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Laboratorio de Microbiología y tuberculosis
COMENTARIOS CLÍNICOS
Laboratorio de Microbiología y tuberculosis E. Gómez Mampaso Servicio de Microbiología. Hospital Ramón y Cajal. Madrid.
Introducción Hasta principios de los años ochenta la tuberculosis (TB) en los países desarrollados había dejado de constituir un problema de salud pública y, en alguna forma, los medios diagnósticos estaban desfasados con respecto a otros campos de la microbiología y las enfermedades infecciosas, situación que también tuvo su repercusión en el desarrollo de nuevos fármacos antituberculosos. Ambas circunstancias influyeron negativamente en el diagnóstico y asistencia de los enfermos tuberculosos, fundamentalmente en los países en vías de desarrollo. Pero la aparición de la epidemia de sida, así como el incremento de los grupos de inmigrantes y de población indigente y su cohabitación con la TB, provocaron un cambio en las actitudes de los medios sanitarios, científicos y económicos de los países industrializados. Durante estos años, la aportación de la microbiología a la TB ha ido aumentando de forma paulatina, con la incorporación de nuevas metodologías y la mejora de las ya existentes, cristalizando en una serie de innovaciones, recientemente revisadas 1,2, que hoy día abarcan numerosos campos entre los cuales destacan: a) diagnóstico precoz de la enfermedad; b) diagnóstico de certeza de la misma; c) orientación terapéutica; y d) estudio epidemiológico (tabla 1). Diagnóstico precoz de la enfermedad tuberculosa Habitualmente, el diagnóstico inicial y presuntivo de la TB se realiza a través del examen directo mediante las tinciones de auramina o de Ziehl Neelsen que ponen de manifiesto la presencia de bacilos ácido-alcohol-resistentes (BAAR) en aquellas muestras clínicas representativas de las distintas localizaciones de la TB (esputos, orinas, biopsias, etc.) y constituye el medio más rápido, fácil y económico para el diagnóstico presuntivo de la TB. La tinción de auramina es preferible a la tinción de Ziehl Neelsen 3, ya que el examen de la preparación se puede realizar de forma completa, en poco tiempo y sin cansancio del observador. En muestras respiratorias los valores estadísticos de las tinciones varían según los autores y los laboratorios, con una sensibilidad (S) que varía del 22% al 65%, y que en algunos casos se aproxima a la del cultivo cuando se utiliza
Correspondencia: E. Gómez Mampaso. Servicio de Microbiología. Hospital Ramón y Cajal. Crta. de Colmenar, km. 9,100. 28034 Madrid. Aceptado para su publicación el 29 de septiembre de 2000.
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una concentración de la muestra mediante cito centrífugas 4. En muestras extrarrespiratorias la S no es superior al 50%, con valores que no alcanzan el 15% cuando se trata de líquidos de serosas. Los informes de los exámenes directos de las muestras respiratorias deben incluir una cuantificación, siempre a título orientativo, con el fin de comprobar la eficacia del tratamiento y en los casos indicados retirar el aislamiento al que el enfermo se ve sometido. Para valorar el significado de una tinción positiva debemos tener en cuenta dos circunstancias: enfermo y tipo de muestra analizada. En términos generales, en enfermos inmunocompetentes una tinción positiva suele corresponder con un cultivo positivo de M. tuberculosis, salvo en algunas situaciones entre las que destacan: muestras de orina, adenopatías y esputos procedentes de enfermos con fibrosis quística. En muestras de orina la presencia de BAAR asociados en cuerdas (cord factor) es muy sugestiva de M. tuberculosis; cuando no existen cuerdas, y en ausencia de sospecha de TB meníngea o miliar, es aconsejable esperar el resultado de los cultivos, ya que pudiera corresponderse con micobacterias no tuberculosas (MNTB), sobre todo en mujeres, donde en cerca de un 10% puede cultivarse MNTB en el exudado vulvovaginal, muy probablemente debido a la íntima relación del agua de grifos (colonizados con porcentajes cercanos al 100%) y de las duchas con los hábitos higiénicos y de aseo personal (hay que insistir en que el agua corriente de cualquier instalación es la principal causa de falsos positivos de las tinciones para BAAR). En adenopatías de niños pequeños las tinciones positivas suelen corresponderse en gran parte con MNTB, al igual que ocurre con las tinciones positivas de esputos de enfermos con fibrosis quística, en los
TABLA 1 Tuberculosis y laboratorio de Microbiología Diagnóstico precoz Tinción de auramina Amplificación genómica Diagnóstico de certeza Cultivo en medios sólidos Coletsos Lowenstein Cultivo en medios líquidos Radiométricos Bactec 460 No radiométricos MB/BacT, ESPII, BACTEC 9050 Orientación terapéutica: antibiograma En medio sólido:Cannetti En medio líquido: radiométrico y no radiométrico Orientación epidemiológica RFLP Spoligotyping
