR3
-
LFA-3 ICAM-1 ICAM-2
CR3(Cl 1b/CD18)
-
"X.
PECA
~
/
,
"~
CR4(CD11clCD18) C5aR(CD88) MCP(CD46) DAF(CD55) I MACIF(CD59) IL1-RII
ICAM-3
r
"
IL2-Rot(CD25)
LEUCOSIALINE (CD43) Pgp-1
/ L IL4-R IL5-R 8-R
(c~44)
.ff INF oCI3-R INF 7-R
SELECTINE (CD62L)
GM-CSF-R MCAF-R CD15 RANTES-R CD40
CD14
FIGURE 1
Fig. 1. - M a r q u e u r s de s u r f a c e d u basophile. E n italique : M a r q u e u r s n o n ddtect6s ou n o n testds s u r le m a s t o c y t e . E n c a r a c t b r e g r a s et soulign6 : M a r q u e u r s d ' a c t i v a t i o n
Le dosage des m6tabolites de l'histamine dans les urines (mdthylhistamine : i m m u n o d o s a g e comp6titif avec m a r q u e u r radioactif) offre l'avantage de permettre le r6alisation d'explorations h distance de l'accident allergique, sous r6serve de conditions tr6s strictes respect6es pour le recueil des 6chantillons. La t r y p t a s e est, tt ce jour, le m a r q u e u r le plus sp6cifique de l'activation mastocytaire. Cette sp6cificit6 est li6e ga la pr6sence 61ective, h concentration 61ev6e, de cette enzyme dans les granules s6cr6toires du mastocyte (10 &35 pg / cellule ; pour le basophile : < 0,04 pg/cellule ; taux ind6tectable pour les autres cellules sanguines). I1 s'agit d'une endoprot6ase neutre dont la lib6ration, dans le milieu extracellulaire, accompagne celle de l'histamine lots du processus d'exocytose. Elle est lib6r6e sous forme active (t6trambre complex6 aux prot6oglycanes) r a p i d e m e n t dissoci6e en une forme m o n o m 6 r i q u e inactive. Diff6rentes m6thodes de dosages ont 6t6 propos6es : m6thodes fluorim6triques, mesure de l'activit6 enzymatique, i m m u n o d o s a g e s non comp6titifs de type sandwich avec des marqueurs radioactifs ou enzymatiques. Les immunodosages pr6sentent l'avantage de doser la forme active et inactive de la tryptase (marqueur plus ,< stable ,, que l'histamine qui a Rev. fr. Allergol., 1996, 36, 8.
une demi-vie de 1 tt 3 minutes dans le sang). Ces m6thodes permettent de doser la tryptase dans la circulation (s6rum ou plasma ; valeurs normales < 5 ng/ml). Des taux s6riques tr6s 61ev6s ont 6t6 observ6s dans les 15 &30 minutes qui suivent une rdaction anaphylactique s6v6re. Darts ces circonstances, ce m a r q u e u r 6tait encore d6tectable plus de 16 heures a w e s l'induction de la r6ponse allergique. Certaines manifestations localis6es s'accompagnent d'une expression tardive du marqueur s6rique ou plasmatique (60 & 120 minutes apr6s piqfire d'hymenopt6re par exemple) ou n'induisent aucune pr6sence d6tectable de tryptase dans la circulation. Ces observations ont justifi6 le d6veloppement des pratiques de dosage dans le LBA avant et apr6s tests de provocation chez l'allergique. Des dosages de tryptase ont 6galement 6t6 effectu6s dans les produits de s6cr6tion nasale dans les rhinites allergiques, dans les larmes ou lots de tests cutan6s. Ces 6tudes ont surtout 6t6 r6alis6es dans le cadre des r6actions allergiques [17]. L'6valuation des diff6rentes formes mol6culaires (alpha ou beta) de la tryptase, reconnues par diff6rents anticorps monoclonaux, pourrait apporter d'utiles informations sur l'activation mastocytaire, n o t a m m e n t dans le cadre des mastocytoses systdmiques [ 18].
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LES BASOPHILES Cellule d'origine medullaire, le basophile, p r & sent en quantit4 faible dans le sang (0,5/a 1 % des leucocytes) est facilement identifiable (m6tachromasie avec les colorants basiques). Sa pr6sence dans les tissus t6moigne du d6veloppement d'un processus pathologique (phase tardive de l'hypersensibilit6 imm6diate, phase pr6coce de l'hypersensibilit6 de type retard6). Le basophile produit de multiples mddiateurs susceptibles d'etre impliqu6s dans diff6rentes 6tapes des r6actions d'hypersensibilit6. I1 synth6tise : l'histamine (concentration moindre que dans le mastocyte), des prot6oglycanes (chondroitine sulfate A), des m6diateurs lipidiques, s u r t o u t le LTC4 et diff6rentes cytokines, n o t a m m e n t l'IL4 mais aussi l'IL13 lib4r4e plus tardivement apr6s une stimulation ddpendante de l'IgE.
Num6ration sanguine En dehors des grandes hyperbasophilies sanguines, observdes dans les leuc6mies my61oides chroniques ou dans d'autres s y n d r o m e s my61oprolif6ratifs, les variations souvent faibles du n o m b r e de basophiles circulants n'ont pas de valeur indicative significative.
Ph6notype membranaire L'analyse par cytofluorom6trie offre l'avantage de permettre l'6tude d'une grand nombre de basophiles sanguins dans un d61ai tr6s court. Certains parambtres (taille de la cellule, m a r q u a g e p a r l'acridine orange des granules) pr6sentent des modifications identifiables en cytofluorom6trie apr6s activation des basophiles [ 11 ]. Le basophile exprime ~ sa surface de n o m b r e u x m a r q u e u r s membranaires ou CD identifids par des anticorps monoclonaux (fig. 1) certains de ces marqueurs seraient sp6cifiques [7] et utiles pour des purifications s6tectives (CDwl7), d'autres ont une densit6 d'expression accrue (CD45) ou ne s'expriment la m e m b r a n e (CD63) que lorsque le basophile est activ6 [4, 8, 19]. La co-expression d'IgE de surface est un bon crit6re d'identification du basophile sanguin, en raison de la liaison stable qu'engage une mol6cule d'IgE monom6rique avec son r6cepteur de forte affinit6 FceRI. L'utilisation d'anticorps anti IgE marqu4s peut entrainer une activation in vitro des basophiles de sujets allergiques ou de sujets t4moins. Des anticorps monoclonaux dirig4s contre la chatne alpha de FceRI peuvent aussi etre utilis6s. I1 existe des sous-populations d'6osinophiles sanguins qui sont aussi susceptibles d'exprimer des IgE de surface et/ou
FceRI [16]. Des 6tudes sont en cours p o u r pr6ciser la valeur et la sensibilit6 de ces explorations par rapport aux analyses 6valuant un 6tat de sensibilisation des basophiles circulants. Lots d'un processus inflammatoire ou d'une r6action d'hypersensibilitG le basophile sanguin pr6-activ6 (~ primed ,, leucocyte) gagne les tissus. I1 exprime en effet des mol4cules d'adh4sion telles que les [31 et [32 int6grines (fig. 1) qui favorisent les interactions avec la cellule endoth61iale (contacts VLA-4 - VCAM-1 ; LFA-1 - ICAM-1 ou ICAM-2). Cet 6tat de pr6-activation li6 h Faction de chemokines ou de cytokines, n o t a m m e n t I'IL3, peut faciliter l'initiation de l'activation cellulaire d6pendante d'IgE [20].
