Charakterisierung von Nigella damascena-Zellkulturen in Airlift-Fermentoren

Biochem. Physiol. Pflanzen 1?9, 611-622 (1984)

Charakterisierung von Nigella dama8cena-Zellkulturen in Airlift-Fermentoren H.-P. SCHMAUDER, P. DOBEL und D. GROGER Institut fiir Biochemie der Pflanzen der Akademie der Wissenschaften der DDR, Halle (Saale), DDR

Characterisation of Cell Snspension Cultures of Nigella damascena L. Grown in Airlift Fermentors Key Term Index: Cell cultures, airlift fermentor, DAHP synthase, anthranilate synthase, chorismate mutase, tryptophan synthase, mitose index; Nigella damascena

Summary The growth pattern of Nigella damascena cells cultivated in the dark and under illumination in an airlift fermentor was investigated.'Considerable variations were observed with regard to the size and morphology of the cells and of the mitose index under different growth conditions. Anthranilic acid derivatives (0,15,ug!mg dry weight) were detectable. N-methylanthranilic acid methyl ester was identified as main compound. Enzymes of the shikimate pathway (DAHP synthase, chorismate mutase, anthranilate synthase and tryptophan synthase) were followed throughout the cultivation period. Some aspects of regulation of the aromatic pathway were studied.

Einleitung

Seit geraumer Zeit bemiiht man sich intensiv, pflanzliche Zellen in Fermentoren zu kultivieren. Zweifellos ist die erfolgreiche Anzucht von Tabakzellkulturen im 200001 MaBstab in Japan als ein Meilenstein auf diesem Gebiet anzusehen (MISAWA and SUZUKI 1982). Das "scale-up" von der Schiittelkultur zur Kultivation pflanzlicher Zellen in Fermentoren bringt, bedingt durch die Eigenschaften pflanzlicher Systeme, eine Reihe von zusiitzlichen Problemen, die man beim Umgang mit Mikroorganismen nicht kennt. So sind pflanzliche Zellen im allgemeinen auBerordentlich empfindlich gegeniiber mechanischen Belastungen. Sedimentation, wandstandiges Wachstum und Flotation kann bei bestimmten Suspensionskulturen auftreten und zu einem stabilen 3-Phasen-System fUhren (WAGNER und VOGELMANN 1977). Die Autoren unterscheiden im wesentlichen 2 verschiedene morphologische Typen pflanzlicher Zellen in Suspensionskultur. Verschiedene Typen von Bioreaktoren hat man bislang zur Massenkultivation pflanzlicher Zellen getestet. Ais giinstig fUr die Fermentorkultur haben sich scherkraftarme AirliftSysteme, die sog. Schlaufenreaktoren, erwiesen. In solchen Reaktortypen, an die viele handelsiibliche Riihrfermentoren angepaBt werden konnen, ist es wiederholt gelungen, Abkiirzungen: DAHP, 3-Deoxy-D-arabino-heptulusonsaure-7-phosphat; LM, Laufmittel 40'

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pflanzliche Systeme zur Sekund1trstoffproduktion anzuregen (Ubersichten: SCHMAUDER und KOBLITZ 1980; KURZ and CONSTABEL 1981; SHARGOOL 1982). In der vorliegenden Arbeit werden unsere Erfahrungen zur Fermentorkultur pflanz~ licher Zellen beschrieben. Es wurde ein an Airlift~Bedingungen angepa13ter Fermentor eingesetzt (SCHMAUDER et al. 1983; SCHMAUDER 1983), bei dem die Miiglichkeit zur Be~ lichtung der Kulturen gegeben ist. Ais Untersuchungsobjekt wurde Nigella damascena gew1thlt, eine Ranunculacee, die sich durch die F1thigkeit zur Ausbildung wuchsiger und widerstandsf1thiger Zell~ und Organkulturen (RAMAN and GREYSON 1974; RAMAN and GREYSON 1979; DOBEL 1983), sowie einen gut analysierbaren (n = 6) Chromosomensatz (Kd.STERSKA and NATARA~ JAN 1975; HIZUME et al. 1982) auszeichnet. Folgende Parameter sollen den physiologischen Zustand n1ther charakterisieren: Wachstum, Zellteilungsverhalten, Aktivit1tten ausgewahlter Enzyme der Biosynthese aromatischer Aminosauren sowie die Bildung von Derivaten der Anthranilsaure.

