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Utilidad de la determinación del activador del plasminógeno tipo tisular citosólico en el adenocarcinoma de pulmón
ORIGINALES Utilidad de la determinación del activador del plasminógeno tipo tisular citosólico en el adenocarcinoma de pulmón
42.482
Álvaro Ruibal, Matilde Isabel Núñez, Mari Carmen del Ríoa, Jesús Rodríguezb y José Feliciano Álvarez de Linerab Laboratorio de Biología Tumoral Fundación Jiménez Díaz. Departamento de Medicina Nuclear. Fundación Jiménez Díaz. Madrid. a Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad Alfonso X el Sabio. Villanueva de la Cañada. Madrid. b Servicio de Cirugía Torácica. Hospital Central de Asturias. Oviedo.
FUNDAMENTO: Estudiar el comportamiento del activador del plasminógeno tipo tisular (t-AP) citosólico en adenocarcinomas pulmonares y sus posibles correlaciones con otros parámetros clinicobiológicos. MATERIAL Y MÉTODO: El grupo de estudio incluyó 59 muestras tisulares de adenocarcinomas pulmonares y 16 de tejido normal de los mismos pacientes. El t-AP fue determinado mediante un enzimoinmunoanálisis (EIA) (Boehringer-Mannheim, Alemania). Se determinaron asimismo las concentraciones citosólicas de CA125, catepsina D, pS2, ácido hialurónico (AH), subunidad beta de la hormona gonadotrófica coriónica, y enolasa específica neuronal, así como las del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), proteína oncogénica erbB2/neu, AH, CD44s, CD44v5 y CD44v6 en las membranas celulares. Otros parámetros considerados fueron los siguientes: estadio clínico, grado histológico, ploidía y fase de síntesis celular (FS). RESULTADOS: En los adenocarcinomas, las concentraciones citosólicas de t-AP oscilaron entre 0,1 y 14,6 ng/mg de proteína (mediana, 1,4) y fueron inferiores, pero sin significación estadística, a las observadas en las muestras de pulmón normal (intervalo, 0,1-18,6; mediana, 2,95 ng/mg de proteína). Asimismo, las concentraciones de t-AP disminuyeron conforme se incrementaba el estadio clínico, siendo superiores en el estadio I frente al II-III (p = 0,080) y frente al III (p = 0,0622). No se constataron diferencias significativas en las concentraciones de la proteasa cuando el grado histológico, ploidía y FS fueron considerados. Los tumores con cifras altas de t-AP (> 3,7 ng/mg de proteína, que representan el percentil 75 de todo el grupo) cursaron con menores concentraciones de CA125 (p = 0,015) y proteína erbB2 (p = 0,087). CONCLUSIONES: Los resultados anteriores apuntan a que el t-AP citosólico se relaciona inversamente con el estadio clínico en el adenocarcinoma de pulmón, sin que podamos precisar su interés como indicador pronóstico. Palabras clave: Activador del plasminógeno tipo tisular (t-AP). Citosol. Adenocarcinomas pulmonares.
Usefulness of cytosolic tissue-type plasminogen activator levels in lung adenocarcinomas BACKGROUND: We aimed at studying the behavior of cytosol tissue-type plasminogen activator (t-PA) levels in lung adenocarcinomas and their correlation with other clinical and biological parameters. MATERIAL AND METHOD: t-PA cytosol levels were determined using EIA (Boehringer Mannheim. Germany) in 59 samples of lung adenocarcinoma and in 16 samples of normal lung tissue from the same patients. Cathepsin D, CA125, pS2, hyaluronic acid (HA), free beta subunit of chorionic gonadotropin hormone and neuron specific enolase (NSE) cytosol concentrations were determined. We also determined the concentrations of HA, erbB2 oncoprotein, epidermal growth factor receptor (EGFR), CD44s, CD44v5 and CD44v6 in cell surfaces. The following parameters were considered: clinical stage, ploidy, cellular S-phase fraction and histological grade. RESULTS: In adenocarcinomas, t-PA cytosol levels ranged from 0.1 to 14.6 ng/mg prot. (median, 1.4). These levels were lower than those in normal lung tissue (r, 0.1-18.6; median, 2.95 ng/mg prot.) but did not reach statistical significance. On the other hand, t-PA concentrations decreased as the clinical stage increased and were higher in stage I than stage II-III (p = 0.080) and stage III (p = 0.0622). No significant differences of t-PA levels were observed when the histological grade, ploidy and S-phase were considered. Adenocarcinomas with high t-PA values (> 3.7 ng/mg prot., representing the 75th percentil of the whole group), had lower CA125 (p = 0.015) and erbB2 oncoprotein (p = 0.087) concentrations. CONCLUSIONS: These results suggest that cytosol t-PA levels are negatively correlated with tumor size in lung adenocarcinomas. However, the usefulness of t-PA as a prognostic factor needs to be clarified in further studies. Key words: Tissue-type plasminogen activator (t-PA). Cytosol. Lung adenocarcinomas.