Analyse des basophiles sensibilis6s 11 existe 104 ~[ 106 FceRI par cellule et le processus de d6granulation fair suite ~ l'agr6gation d'une faible fraction de ces r6cepteurs (1 ~ 15 %). La pr6sence d'IgE de surface peut ~tre appr6hend6e apr6s t'addition, h diff6rentes concentrations, d'allergbnes sp6cifiques. Cet 6tat de sensibilisation sera objectiv6 p a r des analyses c y t o c h i m i q u e s (perte de la r6action m 6 t a c h r o m a t i q u e dans le TDBH ou perte d'affinit6 tinctoriale du basophile activ6 vis-a-vis du bleu alcian dans le TAB) ou par le dosage de m6diateurs (histamine, LTC4...) dans le surnageant des basophiles activ6s in vitro. Le faible nombre de basophiles circulants a n6cessit6 la raise en oeuvre de diff6rents protocoles favorisant l'enrichissement des pr6parations cellulaires en basophiles (s6dimentation en milieu dextran, centrifugation sur gradient de Percoll, de Ficoll ; Techniques de s61ection n6gative ou positive sur billes magn6tiques, cytom4trie avec tri cellulaire) [12]. Ces m6thodes pr6paratives peuvent alt6rer les propri6t6s des cellules avant la r6alisation des diff6rents tests d'activation in vitro (test d'histaminolib6ration ou THL, test de lib6ration des leucotri6nes ou TLL...). L'interpr6tation des r6sultats des THL est souvent d61icate. I1 existe d'importantes variations interindividuelles chez les sujets atopiques et chez les sujets t6moins. Des discordances ont 6t6 observ6es entre le THL, les donn6es de la clinique, les tests cutan6s ou les autres tests tels que le TDBH ou le TAB. I1 a 6t6 d6montr6 que l'activation du basophite ne s'accompagne pas toujours d'une histaminolib6ration d6tectable [8]. L'IL3 favorise l'agr6gation h o m o t y p i q u e des basophiles sans induire une d6granulation. N6anmoins, la pr6incubation des basophiles avec de I'IL3 augmente la sensibilit6 du THL [20]. Les dosages des leucotrihnes, produits n6oform6s, seraient plus sp4cifiques que ceux de l'histamine, m6diateur pr6form6 qui peut etre lib6r6 lors de processus de Rev. fr. Allergol.. 1996, 36, 8.
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degranulation non specifique. Les TLL seraient 6galement plus sensibles en appreciant des mecanismes d'activation dependants ou non dependants de l'IgE. Differents protocoles de TLL ont et6 proposes avec, pour certains, une preincubation de basophiles avec I'IL3. Des donnees recentes ont montr6 que la liberation de mediateurs provoquee par l'agregation des FceRI peut 6tre modulee par la raise en jeu de cosignaux induits par le FcTR (CD32) presents sur les basophiles humains. I1 a ete demontr6 par ailleurs que l'agregation des ~1 integrines par des anticorps m o n o c l o n a u x ou par la fibronectine facilite l'histaminoliberation et module l'activation IgE dependante des basophiles issus de sujets asthmatiques. Ces donnees nouvelles, tres instructives, p e r m e t t e n t d'envisager sous un j o u r n o u v e a u la notion d'etat de sensibilisation des basophiles humains.
du rele pathoghne potentiel du polynucleaire eosinophile (PNE) et ceci grgtce & une meilleure definition moleculaire de ses marqueurs de surface (fig. 2) et de ses composants cytoplasmiques preformes ou n e o f o r m e s (proteines cationiques, mediateurs lipidiques, enzymes, cytokines, chemokines).
Num6ration et analyse morphologique I1 existe une trhs grande variete de situations cliniques associees h une HE sanguine (> 5 x 109/L) et/ou tissulaire [14]. La cause de I'HE peut 6tre rapidement identifiee gr&ce aux donnees conjuguees de l'anamnese, de l'examen clinique et des premiers bilans paracliniques (NFS, bilan inflammatoire, allergologique,parasitologique, radiographie de thorax, 41ectrocardiogramme...). La localisation elective de certaines manifestations pathologiques peut aussi avoir une grande valeur indicative (poumon, peau, signes hepato-digestifs, vascularites, hemopathie...). Lorsque les enquStes repetees restent negatives devant une HE massive (> 1,5 x 109/L) et persistante, le diagnostic rare de syndrome d'hypereosinophilie essentielle (SHE) peut alors ~tre evoque. C'est l'evaluation des criteres d'activite de la maladie, en relation avec le
LES IgOSINOPHILES Longtemps considere c o m m e un simple marqueur biologique, ~ grande valeur d'orientation diagnostique, l'hypereosinophilie (HE) sanguine et/ou tissulaire a aussi une valeur pronostique. Cette nouvelle appreciation est lice ~ la decouverte
ICAM-1 ICAM-3 ~
..........
LFA
(0o4 )/
o/
LA4 CD23 ~
"/"
- 3 / ~
74t Lie
/
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RII (CD32)
\ GGR: R
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fmlp-R
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Fig. 2. - Marqueurs de surface de l'6osinophile. En italique : Marqueurs non detect6s ou non testes sur l'6osinophile. En caractere gras et sou]ign6 : Marqueurs d'activation. Rev. fr. Allergol., 1996, 36, 8.
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----
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LEUCOSlALINE
CR3 LFA-1 VLA6 ~ . . . . *L~-
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statut ph6notypique et fonctionnel du PNE qui guidera la conduite th6rapeutique. Dans l'allergie, le contexte est habituellement tr6s 6vocateur, I'HE est souvent mod6r6e (< 1 x 109/L) voire absente. Des corr61ations ont 6t6 6tablies entre des modifications des taux de PNE sanguins et l'6volution de certaines formes cliniques d'asthme. Outre la num6ration des PNE, des analyses m o r p h o l o g i q u e s ont mis en 6vidence des modifications cytoplasmiques (hypogranulation...) ou nucl6aire (noyau plurilob6 et non plus bilob6) sur des PNE sanguins issus s u r t o u t de patients pr4sentant une H E m a j e u r e (h6mopathies, SHE...). L'HE sanguine n'est pas toujours un reflet fid61e de la r6elle implication du PNE dans certains tissus. Des analyses locales (comptage et analyse morphologique) se sont d6velopp6es sur le LBA (asthme) sur les produits de s6cr6tion nasale (rhinite), sur les larmes (conjonctivites) ou lors de manifestations cutan6es (dermatite atopique, urticaire) ou digestives. L'amplitude des variations du n o m b r e des PNE circulants est souvent faible dans l'allergie avec des facteurs intercurrents (exemple de la disparition de I'HE sanguine lors d'infections bact6riennes). Les analyses morphologiques sont subjectives et souvent d61icates (difficile appr6ciation des 6osinophiles d6granul6s ; techniques sp6cifiques de fixation pour la visualisation des corps lipidiques dont le nombre augmente dans les 6osinophiles activ6s). Enfin, diff6rents travaux ont d6montr6 qu'il n'existe pas de relation stricte entre le niveau de I'HE et l'6tat fonctionnel du PNE. Pour mieux objectiver cet 6tat fonctionnel des m6thodes d'analyses compl6mentaires ont donc 6t6 propos6es.