Material nnd Methodfn K ultivation Das untersuchte Zellmaterial von Nigella damascena L. stammt aus einer seit April 1981 als Suspension in Erlenmeyer-Kolben bei 12stiindigem Licht-Dunkel-Wechsel gehaltenen Schiittelkultur, die urspriinglich aus jungen Laubblattern gewonnen worden war (DOBEL 1983). Zur Kultivierung wurde in der Schiittel- wie in der Fermentor-Kultur ein modifiziertes Medium nach MURASHIGE und SKOOG (1962), mit 2,4-D (2 mg/l) statt IES, auf 2% reduzierter Saccharose-Konzentration und unter Weglassen von Glycin, verwendet. Ais Fermentor wurde die Airlift-Variante des LF2 (CSSR-DDR) eingesetzt (SCHMAUDER et al. 1983; SCHMAUDER 1983), Totalvolumen des Fermentors: 51; Nutzvolumen 3,5 I. Die Beimpfung erfolgte im Verhiiltnis 1: 10 mit im Dunkeln angezogenen Schiittelkulturen, del" Lufteintrag betrug 4~61/min je nach Zuwachsdichte. Die Kultivation erfolgte bei 28°C. Belichtet wurde mit Hilfe von U-formigen Leuchtstofflampen vom Typ LUn40 bei einer Intensitiit von 250~300 Lux im 12 h Licht-Dunkel-Rhythmus. Cytologische M ethoden Fiir die cytologischen Untersuchungen wurden Proben des Materials mit 3: 1 Ethanol-EssigsiiureGemisch fixiert und mit Karminessigsaure oder der Feulgen-Reaktion gefiirbt. Die Mitoserate wurde in Proben von jeweils 3000 Zellen nach folgender Formel bestimmt: Zahl der Zellen in Mitose

- - - - - - = - - - ·100 Gesamtzahl der Zellen

=

%

Biochemische Methoden Zur Bestimmung der Enzymaktivitiiten wurden die Zellen abgesaugt, mit Wasser bzw. 0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,8 gewaschen und im Verhiiltnis 1: 2 bis 1: 3 mit dem AufschluBpuffer, einem 0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,8, der 30% Glycerin und 10-3 M Mercaptoethanol enthalt, versetzt. Der ZellaufschluB erfolgt mit Hilfe der X-Press, die zuvor in einem Alkohol-Trocken· eisbad auf ~50 bis ~70 °C gekiihlt worden war. Es wurde 3 X gepreBt und anschlieBend in einer Kiihlzentrifuge bei 20000 . g fiir 30 min zentrifugiert. Der zellfreie Uberstand wurde vor der Inkubation durch Filtration iiber Sephadex G 25 Siiulen Gelbett 200 X 20 mm) oder Dialyse von niedermolekularen Substanzen befreit ("gereinigter Roh-