Correspondencia: Dr. A. Ruibal Morell. Laboratorio de Biología Tumoral FJD. Departamento de Medicina Nuclear. Fundación Jiménez Díaz. Avda. Reyes Católicos, 2. 28040 Madrid. Recibido el 30-8-2001; aceptado para su publicación el 28-2-2002.
Los activadores del plasminógeno, tipos urocinasa (u-AP) y tisular (t-AP), son serinproteasas cuya principal acción biológica consiste en convertir el plasminógeno inactivo en plasmina1-2. El tipo tisular es una glucoproteína de 70 kDa, sintetizada por las células endoteliales de los vasos sanguíneos, cuyo principal efecto biológico es la fibrinólisis y la trombólisis. En su molécula pueden evidenciarse dos cadenas (pesada y ligera) que permiten su acción biológica3, ejerciendo en ella un importante papel la citoqueratina 84. Su dosificación sérica puede ser de interés en el diagnóstico y seguimiento de la enfermedad de Graves, algunas hepatopatías y retinopatía diabética y para evaluar la tendencia a la trombosis y el riesgo de alteraciones cardíacas en sujetos sometidos a hemodiálisis. En el ámbito tisular, Gris et al5 constataron una expresión similar de ambos activadores en todos los tumores pulmonares, excepto en los de células grandes, donde la del tipo urocinasa fue variable. Especial interés ofrecieron los dos inhibidores de los activadores del plasminógeno (PAI-1 y PAI-2), cuya expresión osciló notablemente y en muchos casos fue negativa, lo cual parece reflejar la importancia fisiopatológica de todos los componentes del sistema del activador del plasminógeno. Heidtmann et al6 demostraron que todas las líneas celulares de tumores no microcíticos producían activadores del plasminógeno y/o sus inhibidores, mientras que ello no ocurría en las derivadas de mesoteliomas y carcinomas de células pequeñas. Es interesante resaltar que algunas estirpes celulares los producen espontáneamente, mientras que otras sólo lo hacen tras determinados estímulos. Robert et al7 comprobaron que la expresión de PAI-2 se correlacionaba con la ausencia de invasión ganglionar, lo cual evidenciaba su papel en la progresión de estos tumores8, mientras que la del PAI-1 lo hacía con el u-AP, reflejando mayor agresividad. Salden et al9, tras estudiar 88 carcinomas pulmonares no microcíticos y 74 muestras normales, describieron mayores concentraciones de u-AP, Med Clin (Barc) 2002;119(1):1-3
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RUIBAL A, ET AL. UTILIDAD DE LA DETERMINACIÓN DEL ACTIVADOR DEL PLASMINÓGENO TIPO TISULAR CITOSÓLICO EN EL ADENOCARCINOMA DE PULMÓN
su receptor y ambos inhibidores en aquéllos, sin que ello se asociase con una significación pronóstica. Menos conocido es el comportamiento del t-AP en los tumores pulmonares, donde se ha descrito un descenso de sus concentraciones frente al tejido normal10, fenómeno opuesto al observado con los otros componentes del sistema11. Por ello hemos querido estudiar en este trabajo sus concentraciones en los citosoles de adenocarcinomas de pulmón y correlacionarlas con otros parámetros clinicobiológicos que pueden ser de ayuda para caracterizar dichas neoformaciones malignas. Material y método El grupo de estudio incluyó 59 muestras de adenocarcinomas pulmonares pertenecientes a 37 varones y 22 mujeres de edades comprendidas entre 36 y 77 (mediana, 64 años), y 16 muestras de tejido pulmonar normal procedentes de aquellos pacientes. Las muestras tisulares fueron limpiadas de sus componentes grasos, congeladas y almacenadas en nitrógeno líquido hasta su homogeneización. Ésta se realizó en un buffer (TRIS 0,1 M, EDTA Na2 0,015 M, glicerol al 10%, monotioglicerol al 0,01%, pH 7,5) y en frío mediante un microhomogeneizador (OMNI 1000, Waterbury, CT, EE.UU.), después las muestras fueron centrifugadas a 1.500 rpm durante 10 min; posteriormente el sobrenadante se sometió a una ultracentrifugación a 100.000 g durante 1 hora a 4 oC, obteniéndose un nuevo sobranadante (citosol) y un precipitado (membranas). El t-AP fue dosificado mediante un enzimoinmunanálisis de Boehringer Mannheim (Alemania), expresándose los resultados, como también el de los otros parámetros biológicos, por miligramo de proteína (mg prot.), utilizando para ello el método de Bradford. A nivel tisular el límite inferior de sensibilidad del t-AP fue de 0,1 ng/mg prot. Determinamos además, las