Densit6 des 6osinophiles Diff4rents laboratoires ont 6tabli les bases de l'existence d'une h6t6rog6n6it6 des PNE sur l'analyse de la densit6 cellulaire (s6dimentation sur gradient de Percoll, de metrizamide...) avec l'identification de PNE normodenses, retrouv6s chez les sujets t6moins ou chez les patients pr6sentant une HE mod6r6e et de PNE hypodenses surtout pr6sents dans la circulation lorsque I'HE est tr6s 61ev6e ou dans les tissus [13]. La pertinence de ces observations a 6t6 confirm6e p a r des analyses fonctionnelles s61ectives qui ont mis l'accent sur le caract6re activ6 des PNE hypodenses. Ce caract6re d'hypodensit6 d'origine multiple (hypogranulation ou diminution de taille des granules sp6cifiques, h o m b r e accru de corps lipidiques...), n'est pourtant qu'un t6moin d'activation cellulaire qui ne peut, h lui seul. d6finir un statut fonctionnel. Les PNE activ6s sont des cellules capables d'exercer des effets b6n4fiques (lyse de cibles tumorales ou parasitaires) mais aussi des effets n6fastes (cardiopathies, bronchopneumopathies, neuropathies...). La s6quence des 6v6nements
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mol6culaires qui conf6rent au PNE un spectre d'activit6s protectrices ou d616t6res doit encore 4tre pr6cis6e. L'expression de certaines de ces fonctions est tr6s d6pendante de la mise en jeu de mol6cules ou de r6cepteurs de surface qui transduisent, selon un certain profil, les signaux d'activation. Dans cette perspective l'analyse du ph6notype membranaire peut apporter d'utiles informations.
Ph6notype membranaire des PNE Le PNE exprime des r6cepteurs pour des immunoglobulines, des fractions du compl4ment, des cytokines, des chemokines, des m6diateurs lipidiques (fig. 2). L'identification de mol6cules d'adh6sion a permis de mieux appr6hender certains contacts, avec la cellule endoth41iale ou la matrice extracellulaire, qui r6gulent les processus de migration, de diap6d6se et de domiciliation. L'importance de ces interactions a 6t6 d4montr6e dans un mod61e exp6rimental d'asthme off le blocage induit p a r un anticorps m o n o c l o n a l antiICAM-1 entraine une diminution significative de l'infiltrat tissulaire en PNE et une att6nuation de l'hyperr6activit6 bronchique. A ce jour, il n'existe pas de marqueurs de surface discriminants permettant d'identifier le PNE en cytom6trie de flux avec un anticorps monoclonal (CD). En revanche, certains marqueurs, absents du neutrophile (VLA4) expliquent la migration s61ective des PNE (et des basophiles) dans certains foyers inflammatoires et permettent d'envisager des purifications s61ectives des PNE (cas du CD9). Des marqueurs de surface ont une densit6 d'expression accrue ou ne s'expriment que sur des sous-populations de PNE ou des PNE activ6s (cas du CD25, CD23, FceRI, CD4, HLA-DR, CD 16, ICAM- 1, CD 11 b). Des travaux r6cents mettent l'accent sur l'int6r~t du marqueur CD69 pour identifier des PNE activ6s par des cytokines, n o t a m m e n t dans l'asthme [5]. La r6elle signification de ces marqueurs de surface en pathologie doit encore 6tre valid6e par des 6tudes cliniques. L'6tude de r6cepteurs solubles de cytokines, n o t a m m e n t le CD25 soluble, a 6t6 r6alis6e dans le s6rum de patients allergiques ou au cours de SHE. Des taux s6riques tr6s 61ev6s ont 6t6 retrouv6s associ6s h des formes s6v6res de SHE. Des travaux r6cents indiquent que le dosage de la forme soluble d'ICAM- 1 dans le sang ou les liquides biologiques pourrait avoir une valeur indicative pour le suivi de patients allergiques [6].
Les m6diateurs Le PNE exerce des fonctions de cellule inflammatoire (production de m6diateurs lipidiques tels que LTC4, PAF-acether, 5 HETE, PGE1, PGE2, t h r o m b o x a n e B2 ; synthbse de chemokines : Rev. fr. Allergol.. 1996.36. 8.
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/MASTOCYTES, BASOPt-I1LES, [~OS1NOPH1LES •
MIP- 1a, RANTES), de cellule immunocomp6tente (cytokines n6osvnth6tisdes ou stock6es : IL 1a, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, GM-CSF, TGF(z, TGF[3, TNF~), de cellule effectrice cytotoxique (g6n6ration de dOriv6s r6actifs de l'oxyg6ne 6tudi6s par chimioluminescence sur PNE purifi6s, s6cr6tion de prot6ines basiques). L'acc6s plus facile ~ certains i m m u n o d o s a g e s explique le plus grand n o m b r e d'6tudes cliniques r6alis6es avec les prot6ines basiques du PNE. Ces prot6ines cationiques sont prdsentes dans les granules sp6cifiques du PNE ; dans l'inclusion cristalline centrale dense aux dlectrons (major basic protein ou MBP) ou dans la matrice p6riph6rique plus claire (neurotoxine ou EDN/EPX, peroxydase ou EPO, prot6ine cationique de l'6osinophile ou ECP). EDN/EPX et ECP pr~sentent une activit6 catalytique ribonucl6asique. Des taux 61ev6s de MBP ont 6t6 retrouv6s dans les liquides biologiques (s6rum et s u r t o u t LBA dans l'asthme s6v6re) avec des valeurs compatibles avec l'expression d'une activit6 cytotoxique in vitro vis-5-vis de diff6rentes cibles cellulaires. Cette cytotoxicit6 peut ~tre neutralis6e par l'hdparine (interactions anions-cations). L'activit6 p6roxydasique peut aussi ~tre 6valu6e, n o t a m m e n t par chimioluminescence dans des tests de stimulation in vitro de PNE purifi6s [16]. C'est surtout les i m m u n o d o sages de I'ECP, dans le s6rum et les liquides biologiques (seuil de sensibilit6 2pl/L) qui se sont d6velopp6s. Des taux 61evds d'ECP ont dt6 observ6s dans le LBA et dans le s6rum dans diffdrentes formes cliniques d'asthme. Des avis contradictoires ont 6t6 formul6s sur la valeur indicative de I'ECP, c o m m e marqueur d'activit6 de la maladie, n o t a m m e n t en comparaison avec certaines donn6es fournies par les tests d'exploration fonctionnelle respiratoire [1, 2]. Les conditions de recueil des 6chantillons doivent ~tre r i g o u r e u s e m e n t contr616es. Ainsi, pour la pr6paration du s6rum, le temps de d6cantation du sang et les conditions de temp6rature doivent 6tre pris en compte pour juger de l'incidence 6ventuelle de la lib6ration non sp6cifique d'ECP issue du culot cellulaire [15]. Le dosage de I'ECP s6rique serait plus utile que l'6valuation de l'6osinophilie sanguine pour surveiller l'6volution de la maladie a s t h m a t i q u e sous traitement. I1 n'existe pas toujours de relation directe entre le taux d'ECP s6rique et la num6ration des PNE circulants. Cette discordance peut s'expliquer par l'existence d'une s6cr6tion d'ECP restreinte ~t une
Rev. fr. Allergol., 1996, 36, 8.
sous-population de PNE (indice d'6osinophiles activ6s : n o m b r e de PNE/taux d'ECP) [2]. Des travaux r6cents ont mis en 6vidence l'existence d'une lib6ration s61ective de prot6ines basiques soit en fonction du contexte clinique, soit en fonction des conditions de stimulation membranaire du PNE in vitro. Ces donn6es soulignent l'int6r6t du dosage, en parall6le, des autres m6diateurs (EPO, MBP, EDN) p o u r mieux appr6hender le profil d'activation du PNE. L'EDN pr6sente l'int6rOt de pouvoir 6tre dos6e dans les urines [9].