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extrakt"). Als Puffer wurden entweder der AufschluBpuffer oder ein glycerinfreier 0,05 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6,6, der 10-s Mol/l Mercaptoethanol enthielt, verwendet. Die Enzymaktivitaten wurden in Anlehnung an SCHMAUDER und GROGER (1973) bei 30°C bestimmt. Folgende Enzyme wurden im Kulturverlauf erfaBt: DAHP-Synthase (Phospho-2-keto-3deoxyheptonat-aldolase; EC 4.1.2.15); Anthranilat-Synthase (Glutamin-Reaktion; EC 4.1.3.27); Chorismat-Mutase (EC 5.4.99.5); Tryptophan-Synthase (Indolverbrauchende Reaktion; EC 4.2.1.20). Zur Ermittlung der DAHP-Synthase-Aktivitat kam der glycerinfreie, imFalie der AnthranilatSynthase, der Tryptophan-Synthase und der Chorismat-Mutase der glycerinhaltige "gereinigte Rohextrakt" zum Einsatz. Die Proteinbestimmung erfolgte nach LOWRY et al. (1951). Das Trockengewicht wurde durch 24stiindiges Trocknen der gewaschenen Zellen bei 80°C ermittelt. Die Chorisminsaure wurde nach GIBSON (1968) hergestellt. Anthranilsaurederivate wurden aus der KUltursuspension durch Extraktion mit Ethylacetat gewonnen. Diese Extraktion erfolgte bei pH-Werten von 2-3,7 sowie 9-10. Die vereinigten und im Vakuum eingeengten iExtrakte wurden mittels Diinnschichtchromatographie an Kieselgel PF 264 "Merck" getrennt und mit Hilfe von Referenzsubstanzen zugeordnet. Verwendete Laufmittel (LM): A: Benzol B: Ethylacetat: i-Propanol: NHs = 45: 35: 20 C: CHCls : Ether: Methanol = 85: 10: 5 Die am starksten fluoreszierende Zone wurde abgeschabt, mit 5 ml Ethylacetat extrahiert und der Gehalt im Fluorimeter gegen Anthranilsaure als Standard bestimmt (Fluoreszenz-Spektrophotometer Perkin-Elmer, Modell 203, Anregung 340 nm, Fluoreszenz 395 nm). Die Massenspektren wurden mit einem doppelfokussierenden Gerat, Modell JMS-D 100 der Firma Jeol, Tokyo, aufgenommen.

Ergebnisse

Die Fermentorkulturen (batch-Verfahren) zeigten ein Wuchsverhalten, das dem Typ 1 nach WAGNER und VOGELMANN (1977) entsprach. Das Trockengewicht stieg von 1,2 mg/ml auf 3,6 mg/ml am 9. d an (Abb. 1). Als Impfmaterial wurden 7 d alte Zellkulturen verwendet. Dieses Zellmaterial zeigte in friiheren Untersuchungen bei "semikontinuierlichen", aller 3-4 d erfoIgenden Passagierungen in neues Medium das folgende Wuchsverhalten: Bei einer Animpfdichte von 2,12 mg/ml erreichten diese Kulturen am 7.-9. Tag ein Maximum von 6-6,6 mg/ml (Do BEL 1983). Der pH-Wert-Verlauf war in beiden Fermentoren identisch (Abb. 1). Bei der mikroskopischen Untersuchung wurden zwischen der verdunkelten und der belichteten Fermentor-Kultur eine Reihe von Unterschieden festgestellt. Wesentlich ist dabei der Gegensatz, den die beiden Kulturen, trotz weitgehender Ubereinstimmung im Wachstum (Abb. 1) wahrend der erst en 7 d, in ihrer Vermehrungsweise erkennen lieBen. 1m verdunkelten Fermentor stieg die Mitoserate unmittelbar nach Versuchsbeginn auf relativ hohe Werte an und sank wahrend der gesamten Kulturdauer nicht wieder unter 3,98%. Das nach 7 d erreichte Mitosemaximum betrug hier 6,6%. Noch bei Abbruch des Versuches nach 15 d, als bereits ein erheblicher Teil der Zellen Degenerationserscheinungen zeigte, betrug die Mitoserate etwa 4 %. 1m belichteten Fermentor

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pH

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4,0 6,0

3,0

5,0 DunkelkulWren Llchtkulturen TG

4,0

pH

5 Abb.1. Wachstum und pH-Wert -

2A

10 Alter (rage)

15

Verlauf der Kulturmedien wiihrend der Fermentation

2B

Abb. 2. Kernfiirbung von 4 Tage alten Fermentor-Kulturen von Nigella damscena (Fermentorlauf 1) (vgl. auch Tabelle 1) A - Dunkelkultur; B - belichtete Kultur. VergroBerung 1: 200;

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Tabelle 1. Mitoseraten der Fermentor-Kulturen in Abhiingigkeit von der Belichtung (vgl. auch Abb. 2) Zeitpunkt nach Kulturbeginn (Tage) 0 2 4 7 9 11 13 15