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cuales más del 75% de las tinciones positivas corresponden a MNTB 5. En enfermos inmunodeficientes, fundamentalmente infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el hallazgo de una tinción positiva en cualquier tipo de muestra significa habitualmente M. tuberculosis, pero el porcentaje de MNTB es más alto que en enfermos sin esa condición. En determinadas situaciones (formas graves de TB, riesgo epidemiológico, etc.) el laboratorio debe acelerar el diagnóstico inicial, sin esperar al diagnóstico de certeza, que es proporcionado por los cultivos. La mejora del diagnóstico precoz ha sido aportada principalmente por la biología molecular a través de la amplificación de ácidos nucleicos mediante distintas metodologías tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de otros procedimientos como la amplificación isotérmica (MTD), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la Q beta-replicasa, SDA, etc., que tratan de poner de manifiesto secuencias específicas de M. tuberculosis, tales como la IS6110, la 16SrARN, el gen que codifica la proteína de 65KD, etc. Desde un punto de vista estadístico, en la TB pulmonar las amplificaciones tienen una muy buena S, superior al 90%, en muestras respiratorias cuyo examen directo para BAAR ha sido positivo, bajando al 60%-70% en muestras BAAR negativas 6; la especificidad (E) en la mayoría de los trabajos es cercana al 100%, aunque no se pueden descartar contaminaciones en los procedimientos que originen falsos positivos, e incluso en ausencia de éstos, positividades de no fácil explicación. En muestras extrarrespiratorias (LCR, orina, biopsias, etc.) estos procedimientos no están completamente evaluados, aunque algunos trabajos indican resultados magníficos, muy similares a los obtenidos en muestras respiratorias 7. En determinados casos 8 se puede incluso detectar y diagnosticar la identidad de una cepa perteneciente a un brote hospitalario. La utilización de otros procedimientos, cromatografía gas líquida asociada a espectrometría de masas, y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), etc., se aplica en algunos laboratorios, pero la instrumentación necesaria para la misma hace difícil su difusión en el diagnóstico inicial de la TB. La detección de anticuerpos frente a M. tuberculosis puede ser útil en niños 9 dada la dificultad de obtener muestras adecuadas para el estudio bacteriológico. No creemos útil esta metodología en adultos ya que la posibilidad de falsos positivos es elevada en otras enfermedades, como neumonía, cáncer de pulmón, empiemas, etc. Es innecesario recordar que determinadas técnicas no microbiológicas como la detección de la adenosín deaminasa (ADA) e interferón gamma en líquidos de serosas constituyen métodos de alto rendimiento en el diagnóstico de serositis tuberculosas. Probablemente en un futuro cercano se validarán otros métodos de diagnóstico precoz. Diagnóstico de certeza de la enfermedad tuberculosa Dada la limitada S de las tinciones (se acepta que debe haber de 10.000 BAAR/ml de muestra para que una tinción sea positiva), la existencia de MNTB, así
como el estudio de la sensibilidad a los distintos fármacos antituberculosos y el estudio epidemiológico de las cepas de diferentes enfermos, es necesario el cultivo de todas las muestras remitidas para el estudio de la TB. Después del adecuado procesamiento de las mismas (homogenización, concentración, y en su caso decontaminación), éstas deben ser inoculadas en medios de cultivo adecuados, sólidos y líquidos. Dentro de los medios sólidos, destacan los medios con base de huevo, Lowenstein, Jensen y Coletsos, teniendo este último la ventaja de conseguir aislamientos más rápidos y numerosos de M. bovis. Los medios sólidos sin base de huevo, como los medios de Middlebrook 7H10 y 7H11, también se utilizan para el aislamiento en muestras clínicas, aunque en nuestro país no se emplean de forma habitual para el aislamiento utilizándose para resiembras, mantenimiento de muestras, antibiogramas y soporte de pruebas fenotípicas. Los medios de cultivo sólidos se mantienen en incubación durante un máximo de 8 semanas. Los cultivos de las muestras con BAAR positivos suelen ser positivos en 11 a 21 días. En cambio, los cultivos de las muestras BAAR negativos suelen tardar 28-35 días. La introducción de medios líquidos monitorizados permite acortar los tiempos anteriores. Hasta hace relativamente poco tiempo sólo se disponía del BACTEC 460, con detección radiométrica del crecimiento de las micobacterias, sistema con algunos problemas que va siendo sustituido progresivamente por medios líquidos monitorizados no radiométricos, tales como ESP II, MGIT, MB/BacT, BACTEC 960 ó 9050, etc. Con la utilización de estos medios líquidos se consigue mayor número de aislamientos, y lo que es más importante, de forma más rápida, acortando 8-10 días la positividad de los cultivos. En nuestra experiencia 10, más del 65% de los cultivos de M. tuberculosis se detecta en menos de 13 días frente al 8%, que se conseguía con el medio de Coletsos en el mismo período de tiempo. Esta diferencia es más acusada para alguna MNTB, como es el caso del complejo M. avium/intracellulare, donde el 100% de los aislamientos se produce en menos de 14 días. Mención aparte merece el hemocultivo de micobacterias; creemos que su indicación fundamental son las micobacteriosis diseminadas, fundamentalmente las bacteriemias producidas por M. avium/ intracellulare en enfermos infectados por el VIH positivos (actualmente en declive gracias a los modernos tratamientos antirretrovíricos), utilizándose sistemas como el BACTEC 9050, donde se inocula directamente la sangre en el vial sin necesidad de lisis ni concentraciones previas. En todos los cultivos en los que se detecta crecimiento de BAAR ha de procederse a la identificación más rápida posible de los mismos. Esta identificación ha de hacerse inicialmente para confirmar o descartar los aislamientos más habituales, M. tuberculosis y M. avium/intracellulare, mediante hibridación con sondas de ácidos nucleicos. Las cepas del grupo M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. africanum y M. bovis) deben ser evaluadas para la reducción de los nitratos.