concentraciones citosólicas de la pS2 (IRMA-CIS, Francia), catepsina D (IRMA-CIS. Francia), ácido hialurónico (RLA-Pharmacia, Suecia), CA125 (IRMA-CIS, Francia), enolasa específica neuronal (NSE) (IRMA-CIS, Francia) y subunidad beta libre de la hormona gonadotrófica coriónica (HCGb) (IRMA-CIS, Francia), así como las de ácido hialurónico, proteína oncogénica erbB2/neu (EIA, Oncogene, EE.UU.), CD44s (EIA, Bender Diagnostica, Austria), CD44v5 (EIA, Bender Diagnostica, Austria), CD44v6 (EIA, Bender Diagnostica, Austria) y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (RLA, Viennalab, Austria) en las membranas celulares. Los dinteles de positividad para el CD44s, CD44v5 y CD44v6 fueron 80, 3 y 5 ng/mg prot., respectivamente. También hemos considerado el estadio clínico, ploidía, fase de síntesis celular (ambas determinadas por citometría de flujo en muestras en fresco [Fascam, Becton Dickinson, EE.UU.]) cuando fue posible y el grado histológico. El análisis estadístico se realizó mediante el programa BMDP3 y, como los factores biológicos no siguieron una distribución normal, hemos empleado pruebas no paramétricas, y la de la χ2 para la comparación de proporciones, con la corrección de Yates si era necesaria. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos cuando el valor de p fue inferior a 0,05.
de t-AP disminuyeron conforme aumentaba el estadio clínico, siendo superiores en el estadio I frente a II-III (p = 0,080) y el III (p = 0,062). No se constataron diferencias en las concentraciones de la proteasa cuando el grado histológico (I frente a III), ploidía (diploides frente a aneuploides) y fase de síntesis celular (mayor del 7% frente a menor del 7,1%, y mayor del 14% frente a menor del 14,1 %) fueron considerados. Cuando los adenocarcinomas fueron clasificados en función de un dintel de positividad de 3,7 ng/mg de proteína (percentil 75 de todo el grupo tumoral), observamos que los casos t-AP positivos presentaban menores concentraciones de CA125 (p = 0,015), así como una tendencia a menores valores de proteína oncogénica erbB2 que rozaron la significación estadística (p = 0,087). TABLA 1 Distribución de las concentraciones citosólicas del activador del plasminógeno tipo tisular en los adenocarcinomas pulmonares clasificados en función de diferentes parámetros clinicobiológicos Parámetro
Estadio I* Estadio II Estadio III* GH1 GH2 GH3 Diploides Aneuploides Fase S > 7% Fase S ≤ 7% Fase S >14% Fase S ≤ 14%
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Med Clin (Barc) 2002;119(1):1-3
Intervalo
Mediana
32 8 19 9 24 26 6 42 33 26 19 40
0,1-14,6 0,1-8,2 0,1-10,0 0,1-11,2 0,1-8,2 0,1-14,6 0,1-14,6 0,1-11,2 0,1-11,2 0,1-14,6 0,1-8,2 0,1-14,6
2,1 1,1 0,6 2,2 1,0 2,5 1,6 1,55 1,7 1,4 1,3 2,1
*I frente a III: p = 0,06219. GH: grado histológico.
Al contrario de lo que ocurre con el u-AP, el t-AP ha sido menos estudiado en los tejidos tumorales. En los cánceres de colon, Raigoso et al12 han descrito mayores concentraciones en la mucosa normal que en los tumores colorrectales, asociándose altas cifras con un peor comportamiento clínico12, mientras que Ganesh et al13 resaltan el papel del sistema del activador del plasminógeno en la carcinogénesis colorrectal. En los melanomas esta proteasa es reflejo de un peor pronóstico14, mientras que en los tumores de mama constituye un factor de buena evolución independientemente del estadio, el grado, la afección axilar y los receptores esteroides2,15,16 y un indicador de la hormonodependencia que se relaciona activamente con la pS217. Diferentes estudios parecen evidenciar la importancia del sistema del activador del plasminógeno en la fisiopatología de los carcinomas pulmonares, especialmente no microcíticos. En líneas celulares de cáncer de pulmón, se ha visto que las metastásicas expresan mayores concentraciones de u-AP, su receptor (uAP-r) y menores de t-AP y el inhibidor PAI-2, mientras que no se constataron diferencias en las concentraciones del inhibidor PAI-118. En los adenocarcinomas pulmonares estudiados las concentraciones citosólicas de t-AP fueron inferiores a las observadas en las muestras normales de los mismos pacientes, pero sin apreciarse diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos. Similares conclusiones han sido descritas por otros grupos10,11, si bien debemos resaltar que no todos los métodos empleados para