In Mitose befindliche Zellen (%) verdunkelte Kultur

belichtete Kultur

2,92 4,86 6,27 6,60 5,51 4,72 4,36 3,98

2,92 0,70 0,86 1,54 1,43 1,20 0,92 0,72

war dagegen mit Versuchsbeginn ein Abfall derMitoserate auf einen Minimalwert von 0,7% festzustellen, dem nur ein relativ geringer Wiederanstieg folgte. Die hier erreichten Mitoseraten blieben mit maximal 1,5 % wahrend der gesamten Kulturdauer weit unter den Werten der Dunkelkultur(Tabelle 1). Parallel zur relativ hohen Mitosefrequenz wies die verdunkelte Fermentor- Kultur einen erheblichen Anteil (10-20 %) verhaltnismiil3ig kleiner und plasmareicher Zellen mit einem 0 von etwa 70,um auf (Abb. 2 a). In der belichteten Kultur traten diese dagegen stark zuruck. Fur die belichteten Fermentor-KUlturen waren Zellen mit 300 bis maximal 900,um 0 und ballonfOrmiger Gestalt (Abb. 2b) charakteristisch. Diese Zellen zeigten zumeist auch stark vergro13erte Kerne, die sich durch ihre Ausma13e (bis 80,um 0) und die in (seltenen )Mitosen zu ermittelnden Chromosomenzahlen als polyploid erwiesen. Au13erdem konnte in vielen ZeBen Zwei- und Mehrkernigkeit festgestellt werden. Die gro13en Kerne waren haufig durch spalt- oder buchtformige EinstUlpungen in mehrere, teilweise nur noch in einem schmalen, bruckenartigen Bereich miteinander verbundene Untereinheiten gegliedert. Dabei handelt es sich offensichtlich um Zwischenstufen einer amitotischen Kernaufteilung, wie sie von NAGL (1970) bei Allium als Kernfragmentierung beschrieben wurde. Der gro13volumige Zelltyp war unter Lichteinflu13 relativ haufig zu beobachten. Das Gesamtvolumen der Zellen dieses Typs entsprach schatzungsweise dem Volumen aller ubrigen Zelltypen in dieser Kultur. Unter den im Dunkeln angezogenen Zellen befand sich dieser Typ wesentlich seltener und erreichte auch nicht die angefUhrten Extremwerte der Zellgro13e. Neben den beschriebenen Zelltypen traten in den beiden Fermentor-Kulturen Zellen mittleren Durchmessers auf, die morphologisch keinen Unterschied zwischen Hell- und Dunkelform erkennen lie13en. Sie hatten gewohnlich eine ovale bis pallisadenformig gestreckte Gestalt mit einem Durchmesser von 100-200,um. Nicht selten waren sie zweikernig, wobei als Ursache wiederum Kernfragmentierung, aber auch der Ausfall der Zellwand-Bildung in der Telophase festgestellt werden konnte. Weiterhin kamen

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hier auch relativ gro13e und polyploide Kerne vor. Diese morphologisch iibereinstimmenden Zellen mit mittleren Ausma13en stellten in der verdunkelten wie in der belichteten Kultur die Majoritat. In der Licht- wie in der Dunkelkultur waren weder Tracheiden noch andere morphologisch differenzierte Zellen feststellbar. An einer mit dem Alter der Kultur zunehmenden Zahl von Zellen aller beschriebenen Typen konnte man etwa vom 7. Kulturtag an Degenerationserscheinungen bemerken. Sie diirften eine Folge der Verarmung des Kulturmediums an bestimmten Komponenten sein, da ein Mediumwechsel nur beim Ubergang von der Schiittelkultur zur Fermentor- Kultur erfolgt war und der Fermentor im batch-Betrieb lief. Die Degeneration au13erte sich in einer verringerten FeulgenAnfarbbarkeit und allmahlichen Auflosung der Zellkerne, in manchen Fallen auch in einer Plasmolyse der Zellen. Bei Abbruch des Versuches am 15. Kultivierungstag wiesen 10-20 % aller Zellen derartige Schadigungssymptome auf. MUNSCHE (1966) stellte fest, da13 Damascenin (I) aus Anthranilsaure und Methionin gebildet wird. Nach den Befunden von MUNSCHE (1966) und MOTHES (1966) ist weiterhin wahrscheinlich, da13 erst die Aminogruppe und anschlie13end die Carboxylgruppe methyliert wird, ehe die Hydroxylierung oder Methoxylierung zum Damascenin erfolgt. Anthranilsaure war in der Pflanze nicht in freier Form nachweisbar. ~OOCH3 ~NHCH3