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En otras ocasiones, las menos, debemos recurrir a fenotipia, cromatografía gas líquida y a procedimientos de amplificación, sobre todo en los de crecimiento en medios líquidos (PCR, AMTD, LcX, etc.). La identificación de las cepas mediante otros procedimientos de biología molecular, distintos a las sondas, tales como el PRA (polimorfismo de fragmentos de restricción) o la secuenciación de ácidos nucleicos (16SrARN) son muy útiles en aquellas cepas cuya identificación inicial con sondas y fenotipia no es clara; su realización está reservada a centros dotados de personal y estructuras propias de un laboratorio de biología molecular. En la actualidad el cultivo de micobacterias se sigue considerando como el medio más fiable para el diagnóstico de la TB y otras micobacterosis. El hallazgo de M. tuberculosis es, inicialmente, siempre valorable, independientemente del tipo de enfermo o de la muestra estudiada. Por el contrario, el aislamiento de MNTB es valorable en muestras habitualmente estériles (sangre, serosas, biopsias estériles, etc.), pero en muestras «no estériles» (esputos, orinas, biopsias contaminadas) el hallazgo de varias muestras positivas y una adecuada valoración clínica de las mismas puede definir su implicación en un cuadro infeccioso. Orientación terapéutica La detección de resistencias a micobacterias, sobre todo a M. tuberculosis, es necesaria en una serie de enfermos, fundamentalmente infectados por el VIH, niños, enfermos procedentes de África (norte y zona subsahariana), cono sudamericano y Asia, donde las resistencias primarias son muy altas 11,12, y en aquellas formas clínicas muy graves (meningitis y miliares) donde es vital un correcto tratamiento. De igual forma es necesario el estudio en enfermos que hayan recibido tratamientos previos (resistencias secundarias) donde las posibilidades terapéuticas pueden estar disminuidas. El antibiograma, sobre todo en el caso de M. tuberculosis, trata de detectar la presencia de mutantes resistentes a uno o más fármacos, circunstancia que puede hacer fracasar el tratamiento de los enfermos tuberculosos. Se puede hacer directamente de la muestra cuando en ésta se observan BAAR, antibiograma directo, aunque en la gran mayoría de los laboratorios se realiza de forma indirecta, a partir de los aislamientos, según la metodología inicialmente descrita por Cannetti 13. Se puede realizar en medio sólido (Lowenstein, Middlebrook 7H107H11), con resultados en 15-30 días y por el sistema BACTEC radiométrico con resultados en 8-10 días. En la actualidad, en algunos laboratorios se están realizando en medios líquidos no radiométricos (MB/bacT) con lecturas en un promedio de 7 días y con resultados equiparables a los considerados métodos de referencia 14. En una primera etapa se debe realizar el antibiograma a los fármacos antituberculosos de primera línea: isoniacida (INH), rifampicina (RMP), etambutol (ETB), estreptomicina (SM) 18
y piracinamida (PZA). En casos de resistencia se deben probar fármacos de segunda línea, como: etionamida, capreomicina, ofloxacina, PAS, amikacina, claritromicina, etc. Sólo en muy contadas ocasiones se debe probar la sensibilidad a fármacos como la tiacetazona, amoxicilina-clavulánico o clofamicina. La biología molecular también ha introducido algunos procedimientos que permiten acortar la información de la sensibilidad de las cepas del grupo de M. tuberculosis en relación con algunos fármacos en sólo 48-72 horas; en este sentido se contempla la detección de alteraciones en diferentes genes cuya expresión enzimática es la diana de los diferentes fármacos 15; las modificaciones en el gen rpoβ, que codifica la subunidad β de la ARN polimerasa, se asocia a la resistencia a la RMP; modificaciones en el gen pncA, que codifica la piracinamidasa, confieren resistencia a la PZA; deleciones en los genes katG, que codifica la actividad catalasa y peroxidasa, e inhA, que interviene en la síntesis de ácidos micólicos, se asocian a resistencia a la INH. El aumento de resistencias a diferentes quinolonas suele ir unida a alteraciones en los genes gyrA y gyr B y la resistencia a la estreptomicina a mutaciones en los genes rpsl y rrs. Hay que tener en