CONCLUSION ET PERSPECTIVES L'ensemble des marqueurs cellulaires analys6s sont le plus souvent le t6moin de la raise en jeu de m6canismes effecteurs de la r6action allergique (tryptase mastocytaire, histamine, ECP...). Ils sont utiles pour 6valuer le degr6 de gravit6 de la r6action allergique ou pour juger de l'efficacit6 d'un traitement. Pour ma~triser la s6quence des 6v6nements pathog6nes et pouvoir ainsi les pr6venir ; il est indispensable de pouvoir disposer de nouveaux marqueurs surtout impliqu6s dans la gen6se et la r6gulation de ces r6actions. Dans cette perspective, l'analyse des cytokines apparait d6terminante. Elles favorisent, en effet, l'entretien et l'arnplification de la r6action allergique en contr6lant la production locale d'anticorps IgE, en initiant le recruternent, la domiciliation et l'activation de cellules impliqu6es dans la cascade d'6v6nements d616tbres. Des m6thodes d'analyses appliqudes au site mSme de la r6action allergique (techniques d'immunomarquage, d'hybridation in situ) ont d6montr6 que les mastocytes, les basophiles et les 6osinophiles produisent ces m6diateurs dont le profil de synthOse se modifie apr~s tests de provocation allerg6nique ou au d6cours de cures de d6sensibilisation. Nous ne disposons pas, ~a ce jour, de m6thode simple et fiable d'analyse de ces profils de synth6se. Les immunodosages propos6s p o u r l'6tude des liquides biologiques pr6sentent de nombreux inconv6nients (m6connaissance de la cellule productrice, liaison possible de la cytokine test6e ~ un r6cepteur soluble ou ~ un autre facteur plasmatique, relation avec l'activit6 biologique...). Devant ces difficult6s, le d6veloppement de nouvelles approches telles que la RT-PCR quantitative offrent des perspectives trbs int6ressantes.
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L. P R I N
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nun
Rev, fr. Allergol., 1996. 36.8.
ET D'IMMUNOLOGIE CLINIQUE
Mastocytes, basophiles, 6osinophiles Analyse des marqueurs biologiques L. P R I N
RI~SUMI~
SUMMARY
L'accbs aux immunodosages a permis le ddveloppement d'anaIyses de nombreux m6diateurs de la rdaction allergique issus de mastocytes, des basophiles ou des dosinophiles ; analyses r6alis6es dans le sang, dans les liquides biologiques ou dans [es surnageants de cellules activdes. Certains de ces m6diateurs ne permettent pas de ddfinir l'implication prdcise d'un type cellulaire (histamine, LTC4, cytokines...), d'autres sont plus spdcifiques (tryptase rnastocytaire, prot6ine cationique de l'6osinophile ou ECP...). Ces explorations prennent surtout en compte la phase effectrice de la r6action d'hypersensibilit6 d6pendante d'IgE. Elles permettent d'identifier des marqueurs potentiels d'activit6 de la maladie allergique et peuvent ainsi 6tre utiles pour juger de l'efficacit6 d'un traitement. D'autres techniques, en pleine 6volution, caractdrisent le phdnotype membranaire (exemple de l'analyse des marqueurs d'activation et/ou de l'expression des moldcules d'adh6sion par cytomdtrie de flux) ou l'6tat fonctionnel de la cellule (exemple du profil de synthbse de cytokines 6valu6 par immunomarquage, hybridation in situ, RT-PCR quantitative...). Ces nouvefles approches devraient permettre de mieux appr6hender, pour mieux les maitriser, les niveaux d'activation cellulaire et la s6quence des 6v6nements impliqu6s dans la gen6se, l'entretien et l'amplification de la rdaction allergique.
Mast cells, basophils, eosinophils. Analysis of laboratory markers. - Access to immunoassays has allowed the development of analyses of many mediators of the allergic reaction derived from mast cells, basophils or eosinophils; analyses performed in blood, biological fluids or activated cell supernatants. Some of these mediators cannot indicate the precise implication of a given cell type (histamine, LTC4, cytokines, etc.), while others are more specific (mast cell tryptase, eosinophil cationic protein (ECP), etc.). These investigations essentially explore the effector phase of the IgG-dependent hypersertsitivity reaction. They allow identification of potential activity markers of allergic disease and can therefore be useful to assess the efficacy of treatment. Other techniques, currently under development, characterize the membrane phenotype (e.g. analysis of activation markers and/or expression of adhesion molecules by flow cytometry) or the functional state of the cell (e.g. cytokine synthesis profile evaluated by immunolabelling,in situ hybridization, quantitative RT-PCR, etc.). These new approaches appear to provide a better understanding and control of the levels of cell activation and the sequence of events involved in the pathogenesis, maintenance and amplification of the allergic reaction.
INTRODUCTION Les p r o g r b s e n m a t i b r e d e r e c h e r c h e a l l e r g o l o g i q u e o n t 6t6 ~t l ' o r i g i n e d u d 6 v e l o p p e m e n t r 6 c e n t de n o m b r e u s e s m 6 t h o d e s d ' e x p l o r a t i o n s . D e v a n t ce f o i s o n n e m e n t , il i m p o r t e d e f a i r e la p a r t e n t r e les e x a m e n s q u i a p p o r t e n t u n e i n f o r m a t i o n r 6 e l l e m e n t u t i l e p o u r le d i a g n o s t i c o u la p r i s e d e d6ci-
Unit6 d'Immunologie, CHU Amiens, Place Victor-Pauchet 80054 AMIENSCedex. Tirds Rpart : Dr L. Prin.
s i o n t h 6 r a p e u t i q u e et les e x a m e n s , e n c o u r s d e v a l i d a t i o n , d o n t l ' i n d i c a t i o n d o i t e n c o r e 6tre rdserv6e a u x p r o t o c o l e s d e r e c h e r c h e c l i n i q u e . L a valid a t i o n d ' u n e x a m e n r e p o s e g la fois s u r d e s crit6res techniques (contr61e de q u a l i t 6 des m6thodes d'analyse, signification du param6tre b i o l o g i q u e ) et s u r u n e m i s e / ~ l " 6 p r e u v e p a r d e s 6tudes cliniques rationnelles.
PRIN L. - Mastocytes, basophiles, eosinophiles, analyse des marqueurs biologiques. Rev. fr. Allergol., 1996, 36 (8), 889-896.
© Expansion Scientifique Frangaise, 1996
890
• L. PR1N/
Pour la pratique clinique, les explorations qui t6moignent d'une activation du mastocyte, du basophile ou de l'6osinophile, ne se justifient que si l'enqu4te allergologique (anamn6se, tests cutan6s, recherche des anticorps IgE sp6cifiques d'allerg6nes) a 6t6 d6faillante (cas 6ventuel des allergies m6dicamenteuses). Ces explorations compl6mentaires sont n6anmoins indispensables p o u r mieux appr6hender le r61e de ces cellules dans la r6ponse allergique. Elles peuvent participer ~ toutes les 6tapes de la r6action d'hypersensibilit6 (pr6sentation antig6nique, r6gulation de la synth6se locale des anticorps de classe IgE, g6n4ration de m6diateurs pro-inflammatoires...). Les m6canismes mol6culaires d'activation membranaire sont surtout bien d o c u m e n t 6 s p o u r les r6cepteurs de forte affinit6 pour la portion Fc des IgE (FcCRI) ; r6cepteurs identifi6s depuis longtemps sur le basophile et le mastocyte et plus r6cemment sur l'6osinophile humain [ 16]. L'agr6gation de ces r6cepteurs initie une cascade d'6v6nements intracellulaires qui vont modifier le ph6notype membranaire, favoriser l'exocytose des granules ou la s6cr6tion de leurs composants, g6n6rer la synth6se de m6diateurs lipidiques ou prot6iques., Ces cellules ~ont aussi sensibles 1 action de nombreux autres stimuli (chemokines, cytokines, anaphylatoxines, neuropeptides...). Nous tenterons de pr6ciser la valeur et les limites des tests utilis6s p o u r appr6cier ces 6tats d'activation.
