Dünnschichtchromatographische bestimmung von chlorophyllen und carotinoiden aus kirschbaumblättern

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JOURNALOFCXIROMATOGRAPHY

DUNNSCHICHTCHROMATOGRAPHISCHE BESTIMMUNG VON CHLOROPHYLLEN UND CAROTINOIDEN AUS KIRSCHBAUMBLATTERN K. E-I. SCHAIaTEGGER

BiocJ8emisches Laboratorizcm, EidgcnBssiscJze Wddenswil (SGJZWC~Z) (Eingegangen den II. Dezembcr 1964)

VersaficJrsansta.lt fa’iv Oh?-,

We&-

und

Gartenbau,

In Zusammenhang mit physiologischen Untersuchungen an Kirschbaumblattern war es notig. eine differenzierte, quantitative Pigmentanalyse vieler Einzelblgtter durchzuftihren. Es wurde daher ein m8glichst einfaches Extraktions- und Trennverfahren, das eine Analyse mit wenig Blattmaterial erintiglicht, gesucht. Zur Bestimmung der Carotinoide sind zahlreiche ‘saulen-, papier- und dtinnschichtchromatographische Methoden publiziert wordenl-0, ebenso zur Trennung von direkt Chlorophyllen ~12 . BUTLER UND NORRIS~~ messen die Chlorophyll-Absorption an Apfelschnitzen. Aus verschiedenen Grtinden sind diese Verfahren ftir den obgen.annten Zweck nicht geeignet. In der vorliegenden Arbeit wird eine diinnschichtchromatographische Methode’ zur Bestimmung der Chlorophylle und Hauptcarotinoide in einzelnen Kirschbaumblattern nach einem einzigen Trenngang beschrieben. METHODE

Frisch gepfhickte Kirschbaumblatter wurden entrippt und sofort in der Reibschale in Trockeneis zerrieben und lyophilisiert. Das getrocknete Blattmaterial wurde vor der Untersuchung bis zu drei Monaten bei -18" aufbewahrt. Die Proben wurden maglichst im Dunkeln gehalten und alle Arbeiten wurden im Halbdunkel ausgeftihrt. Extraktion, chrom.atographischeTrennung und photometrische Bestimmung erfolgten raschmijglichst nacheinander. Die ganze Untersuchung dauerte ungeftihr vier Stunden. Das lyophilisierte Blattmaterial (0.1 g) wurde unmittelbar vor der Extraktion nochmals in der Rcibschale zerrieben, dann portionenweise mit frisch absolutiertem Aether unter Zusatz von Quarzsand’ und Natriumsulfat bei Zimmertemperatur extrahiert. Die vereinigten Aetherextrakte (30-40 cc) wurden am Vacuum zur Trockne ,eingedampft. Der in Eis oder Trockeneis gektihlte Riiclcstand wurde im Das Aether-Alkohol-Gemisch wurde jede Aether-Alkohol-Gemisch (I : I) gel&t. Woche frisch bereitet. Die Trennung wurde auf einer 0.35 mm Schicht’von Silikagel G durchgeftihrt*. Die Platten wurden bei 110~ getrocknet und im Exsikkator aufbewahrt. 0.2 ml der u -_i

* Gewissc Proben, besondors Bltme, licsscn sich schtlrfcr in die vorschiedenen Farbstoffe trennen auf psraffinietien Platten. Fiir solche PlslCten wurde Sililcsgol G an&&t: in Wasser in einem Gemisch von hllcohol und 5 o/OParaffin in Tetrachlorkohl&stoff (18 :I, v/v) aufgeschllmmt. und aufgetmgen. J, Clwomalog.,