~COOCH3 ~NHCH3

OCH3

I

][

Das von der intakten Pflanze gebildete und vorwiegend im Samen lokalisierte Damascenin konnte in unseren ZelIkulturen (Schiittelkolben, Fermentor) nicht nachgewiesen werden. In den untersuchten Fermentorkulturen wurden einige stark flu oreszierende Verbindungen, aber keine freie Anthranilsaure gefunden. Als Hauptkomponente konnte N-Methylanthranilsauremethylester (II) identifiziert werden: -

Cochromatographie mit synthetischem Produkt (Rf: LM A ca. 0,57, LM B ca. 0,94, LM C ca. 0,93). hochauflosende Massenspektroskopie: Molpeak gef. 165,0809 (C 9 H ll N0 2), (ber. 165,0789).

Das Vorliegen von N-Methylanthranilsaure und Anthranilsauremethylester konnte durch vergleichende DC wahrscheinlich gemacht werden. Die Produktbildungsaktivitat, bezogen auf Anthranilsaure als Fluoreszenz-Standard, war in allen untersuchten Fallen nur sehr gering (etwa 0,15 pg/mg Trockenmasse). Da wir in Spuren Derivate der Anthranilsaure nachweisen konnten, untersuchten wir regulatorisch wichtige, an der Bildung aromatischer Aminosauren beteiligte Enzyme. Die DAHP-, Anthranilat-Synthase und Chorismat-Mutase zeigen wahrend des Kulturverlaufes erhOhte Aktivitaten in den Dunkelkulturen im Vergleich zu den be-

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Anthranilaf- Synthase

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DAHP- Sase

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Abb.3. Aktivitiiten von 3 wichtigen Enzymen der Biosynthese aromatischer Aminosiiuren ron Nigella damascena-Fermentor-Kulturen in Abhangigkeit vom Kulturalter

lichteten (Abb.3). In beiden System en zeigten diese Enzyme ein charakteristisches Verhalten: Die DAHP- wie auch die Anthranilat-Synthase zeigen einen schnellen Anstieg ihrer Aktivitat bis zum Maximum am 4. bzw. 2.-4. d der Kultur, urn dann in ihren Aktivitaten stark nachzulassen. So waren z. B. beide Enzyme ab dem 9. d der Fermentation mit unseren Methoden nicht mehr nachweisbar. Die Chorismat-Mutase dagegen, die mit der Anthranilat-Synthase nm das Substrat Chorisminsaure konkurriert, zeigt zwar in den erst en d einen Aktivitatsriickgang, war aber langer (bis zum 11. d) aktiv. Bei diesem Enzym unterschieden sich Licht- und Dunkelkulturen deutlich. Die Lichtkultur

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Abb. 4. Allgemeines Regulationsverhalten der Hauptenzyme zur Biosynthese aromatl;scher Aminosiiuren in 5 d alten Nigella damascena-Fermentorkulturen (Dunkelkulturen) Die eingetragenen Zahlen beziehen sich auf %-Hemmung bzw. -Aktivierung im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Im in vitro-System lag die Endkonzentration an Effektoren (tyr, phe, trp) bei 1 mmol/l. Fiir die Anthranilat-Synthase vergleiche man mit Abb. 5. Die Kontrollaktivitiiten betrugen: CD-DAHP-Synthase: ®-Chorismat-Mutase: @-Anthranilat-Synthase: @-Tryptophan-Synthase:

6,12 822 2,7 5,2

pkatjmg pkatjmg pkat/mg pkatjmg

Protein Protein Protein Protein

20

2

10-6

o

5'70-6 M Up

Abb. 5. EinflufJ von L-Tryptophan auf die Aktivitiit der Anthranilat-Synthase von Nigella damascenaLichtkulturen V ist angegeben in pkat/mg Protein. Konzentration an Chorisminsiiure: 1-1.1 mmoljl; 2-0.3 mmoljl