cuenta que no en todas las cepas consideradas como resistentes por los métodos de referencia se detectan las alteraciones antes comentadas, por lo que todavía no existe una correlación exacta con algunos fármacos, pero no cabe duda que en un futuro no muy lejano la información de sensibilidad o resistencia podrá hacerse directamente en la muestra clínica mediante la detección de las modificaciones de una serie de genes para muchos de los fármacos utilizados en el tratamiento de la TB; sería el antibiograma «molecular» o «genético». Se están ensayando otra serie de métodos como la citometría de flujo 16, la utilización de sondas 17, la expresión del gen de la luciferasa, HPLC, detección de ATP, etc., cuya incorporación y aplicación a los laboratorios de TB se irá definiendo en un futuro. El estudio de la sensibilidad en MNTB no está suficientemente acreditada. A pesar de las numerosas limitaciones actuales, puede ser útil el estudio de diferentes fármacos en enfermos con micobacteriosis comprobada por M. kansasii (RMP, ETB e INH) por micobacterias del grupo M. fortuitum/chelonae (quinolonas, macrólidos, tetraciclinas, aminoglucósidos, etc.) y del grupo avium/intracellulare (rifabutina, claritromicina, etc.) 18. Orientación epidemiológica Hasta hace muy poco tiempo los estudios que se realizaban en los laboratorios de Microbiología para tratar de establecer las conexiones epidemiológicas de las cepas de M. tuberculosis aisladas en un enfermo con las aisladas en otros era realizado con fagotipia, análisis serológico, fenotipia y antibiotipia, procedimientos siempre limitados y en ocasiones equívocos. Uno de los campos de mayor aplicación de los métodos de la biología molecular en la
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TB está en la epidemiología. La digestión mediante la enzima de restricción PvII y la hibridación con sondas dirigidas a la IS6110 (de la que puede haber hasta 20 copias en el genoma de M. tuberculosis) produce numerosos patrones de restricción, un polimorfismo que con la ayuda de determinados programas de análisis de imagen permite la identificación y correlación de unas cepas con otras. Esta metodología, RFLP 19, ha constituido un gran avance que ha permitido tipificar brotes nosocomiales y en la comunidad demostrar la coinfección de diferentes cepas de M. tuberculosis en un mismo individuo, así como la posibilidad de detectar contaminaciones cruzadas en el laboratorio. En ocasiones, cuando el genoma de M. tuberculosis tiene pocas copias de la IS6110, es necesario realizar estudios complementarios como el spoligotyping 20, procedimiento en el que se utilizan 43 marcadores y que permite una mejor clasificación de estas cepas, así como diferenciarlas de M. bovis, variedad del complejo de M. tuberculosis, que en nuestro medio ha causado un brote multihospitalario de multirresistencia a numerosos fármacos antituberculosos 21, y que gracias a esta metodología ha sido perfectamente caracterizado 22. Los medios de los que en la actualidad puede disponer un laboratorio son numerosos, cada vez más complejos y sofisticados, capaces de proporcionarnos una información hasta hace poco impensable, pero al mismo tiempo considerablemente más caros, necesitados de una mayor instrumentación e infraestructura y de personal cada vez más cualificado. A pesar de todo deben ser manejados dentro del contexto de que no hay ninguno que sea el mejor y que excluya a los demás; al contrario, en la mayoría de los casos son complementarios. Son los responsables de los laboratorios (porque conocen sus medios y posibilidades) los que deben establecer las técnicas que pueden poner a disposición de los clínicos para ajustarse a las necesidades asistenciales que éstos les planteen. Como ha sido señalado 23, la constante comunicación entre responsables del laboratorio y de la clínica es uno de los pilares en el que se debe apoyar la mejora constante de la asistencia a los enfermos tuberculosos; un marco de tal colaboración podría resumirse en la tabla 1. Por último, conviene recordar que de poco serviría la aplicación de las mejores técnicas y métodos si la rapidez en la que se producen los resultados es deficiente o la gestión de la información que se genera es inadecuada.
