Influence de l'injection de pyrodoxine sur la décarboxylation de l'acide glutamique et de l'acide cystéinesulfinique par le cerveau chez le rat

634

B . M . BRAGANCA, I. ARAVINDAKSHAN, D. S. GHANEKAR

VOL. 2 5

(1957)

REFERENCES 1 L. D. WRIGHT, H. R. SKEGGS AND A. D. WELCH, Arch. Biochem., 6 (I945) I5. M. SILVERMAN, J. C. KERESZTESY AND G. J. KOVAL, J. Biol. Chem., 2 i i (I954) 533 j. S. DINNING,J. T. SIME AND P. L. DAy, Federation Proc., 15 (1956) 549. 4 S. FUTTERMANN, Federation Proc., 15 (I956) 258. 5 A. C. BRATTON AND E. K. MARSHALL, J. Biol. Chem., 128 (1939) 537. 6 B. M. BRAGANCA AND U. W. KENKARE, 3rd Congr. Intern. Biochem. Research, 4 (1955) 26. 7 B. L. HUTCHINGS, E. L. R. STOKSTAD,J. H. BOOTHE, J. H. MOWAT, C. W. WALLER, R. B. ANGIER, J. SEMB AND Y. SUBBAROW, J. Biol. Chem., 108 (1947) 705 • H. M. KALCKAR, J. Biol. Chem., 167 (I947) 461. 9 U. W. KENKARE AND ]3. M. BRAGANCA,unpublished data. 10 H. M. KALCKAR, N. O. KJELDGAARD AND H. KLENOW, Biochim. Biophys. Acta, 5 (195o) 586. 11 O. H. LOWRY, O. A. BESSEY AND E. J. CRAWFORD, J. Biol. Chem., i8o (1949) 389 • 12 E. L. R. STOKSTAD, B. L. HUTCHINGS, J. H. MOWAT, J. H. BOOTHE, C. W. WALLER, R. B. Ar~GIER, J. SEMB AND Y. SUBBAROW, J. Am. Chem. Soc., 7 ° (1948) 5. la B. KAMAN, Acta Chem. Scan&, 2 (1948) 383 . 14 M. WEBB, Biochim. Biophys. Acta, 17 (1955) 212. 15 H. A. KREBS, The Enzymes, Vol. II, Part I, Academic Press, Inc., New York, 195 I, p. 499. 16 H. M. KALCKAR, N. O. KJELDGAARD AND H. KLENOW, J . Biol. Chem., 174 (1948) 771. 17j. C. VAN METERAND J. J. OLESON,J. Biol. Chem., i87 (7950) 91.

Received April i3th , i957.

INFLUENCE DE L'INJECTION DE PYRIDOXINE

SUR

LA D ~ : C A R B O X Y L A T I O N D E L ' A C I D E G L U T A M I Q U E E T D E L ' A C I D E C Y S T ~ : I N E S U L F I N I Q U E P A R L E C E R V E A U C H E Z L E RAT CARLO D E MARCO*

Laboratoire de Chimie biologique de la Facult~ des Sciences, Paris (France)

I1 est maintenant bien 6tabli que la dGcarboxylation enzymatique, chez les animaux supGrieurs, de l'acide cystGinesulfiniquO,2, 3, de l'acide cystGiquea et de l'acide glutamiqueS, 6 implique la participation du phosphate de pyridoxal. Des travaux antGfieurs ont montr6 que, chez le rat a e t le ]apin 7, l'activit6 dGcarboxylante de broyats de foie vis ~ vis de l'acide cystGinesulfinique et de l'acide cystGique n'est pas sensiblement accrue par addition, in vitro, de phosphate de pyridoxal, ce qui indique que, dans le foie, les syst~mes enzymatiques responsables de ces dGcarboxylations sont pratiquement saturGs en coenzyme. Ces travaux ont montr6 d'autre part que, chez les m~mes animauxa, 7, l'activit6 d~carboxylante de broyats de cerveau vis h vis de l'acide cystGinesulfinique, de l'acide cystGique et de l'acide glutamique est au contraire fortement accrue par l'addition, in vitro, de phosphate de pyridoxal. I1 a paru utile de rechercher £ quoi ~tait due une telle diffGrence entre les systGmes dGcarboxylants du cerveau et ceux du foie. A priori, on pouvait faire deux hypotheses: * Boursier du Consiglio Nazionale delle Ricerche. Adresse actuelle: I s t i t u t o di Chimica biologica, Universita di Roma, R o m a , Italia.