TABLA 2 Distribución de los valores de los diferentes parámetros clinicobiológicos en los adenocarcinomas pulmonares clasificados en función de la positividad o no del activador del plasminógeno tipo tisular citosólico Parámetro
ErbB2a CA125 Fase S Tamañod EGFRe CATDf pS2+b AHcitosolb AHmembranab HCGbb NSEb GH3 Aneuploides > 3 cm > 5 cm Fase S > 7% Fase S > 14% CD44s+b CD44v5+b CD44v6+b
Resultados En los 59 adenocarcinomas, las concentraciones de t-AP oscilaron entre 0,1 y 14,6 ng/mg prot. (mediana, 1,4) y fueron menores, pero sin significación estadística, a las observadas en 16 muestras de tejido pulmonar normal de los mismos pacientes (intervalo, 0,1-18,6; mediana, 2,95 ng/mg prot.). Tal como se puede observar en las tablas 1 y 2, los valores
Número
Discusión
a
t-AP > 3,7 ng/mg de proteína(14)
t-AP < 3,71 (45)
Intervalo
Mediana
Intervalo
Mediana
171-117.750 1,0-334 1,4-28,7 1,5-7,5 0,9-128 2,5-142 0,1-293 894-5.310 159-2.862 0,01-78,3 56,7-579
2.497 32,8 9,9 4,5 25,1 77,4 0,4 2.780 911 0,05 244
656-20.590 1,0-9.225 1,2-26,7 2,0-10,0 1,8-97,8 24,7-295 0,1-98,4 695-21.290 50-4.622 0,01-8,9 26,8-1.004
3.438 134 12,8 4,0 21,4 66 0,1 3.029 983 0,03 285,5
9/14 8/10 10/14 3/14 7/9 3/9 10/14 6/14 6/14
17/45 34/38 35/45 9/45 26/35 16/35 32/45 21/45 28/45
NHI/mg de proteína; bng/mg de proteína; cU/mg de proteína; dcm; efmol/mg de proteína; fpmol/mg de proteína AH: ácido hialurónico; NS: no significativo.
p
0,087 0,015 NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS
RUIBAL A, ET AL. UTILIDAD DE LA DETERMINACIÓN DEL ACTIVADOR DEL PLASMINÓGENO TIPO TISULAR CITOSÓLICO EN EL ADENOCARCINOMA DE PULMÓN
evidenciar el valor del t-AP son equiparables en sus resultados19. Mediante estudios inmunohistoquímicos, Nakstad y Lyberg20 describen una negatividad para el t-AP en los adenocarcinomas, siendo sólo positivo el endotelio. Este comportamiento del t-AP podría explicar que altas concentraciones en tumores pulmonares fueran el reflejo de una situación celular «normal» y se asociaran con mejores comportamiento y evolución. Nosotros hemos observado que las concentraciones de t-AP eran superiores en el estadio I frente al II-III y frente al III, rozándose la significación estadística, pero no constatamos diferencias cuando fueron considerados el grado histológico, la ploidía y la proliferación. Al clasificar los adenocarcinomas en función de la positividad para el t-AP, tomando como dintel la cifra de 3,7 ng/mg prot., que representa el percentil 75 de todo el grupo, observamos que los casos positivos cursaron con menores concentraciones de CA125 (p = 0,015) y de proteína erbB2, que rozaron la significación estadística (p = 0,087). El CA125 es un marcador cuya principal aplicación clínica es en los tumores no mucinosos de ovario21, si bien puede utilizarse en otros como los de endometrio y pulmón, especialmente adenocarcinomas y de células grandes. Por otro lado se ha observado que sus concentraciones tisulares son mayores en los adenocarcinomas que en los carcinomas escamosos de pulmón, que se correlacionan con las séricas, las cuales aumentan con la pérdida de diferenciación celular y que se comportan como un factor pronóstico, de tal modo que valores superiores a 26 U/mg prot. reflejan menores intervalo libre de enfermedad y supervivencia global22-25. En relación con el oncogén erbB2/neu, se ha descrito su alteración en el 38% de los adenocarcinomas, comportándose como una factor pronóstico independiente de mala evolución y comportamiento26,27, siendo su efecto aditivo con las mutaciones en K-ras28. En líneas celulares pulmonares (H460), la sobrexpresión de este oncogén se asoció con una mayor secreción de urocinasa, lo cual podría explicar una mayor agresividad y progresión tumoral29. Los resultados anteriores muestran que las concentraciones citosólicas de t-AP en los adenocarcinomas pulmonares tienen una tendencia a correlacionarse inversamente con el estadio tumoral. Sin embargo, su posible valor como factor pronóstico necesita una evaluación posterior, pues se co-
rrelacionan negativamente con ciertos indicadores (CA125 y c-erbB2), pero no con otros factores (fase S, ploidía, grado histológico) que sí parecen incidir en la evolución ulterior de aquellas neoformaciones.