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erreichte am 4. d ein Maximum, das aber mit 2/3 der Aktivitat noch deutlich unter der Aktivitat des Inokulums lag, urn dann stetig abzunehmen. Bei den Dunkelkulturen dagegen wurde das Maximum erst am 9. d erreicht. Als "Flaschenhals"-Enzym erwies sich in unserem System offensichtlich die Anthranilat-Synthase, wahrend die Chorismat-Mutase, die die Chorisminsaure yom Tryptophan- in den Tyrosin-Phenyl alan in-Weg kanalisiert, einmal mehr das aktivste Enzym dieses Biosynthesebereiches darstellt (Abb. 3). Die Tryptophan-Synthase war eindeutig nachweisbar (4 d alte Kulturen: 30-40 pkat/mg Protein). Ihre relative Aktivitat war im Vergleich zur Anthranilat-Synthase deutlich erhOht. Unterschiede zwischen Licht- und Dunkelkulturen wurden nicht beobachtet. Abb.4 zeigt einen allgemeinen Uberblick iiber die regulatorische BeeinfluBbarkeit der untersuchten Enzyme im in vitro-Test durch die Endprodukte dieses Biosynthesewegs, Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan. Bei Endkonzentrationen dieser Effektoren von 1 mmol/l zeigten sowohl Chorismat-Mutase wie auch die DAHP-Synthase nur geringe Hemmeffekte, die unter 25% lagen. Tryptophan kann die Chorismat-Mutase eben falls nur gering aktivieren. Vollig anders ist dagegen das Verhalten der Anthranilat-Synthase gegeniiber Tryptophan, die bei Endkonzentrationen von 1 mmol vollstandig gehemmt ist. Aus den in Abb. 5 dargestellten Hemmkurven laBt sich ein K i Wert von etwa 2,2-2,3,umoljl berechnen. Diskussion

Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchung zeigten bei einem weiteren Objekt, daB sich Suspension en pflanzlicher Zellen im Airlift-Fermentor mit befriedigenden Zuwachsraten kultivieren lassen. Aus den cytologischen Aspekten der beiden Kulturen geht hervor, daB im verdunkelt en Fermentor die Massenzunahme auf normale Weise durch Zellteilungen und durch anschlieBendes Zellwachstum zustandekommt. 1m belichteten Fermentor ist dagegen die Mitoserate erheblich reduziert. Die hier festgestellte Zunahme des Trockengewichts diirfte daher weniger auf Zellvermehrung als vielmehr auf die bei vielen Zellen dieser Kultur beobachtbare starke ZellvergroBerung zuriickzufiihren sein. Die im belichteten Fermentor zu verzeichnende Herabsetzung der Mitoserate bei Nigella zeigt aber auch, daB beim Einsatz dieser Technik neue Probleme entstehen konnen. Mit dem 3-4 d alten Impfmaterial beimpfte Schiittelkolben wiesen bei Kultivierung im 12 h Licht-Dunkel-Wechsel Mitoseraten bis zu 5,6 % auf (DOBEL 1983). Der "Fermentor-Effekt" konnte damit zusammenhiingen, daB die Zellen im Fermentor wesentlich besser beliiftet und mit Sauerstoff versorgt werden als im Schuttelkolben. Es ist vorstellbar, daB photooxydative Prozesse zu Mitosehemmungen fuhren. Fur Schiittelkulturen ist aus einer Reihe von Einzeluntersuchungen bekannt (zusammenfassende Darstellung: LINDSEY and YEOl\fAN 1983), daB schnellwiichsiges Material, das gewohnlich zu einem erheblichen Teil aus kleinen und undifferenzierten ZeBen besteht, generell einen wesentlich geringeren Sekundarstoffgehalt aufweist als langsam wachsende Kulturen mit zumeist groBeren Zellen.