LES MASTOCYTES Les mastocytes sont issus de cellules souches h6matopoi6tiques. Diff6rents travaux r6cents ont soulign6 l'importance du facteur de croissance de cellules souches (Stem Cell Factor ou c-kit ligand) p o u r promouvoir l'engagement vers la diff4renciation mastocytaire. I1 existe des pr6curseurs dans le sang mais leur diff6renciation s'ach6ve dans les tissus. Le r61e de l'environnement tissulaire (stroma, fibroblastes) apparait d6terminant dans cette 6tape finale de maturation. On observe des diff6rences morphologiques et fonctionnelles en relation avec la localisation tissulaire de ces cellules (variabilit6 dans l'expression de r6cepteurs m e m b r a n a i r e s et dans le c o n t e n u en prot6ases neutres cytoplasmiques).
Ph6notype membranaire Le r6cepteur pour le Stem Cell Factor (R-SCF ou CD 117) peut @tre identifi6 sur les pr6curseurs sanguins (Cellules CD34 +, CD 117*) mais l'analyse en cytom6trie de flux de ces ceIlules circulantes
n'a pas encore f a r l'objet d'6tudes document6es. Le m a r q u e u r CD 117, fortement exprim6 sur les mastocytes tissulaires, parait 6tre tr6s sp6cifique. I1 peut p e r m e t t r e le d6veloppement ult6rieur d'6tudes histochimiques ou la mise en oeuvre de techniques de purification s61ective (19). Le m a s t o c y t e partage certains m a r q u e u r s de surface avec le basophile (fig. 1), n o t a m m e n t FcCRI mais aussi CD 14 (r6cepteur du LPS), CD54 (r4cepteur de rhinovirus), CD46 (r6cepteur du virus de la rougeole). Les mastocytes sont aussi retrouv6s dans des sites inflammatoires. Ils sont sensibles g l'effet de chemokines ou de cytokines et engagent des contacts avec la cellule endoth6liale (cellules localis6es g proximit6 de petits vaisseaux ou de veinules post-capillaires ; pr6sence dans les zones de surface en contact avec l'environnement) et surtout avec la matrice extra-cellulaire (contacts VLA4-VCAM 1, VLA-5 - Laminine, [~3 integrine-vitronectine). L'identification des mastocytes (m6tachromasie avec les colorants basiques) peut 4tre facilit6e, au niveau tissulaire, en utilisant des techniques d'immunomarquage, avec l'emploi, n o t a m m e n t d'anticorps monoclonaux anti-tryptase. Les sous-populations de mastocytes ont ainsi pu 4tre caract6ris6es en fonction de leur contenu en prot6ases [3].
M6diateurs m a s t o c y t a i r e s Le mastocyte a la capacit6 de lib6rer de nombreux m6diateurs, n o t a m m e n t l'histamine (3pg/cellule) mais aussi des prot6oglycanes (h6parine, chondroYtine sulfate E...), des m6diateurs lipidiques (LTC4, PGD2, PAF-acether...), des cytokines (IL3, IL4, IL5, GM-CSF, IL6, [L8, IL13,TNFc~...) et plus sp6cifiquement des prot6ases neutres (tryptase, chymase, carboxypeptidase, 61astase...). Nous ne disposons pas de m6thode sensible d'analyse pour l'6tude des prot6oglycanes. Cytokines, LTC4, PAF-acether ne sont pas des marqueurs sp4cifiques de l'activation mastocytaire. Le PGD2 est un m6diateur lib6r6 par le mastocvte activ6, par les plaquettes ou les macrophages ~v6olaires. Diff6rentes m6thodes de dosage de la PGD2 ont 6t4 appliqu6es, notamment pour l'analyse d'6chantillons urinaires ou l'6tude de LBA avant et apr6s test de provocation allerg6nique. L'histamine est un m a r q u e u r non sp6cifique lib6r6 par le m a s t o c y t e mais aussi par le basophile activ6. D iff6rents 416ments restrictifs limitent l'int6rOt de son dosage dans la circulation (demi-vie courte, rapide excr6tion urinaire, voles m6taboliques parfois alt6r6es, incidence possible d'aliments ing6r6s, contraintes de pr616vements...). Diff6rentes m6thodes d'analyse ont 6t6 propos6es : des m6thodes fluorim6triques ou des m6thodes plus sensibles et plus sp6cifiques (immunodosages avec m a r q u e u r radioactif) [ 10]. Rev. fr. Allergol.. 1996.36. 8.
/MASTOCYTES, BASOPHILES, E,OSINOPHILES •
891
CD45
VLA-4 VLA-5
RII (CD32) "~ Cm (CD35)
LFA-1 CR3
-
LFA-3 ICAM-1 ICAM-2
CR3(Cl 1b/CD18)
-
"X.
PECA
~
/
,
"~
CR4(CD11clCD18) C5aR(CD88) MCP(CD46) DAF(CD55) I MACIF(CD59) IL1-RII
ICAM-3
r
"
IL2-Rot(CD25)
LEUCOSIALINE (CD43) Pgp-1
/ L IL4-R IL5-R 8-R
(c~44)
.ff INF oCI3-R INF 7-R
SELECTINE (CD62L)
GM-CSF-R MCAF-R CD15 RANTES-R CD40
CD14
FIGURE 1
Fig. 1. - M a r q u e u r s de s u r f a c e d u basophile. E n italique : M a r q u e u r s n o n ddtect6s ou n o n testds s u r le m a s t o c y t e . E n c a r a c t b r e g r a s et soulign6 : M a r q u e u r s d ' a c t i v a t i o n
Le dosage des m6tabolites de l'histamine dans les urines (mdthylhistamine : i m m u n o d o s a g e comp6titif avec m a r q u e u r radioactif) offre l'avantage de permettre le r6alisation d'explorations h distance de l'accident allergique, sous r6serve de conditions tr6s strictes respect6es pour le recueil des 6chantillons. La t r y p t a s e est, tt ce jour, le m a r q u e u r le plus sp6cifique de l'activation mastocytaire. Cette sp6cificit6 est li6e ga la pr6sence 61ective, h concentration 61ev6e, de cette enzyme dans les granules s6cr6toires du mastocyte (10 &35 pg / cellule ; pour le basophile : < 0,04 pg/cellule ; taux ind6tectable pour les autres cellules sanguines). I1 s'agit d'une endoprot6ase neutre dont la lib6ration, dans le milieu extracellulaire, accompagne celle de l'histamine lots du processus d'exocytose. Elle est lib6r6e sous forme active (t6trambre complex6 aux prot6oglycanes) r a p i d e m e n t dissoci6e en une forme m o n o m 6 r i q u e inactive. Diff6rentes m6thodes de dosages ont 6t6 propos6es : m6thodes fluorim6triques, mesure de l'activit6 enzymatique, i m m u n o d o s a g e s non comp6titifs de type sandwich avec des marqueurs radioactifs ou enzymatiques. Les immunodosages pr6sentent l'avantage de doser la forme active et inactive de la tryptase (marqueur plus ,< stable ,, que l'histamine qui a Rev. fr. Allergol., 1996, 36, 8.