BibliograpMe p. 64o.

V()l., 2,~ ( I 9 5 7 ) I)I.~('.\RBOXYI..VII()N I)'.\(II)F.S (;LUI.\MIt2tI- l.;t (",STI.~INISI'I.I.'INI(,2UI.. (~.~5

on p o u v a i t imaginer que, les a p o e n z y m e s du cerveau 6tant les m6nles (lne ('t,ux du foie ou diff&ents, la c o n c e n t r a t i o n en coenzyme dans h: cerveau soit insufflsante pour assurer la s a t u r a t i o n des a p o e n z y m e s en coenzx'me: dans ce cas, le cerveau serait n a t u r e l l e m e n t d6ficient en coenzyme et il serait intdressant de savoir ce que devient son fonctionnement chez l ' a n i m a l a y a n t req'u un a p p o r t massif de vitamine B 6. On p o u v a i t dgalement penser que, dans le cerveau, les systOmes e n z y m a t i q u e s ne sent pas les m6mes que dans le foic, les constantes de dissociation des systt"mes a p o e n z y m e coenzyme (;tant plus (;levdes dans le cerveau; dans ce cas, ce dernier fonctionnerait au m a x i m u m chez l ' a n i m a l v i v a n t et le ralentissement de l'activit6 d(,carboxylante des b r o y a t s c o r r e s p o n d r a i t it une dissociation du coenzyme, dissociation provoqu6e p a r la d e s t r u c t i o n des organisations cellulaires et se m a n i f e s t a n t au sein des solutions salines utilisdes; il s ' a g i r a i t ainsi d ' u n e action de dilution s ' e x e r q a n t au cours de la p r @ a r a t i o n des e x t r a i t s enzymatiques. l.a question a ddjlt fait l ' o b j e t de quelques investigations: d'apr~s \VINGO ET AWAPARA s, la sensibilitY', des b r o y a t s de cerveau ~t l ' a d d i t i o n tie p h o s p h a t e de p y r i d o x a l s ' e x p l i q u e r a i t , au moins en pattie, p a r un ph{mom6ne de dilution. I)'aprbs I{(mERTS 9, au contraire, aucune action de dilution ne p o u r r a i t ~tre mise en dvidence, ce qui conduit "t penser que, n o r m a l e m e n t , in vivo, le cerveau du rat est loin d ' e t r e satur6 en coenzyme. R o b e r t s a cherch(" "t accroitre l'activitd d 6 c a r b o x y l a n t e du cerveau vis ~ vis de l'acide g l u t a m i q u e , chez le rat, en faisant ing6rer "t l'animal, p e n d a n t I I jours, de la pyridoxine, "t la dose de I m g par jour. Il n'a p a s t m c o n s t a t e r de r4sultat significatif chez les a n i m a u x ainsi trait4s. E t a n t donnd les incertitudes s u b s i s t a n t sur la raison pour laquelle l'activit~ des b r o y a t s de cerveau peut 6tre a u g m e n t d e p a r a d d i t i o n de p h o s p h a t e de pyridoxal, il a paru utile d ' ~ t a b l i r (te fa¢on plus precise si ce ph~nom~'ne 6tait dfl ~t une nons a t u r a t i o n r6elle du cerveau en coenzyme chez l ' a n i m a l v i v a n t ou si il 6tait dfl it une dilution lots de la p r d p a r a t i o n des hroyats. Dans le prdsent travail, nous avons tout d ' a b o r d montrd qu'il s'agissait bien d ' u n e n o n - s a t u r a t i o n in rive du cerveau en coe n z y m e ; nous avons ensuite recherch6 s'il dtait possible d'accroitre l'activit6 d6c a r b o x y l a n t e du cerveau vis it vis de l'acide g l u t a m i q u e et (te l'acide cyst4inesulfinique, chez le rat, en in jectant ~t cet a n i m a l des q u a n t i t d s ('lev(~es de pyridoxine.