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G ROGE R

Den Beziehungen zwischen ZellgroBe, Ploidiegrad und Syntheseleistungen der Fcrmentor- Kulturen konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht weiter nachgegangen werden. Diese Verhii.ltnisse und ihre BeeinfluBbarkeit durch Belichtung, Nahrstoffund Wuchsstoff-Versorgung der ZeBen im Fermentor bedurfen noch einer eingehenden Untersuchung. Fur die auBerordentlich geringe Synthese von Anthrallilsaurederivaten konnen auf Grund der Regulationsverhaltnisse im Bereich der Biosyllthese aromatischer Aminosauren folgende Ursachen angenommen werden: 1. Der AbfluB der Chorisminsaure in den Phenylalanin-Tyrosinzweig erfolgt stark zu ungunsten des Tryptophanweges, da die Chorismat-Mutase-Aktivitat gegenuber der der Anthranilat-Synthase drastisch erhOht ist. Die beobachtete Aktivierung dieses Enzyms durch Tryptophan verstarkt diesen AbfluB noch weiter. Aktivierungen der Chorismat-Mutase von pflanzlichell System en dureh Tryptophan beschrieben GILCHRIST et al. (1972) sowie GILCHRIST und KOSUGE (1974) fUr PhaseoZu,s au,reu,s (~50150 % Steigerung), GADAL und Bouyssou (1973) fUr Qu,ercus peduncu,lata (~ 46 %), WOODIN und NISHIOKA (1973) fur Luzerne (~40-75 %) und WIDHOLM (1974a) fur Tabak (35 %). Die Hemmungen dureh Phenylalanin und Tyrosin waren bei den genannten Organismen jedoch teilweise starker ausgepragt als bei den von uns verwendeten Kulturen von Nigella damascena. 2. Die Biosynthesekette beginnt mit der DAHP-Synthase. Deren Aktivitat ist gegentiber der Chorismat-Mutase ebenfalls deutlich erniedrigt, aber gegeniiber der Anthranilat-Synthase noeh immer urn das 7-10fache erhoht. Die nachweisbare Aktivitat ist als ausreichend anzusehen, urn die Zellen mit den fUr Waehstum und normale Lebensprozesse notwendigen Mengen an den Aminosauren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan zu versorgen. 3. Das "Flaschenhals-Enzym" Anthranilat-Synthase zeigt von den 3 untersuchten Enzymen nieht nur die geringste Aktivitiit, sondern weist auch die groBte Empfindlichkeit gegenuber dem Tryptophan, einem der Endprodukte des Biosyntheseweges, auf. Der Kj-Wert von etwa 2,2-2,3Ilmol/1 kommt nahe an die Tryptophan-Konzentration heran, die fur andere sekundarstoffbildende pflanzliche Zellkulturen als zellint erner Pool ermittelt werden konnte (2-5 Ilmol fur Catharanthu,s roseus, Cinchona su,cciru,bra, SCHMAUDER, unpubliziert). WIDHOLM (1974a, b) beschrieb fUr Tabak, Sojabohne, Reis und Karotte zellinterne PoolgroBen von 16-18 Ilmol Tryptophan, die bei gegen 5-Methyltryptophan resistenten Linien urn das 25-30fache hOher lagen. Die Ki - Werte fUr den EinfluB des Tryptophans auf die Anthranilat-Synthase normaler Zellkulturen gibt er dagegen mit etwa 1-25,umol an (WIDHOLM 1972a, 1972b, 1972c, 1974b). Daher ist es wahrscheinlich, daB das von Natur aus gering aktive Enzym Anthranilat-Synthase relativ schnell durch den Effektor Tryptophan in seiner Aktivitat zusatzlich gedampft wird. Vergleicht man die spezifischen Aktivitaten und deren Verlauf wahrend der Kultur, so ergeben sich Parallel en zu einem anderen eukaryotischen System (SCHMAUDER und GROGER 1973). Bei Ascomyceten der Gattung Claviceps konnten deutliche Unterschiede in dem Aktivitatsverhalten der DAHP-, Anthranilat- und Tryptophan-Synthase alka-