une demi-vie de 1 tt 3 minutes dans le sang). Ces m6thodes permettent de doser la tryptase dans la circulation (s6rum ou plasma ; valeurs normales < 5 ng/ml). Des taux s6riques tr6s 61ev6s ont 6t6 observ6s dans les 15 &30 minutes qui suivent une rdaction anaphylactique s6v6re. Darts ces circonstances, ce m a r q u e u r 6tait encore d6tectable plus de 16 heures a w e s l'induction de la r6ponse allergique. Certaines manifestations localis6es s'accompagnent d'une expression tardive du marqueur s6rique ou plasmatique (60 & 120 minutes apr6s piqfire d'hymenopt6re par exemple) ou n'induisent aucune pr6sence d6tectable de tryptase dans la circulation. Ces observations ont justifi6 le d6veloppement des pratiques de dosage dans le LBA avant et apr6s tests de provocation chez l'allergique. Des dosages de tryptase ont 6galement 6t6 effectu6s dans les produits de s6cr6tion nasale dans les rhinites allergiques, dans les larmes ou lots de tests cutan6s. Ces 6tudes ont surtout 6t6 r6alis6es dans le cadre des r6actions allergiques [17]. L'6valuation des diff6rentes formes mol6culaires (alpha ou beta) de la tryptase, reconnues par diff6rents anticorps monoclonaux, pourrait apporter d'utiles informations sur l'activation mastocytaire, n o t a m m e n t dans le cadre des mastocytoses systdmiques [ 18].
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" L. PR1N/
LES BASOPHILES Cellule d'origine medullaire, le basophile, p r & sent en quantit4 faible dans le sang (0,5/a 1 % des leucocytes) est facilement identifiable (m6tachromasie avec les colorants basiques). Sa pr6sence dans les tissus t6moigne du d6veloppement d'un processus pathologique (phase tardive de l'hypersensibilit6 imm6diate, phase pr6coce de l'hypersensibilit6 de type retard6). Le basophile produit de multiples mddiateurs susceptibles d'etre impliqu6s dans diff6rentes 6tapes des r6actions d'hypersensibilit6. I1 synth6tise : l'histamine (concentration moindre que dans le mastocyte), des prot6oglycanes (chondroitine sulfate A), des m6diateurs lipidiques, s u r t o u t le LTC4 et diff6rentes cytokines, n o t a m m e n t l'IL4 mais aussi l'IL13 lib4r4e plus tardivement apr6s une stimulation ddpendante de l'IgE.
Num6ration sanguine En dehors des grandes hyperbasophilies sanguines, observdes dans les leuc6mies my61oides chroniques ou dans d'autres s y n d r o m e s my61oprolif6ratifs, les variations souvent faibles du n o m b r e de basophiles circulants n'ont pas de valeur indicative significative.
Ph6notype membranaire L'analyse par cytofluorom6trie offre l'avantage de permettre l'6tude d'une grand nombre de basophiles sanguins dans un d61ai tr6s court. Certains parambtres (taille de la cellule, m a r q u a g e p a r l'acridine orange des granules) pr6sentent des modifications identifiables en cytofluorom6trie apr6s activation des basophiles [ 11 ]. Le basophile exprime ~ sa surface de n o m b r e u x m a r q u e u r s membranaires ou CD identifids par des anticorps monoclonaux (fig. 1) certains de ces marqueurs seraient sp6cifiques [7] et utiles pour des purifications s6tectives (CDwl7), d'autres ont une densit6 d'expression accrue (CD45) ou ne s'expriment la m e m b r a n e (CD63) que lorsque le basophile est activ6 [4, 8, 19]. La co-expression d'IgE de surface est un bon crit6re d'identification du basophile sanguin, en raison de la liaison stable qu'engage une mol6cule d'IgE monom6rique avec son r6cepteur de forte affinit6 FceRI. L'utilisation d'anticorps anti IgE marqu4s peut entrainer une activation in vitro des basophiles de sujets allergiques ou de sujets t4moins. Des anticorps monoclonaux dirig4s contre la chatne alpha de FceRI peuvent aussi etre utilis6s. I1 existe des sous-populations d'6osinophiles sanguins qui sont aussi susceptibles d'exprimer des IgE de surface et/ou
FceRI [16]. Des 6tudes sont en cours p o u r pr6ciser la valeur et la sensibilit6 de ces explorations par rapport aux analyses 6valuant un 6tat de sensibilisation des basophiles circulants. Lots d'un processus inflammatoire ou d'une r6action d'hypersensibilitG le basophile sanguin pr6-activ6 (~ primed ,, leucocyte) gagne les tissus. I1 exprime en effet des mol4cules d'adh4sion telles que les [31 et [32 int6grines (fig. 1) qui favorisent les interactions avec la cellule endoth61iale (contacts VLA-4 - VCAM-1 ; LFA-1 - ICAM-1 ou ICAM-2). Cet 6tat de pr6-activation li6 h Faction de chemokines ou de cytokines, n o t a m m e n t I'IL3, peut faciliter l'initiation de l'activation cellulaire d6pendante d'IgE [20].
Analyse des basophiles sensibilis6s 11 existe 104 ~[ 106 FceRI par cellule et le processus de d6granulation fair suite ~ l'agr6gation d'une faible fraction de ces r6cepteurs (1 ~ 15 %). La pr6sence d'IgE de surface peut ~tre appr6hend6e apr6s t'addition, h diff6rentes concentrations, d'allergbnes sp6cifiques. Cet 6tat de sensibilisation sera objectiv6 p a r des analyses c y t o c h i m i q u e s (perte de la r6action m 6 t a c h r o m a t i q u e dans le TDBH ou perte d'affinit6 tinctoriale du basophile activ6 vis-a-vis du bleu alcian dans le TAB) ou par le dosage de m6diateurs (histamine, LTC4...) dans le surnageant des basophiles activ6s in vitro. Le faible nombre de basophiles circulants a n6cessit6 la raise en oeuvre de diff6rents protocoles favorisant l'enrichissement des pr6parations cellulaires en basophiles (s6dimentation en milieu dextran, centrifugation sur gradient de Percoll, de Ficoll ; Techniques de s61ection n6gative ou positive sur billes magn6tiques, cytom4trie avec tri cellulaire) [12]. Ces m6thodes pr6paratives peuvent alt6rer les propri6t6s des cellules avant la r6alisation des diff6rents tests d'activation in vitro (test d'histaminolib6ration ou THL, test de lib6ration des leucotri6nes ou TLL...). L'interpr6tation des r6sultats des THL est souvent d61icate. I1 existe d'importantes variations interindividuelles chez les sujets atopiques et chez les sujets t6moins. Des discordances ont 6t6 observ6es entre le THL, les donn6es de la clinique, les tests cutan6s ou les autres tests tels que le TDBH ou le TAB. I1 a 6t6 d6montr6 que l'activation du basophite ne s'accompagne pas toujours d'une histaminolib6ration d6tectable [8]. L'IL3 favorise l'agr6gation h o m o t y p i q u e des basophiles sans induire une d6granulation. N6anmoins, la pr6incubation des basophiles avec de I'IL3 augmente la sensibilit6 du THL [20]. Les dosages des leucotrihnes, produits n6oform6s, seraient plus sp4cifiques que ceux de l'histamine, m6diateur pr6form6 qui peut etre lib6r6 lors de processus de Rev. fr. Allergol.. 1996, 36, 8.