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Álvaro Ruibal, Matilde Isabel Núñez, Mari Carmen del Ríoa, Jesús Rodríguezb y José Feliciano Álvarez de Linerab Laboratorio de Biología Tumoral Fundación Jiménez Díaz. Departamento de Medicina Nuclear. Fundación Jiménez Díaz. Madrid. a Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad Alfonso X el Sabio. Villanueva de la Cañada. Madrid. b Servicio de Cirugía Torácica. Hospital Central de Asturias. Oviedo.
FUNDAMENTO: Estudiar el comportamiento del activador del plasminógeno tipo tisular (t-AP) citosólico en adenocarcinomas pulmonares y sus posibles correlaciones con otros parámetros clinicobiológicos. MATERIAL Y MÉTODO: El grupo de estudio incluyó 59 muestras tisulares de adenocarcinomas pulmonares y 16 de tejido normal de los mismos pacientes. El t-AP fue determinado mediante un enzimoinmunoanálisis (EIA) (Boehringer-Mannheim, Alemania). Se determinaron asimismo las concentraciones citosólicas de CA125, catepsina D, pS2, ácido hialurónico (AH), subunidad beta de la hormona gonadotrófica coriónica, y enolasa específica neuronal, así como las del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), proteína oncogénica erbB2/neu, AH, CD44s, CD44v5 y CD44v6 en las membranas celulares. Otros parámetros considerados fueron los siguientes: estadio clínico, grado histológico, ploidía y fase de síntesis celular (FS). RESULTADOS: En los adenocarcinomas, las concentraciones citosólicas de t-AP oscilaron entre 0,1 y 14,6 ng/mg de proteína (mediana, 1,4) y fueron inferiores, pero sin significación estadística, a las observadas en las muestras de pulmón normal (intervalo, 0,1-18,6; mediana, 2,95 ng/mg de proteína). Asimismo, las concentraciones de t-AP disminuyeron conforme se incrementaba el estadio clínico, siendo superiores en el estadio I frente al II-III (p = 0,080) y frente al III (p = 0,0622). No se constataron diferencias significativas en las concentraciones de la proteasa cuando el grado histológico, ploidía y FS fueron considerados. Los tumores con cifras altas de t-AP (> 3,7 ng/mg de proteína, que representan el percentil 75 de todo el grupo) cursaron con menores concentraciones de CA125 (p = 0,015) y proteína erbB2 (p = 0,087). CONCLUSIONES: Los resultados anteriores apuntan a que el t-AP citosólico se relaciona inversamente con el estadio clínico en el adenocarcinoma de pulmón, sin que podamos precisar su interés como indicador pronóstico. Palabras clave: Activador del plasminógeno tipo tisular (t-AP). Citosol. Adenocarcinomas pulmonares.
Usefulness of cytosolic tissue-type plasminogen activator levels in lung adenocarcinomas BACKGROUND: We aimed at studying the behavior of cytosol tissue-type plasminogen activator (t-PA) levels in lung adenocarcinomas and their correlation with other clinical and biological parameters. MATERIAL AND METHOD: t-PA cytosol levels were determined using EIA (Boehringer Mannheim. Germany) in 59 samples of lung adenocarcinoma and in 16 samples of normal lung tissue from the same patients. Cathepsin D, CA125, pS2, hyaluronic acid (HA), free beta subunit of chorionic gonadotropin hormone and neuron specific enolase (NSE) cytosol concentrations were determined. We also determined the concentrations of HA, erbB2 oncoprotein, epidermal growth factor receptor (EGFR), CD44s, CD44v5 and CD44v6 in cell surfaces. The following parameters were considered: clinical stage, ploidy, cellular S-phase fraction and histological grade. RESULTS: In adenocarcinomas, t-PA cytosol levels ranged from 0.1 to 14.6 ng/mg prot. (median, 1.4). These levels were lower than those in normal lung tissue (r, 0.1-18.6; median, 2.95 ng/mg prot.) but did not reach statistical significance. On the other hand, t-PA concentrations decreased as the clinical stage increased and were higher in stage I than stage II-III (p = 0.080) and stage III (p = 0.0622). No significant differences of t-PA levels were observed when the histological grade, ploidy and S-phase were considered. Adenocarcinomas with high t-PA values (> 3.7 ng/mg prot., representing the 75th percentil of the whole group), had lower CA125 (p = 0.015) and erbB2 oncoprotein (p = 0.087) concentrations. CONCLUSIONS: These results suggest that cytosol t-PA levels are negatively correlated with tumor size in lung adenocarcinomas. However, the usefulness of t-PA as a prognostic factor needs to be clarified in further studies. Key words: Tissue-type plasminogen activator (t-PA). Cytosol. Lung adenocarcinomas.