PARTIE EXPER IME NTA Lt"-

]'ech),iques Les rats utilisds sent des rats mfiles "vVistar, de 17o b, 2oo g, soumis h l'alimentation normale du laboratoire. La pyridoxine (chlorhydrate de pyridoxine, H o f f m a n n l.a Roche ou "Becilan" Specia) est injectde par vole sous-cutande ou intraveineuse en une seule Iois, saul indication autre. "t raison de 5 mg dans i ml de solution physiologique neutralisde, l.es a n i m a n x sent sacrifids" "it des t e m p s variables apr~s l'injection. Le cerveau, pr~lev6 aussi r a p i d e m e n t que possible, est broyd avec 2 g. 3 fois son poids d'eau distillde d a n s un b r o y e u r de P o t t e r - E l v e h j e m ; la ddcarboxylation du s u b s t r a t 6tudi6 est suivie p a r le d6gagement du CO 2, a. 35 ~ C, selon la technique classique de W a r b u r g . I.e t e m p s m a x i m u m entre le prdlbvement du cerveau et le d~but des mesurcs ne d~passe pas 2o minutes. On utilise des cellules de \ V a r b u r g /t 2 a m p o u l e s latdrales; chaque eelhfle contient z ml de suspension de b r o y a t de cerveau, 0.8 ml de solution t a m p o n p h o s p h a t e o.25 3 ' / ( p t t 6.8), dventuellem e n t o.t ml d ' u n e solution de p h o s p h a t e de pyridoxal, sel de sodium ( " R o c h e Products") h l mg * Sans avoir 6t6 pr6alablement perfust}s: une perfusion cut n6cessitd, en effet, l'anesthdsie de l'animal, et il a paru souhaitable d'6viter t o u t t r a i t e m e n t qui eut risqu6 d'influencer le m~tabolisme du cerveau.

Bibliographie p. 61o.

636

c. DE MARCO

VOL25(I957)

p a r ml, et de l'eau de telle sorte q u e le v o l u m e total final du liquide soit de 3.4 ml. U n e a m p o u l e lat6rale r e n f e r m e o.2 ml d ' u n e solution du s u b s t r a t neutralis6 I6. I o - S M , et l ' a u t r e o.2 ml d ' u n e solution d ' a c i d e s u l f u r i q u e 5 N. Le t o u t est sous a t m o s p h e r e d ' a z o t e pur. Les v a i e u r s de Qcos s o n t calcul6es ~t p a r t i r de la q u a n t i t 6 tot.ale de CO t d6gag6, m e s u r d e apr~s 6o m i n u t e s d ' i n c u b a t i o n , apr~s acidification du milieu r6actionnel, et s a n s t e n i r c o m p t e d u faible d 6 g a g e m e n t de CO 2 observ6 d a n s les b r o y a t s de c e r v e a u s a n s i n t r o d u c t i o n de s u b s t r a t , ceci p o u r des raisons d6jA expliqu6es p a r Z)AVISONa e t q u e n o u s a v o n s pu confirmer. T e n a n t c o m p t e de la possibilit6 envisag6e p a r DAVISONa, q u e les d 6 c a r b o x y l a s e s du c e r v e a u s o n t des e n z y m e s tt g r o u p e s - S H , n o u s a v o n s v6rifi6 si l'activit6 d 6 c a r b o x y l a n t e de b r o y a t s de c e r v e a u 6tait sensible ou n o n ~ l ' i n t r o d u c t i o n de thiols, et ceci en pr6sence ou n o n de p h o s p h a t e de pyridoxal. N o u s a v o n s utilis6 c o m m e thiol le B A L (2,3-dimercaptopropanol) (Specia). Cette s u b s t a n c e , ~. la c o n c e n t r a t i o n finale: 3 - 1 o - $ M , e n t r a t n e u n e inhibition import.ante de la d6c a r b o x y l a t i o n de l'acide g l u t a m i q u e et de l'acide cyst6inesulfinique p a r u n b r o y a t de cerveau. Ce fait p e u t 6tre rapproch6 d ' u n e p a r t d ' u n e o b s e r v a t i o n de ROBERTS et al. s d ' a p r 6 s laquelle la cystdine ( i . i o - a M ) inhibe de 5 o % la d 6 c a r b o x y l a t i o n de l'acide g l u t a m i q u e d a n s le cerveau d u rat, et d ' a u t r e p a r t des r 6 s u l t a t s de BERGERET et al.: qui o n t m o n t r 6 q u e la cyst6ine (5" I o - a M } i n h i b e d ' e n v i r o n 4 o % la d 6 c a r b o x y l a t i o n de l'acide g l u t a m i q u e , de l'acide cyst6inesulfinique et de l'acide cyst6ique dams le c e r v e a u du lapin, s a n s d o u t e p a r c o m b i n a i s o n de ce compos6 a v e c le p h o s p h a t e de pyridoxal. II n ' 6 t a i t donc p a s possible d ' e m p l o y e r n i l e BAL, ni la cyst6ine c o m m e a c t i v a t e u r s 6 v e n t u e l s des d6carboxylases d a n s le cerveau.