BIBLIOGRAFÍA 1. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Procedimientos en Microbiología Clínica. Nº 9. Diagnóstico microbiológico de las infecciones por micobacterias. Co. M. Casal; 2000. 2. American Thoracic Association. Diagnostic standards and classification of tuberculosis in adults and children. Am J Respir Crit Care Med 2000; 1161:1376-95. 3. Salfinger M, Pfyffer GE.The new diagnostic mycobacteriology laboratory. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994;13:961-79. 4. Sacenau CA, Pfeiffer NC, McLean T. Evaluation of sputum smears concentrated by citocentrifugation for detection of acid fast bacilli. J Clin Microbiol 1993;31:2371-4. 5. Oliver A, Maiz L, Cantón R, Escobar H, Navas E, Baquero F, et al. Non tuberculous mycobacteria colonization/infection in cystic fibrosis patients. XIII International Cystic Fibrosis Congress; 2000 June; Stockholm. 6. American Thoracic Association Workshop. Rapid diagnostic test for tuberculosis. What is the appropiate use? Ed. Catanzaro A. Am J Respir Crit Care Med 1997;155:1804-14. 7. Gamboa F, Domínguez J, Padilla E, Manterola JM, Gazapo E, Lonca J, et al. Rapid diagnosis of extrapulmonary tuberculosis by ligase chain reaction amplification. J Clin Microbiol 1998;36:1324-9. 8. Espinosa de los Monteros LE, Gómez-Mampaso E, Cobo J, Guerrero A, Baquero F, Blázquez J. Laboratory diagnosis of antibiotic resistance Mycobacterium bovis within 48 h; a qualitative change in the approach to mycobacterial diseases in AIDS patients. AIDS 1997;11:827-8. 9. Gómez-Mampaso E, Palenque E, Sánchez M, Rivera MJ, De la Torre F, González EA, et al. Detección de anticuerpos IgG frente al antígeno 60 para el diagnóstico de la tuberculosis humana: resultados de un estudio multicéntrico. Rev Esp Microbiol Clin 1991;6:456-63. 10. Gómez Mampaso E, Diéguez A, Muñoz T. Cultivo y detección de micobacterias mediante el sistema ESP II. Comparación con el medio de Coletsos. VII Reunión de la GEM, Zaragoza, 1996. 11. Huerga H, López Vélez R, Navas E, Gómez Mampaso E. Clinicoepidemiologicals features of inmigrants with tuberculosis living in Madrid, Spain. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000;19:236-40. 12. Pablos-Mendez A, Raviglione MC, Laszlo A, Binkin N, Rieder HR, Bustreo F, et al. Global surveillance for antituberculosis-drug resistance, 19941997. N Engl J Med 1998;338:1641-9. 13. Cannetti G, Rist N, Grosset J. Mesure de la sensibilité du bacille tuberculeux aux drogues antibacillaires para la méthode des proportions: méthodologie, critéres de résistance, résultats, interprétation. Rev Tuberc 1963;27:217-72. 14. Díaz-Infantes MS, Ruiz-Serrano MJ, Martínez-Sánchez L, Ortega A, Bouza E. Evaluation of M/Bact T Mycobacterium detection system for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2000; 38:1988-9. 15. Musser JM. Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria: molecular genetics insights. Clin Microbio Rev 1995;8:496-514. 16. Kirk S, Mazurek GH, Callister SM, Moore AV, Schell RF. Mycobacteriun tuberculosis susceptibility results in 24 hours by using flow cytometry. Clin Microbiol Newsletter 1998;20:83-90. 17. Marti-Casabona N, Mimo X, González T, Roselló J, Arcalís L. Rapid method for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis by using DNA probes. J Clin Microbiol 1997;35:2521-5. 18. Salfinger M, Wallace R. Susceptibility testing for nontuberculous mycobacteria: should it be performed? Clin Microbiol Newsletter 1997;19:68-70. 19. Van Embdem JD, Cave MD, Crawford JT, Dale JW, Eisenach KD, Gicquel B, et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting; recomendations for standardized methodology. J Clin Microbiol 1993;31:406-9. 20. Kammerbeek JL, Schouls L, Kolk A, van Agterveld M, Van Soloingen D, Kuijper S, et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J Clin Microbiol 1997;35:907-14. 21. Guerrero A, Cobo J, Fortún J, Navas E, Quereda C, Asensio A, et al. Nosocomial transmisión of Mycobacterium bovis resistant to 11 drugs in people with advanced HIV-1 infection. Lancet 1997;350:1738-42. 22. Blázquez J, Espinosa de los Monteros LE, Samper S, Martín C, Guerrero A, Cobo J, et al. Genetic characterization of multidrug-resistant Mycobacterium bovis strains from a hospital involving human immunodeficiency virus-positive patients. J Clin Microbiol 1997;35:1390-3. 23. Salfinger M. Role of the laboratory in evaluating patients with mycobacterial disease. Clin Microbiol Newsletter 1995; 17:108-10.