Correspondencia: Dr. A. Ruibal Morell. Laboratorio de Biología Tumoral FJD. Departamento de Medicina Nuclear. Fundación Jiménez Díaz. Avda. Reyes Católicos, 2. 28040 Madrid. Recibido el 30-8-2001; aceptado para su publicación el 28-2-2002.
Los activadores del plasminógeno, tipos urocinasa (u-AP) y tisular (t-AP), son serinproteasas cuya principal acción biológica consiste en convertir el plasminógeno inactivo en plasmina1-2. El tipo tisular es una glucoproteína de 70 kDa, sintetizada por las células endoteliales de los vasos sanguíneos, cuyo principal efecto biológico es la fibrinólisis y la trombólisis. En su molécula pueden evidenciarse dos cadenas (pesada y ligera) que permiten su acción biológica3, ejerciendo en ella un importante papel la citoqueratina 84. Su dosificación sérica puede ser de interés en el diagnóstico y seguimiento de la enfermedad de Graves, algunas hepatopatías y retinopatía diabética y para evaluar la tendencia a la trombosis y el riesgo de alteraciones cardíacas en sujetos sometidos a hemodiálisis. En el ámbito tisular, Gris et al5 constataron una expresión similar de ambos activadores en todos los tumores pulmonares, excepto en los de células grandes, donde la del tipo urocinasa fue variable. Especial interés ofrecieron los dos inhibidores de los activadores del plasminógeno (PAI-1 y PAI-2), cuya expresión osciló notablemente y en muchos casos fue negativa, lo cual parece reflejar la importancia fisiopatológica de todos los componentes del sistema del activador del plasminógeno. Heidtmann et al6 demostraron que todas las líneas celulares de tumores no microcíticos producían activadores del plasminógeno y/o sus inhibidores, mientras que ello no ocurría en las derivadas de mesoteliomas y carcinomas de células pequeñas. Es interesante resaltar que algunas estirpes celulares los producen espontáneamente, mientras que otras sólo lo hacen tras determinados estímulos. Robert et al7 comprobaron que la expresión de PAI-2 se correlacionaba con la ausencia de invasión ganglionar, lo cual evidenciaba su papel en la progresión de estos tumores8, mientras que la del PAI-1 lo hacía con el u-AP, reflejando mayor agresividad. Salden et al9, tras estudiar 88 carcinomas pulmonares no microcíticos y 74 muestras normales, describieron mayores concentraciones de u-AP, Med Clin (Barc) 2002;119(1):1-3
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RUIBAL A, ET AL. UTILIDAD DE LA DETERMINACIÓN DEL ACTIVADOR DEL PLASMINÓGENO TIPO TISULAR CITOSÓLICO EN EL ADENOCARCINOMA DE PULMÓN
su receptor y ambos inhibidores en aquéllos, sin que ello se asociase con una significación pronóstica. Menos conocido es el comportamiento del t-AP en los tumores pulmonares, donde se ha descrito un descenso de sus concentraciones frente al tejido normal10, fenómeno opuesto al observado con los otros componentes del sistema11. Por ello hemos querido estudiar en este trabajo sus concentraciones en los citosoles de adenocarcinomas de pulmón y correlacionarlas con otros parámetros clinicobiológicos que pueden ser de ayuda para caracterizar dichas neoformaciones malignas. Material y método El grupo de estudio incluyó 59 muestras de adenocarcinomas pulmonares pertenecientes a 37 varones y 22 mujeres de edades comprendidas entre 36 y 77 (mediana, 64 años), y 16 muestras de tejido pulmonar normal procedentes de aquellos pacientes. Las muestras tisulares fueron limpiadas de sus componentes grasos, congeladas y almacenadas en nitrógeno líquido hasta su homogeneización. Ésta se realizó en un buffer (TRIS 0,1 M, EDTA Na2 0,015 M, glicerol al 10%, monotioglicerol al 0,01%, pH 7,5) y en frío mediante un microhomogeneizador (OMNI 1000, Waterbury, CT, EE.UU.), después las muestras fueron centrifugadas a 1.500 rpm durante 10 min; posteriormente el sobrenadante se sometió a una ultracentrifugación a 100.000 g durante 1 hora a 4 oC, obteniéndose un nuevo sobranadante (citosol) y un precipitado (membranas). El t-AP fue dosificado mediante un enzimoinmunanálisis de Boehringer Mannheim (Alemania), expresándose los resultados, como también el de los otros parámetros biológicos, por miligramo de proteína (mg prot.), utilizando para ello el método de Bradford. A nivel tisular el límite inferior de sensibilidad del t-AP fue de 0,1 ng/mg prot. Determinamos además, las concentraciones citosólicas de la pS2 (IRMA-CIS, Francia), catepsina D (IRMA-CIS. Francia), ácido hialurónico (RLA-Pharmacia, Suecia), CA125 (IRMA-CIS, Francia), enolasa específica neuronal (NSE) (IRMA-CIS, Francia) y subunidad beta libre de la hormona gonadotrófica coriónica (HCGb) (IRMA-CIS, Francia), así como las de ácido hialurónico, proteína oncogénica erbB2/neu (EIA, Oncogene, EE.UU.), CD44s (EIA, Bender Diagnostica, Austria), CD44v5 (EIA, Bender Diagnostica, Austria), CD44v6 (EIA, Bender Diagnostica, Austria) y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (RLA, Viennalab, Austria) en las membranas celulares. Los dinteles de positividad para el CD44s, CD44v5 y CD44v6 fueron 80, 3 y 5 ng/mg prot., respectivamente. También hemos considerado el estadio clínico, ploidía, fase de síntesis celular (ambas determinadas por citometría de flujo en muestras en fresco [Fascam, Becton Dickinson, EE.UU.]) cuando fue posible y el grado histológico. El análisis estadístico se realizó mediante el programa BMDP3 y, como los factores biológicos no siguieron una distribución normal, hemos empleado pruebas no paramétricas, y la de la χ2 para la comparación de proporciones, con la corrección de Yates si era necesaria. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos cuando el valor de p fue inferior a 0,05.