RESULTATS

Influence de la quantit~ de broyat sur la vitesse de d~carboxylation de l'acide glutamique et de l'acide cyst~inesul~nique Les courbes des Figs. I et 2 montrent que les vitesses de d6carboxylation de l'acide glutamique et de l'acide cyst6inesulfinique, en pr6sence ou en absence de phosphate de pyddoxal, sont rigoureusement proportionnelles ~ la quantit6 de broyat utilis6. Ce r6sultat, qui confirme les observations de ROBERTS 9, montre qu'fl ne se manifeste ici aucun effet de dilution. On peut en conclure que ]a quantit6 de phosphate de pyridoxal disponible clans le cerveau, in vivo, pour le fonctionnement des d6carboxylases de cet organe est tr6s inf6rieure k ce qui serait n6cessaire pour que ces enzymes puissent exercer leur activit6 maximum.

300

/

U

~oo

/

150 U

I

5oo

.t

50

-

1oo

15o

mg (poid$ r~c de broyat de cerveau)

Fig. i. Influence de la c o n c e n t r a t i o n en e n z y m e s u r l'intensit6 de la d 6 c a r b o x y l a t i o n de l'acide glutamique. Bibliographie p. 64o.

-./

j s

25 50 75 mg (polds sec de broyat de cerveou)

Fig. 2. Influence de la c o n c e n t r a t i o n en e n z y m e s u r l'intensit~ de la d 6 c a r b o x y l a t i o n de l'acide cyst~inesulfinique.

VOL.

25 (1957)

I)I~X:AI{BOXYI.ATION I ) ' A C I I ) I - S ( ; I . U T . X M I Q U I - 1.71 t Y S ' f I : H N E S L : I . F I N 1 Q I ' I . ~ {~.{7

Influence de l'im.'ection de pyridoxim~ sur ht vitesse ,to ddcarhl~xylation, d,' l'acide ,@dam.ique et de l'acide cystiinesul/i~dque L'influence de l'injection de pyridoxinc sur l'activit(' des d(~.carboxylases dn ccrvt.au est 6tudide ici en comparant les vitesses de ddcarboxylation de l'acide glutanaique et de l'acide cystbinesulfinique par des broyats de. cerveau de rats normaux additionn('s ou non in vitro de phosphate de pyridoxal, avec les vitesses de ddcarboxvlation des m~mes substrats, dans les retirees conditions, mais sous l'action de broyats de cerveaux pr(devds chez des animaux prdalablement injectfis de pyridoxine et sacrifids 2, (~, 24, 48 et 72 heures aprbs cette injection. Les rdsultats obtenus sont groupds clans les Tableaux I et II. Les chiffres de ces tableaux permettent de constater qu'il cxistc des diffdrences significatives entre la vitesse de ddcarboxylation du cerveau des animaux tdmoins et des animaux injectds lorsque les animaux sont sacrifi6s quelques heures aprbs l'injection; dtant donn6 que les diffdrences obtenues 72 heures apff, s l'injection ne sont plus nettement significatives, nous avons limit(', nos essais "Xcette pdriode. Dans tous les cas l'injection intraveineuse conduit "X une augmentation de la dt4carboxylation plus grande et plus rapide; en particulier ddj~t 2 heures apff~s l'injection intraveineuse, on constate une augmentation de l'ordre de 2o it 3o% pour l'un et l'autre substrat. I1 West pas possible d'obtenir une augmentation plus forte en injectant TABLEAU