19 (1965) 75-80

76

K. N.SCWALTEGGER

&the&&-alkoholischen Farbstofflosung wurden im Stickstoffstrom strichformig auf die Silikagelplatte aufgetragen und ungefjlhr 7 Minuten bei 50” nachgetrocknet. Der Chromatographiertrog wurde mit Glasperlen (Boden) und feuchtigkeitsunempfindlichern Glasfaserff its (Wande) belegt . Als Fliessmittelgemisch diente Petrolather (Siedepunkt 55-7o”)-Benzol-Alkohol(40 : 15 :3.6, v/v). Petrolather und Benz01 wurden iiber Natrium destilliert, Alkohol iiber Bariumoxyd. Der Trog mit der DtinnschichtPlatte und dem L8sungsmittelgemisch wurde einige Sekunden evakuiert. Nach 50-60 Minuten ,war die Grenzlinie bei 15 cm Steighijhe erreicht bei 20-23~. Das Dtinnschichtchromatogramm wurde im Vacuum bei Zimmertemperatur getrocknet. An der Silikagelschicht waren 12 Farbstoffe in Banden aufgetrennt. Jede Bande wurde fur sich abgekratzt. Chlorophylle und Carotinoide liessen sich aus dem Tragermaterial mit 95% hlkohol (pII 6.5) leicht herauslosen. Das Silikagel wurde durch kurze Zentrifugation abgetrennt und die Absorption der Farbstoffliisungen sofort mit dem Beckmann DB Spektrophotometer gemessen. Das Photometer wurde bei verschiedenen Wellenlangen geeicht. Die Teilungskoeffiziente der isolierten Farbstoffe wurden durch Ausschtitteln in gleichen Volumina Wexan-85 o/o Methanol (I : I, v/v) bei ca. 20' bestimmt. [Texan Zofingen) mit 85 y. Methanol gesattigt ; reinst zur Chromatographie (Siegfried, Methanol absolut (Siegfried, Zofingen) auf 85% (g/g) verdiinnt mit Wasser und mit Bexan gesattigt. J Als Epoxydnachweis bei den Carotinoiden wurde die Methode von YAMAMOTO, angewandt, und bei den Chlorophyllen wurde auf CHICHESTER UND NAICAYAMA~~ Magnesium mit Chinalizarin nach FEIGL~~ getestet. RESULTATE

UND

DISKUSSION

Die Blattfarbstoffe unterliegen bei Zimmertemperatur rasch einer Veranderung. Die &hen Kirschbaumblatter bediirfen zur Extraktion eines starken Losungsmittels fur hydrophobe sowie relativ hydrophile Pffanzenfarbstoffe. Durch wasserhaltige Losungsmittel, wie such durch geringe Ansauerung trockener Losungsmittel lassen sich die Farbstoffe rasch ausziehen. Chlorophyll wird dabei aber teilweise hydrolysiert und der Gehalt an Phaophytin erhoht sich entsprechend. Wird die Extraktion bei erhijhtem pH ausgeftihrt durch Zusatz von etwas Zinkkarbonat zum Aether, so erh5lt man zwei zusatzliche Chlorophyllbanden. Die Carotinoide verandern sich dabei nicht. Durch die mechanische Zerkleinerung des getrockneten Pff anzenmaterials wird die Labilitat der Farbstoffe stark erhiiht. Nach dem Mahlen in einer Mikroschlagmtihle . (Culatti, Zurich) erh5lt man in einzelnen, nicht in allen Untersuchungen, stark verBnderte Chlorophyll und Carotinoidbefunde. Eine quantitative Extraktion der Blattfarbstoffe mit Aether ist nur bei sehr fein zerriebenem Blattmaterial mijglich, daher wurde die Extraktion gleich in der Reibschale durchgeftihrt. Nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren liessen sich folgende Blattfarbstoffe abtrennen : @Carotin (mit Spuren a-Carotin) , Phaophytin, Chlorophylle u und b, Lutein, Violaxanthin, Neoxanthin und Porphyrin (siehe Tabelle I). Das Di_innschichtchromatogramm zeigte verschiedene Chlorophyllbanden. Sie wurden durch ihre Absorptionsspektren als Chlorophyll GE,respektive b identifiziert. Die verschiedenen Fraktionen wurden in der Folge mit Chlorophyll al, us, u3, respektive b, und b, bezeichnet, In Fig, I und 2 sind die Spektren aufgezeichnet. Da die J.C?zvomntog.,xg (1965) 75-80

CWLOROPWVLLE

TABELLE

UND

CAROTLN0ID.E

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KIRSCHBAUMBL~TTERN

I

FARBSTOPB-BRAKTIONEN UND

AUS

r\BSORPTIONSMhXIMh

DES IN

DtiNNSCHICHTCHROMhTOGRhMMES

MIT

ZUGEH6RIGEN

RF-WERTEN

ALICOHOL Rp-

Wfw

Absorfitio~snzaxinzn

/3-Cxrotin Ph~ophytin a Chlorophyll a, Chlorophyll a2 Chl,orophyll 21, Chloropl~yll b, Chlorophyll a3