de t-AP disminuyeron conforme aumentaba el estadio clínico, siendo superiores en el estadio I frente a II-III (p = 0,080) y el III (p = 0,062). No se constataron diferencias en las concentraciones de la proteasa cuando el grado histológico (I frente a III), ploidía (diploides frente a aneuploides) y fase de síntesis celular (mayor del 7% frente a menor del 7,1%, y mayor del 14% frente a menor del 14,1 %) fueron considerados. Cuando los adenocarcinomas fueron clasificados en función de un dintel de positividad de 3,7 ng/mg de proteína (percentil 75 de todo el grupo tumoral), observamos que los casos t-AP positivos presentaban menores concentraciones de CA125 (p = 0,015), así como una tendencia a menores valores de proteína oncogénica erbB2 que rozaron la significación estadística (p = 0,087). TABLA 1 Distribución de las concentraciones citosólicas del activador del plasminógeno tipo tisular en los adenocarcinomas pulmonares clasificados en función de diferentes parámetros clinicobiológicos Parámetro
Estadio I* Estadio II Estadio III* GH1 GH2 GH3 Diploides Aneuploides Fase S > 7% Fase S ≤ 7% Fase S >14% Fase S ≤ 14%
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Med Clin (Barc) 2002;119(1):1-3
Intervalo
Mediana
32 8 19 9 24 26 6 42 33 26 19 40
0,1-14,6 0,1-8,2 0,1-10,0 0,1-11,2 0,1-8,2 0,1-14,6 0,1-14,6 0,1-11,2 0,1-11,2 0,1-14,6 0,1-8,2 0,1-14,6
2,1 1,1 0,6 2,2 1,0 2,5 1,6 1,55 1,7 1,4 1,3 2,1
*I frente a III: p = 0,06219. GH: grado histológico.
Al contrario de lo que ocurre con el u-AP, el t-AP ha sido menos estudiado en los tejidos tumorales. En los cánceres de colon, Raigoso et al12 han descrito mayores concentraciones en la mucosa normal que en los tumores colorrectales, asociándose altas cifras con un peor comportamiento clínico12, mientras que Ganesh et al13 resaltan el papel del sistema del activador del plasminógeno en la carcinogénesis colorrectal. En los melanomas esta proteasa es reflejo de un peor pronóstico14, mientras que en los tumores de mama constituye un factor de buena evolución independientemente del estadio, el grado, la afección axilar y los receptores esteroides2,15,16 y un indicador de la hormonodependencia que se relaciona activamente con la pS217. Diferentes estudios parecen evidenciar la importancia del sistema del activador del plasminógeno en la fisiopatología de los carcinomas pulmonares, especialmente no microcíticos. En líneas celulares de cáncer de pulmón, se ha visto que las metastásicas expresan mayores concentraciones de u-AP, su receptor (uAP-r) y menores de t-AP y el inhibidor PAI-2, mientras que no se constataron diferencias en las concentraciones del inhibidor PAI-118. En los adenocarcinomas pulmonares estudiados las concentraciones citosólicas de t-AP fueron inferiores a las observadas en las muestras normales de los mismos pacientes, pero sin apreciarse diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos. Similares conclusiones han sido descritas por otros grupos10,11, si bien debemos resaltar que no todos los métodos empleados para
TABLA 2 Distribución de los valores de los diferentes parámetros clinicobiológicos en los adenocarcinomas pulmonares clasificados en función de la positividad o no del activador del plasminógeno tipo tisular citosólico Parámetro
ErbB2a CA125 Fase S Tamañod EGFRe CATDf pS2+b AHcitosolb AHmembranab HCGbb NSEb GH3 Aneuploides > 3 cm > 5 cm Fase S > 7% Fase S > 14% CD44s+b CD44v5+b CD44v6+b
Resultados En los 59 adenocarcinomas, las concentraciones de t-AP oscilaron entre 0,1 y 14,6 ng/mg prot. (mediana, 1,4) y fueron menores, pero sin significación estadística, a las observadas en 16 muestras de tejido pulmonar normal de los mismos pacientes (intervalo, 0,1-18,6; mediana, 2,95 ng/mg prot.). Tal como se puede observar en las tablas 1 y 2, los valores