I

D£CARBOXYLATI ON DE L ' A C I D E I . - G L U T A M I Q U E

RT.x RT.2 A B SC IV T N

= = = = = = =

B r o y a t de c e r v e a u d e r a t B r o y a t de c e r v e a u de rat B r o y a t de c e r v e a u de rat B r o y a t d e c e r v e a u d e rat Injection sous-cutande. Injection intraveineuse. T e m p s , en h e u r e s , dcould Nombre d'animaux.

tdmoin tdmoin injectd injectd

+ + ~n-

acidc acide acide acide

glutamique. g l u t a m i q u e + p h o s p h a t e tie p y r i d o x a l . glutamique. g l u t a m i q u e + p h o s p h a t e de p y r i d o x a l .

e n t r e l ' i n j e c t i o n tie p y r i d o x i n e et le sacrifice de l ' a n i m a l .

P o i d s sec des b r o y a t s de c e r v e a u : 8o ~t 9 o mg. A RI'.1

. . . . 5 mg B, 5C

T .~,"

27

Qco,

o.87 ~_O.1¢)

/

--

g"

--

1)

--

%act.

loo

o/ lo a c t . pot.

.

.

.

.

.

B .

.

.

.

.

.

. . . . 5 mg B e IV

.

72

2

6

24

4 A"

Itl

7

tl

6

12

2,1

j

h

I.O 4

l.On

0.07

1.1¢)

I.l 5

1.12

: 0.08

:O.O2

- o . n7

.;..O. X3

[.o.14

4 .08

".77

2.33

z.53

5.00

5.45

3 .80

56

42

"~O.O I

<~O.O I

127

11(~

50.5

47.5

53

48

43

~O.O2

~O.I

~O.OI

~O.Ol

~O.()I

=0.02

ii1

133

132

129

117

52

51

46

44

" P l u s i e u r s e s s a i s o n t dt6 faits e n d o u b l e .

5z.7

22

41

40.5

to

2.1¢1

2.20

~-o.42

::O.45

2.2o

41

•

64 o.

I.O2 -: O.O¢~

44

110

RT.2 5 mg B, SC

.t8

! 0.09

Bibliographie p.

.

d."

l.Ir

-

.

5

! O.18

39.5

.

o.08

" ---

4° >O. 5

25¢)

2.51

zoo

1oo

638

c. DE MARCO

VOL. 2$ (1957)

2 lois 5 m g de pyfidoxine k 3 heures d'intervalle et en sacfifiant l'animal 3 heures apr~s la seconde injection. Dans tous les cas, la vitesse de d6carboxylation en presence de phosphate de pyridoxal ajout6 in vitro, est la m~me pour les animaux norrnaux et pour les animaux inject6s. TABLEAU

II

D]~CAEBOXYLATION DE L'ACIDE CYSTgINESULFINIQUE RT.I RT.2 A B

= = = =

Broyat Broyat Broyat Broyat

de de de de

cerveau cerveau cerveau cerveau

de de de de

rat rat rat rat

t~moin t~moin inject6 inject6

+ + + +

acide acide acide acide

cyst6inesulfinique. c y s t 6 i n e s u l f i n i q u e + p h o s p h a t e de p y r i d o x a l . cyst~inesulflnique. c y s t ~ i n e s u l f i n i q u e + p h o s p h a t e de p y r i d o x a l .

(Pour le reste des l~gendes, cf. T a b l e a u I) A

B I~

RT.x

RT.2** 5 mg B a S C

N

r5

Qco,"

5 mg B, SC

5 mg B I I V

5

2g

48

72

2

16

48

zx

8

9

6

6

4

6

0.65

o.81

0.82

0.79

0.76

0.79

0.79

0.76

2.4i

2.35

4-0.o9

+0.06

--'o.II

4-0.08

4-0.04

4-0.06

+0.08

4-0.08

4-o.18

--0.29

t

--

g

--

25

•P

--

<0.0I



<0.02

<0.01

<0.02

<0.02

124

126

I22

I17

122

I22

IX7

% act.