0497

Lutcin Violsxsntliin Fralction I Violnxanthin Fralction 2 Ncoxanthin Porphyrin (c

0.15

m*

445

0.11

--426,

449

666,

427

4501 263

0.81

666, 409

o-73 o,GS o.Go 0.55 0.49

(i66, 427 666, 427 649, 464 649n 464 666, 427

0.086 0.033 0.020

(nzp)

423, 4oo 4651 436

Farbstoffe in ganz unterschiedlicher Menge vorlagen, wurden sie zur Bestimmung in verschiedenen LiSsungsmittelmengen gelijst. Die Chlorophylle ul+ unterscheiden sich im RF-Wert des Dtinnschichtchromatogramms und im Teilungskoeffizienten Hexany-, Methanol. Die drei Chlorophylle weisen dieselben Absorptionsmaxima auf und ungefghr denselben Kurvenverlauf. Analog Chlorophyll a, und as liegt die schwache Bande von Chlorophyll B, im Chromatogramm gleich tiber der Hauptfraktion bs. Sie liess sich oft schlecht abtrennen. Farbe und hbsorptionsspektren der beiden b-Fraktionen sind gleich, unterschiedlich sind such hier nur RF-Wert des Chromatogramms und Teilungskoeffizient. Weitere negativer Magnesiumbefund und Banden des Chromatogramms waren Phaophytin charakteristische, zusZ.tzliche Absorptionsmaxima bei 508 und 538 rnp -und das organophobere Porphyrin mit der Farbe und den Absorptionsmaxima von Chlorophyll a. Mengenmassig wurden in den untersuchten Kirschbaumblattern auf 100 Teile Chlorophyll u2 zum Beispiel 4 Teile Phaophytin, 14 Teile Chlorophyll a,, z Teile Chlorophyll a3 und 0.4 Teile Porphyrin a gefunden und auf IOO Teile Chlorophyll b, 31 Teile Chlorophyll B,. TAl3ELI.I;:

II

TEILUNGSKOEFIrIZIENTEN

IN

HEXAN-METHANOL Wexan

p-Carotin Pli&ophytin Chloropliyll Chlorophyll Chlorophyll Chlorophyll Lutein Violaxanthin Violaxanthin Neoxanthin

a al a2 b, b, Fraktion I Fralction 2

9803 97.6 94.2 78,s

I.7 9:: 2x,2 2941

Zo6:: 18.3

1745 4.0 1.6

33.9 81~7 82,s gG.0 9814

Mittclwert von 3 Mittclwert von 3 Mittclwcrt von 3 Mittclwcrt von 2 Einzclbestimmung Mittclwert von 4 Mittclwert von 4 Mittclwert von 2 Mittclwert von 2 Mittclwcrt von 3

Best. Best. Best. Best. Best. Best. Best. Best. Best.

J, Cltromatog., Ig (1965) 75-80

78

K. H. SCWALTEGGER

600

Wellenltlnge

500

(mp)

Fig. I. Absorptionsspcktrcn in Alkohol (unkorrigiert und Chlorophyll cc2- - -; Chlorophyll a3 -* -. -* ; Ph&ophytin

qualitativ). a - --;

Chlorophyll Porphyrin a

Fig. 2. Abso&ionsspcktrcn Chlorophyll b, - - -.

qualitsliv).

Chlorophyll

in Allcol~ol (unkorrigicrt

und

Chlorophyll a3 veranderte sich auf vielen, aber nicht allen Dtinnschichtchromatogrammen inner-t r/z bis 3 Stunden von einem dunkelgrtinen zu einem gelben Farbstoff, der in Alkohol dieselben Absorptionsmaxima zeigte und denselben Verlauf des Spektrums wie die griine Fraktion (siehe Fig. I). Chlorophyll a3 konnte nicht immer isoliert: werden. Oft land man Chlorophyll a3 nur als gelblichen Rand der Chlorophyll bs-Bande auf dem Chromatogramm. Die Carotinoide konnten auf Grund der &PWerte des Chromatogramms, der Maxima- und Minimaverteilung* des Absorptionsspektrums und des Epoxydnachweises charakterisiert werden. Einige Carotinoidmuster wurden freundlicherweise von der Firma Hoffmann La-Roche & Co, AG zur Verfiigung gestellt. ,&Carotin wurde zusammen mit a-Carotin bestimmt. Da letzteres bekanntlich nur in sehr geringen Mengen vorkommt, wurde immer nur p-Carotin erwahnt. TABELLE