Número
Discusión
a
t-AP > 3,7 ng/mg de proteína(14)
t-AP < 3,71 (45)
Intervalo
Mediana
Intervalo
Mediana
171-117.750 1,0-334 1,4-28,7 1,5-7,5 0,9-128 2,5-142 0,1-293 894-5.310 159-2.862 0,01-78,3 56,7-579
2.497 32,8 9,9 4,5 25,1 77,4 0,4 2.780 911 0,05 244
656-20.590 1,0-9.225 1,2-26,7 2,0-10,0 1,8-97,8 24,7-295 0,1-98,4 695-21.290 50-4.622 0,01-8,9 26,8-1.004
3.438 134 12,8 4,0 21,4 66 0,1 3.029 983 0,03 285,5
9/14 8/10 10/14 3/14 7/9 3/9 10/14 6/14 6/14
17/45 34/38 35/45 9/45 26/35 16/35 32/45 21/45 28/45
NHI/mg de proteína; bng/mg de proteína; cU/mg de proteína; dcm; efmol/mg de proteína; fpmol/mg de proteína AH: ácido hialurónico; NS: no significativo.
p
0,087 0,015 NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS NS
RUIBAL A, ET AL. UTILIDAD DE LA DETERMINACIÓN DEL ACTIVADOR DEL PLASMINÓGENO TIPO TISULAR CITOSÓLICO EN EL ADENOCARCINOMA DE PULMÓN
evidenciar el valor del t-AP son equiparables en sus resultados19. Mediante estudios inmunohistoquímicos, Nakstad y Lyberg20 describen una negatividad para el t-AP en los adenocarcinomas, siendo sólo positivo el endotelio. Este comportamiento del t-AP podría explicar que altas concentraciones en tumores pulmonares fueran el reflejo de una situación celular «normal» y se asociaran con mejores comportamiento y evolución. Nosotros hemos observado que las concentraciones de t-AP eran superiores en el estadio I frente al II-III y frente al III, rozándose la significación estadística, pero no constatamos diferencias cuando fueron considerados el grado histológico, la ploidía y la proliferación. Al clasificar los adenocarcinomas en función de la positividad para el t-AP, tomando como dintel la cifra de 3,7 ng/mg prot., que representa el percentil 75 de todo el grupo, observamos que los casos positivos cursaron con menores concentraciones de CA125 (p = 0,015) y de proteína erbB2, que rozaron la significación estadística (p = 0,087). El CA125 es un marcador cuya principal aplicación clínica es en los tumores no mucinosos de ovario21, si bien puede utilizarse en otros como los de endometrio y pulmón, especialmente adenocarcinomas y de células grandes. Por otro lado se ha observado que sus concentraciones tisulares son mayores en los adenocarcinomas que en los carcinomas escamosos de pulmón, que se correlacionan con las séricas, las cuales aumentan con la pérdida de diferenciación celular y que se comportan como un factor pronóstico, de tal modo que valores superiores a 26 U/mg prot. reflejan menores intervalo libre de enfermedad y supervivencia global22-25. En relación con el oncogén erbB2/neu, se ha descrito su alteración en el 38% de los adenocarcinomas, comportándose como una factor pronóstico independiente de mala evolución y comportamiento26,27, siendo su efecto aditivo con las mutaciones en K-ras28. En líneas celulares pulmonares (H460), la sobrexpresión de este oncogén se asoció con una mayor secreción de urocinasa, lo cual podría explicar una mayor agresividad y progresión tumoral29. Los resultados anteriores muestran que las concentraciones citosólicas de t-AP en los adenocarcinomas pulmonares tienen una tendencia a correlacionarse inversamente con el estadio tumoral. Sin embargo, su posible valor como factor pronóstico necesita una evaluación posterior, pues se co-
rrelacionan negativamente con ciertos indicadores (CA125 y c-erbB2), pero no con otros factores (fase S, ploidía, grado histológico) que sí parecen incidir en la evolución ulterior de aquellas neoformaciones.
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