5 $o

8

4.75

IO0

3 .68 22

3 .68 23

2.77

3.47

20

•

2i

2.65

2.63

I8

--

2I

.

,

.

0.55

--

22

--

>0. 5

.

.

L es v a l e u r s de Qcot o n t ~t6 calcul6es sans soustraxre la v a l e u r due a la falble a c t l v l t 6 p r o p r e du c e r v e a u 6 t a n t donn6 que, a v e c du c e r v e a u de r a t inject6 i nc ub6 s a n s s u b s t r a t , les r a p p o r t s r e s t e n t les m ~ m e s q u e l'on t i e n n e c o m p t e ou non de c e t t e a c t i v i t 6 propre. • " Les chiffres i n d i q u 6 s d a n s les colonnes RT.z et B o n t 6t6 o b t e n u s a v e c des a n i m a u x n ' a p p a r t e n a n t p a s au m~me lot que c e u x a y a n t fourni les chiffres indiqu~s d a n s le T a b l e a u I e t d a n s les colonnes RT.z et A du p r 6 s e n t t a b l e a u . TABLEAU

III

INFLUENCE DU SANG DE RAT INJECT]~ DE VITAMINE B 6 SUR LA DI~CARBOXYLATION DE L'ACIDE GLUTAMIQUE PAR DU BROYAT DE CERVEAU R T = B r o y a t de c e r v e a u de r a t tdmoin. R T + S = B r o y a t de c e r v e a u de r a t t 6 m o i n + s a n g du m ~ me a n i m a l . R T % Siv. = B r o y a t de c e r v e a u de r a t t 6 m o i n + s a n g d ' u n a u t r e a n i m a l a y a n t re~u p a r i n j e c t i o n i n t r a v e i n e u s e 5 m g de v i t a m i n e B6, e t sacrifi6 2 h e u r e s apr~s. D 6 t a i l s e x p ~ r i m e n t a u x darts le t e x t e . RT

Qco I

o.64

RT - 5

o.64

R T ~- Si,,

o.65

Pour 6carter toute possibilit6 que l'augmentation de la vitesse de d~carboxylation mise en 6vidence n'ait 6t6 provoqu6e par du phosphate de pyridoxal pr6sent initialement dans le sang irrigant le cerveau de l'animal inject~ et mis ainsi en contact avec les cellules du cerveau au cours du broyage de cet organe, nous avons recherch~ si Bibliographie

p. 640.

VOL.

llN (1957) DI2;CARBOXYL.\TIOS I)'.\CII)1.2S (,LUT.XMIQUI? t..T CYSTt~INI.;SVI.I:INIqKI.: t)39

l'addition du sang d'un rat inject(~ par vole intraveineuse de pyridoxine, on de phosphate de pyridoxal et sacritid 2 heures apr~'.s, augmente la vitesse de ddcarboxylation de l'acide glutamique. Le volume de sang utilisd a 6% de o.o2 ml par cellule, ee qui est tr~s sup6rieur "t la quantit6 de sang prdsente dans 2 ml de broyat, d(~terininOe par dosage de l'h~moglobine. A titre d'exemple, nous donnons ci-dessous (Tableau I I I ) , le rdsultat d'une expdrience. Aucune augmentation de la ddcarboxylation n'a jamais pu ~tre mise en ~vidence, ee qui exclut qu'une quantit~ efficace de phosphate de pyridoxal ait dt~. prdsente clans le faible volume de sang dventuellement introduit avec le broyat de cerveau. Remarque I1 n ' a p a s dt6 possible de c o n s t a t e r , p a r c h r o m a t o g r a p h i e sur papier ~t l'aide du s o h , a n t p h d n o l - e a u (8o:2o) de diftdrences appreciables e n t r e les q u a n t i t 6 s d ' a c i d e y - a m i n o b u t y r i q u e c o n t e n u e s d a n s les filtrats o b t e n u s apr~s ddprot6inisation p a r l'acide trichlorac~tique des b r o v a t s de c e r v e a u x d ' a n i m a u x t d m o i n s et des b r o y a t s de c e r v e a u x d ' a n i m a u x inject6s.