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Introducción Hasta principios de los años ochenta la tuberculosis (TB) en los países desarrollados había dejado de constituir un problema de salud pública y, en alguna forma, los medios diagnósticos estaban desfasados con respecto a otros campos de la microbiología y las enfermedades infecciosas, situación que también tuvo su repercusión en el desarrollo de nuevos fármacos antituberculosos. Ambas circunstancias influyeron negativamente en el diagnóstico y asistencia de los enfermos tuberculosos, fundamentalmente en los países en vías de desarrollo. Pero la aparición de la epidemia de sida, así como el incremento de los grupos de inmigrantes y de población indigente y su cohabitación con la TB, provocaron un cambio en las actitudes de los medios sanitarios, científicos y económicos de los países industrializados. Durante estos años, la aportación de la microbiología a la TB ha ido aumentando de forma paulatina, con la incorporación de nuevas metodologías y la mejora de las ya existentes, cristalizando en una serie de innovaciones, recientemente revisadas 1,2, que hoy día abarcan numerosos campos entre los cuales destacan: a) diagnóstico precoz de la enfermedad; b) diagnóstico de certeza de la misma; c) orientación terapéutica; y d) estudio epidemiológico (tabla 1). Diagnóstico precoz de la enfermedad tuberculosa Habitualmente, el diagnóstico inicial y presuntivo de la TB se realiza a través del examen directo mediante las tinciones de auramina o de Ziehl Neelsen que ponen de manifiesto la presencia de bacilos ácido-alcohol-resistentes (BAAR) en aquellas muestras clínicas representativas de las distintas localizaciones de la TB (esputos, orinas, biopsias, etc.) y constituye el medio más rápido, fácil y económico para el diagnóstico presuntivo de la TB. La tinción de auramina es preferible a la tinción de Ziehl Neelsen 3, ya que el examen de la preparación se puede realizar de forma completa, en poco tiempo y sin cansancio del observador. En muestras respiratorias los valores estadísticos de las tinciones varían según los autores y los laboratorios, con una sensibilidad (S) que varía del 22% al 65%, y que en algunos casos se aproxima a la del cultivo cuando se utiliza
Correspondencia: E. Gómez Mampaso. Servicio de Microbiología. Hospital Ramón y Cajal. Crta. de Colmenar, km. 9,100. 28034 Madrid. Aceptado para su publicación el 29 de septiembre de 2000.
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una concentración de la muestra mediante cito centrífugas 4. En muestras extrarrespiratorias la S no es superior al 50%, con valores que no alcanzan el 15% cuando se trata de líquidos de serosas. Los informes de los exámenes directos de las muestras respiratorias deben incluir una cuantificación, siempre a título orientativo, con el fin de comprobar la eficacia del tratamiento y en los casos indicados retirar el aislamiento al que el enfermo se ve sometido. Para valorar el significado de una tinción positiva debemos tener en cuenta dos circunstancias: enfermo y tipo de muestra analizada. En términos generales, en enfermos inmunocompetentes una tinción positiva suele corresponder con un cultivo positivo de M. tuberculosis, salvo en algunas situaciones entre las que destacan: muestras de orina, adenopatías y esputos procedentes de enfermos con fibrosis quística. En muestras de orina la presencia de BAAR asociados en cuerdas (cord factor) es muy sugestiva de M. tuberculosis; cuando no existen cuerdas, y en ausencia de sospecha de TB meníngea o miliar, es aconsejable esperar el resultado de los cultivos, ya que pudiera corresponderse con micobacterias no tuberculosas (MNTB), sobre todo en mujeres, donde en cerca de un 10% puede cultivarse MNTB en el exudado vulvovaginal, muy probablemente debido a la íntima relación del agua de grifos (colonizados con porcentajes cercanos al 100%) y de las duchas con los hábitos higiénicos y de aseo personal (hay que insistir en que el agua corriente de cualquier instalación es la principal causa de falsos positivos de las tinciones para BAAR). En adenopatías de niños pequeños las tinciones positivas suelen corresponderse en gran parte con MNTB, al igual que ocurre con las tinciones positivas de esputos de enfermos con fibrosis quística, en los
TABLA 1 Tuberculosis y laboratorio de Microbiología Diagnóstico precoz Tinción de auramina Amplificación genómica Diagnóstico de certeza Cultivo en medios sólidos Coletsos Lowenstein Cultivo en medios líquidos Radiométricos Bactec 460 No radiométricos MB/BacT, ESPII, BACTEC 9050 Orientación terapéutica: antibiograma En medio sólido:Cannetti En medio líquido: radiométrico y no radiométrico Orientación epidemiológica RFLP Spoligotyping