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/MASTOCYTES, BASOPHILES, EOSINOPHILES •
degranulation non specifique. Les TLL seraient 6galement plus sensibles en appreciant des mecanismes d'activation dependants ou non dependants de l'IgE. Differents protocoles de TLL ont et6 proposes avec, pour certains, une preincubation de basophiles avec I'IL3. Des donnees recentes ont montr6 que la liberation de mediateurs provoquee par l'agregation des FceRI peut 6tre modulee par la raise en jeu de cosignaux induits par le FcTR (CD32) presents sur les basophiles humains. I1 a ete demontr6 par ailleurs que l'agregation des ~1 integrines par des anticorps m o n o c l o n a u x ou par la fibronectine facilite l'histaminoliberation et module l'activation IgE dependante des basophiles issus de sujets asthmatiques. Ces donnees nouvelles, tres instructives, p e r m e t t e n t d'envisager sous un j o u r n o u v e a u la notion d'etat de sensibilisation des basophiles humains.
du rele pathoghne potentiel du polynucleaire eosinophile (PNE) et ceci grgtce & une meilleure definition moleculaire de ses marqueurs de surface (fig. 2) et de ses composants cytoplasmiques preformes ou n e o f o r m e s (proteines cationiques, mediateurs lipidiques, enzymes, cytokines, chemokines).
Num6ration et analyse morphologique I1 existe une trhs grande variete de situations cliniques associees h une HE sanguine (> 5 x 109/L) et/ou tissulaire [14]. La cause de I'HE peut 6tre rapidement identifiee gr&ce aux donnees conjuguees de l'anamnese, de l'examen clinique et des premiers bilans paracliniques (NFS, bilan inflammatoire, allergologique,parasitologique, radiographie de thorax, 41ectrocardiogramme...). La localisation elective de certaines manifestations pathologiques peut aussi avoir une grande valeur indicative (poumon, peau, signes hepato-digestifs, vascularites, hemopathie...). Lorsque les enquStes repetees restent negatives devant une HE massive (> 1,5 x 109/L) et persistante, le diagnostic rare de syndrome d'hypereosinophilie essentielle (SHE) peut alors ~tre evoque. C'est l'evaluation des criteres d'activite de la maladie, en relation avec le
LES IgOSINOPHILES Longtemps considere c o m m e un simple marqueur biologique, ~ grande valeur d'orientation diagnostique, l'hypereosinophilie (HE) sanguine et/ou tissulaire a aussi une valeur pronostique. Cette nouvelle appreciation est lice ~ la decouverte
ICAM-1 ICAM-3 ~
..........
LFA
(0o4 )/
o/
LA4 CD23 ~
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Fig. 2. - Marqueurs de surface de l'6osinophile. En italique : Marqueurs non detect6s ou non testes sur l'6osinophile. En caractere gras et sou]ign6 : Marqueurs d'activation. Rev. fr. Allergol., 1996, 36, 8.
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I
----
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PSGL-I~
LEUCOSlALINE
CR3 LFA-1 VLA6 ~ . . . . *L~-
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t:
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statut ph6notypique et fonctionnel du PNE qui guidera la conduite th6rapeutique. Dans l'allergie, le contexte est habituellement tr6s 6vocateur, I'HE est souvent mod6r6e (< 1 x 109/L) voire absente. Des corr61ations ont 6t6 6tablies entre des modifications des taux de PNE sanguins et l'6volution de certaines formes cliniques d'asthme. Outre la num6ration des PNE, des analyses m o r p h o l o g i q u e s ont mis en 6vidence des modifications cytoplasmiques (hypogranulation...) ou nucl6aire (noyau plurilob6 et non plus bilob6) sur des PNE sanguins issus s u r t o u t de patients pr4sentant une H E m a j e u r e (h6mopathies, SHE...). L'HE sanguine n'est pas toujours un reflet fid61e de la r6elle implication du PNE dans certains tissus. Des analyses locales (comptage et analyse morphologique) se sont d6velopp6es sur le LBA (asthme) sur les produits de s6cr6tion nasale (rhinite), sur les larmes (conjonctivites) ou lors de manifestations cutan6es (dermatite atopique, urticaire) ou digestives. L'amplitude des variations du n o m b r e des PNE circulants est souvent faible dans l'allergie avec des facteurs intercurrents (exemple de la disparition de I'HE sanguine lors d'infections bact6riennes). Les analyses morphologiques sont subjectives et souvent d61icates (difficile appr6ciation des 6osinophiles d6granul6s ; techniques sp6cifiques de fixation pour la visualisation des corps lipidiques dont le nombre augmente dans les 6osinophiles activ6s). Enfin, diff6rents travaux ont d6montr6 qu'il n'existe pas de relation stricte entre le niveau de I'HE et l'6tat fonctionnel du PNE. Pour mieux objectiver cet 6tat fonctionnel des m6thodes d'analyses compl6mentaires ont donc 6t6 propos6es.
Densit6 des 6osinophiles Diff4rents laboratoires ont 6tabli les bases de l'existence d'une h6t6rog6n6it6 des PNE sur l'analyse de la densit6 cellulaire (s6dimentation sur gradient de Percoll, de metrizamide...) avec l'identification de PNE normodenses, retrouv6s chez les sujets t6moins ou chez les patients pr6sentant une HE mod6r6e et de PNE hypodenses surtout pr6sents dans la circulation lorsque I'HE est tr6s 61ev6e ou dans les tissus [13]. La pertinence de ces observations a 6t6 confirm6e p a r des analyses fonctionnelles s61ectives qui ont mis l'accent sur le caract6re activ6 des PNE hypodenses. Ce caract6re d'hypodensit6 d'origine multiple (hypogranulation ou diminution de taille des granules sp6cifiques, h o m b r e accru de corps lipidiques...), n'est pourtant qu'un t6moin d'activation cellulaire qui ne peut, h lui seul. d6finir un statut fonctionnel. Les PNE activ6s sont des cellules capables d'exercer des effets b6n4fiques (lyse de cibles tumorales ou parasitaires) mais aussi des effets n6fastes (cardiopathies, bronchopneumopathies, neuropathies...). La s6quence des 6v6nements
• L. PRIN/
mol6culaires qui conf6rent au PNE un spectre d'activit6s protectrices ou d616t6res doit encore 4tre pr6cis6e. L'expression de certaines de ces fonctions est tr6s d6pendante de la mise en jeu de mol6cules ou de r6cepteurs de surface qui transduisent, selon un certain profil, les signaux d'activation. Dans cette perspective l'analyse du ph6notype membranaire peut apporter d'utiles informations.