CONCLUSIONS

Les r~sultats du prdsent travail montrent que dans le cerveau du rat, chez l'animal vivant normal, la quantitd de coenzyme (phosphate de pyridoxal) disponible est insuffisante pour que l'activitd maximum de l'enzyme ou des enzymes ddcarboxylant l'acide glutamique et l'acide cyst~inesulfinique puisse s'exercer. Aprbs injection chez l'animal, en une seule lois, d'une quantit6 massive de pyridoxine, on observe une augmentation significative de l'aptitude du cerveau k d~carboxyler in vitro les aeides amin~s en question. Toutefois eette augmentation ne d~passe pas 222.0 de celle obtenue par addition de phosphate de pyridoxal in vitro. I1 apparait ainsi que, m~me en donnant ~ l'animal des quantit~s importantes de vitamine B e, il n'a pas ~t~ possible, dans les conditions exp~rimentales du prdsent travail, de saturer en eoenzyme la ou les apod6carboxylases en ieu.

R~SUM~:t L a q u a n t i t ~ de p h o s p h a t e de p y r i d o x a l disponible d a n s le c e r v e a u du r a t in rive p o u r le Ionctionnem e n t des d d c a r b o x v l a s e s de cet o r g a n e est trbs infdrieure & ce qui serait ndcessaire p o u r q u e ces e n z y m e s p u i s s e n t exercer leur activit6 m a x i m u m . I1 est possible d ' o b t e n i r u n e a u g m e n t a t i o n significative de l ' a p t i t u d e du c e r v e a u ~ la d ~ c a r b o x y l a t i o n en i n j e c t a n t ~ l ' a n i m a l u n e q u a n t i t 6 m a s s i v e de pyridoxine, m a i s l ' a u g m e n t a t i o n ainsi o b t e n u e n ' a p a s d~pass6, d a n s les conditions du p r e s e n t travail. 22 % de celle o b t e n u e p a r a d d i t i o n de p h o s p h a t e de p y r i d o x a l in vitro. SUMMARY T h e a m o u n t of p y r i d o x a l p h o s p h a t e available in t h e brain of t h e rat in rive for t h e f u n c t i o n i n g of tile d e c a r b o x v l a s e s of t h i s o r g a n is v e r y m u c h less t h a n t h a t which would be n e c e s s a r y to allow t h e s e e n z y m e s to e x e r t their m a x i m u m a c t i v i t y . I t is possible to o b t a i n a significant increase in t h e c a p a c i t y of t h e brain for d e c a r b o x y l a t i o n b y injecting into t h e a n i m a l m a s s i v e q u a n t i t i e s of p y r i d o x a l , but, u n d e r t h e c o n d i t i o n s of this work, t h e increase t h u s obtained h a s n o t exceeded 22 % of t h a t o b t a i n e d by t h e a d d i t i o n of p y r i d o x a l p h o s p h a t e in vitro. 13ibliographie p. 640.

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c. I~E MARCO

VOL. 25 (1957)

BIBLIOGRAPHIE 1 F. CHATAGNER, H. TABECHIAN ET B. BERGERET, Biochim. Biophys. Acta, 13 (1954) 313 . B. BERGERET, F. CHATAG.'~ER ETC. FROMAGEOT, Biochim. Biophys. Acta, 17 (I955) I28. s A. N. DAVISON, Biochim. Biophys. Acta, 19 (1956) 66. 4 H. BLASCnKO, S. P. DATTA ET H. HARRIS, Brit. J. Nutrition, 7 (1953) 364 • 5 E. ROBERTS ET S. FRANKEL, J. Biol. Chem., i88 (195 I) 789 . 6 E. ROBERTS ET S. FRANKEL, J. Biol. Chem., 19° (1951) 5o5. B. BERGERET, F. CHATAGNEE ETC. FROMAGEOT, Biochim. Biophys. Acta, 22 (I956) 329 • s W. J. WINOO ET J. AWAPARA, J. Biol. Chem., 187 (195o) 267. 9 E. ROBERTS, F. YOUNGER ET S. FRANKEL, J. Biol. Chem., I91 (i951) 277.