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loidproduzierender und alkaloidfreier Stamme beobachtet werden. Die "Produzenten" zeigen einen schnellen Anstieg der Enzymaktivitaten wie auch einen Abfall der Aktivitat nach einem scharfen Maximum. Ein ahnliches Resultat beschreiben KNOBLOCH et al. (1981) fUr ein Schliisselenzym der Alkaloidbiosynthese von Catharanthus roseus-Zellkulturen. So zeigt zum Beispiel die Tryptophan-Decarboxylase von alkaloidbildenden Zellkulturen ein ausgepragtes Maximum zu Beginn der Kultur, gefolgt von einem schnellen Aktivitatsabfall. Es sonte in Anlehnung an WIDHOLM (1972b, c) in weiteren Experimenten geklart werden, ob es miiglich ist, mit Hilfe von Antimetaboliten des Tryptophans, wie z. B. 5-Methyl- oder 5-Fluortryptophan, Variant en zu isolieren, die in den regulatorischen Eigenschaften der Anthranilat-Synthase so verandert sind, daB sie eine erhiihte Biosyntheseleistung fUr Anthranilsaure oder deren Derivaten erbringen. Bisherige Versuche hierzu schlugen allerdings fehl. Nach mehrmonatiger Kultur auf 5-Fluortryptophan (5-20 ppm)-haltigen Medien waren keine Veranderungen des Verhaltens der Anthranilat-Synthase gegeniiber Tryptophan feststellbar (SCHMAUDER, SCHRODER und BOHM, unpubliziert). Wir danken Herm Dr. W. IHN, Jena, herzlich fiir die Aufnahme der hochaufgeliisten Massenspektren.

Literatur DOBEL, P.: Verringerung des Ploidiegrades und der Restitutionskembildung in einer gegen hohe 2,4-D-Konzentration resistenten Suspensionskultur von Nigella damascena. BioI. Zbl. 102, 431444 (1983). GADAL, P., and BouyssoU, H.: Allosteric properties of chorismate mutase from Quercus pedunculata. Physiol. Plant. 28, 7-13 (1973). GIBSON, F.: Chorismic acid. Biochem. Prep. 12, 94-97 (1968). GILCHRIST, D. G., WOODIN, T. S., JOHNSON, M. L., and KOSUGE, T.: Regulation of aromatic amino acid biosynthesis in higher plants. 1. Evidence for a regulatory form of chorismate mutase in etiolated mung bean seedlings. Plant Physiol. 49, 52-7 (1972). GILCHRIST, D. G., and KOSUGE, T.: Regulation of aromatic amino acid biosynthesis in higher plants. Properties of an aromatic amino acid sensitive chorismate mutase (CM-1) from mung bean. Arch. Biochem. Biophys. 164, 95-105 (1974). HIZUME, M., TANAKA, A., and SHIGEMATSU, H.: Detection of nucleolar organising regions in the chromosomes of Nigella damascena. Experientia 38, 238 (1982). Kd3hERSKA, 1., and NATARAJAN, A. T.: Distribution of heterochromatin in the chromosomes of Nigella damascena and Vicia (aha. Hereditas 79, 154-156 (1975). KNOBLOCH, K.-H., HANSEN, B., and BERLIN, J.: Medium-influenced formation of indole alkaloids and concomitant changes of interrelated enzyme activities in cell suspension cultures of Catharanthus rose us. Z. Naturforsch. 36e, 40-43 (1981). KURz, W. G. W., and CONSTABEL, F.: Continuous culture of plant cells. Contino Culture of Cells 2, 141-157 (1981). LINDSEY, K., and YEOMAN, M. M.: The Relationship between growth rate, differentiation and alkaloid accumulation in cell cultures. J. Exp. Bot. 34, 1055-1065 (1983). LOWRY, O. H., ROSEBROUGH, N. J., FARR, A. L., and RANDALL, R. L.: Protein measurement with Folin-phenol reagent. J. BioI. Chern. 193, 265-275 (1951).

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H. P. SCHMAUDER, P. DOBEL und D. GROGER, Charakterisierung von Nigella-Zellkulturen

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Anschrift der Verfasser: Institut fUr Biochemie der Pflanzen der Akademie der Wissenschaften der DDR, DDR - 4010 Halle (Saale), Weinberg.