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cuales más del 75% de las tinciones positivas corresponden a MNTB 5. En enfermos inmunodeficientes, fundamentalmente infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), el hallazgo de una tinción positiva en cualquier tipo de muestra significa habitualmente M. tuberculosis, pero el porcentaje de MNTB es más alto que en enfermos sin esa condición. En determinadas situaciones (formas graves de TB, riesgo epidemiológico, etc.) el laboratorio debe acelerar el diagnóstico inicial, sin esperar al diagnóstico de certeza, que es proporcionado por los cultivos. La mejora del diagnóstico precoz ha sido aportada principalmente por la biología molecular a través de la amplificación de ácidos nucleicos mediante distintas metodologías tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de otros procedimientos como la amplificación isotérmica (MTD), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la Q beta-replicasa, SDA, etc., que tratan de poner de manifiesto secuencias específicas de M. tuberculosis, tales como la IS6110, la 16SrARN, el gen que codifica la proteína de 65KD, etc. Desde un punto de vista estadístico, en la TB pulmonar las amplificaciones tienen una muy buena S, superior al 90%, en muestras respiratorias cuyo examen directo para BAAR ha sido positivo, bajando al 60%-70% en muestras BAAR negativas 6; la especificidad (E) en la mayoría de los trabajos es cercana al 100%, aunque no se pueden descartar contaminaciones en los procedimientos que originen falsos positivos, e incluso en ausencia de éstos, positividades de no fácil explicación. En muestras extrarrespiratorias (LCR, orina, biopsias, etc.) estos procedimientos no están completamente evaluados, aunque algunos trabajos indican resultados magníficos, muy similares a los obtenidos en muestras respiratorias 7. En determinados casos 8 se puede incluso detectar y diagnosticar la identidad de una cepa perteneciente a un brote hospitalario. La utilización de otros procedimientos, cromatografía gas líquida asociada a espectrometría de masas, y la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), etc., se aplica en algunos laboratorios, pero la instrumentación necesaria para la misma hace difícil su difusión en el diagnóstico inicial de la TB. La detección de anticuerpos frente a M. tuberculosis puede ser útil en niños 9 dada la dificultad de obtener muestras adecuadas para el estudio bacteriológico. No creemos útil esta metodología en adultos ya que la posibilidad de falsos positivos es elevada en otras enfermedades, como neumonía, cáncer de pulmón, empiemas, etc. Es innecesario recordar que determinadas técnicas no microbiológicas como la detección de la adenosín deaminasa (ADA) e interferón gamma en líquidos de serosas constituyen métodos de alto rendimiento en el diagnóstico de serositis tuberculosas. Probablemente en un futuro cercano se validarán otros métodos de diagnóstico precoz. Diagnóstico de certeza de la enfermedad tuberculosa Dada la limitada S de las tinciones (se acepta que debe haber de 10.000 BAAR/ml de muestra para que una tinción sea positiva), la existencia de MNTB, así
como el estudio de la sensibilidad a los distintos fármacos antituberculosos y el estudio epidemiológico de las cepas de diferentes enfermos, es necesario el cultivo de todas las muestras remitidas para el estudio de la TB. Después del adecuado procesamiento de las mismas (homogenización, concentración, y en su caso decontaminación), éstas deben ser inoculadas en medios de cultivo adecuados, sólidos y líquidos. Dentro de los medios sólidos, destacan los medios con base de huevo, Lowenstein, Jensen y Coletsos, teniendo este último la ventaja de conseguir aislamientos más rápidos y numerosos de M. bovis. Los medios sólidos sin base de huevo, como los medios de Middlebrook 7H10 y 7H11, también se utilizan para el aislamiento en muestras clínicas, aunque en nuestro país no se emplean de forma habitual para el aislamiento utilizándose para resiembras, mantenimiento de muestras, antibiogramas y soporte de pruebas fenotípicas. Los medios de cultivo sólidos se mantienen en incubación durante un máximo de 8 semanas. Los cultivos de las muestras con BAAR positivos suelen ser positivos en 11 a 21 días. En cambio, los cultivos de las muestras BAAR negativos suelen tardar 28-35 días. La introducción de medios líquidos monitorizados permite acortar los tiempos anteriores. Hasta hace relativamente poco tiempo sólo se disponía del BACTEC 460, con detección radiométrica del crecimiento de las micobacterias, sistema con algunos problemas que va siendo sustituido progresivamente por medios líquidos monitorizados no radiométricos, tales como ESP II, MGIT, MB/BacT, BACTEC 960 ó 9050, etc. Con la utilización de estos medios líquidos se consigue mayor número de aislamientos, y lo que es más importante, de forma más rápida, acortando 8-10 días la positividad de los cultivos. En nuestra experiencia 10, más del 65% de los cultivos de M. tuberculosis se detecta en menos de 13 días frente al 8%, que se conseguía con el medio de Coletsos en el mismo período de tiempo. Esta diferencia es más acusada para alguna MNTB, como es el caso del complejo M. avium/intracellulare, donde el 100% de los aislamientos se produce en menos de 14 días. Mención aparte merece el hemocultivo de micobacterias; creemos que su indicación fundamental son las micobacteriosis diseminadas, fundamentalmente las bacteriemias producidas por M. avium/ intracellulare en enfermos infectados por el VIH positivos (actualmente en declive gracias a los modernos tratamientos antirretrovíricos), utilizándose sistemas como el BACTEC 9050, donde se inocula directamente la sangre en el vial sin necesidad de lisis ni concentraciones previas. En todos los cultivos en los que se detecta crecimiento de BAAR ha de procederse a la identificación más rápida posible de los mismos. Esta identificación ha de hacerse inicialmente para confirmar o descartar los aislamientos más habituales, M. tuberculosis y M. avium/intracellulare, mediante hibridación con sondas de ácidos nucleicos. Las cepas del grupo M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. africanum y M. bovis) deben ser evaluadas para la reducción de los nitratos.