Re~u le 12 avril 1957

Short Communications

Some observations on the extra-protein of cross-striated muscle SZENT-GYoRGYI el al. 1 reported t h a t w h e n glycerated myofibrils are e x t r a c t e d with KC1 solutions of h i g h ionic s t r e n g t h w i t h a d d e d MgCI z a n d A T P or p y r o p h o s p h a t e , m y o s i n p a s s e s into solution t o g e t h e r w i t h a n o t h e r fraction w h i c h is soluble a t low ionic s t r e n g t h . VILLAFRANCA~ s t u d i e d t h e s a m e fraction further, w h i c h he called " E x t r a - P r o t e i n " , b o t h in glycerated a n d fresh myofibrils. H e s u g g e s t e d t h a t it is a n o t h e r fibrous protein, w h i c h in a d d i t i o n to m y o s i n , actin, a n d t r o p o m y o s i n , is leached o u t of myofibrils w h e n t h e y are t r e a t e d with a n y m e d i u m s u i t a b l e for t h e e x t r a c t i o n of m y o s i n . He pointed o u t t h a t its viscosity is reduced b y increasing t h e ionic s t r e n g t h of t h e solution, b u t its intrinsic viscosity is lower t h a n t h a t of tropom y o s i n u n d e r t h e s a m e conditions. Moreover, it is precipitated a l m o s t c o m p l e t e l y a t lower (NH4)zSO4 c o n c e n t r a t i o n s t h a n t r o p o m y o s i n . W h i l e s t u d y i n g myofibrillar proteins in v i t a m i n E-deficient rabbits, we also o b s e r v e d t h a t a p a r t of t h e p r o t e i n material, G h i c h is e x t r a c t e d b y c o n c e n t r a t e d KCI, is soluble a t low ionic s t r e n g t h , b u t o u r r e s u l t s indicate t h a t it is n o t a pure protein a n d t h a t s o m e of its properties differ from t h o s e reported b y VILLAFRANCA. T h e p u r p o s e of t h i s n o t e is to give a s h o r t a c c o u n t of o u r o b s e r v a t i o n s in n o r m a l rabbits, to which t h e o b s e r v a t i o n s in r a b b i t s u n d e r pathological conditions will be related. Myofibrils were p r e p a r e d from fresh m u s c l e of n o r m a l r a b b i t s b y t h e m e t h o d described b y PERRY AND GREY3, slightly modified, a n d were e x t r a c t e d with high ionic s t r e n g t h buffers (0. 5 M KCI, o.o 4 M K p h o s p h a t e buffer, p H 6.2-8.6; in s o m e cases, o.ol M N a ~ P 2 0 v a n d o.oo1 M MgC1 z were added). T h e e x t r a c t w a s s e p a r a t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 29oo0 g a n d dialysed 2o-24 h o u r s a g a i n s t 0.o32.5 M KCI c o n t a i n i n g o.0o5 M K p h o s p h a t e buffer p H 7-t ; t h e precipitate w a s r e m o v e d by c e n t r i f u g a t i o n , a n d t h e s u p e r n a t a n t c o n c e n t r a t e d b y s u s p e n d i n g it a t o ° in a dialysis b a g in front of a fan. T h i s p r o t e i n fraction, which is e x t r a c t e d with m y o s i n a n d a c t o m y o s i n a n d is soluble a t low ionic s t r e n g t h , did n o t exceed 7 % of t h e total myofibrillar protein. Electrophoresis in t h e P e r k i n - E l m e r a p p a r a t u s showed t h a t t h e e x t r a c t is a m i x t u r e of a t least t h r e e c o m p o n e n t s (Fig. I ), t h e relative proportion of which varies according to t h e conditions of e x t r a c t i o n : w h e n t h e e x t r a c t i o n was carried o u t a t lower p H , t h e f a s t e s t c o m p o n e n t w a s m u c h increased in relation to t h e others. T h i s c o m p o n e n t h a s t h e s a m e m o b i l i t y as t r o p o m y o s i n ; t h e c o r r e s p o n d i n g peak increases w h e n p u r e r a b b i t t r o p o m y o s i n is a d d e d to t h e solution a n d no splitt i n g can be detected e v e n after prolonged electrophoresis. T h e viscosity drop in t h e m i x t u r e , on