Ph6notype membranaire des PNE Le PNE exprime des r6cepteurs pour des immunoglobulines, des fractions du compl4ment, des cytokines, des chemokines, des m6diateurs lipidiques (fig. 2). L'identification de mol6cules d'adh6sion a permis de mieux appr6hender certains contacts, avec la cellule endoth41iale ou la matrice extracellulaire, qui r6gulent les processus de migration, de diap6d6se et de domiciliation. L'importance de ces interactions a 6t6 d4montr6e dans un mod61e exp6rimental d'asthme off le blocage induit p a r un anticorps m o n o c l o n a l antiICAM-1 entraine une diminution significative de l'infiltrat tissulaire en PNE et une att6nuation de l'hyperr6activit6 bronchique. A ce jour, il n'existe pas de marqueurs de surface discriminants permettant d'identifier le PNE en cytom6trie de flux avec un anticorps monoclonal (CD). En revanche, certains marqueurs, absents du neutrophile (VLA4) expliquent la migration s61ective des PNE (et des basophiles) dans certains foyers inflammatoires et permettent d'envisager des purifications s61ectives des PNE (cas du CD9). Des marqueurs de surface ont une densit6 d'expression accrue ou ne s'expriment que sur des sous-populations de PNE ou des PNE activ6s (cas du CD25, CD23, FceRI, CD4, HLA-DR, CD 16, ICAM- 1, CD 11 b). Des travaux r6cents mettent l'accent sur l'int6r~t du marqueur CD69 pour identifier des PNE activ6s par des cytokines, n o t a m m e n t dans l'asthme [5]. La r6elle signification de ces marqueurs de surface en pathologie doit encore 6tre valid6e par des 6tudes cliniques. L'6tude de r6cepteurs solubles de cytokines, n o t a m m e n t le CD25 soluble, a 6t6 r6alis6e dans le s6rum de patients allergiques ou au cours de SHE. Des taux s6riques tr6s 61ev6s ont 6t6 retrouv6s associ6s h des formes s6v6res de SHE. Des travaux r6cents indiquent que le dosage de la forme soluble d'ICAM- 1 dans le sang ou les liquides biologiques pourrait avoir une valeur indicative pour le suivi de patients allergiques [6].
Les m6diateurs Le PNE exerce des fonctions de cellule inflammatoire (production de m6diateurs lipidiques tels que LTC4, PAF-acether, 5 HETE, PGE1, PGE2, t h r o m b o x a n e B2 ; synthbse de chemokines : Rev. fr. Allergol.. 1996.36. 8.
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/MASTOCYTES, BASOPt-I1LES, [~OS1NOPH1LES •
MIP- 1a, RANTES), de cellule immunocomp6tente (cytokines n6osvnth6tisdes ou stock6es : IL 1a, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL8, GM-CSF, TGF(z, TGF[3, TNF~), de cellule effectrice cytotoxique (g6n6ration de dOriv6s r6actifs de l'oxyg6ne 6tudi6s par chimioluminescence sur PNE purifi6s, s6cr6tion de prot6ines basiques). L'acc6s plus facile ~ certains i m m u n o d o s a g e s explique le plus grand n o m b r e d'6tudes cliniques r6alis6es avec les prot6ines basiques du PNE. Ces prot6ines cationiques sont prdsentes dans les granules sp6cifiques du PNE ; dans l'inclusion cristalline centrale dense aux dlectrons (major basic protein ou MBP) ou dans la matrice p6riph6rique plus claire (neurotoxine ou EDN/EPX, peroxydase ou EPO, prot6ine cationique de l'6osinophile ou ECP). EDN/EPX et ECP pr~sentent une activit6 catalytique ribonucl6asique. Des taux 61ev6s de MBP ont 6t6 retrouv6s dans les liquides biologiques (s6rum et s u r t o u t LBA dans l'asthme s6v6re) avec des valeurs compatibles avec l'expression d'une activit6 cytotoxique in vitro vis-5-vis de diff6rentes cibles cellulaires. Cette cytotoxicit6 peut ~tre neutralis6e par l'hdparine (interactions anions-cations). L'activit6 p6roxydasique peut aussi ~tre 6valu6e, n o t a m m e n t par chimioluminescence dans des tests de stimulation in vitro de PNE purifi6s [16]. C'est surtout les i m m u n o d o sages de I'ECP, dans le s6rum et les liquides biologiques (seuil de sensibilit6 2pl/L) qui se sont d6velopp6s. Des taux 61evds d'ECP ont dt6 observ6s dans le LBA et dans le s6rum dans diffdrentes formes cliniques d'asthme. Des avis contradictoires ont 6t6 formul6s sur la valeur indicative de I'ECP, c o m m e marqueur d'activit6 de la maladie, n o t a m m e n t en comparaison avec certaines donn6es fournies par les tests d'exploration fonctionnelle respiratoire [1, 2]. Les conditions de recueil des 6chantillons doivent ~tre r i g o u r e u s e m e n t contr616es. Ainsi, pour la pr6paration du s6rum, le temps de d6cantation du sang et les conditions de temp6rature doivent 6tre pris en compte pour juger de l'incidence 6ventuelle de la lib6ration non sp6cifique d'ECP issue du culot cellulaire [15]. Le dosage de I'ECP s6rique serait plus utile que l'6valuation de l'6osinophilie sanguine pour surveiller l'6volution de la maladie a s t h m a t i q u e sous traitement. I1 n'existe pas toujours de relation directe entre le taux d'ECP s6rique et la num6ration des PNE circulants. Cette discordance peut s'expliquer par l'existence d'une s6cr6tion d'ECP restreinte ~t une
Rev. fr. Allergol., 1996, 36, 8.
sous-population de PNE (indice d'6osinophiles activ6s : n o m b r e de PNE/taux d'ECP) [2]. Des travaux r6cents ont mis en 6vidence l'existence d'une lib6ration s61ective de prot6ines basiques soit en fonction du contexte clinique, soit en fonction des conditions de stimulation membranaire du PNE in vitro. Ces donn6es soulignent l'int6r6t du dosage, en parall6le, des autres m6diateurs (EPO, MBP, EDN) p o u r mieux appr6hender le profil d'activation du PNE. L'EDN pr6sente l'int6rOt de pouvoir 6tre dos6e dans les urines [9].
CONCLUSION ET PERSPECTIVES L'ensemble des marqueurs cellulaires analys6s sont le plus souvent le t6moin de la raise en jeu de m6canismes effecteurs de la r6action allergique (tryptase mastocytaire, histamine, ECP...). Ils sont utiles pour 6valuer le degr6 de gravit6 de la r6action allergique ou pour juger de l'efficacit6 d'un traitement. Pour ma~triser la s6quence des 6v6nements pathog6nes et pouvoir ainsi les pr6venir ; il est indispensable de pouvoir disposer de nouveaux marqueurs surtout impliqu6s dans la gen6se et la r6gulation de ces r6actions. Dans cette perspective, l'analyse des cytokines apparait d6terminante. Elles favorisent, en effet, l'entretien et l'arnplification de la r6action allergique en contr6lant la production locale d'anticorps IgE, en initiant le recruternent, la domiciliation et l'activation de cellules impliqu6es dans la cascade d'6v6nements d616tbres. Des m6thodes d'analyses appliqudes au site mSme de la r6action allergique (techniques d'immunomarquage, d'hybridation in situ) ont d6montr6 que les mastocytes, les basophiles et les 6osinophiles produisent ces m6diateurs dont le profil de synthOse se modifie apr~s tests de provocation allerg6nique ou au d6cours de cures de d6sensibilisation. Nous ne disposons pas, ~a ce jour, de m6thode simple et fiable d'analyse de ces profils de synth6se. Les immunodosages propos6s p o u r l'6tude des liquides biologiques pr6sentent de nombreux inconv6nients (m6connaissance de la cellule productrice, liaison possible de la cytokine test6e ~ un r6cepteur soluble ou ~ un autre facteur plasmatique, relation avec l'activit6 biologique...). Devant ces difficult6s, le d6veloppement de nouvelles approches telles que la RT-PCR quantitative offrent des perspectives trbs int6ressantes.
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L. P R I N
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