III

FARBSTOIWGEHALTSZAHLEN

IN

EINEM

KLRSCHBAUMBLATT

(BEISPIEL)

pg Farbstoff pro g Xrocimasubstan.z 264 342 248

Violaxanthin Ncoxmthin Chlorophyll a, Chlorophyll a2 Chlorophyll a3 Chlorophyll b, Chlorophyll b, Phtiophytin Porphyrin a

110

226 1560

29 12c

407 57 G

Die erhaltenen Zahlenwerte lassen sich bei genauer Einhaltung des Verfahrens reproduzieren. Violaxanthin zerfallt beim Chromatographieren in zwei andere Carotinoide, Fraktion I und 2. In Fig. 4 sind die Absorptionskurven einer reinen ViolaxanthinJ. Ckvomatog.,

x9 (W%)

75-80

CI-ILOROPHYLLE

UND CAROTINOIDE AUS KIRSCWBAUMBL~TTERN

16sung (Hoffman La-Roche & Co. AG) wiedergegeben, ‘I und 2 nach dem Chromatographieren, die mit den I
000

79

sowie deren gelbe Fraktionen Fraktionen I und 2 aus dem von Fraktion I zu 2 ist unterverlief der Epoxydnachweis

300

Wellenlijnge(ml-l)

Fig. 5. hbsorptionsspcktron - - -; Neoxanthin - - --;

in .Alkohol (unkorrigicrd und quslitativ). Neoxanthin grlin -*-*-* I

,%Czwotin -:

‘9g. 4. Absorptionsspektren in Alkohol (unkorrigiert und qualitativ). Violaxanthin, I matographiert ; Chromatographierte Fraktion I - - - ; Chromalzographierte -* -. -* ; Chromatographierto Fraktion 2. grtin - - -.

Lutein nicht chroFraktion z

Wie bei Chlorophyll a3 treten such bei den Carotinoiden Umlagerungen auf beim Stehenlassen der Diinnschichtplatte am Licht. Die gelbe Fraktion 2 aus Violaxanthin wird oft griin. Das Absorptionsspektrum der griinen Verbindung zeigt das Maximum bei 450 rnp nicht mehr, dafiir ist das Maximum bei 382 rnp ausgeprggter. Relativ selten konnte bei Neoxanthin eine Ver&nderung zu einem gelbgriinen Farbstoff beobachtet werden. Die Umlagerung geht anscheinend bei Neoxanthin vie1 langsamer vor sich, als bei der Violaxanthin-Fraktion 2. Das Absorptionsspektrum ist nach dem ktirzeren Wellenl5,ngenbereich verschoben. Die Verschiebung gleicht derjenigen, die bei der Umwandlung von Violaxanthin zu Fraktion I nach dem Chromatographieren festgestellt wird. DANK

Herrn Dr. 15. STUTZ danke ich fiir die kritische Durchsicht

der Arbeit.

ZUSAMMENFASSUNG

Es wird eine einfache diinnschichtchromatographische Methode zur Bestimmung von Chlorophyllen und Carotinoiden aus einzelnen I
I<. II. SCNALTEGGER

80

SUMMARY

A simple thin-layer chromatographic method for the estimation of chlorophylls and carotenoids from single leaves of sweet cherry trees is described. The following pigments could be isolated in one separation step: p-carotene, lutein, violaxanthin, neoxanthin, phaeophytin, three chlorophylls a, two chlorophylls 6, porphyrin. The pigments are characterized by chromatographic data, partition coefficients and spectra. The lability of Vthe pigments during the extraction and on the thin-layer is briefly discussed. Certain visible changes of chlorophyll and carotenoids taking place on the thin-layer plate (colour changes from green to yellow, respectively from yellow to green) are registered. BIBLY.OGRAPHIE

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