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En otras ocasiones, las menos, debemos recurrir a fenotipia, cromatografía gas líquida y a procedimientos de amplificación, sobre todo en los de crecimiento en medios líquidos (PCR, AMTD, LcX, etc.). La identificación de las cepas mediante otros procedimientos de biología molecular, distintos a las sondas, tales como el PRA (polimorfismo de fragmentos de restricción) o la secuenciación de ácidos nucleicos (16SrARN) son muy útiles en aquellas cepas cuya identificación inicial con sondas y fenotipia no es clara; su realización está reservada a centros dotados de personal y estructuras propias de un laboratorio de biología molecular. En la actualidad el cultivo de micobacterias se sigue considerando como el medio más fiable para el diagnóstico de la TB y otras micobacterosis. El hallazgo de M. tuberculosis es, inicialmente, siempre valorable, independientemente del tipo de enfermo o de la muestra estudiada. Por el contrario, el aislamiento de MNTB es valorable en muestras habitualmente estériles (sangre, serosas, biopsias estériles, etc.), pero en muestras «no estériles» (esputos, orinas, biopsias contaminadas) el hallazgo de varias muestras positivas y una adecuada valoración clínica de las mismas puede definir su implicación en un cuadro infeccioso. Orientación terapéutica La detección de resistencias a micobacterias, sobre todo a M. tuberculosis, es necesaria en una serie de enfermos, fundamentalmente infectados por el VIH, niños, enfermos procedentes de África (norte y zona subsahariana), cono sudamericano y Asia, donde las resistencias primarias son muy altas 11,12, y en aquellas formas clínicas muy graves (meningitis y miliares) donde es vital un correcto tratamiento. De igual forma es necesario el estudio en enfermos que hayan recibido tratamientos previos (resistencias secundarias) donde las posibilidades terapéuticas pueden estar disminuidas. El antibiograma, sobre todo en el caso de M. tuberculosis, trata de detectar la presencia de mutantes resistentes a uno o más fármacos, circunstancia que puede hacer fracasar el tratamiento de los enfermos tuberculosos. Se puede hacer directamente de la muestra cuando en ésta se observan BAAR, antibiograma directo, aunque en la gran mayoría de los laboratorios se realiza de forma indirecta, a partir de los aislamientos, según la metodología inicialmente descrita por Cannetti 13. Se puede realizar en medio sólido (Lowenstein, Middlebrook 7H107H11), con resultados en 15-30 días y por el sistema BACTEC radiométrico con resultados en 8-10 días. En la actualidad, en algunos laboratorios se están realizando en medios líquidos no radiométricos (MB/bacT) con lecturas en un promedio de 7 días y con resultados equiparables a los considerados métodos de referencia 14. En una primera etapa se debe realizar el antibiograma a los fármacos antituberculosos de primera línea: isoniacida (INH), rifampicina (RMP), etambutol (ETB), estreptomicina (SM) 18
y piracinamida (PZA). En casos de resistencia se deben probar fármacos de segunda línea, como: etionamida, capreomicina, ofloxacina, PAS, amikacina, claritromicina, etc. Sólo en muy contadas ocasiones se debe probar la sensibilidad a fármacos como la tiacetazona, amoxicilina-clavulánico o clofamicina. La biología molecular también ha introducido algunos procedimientos que permiten acortar la información de la sensibilidad de las cepas del grupo de M. tuberculosis en relación con algunos fármacos en sólo 48-72 horas; en este sentido se contempla la detección de alteraciones en diferentes genes cuya expresión enzimática es la diana de los diferentes fármacos 15; las modificaciones en el gen rpoβ, que codifica la subunidad β de la ARN polimerasa, se asocia a la resistencia a la RMP; modificaciones en el gen pncA, que codifica la piracinamidasa, confieren resistencia a la PZA; deleciones en los genes katG, que codifica la actividad catalasa y peroxidasa, e inhA, que interviene en la síntesis de ácidos micólicos, se asocian a resistencia a la INH. El aumento de resistencias a diferentes quinolonas suele ir unida a alteraciones en los genes gyrA y gyr B y la resistencia a la estreptomicina a mutaciones en los genes rpsl y rrs. Hay que tener en cuenta que no en todas las cepas consideradas como resistentes por los métodos de referencia se detectan las alteraciones antes comentadas, por lo que todavía no existe una correlación exacta con algunos fármacos, pero no cabe duda que en un futuro no muy lejano la información de sensibilidad o resistencia podrá hacerse directamente en la muestra clínica mediante la detección de las modificaciones de una serie de genes para muchos de los fármacos utilizados en el tratamiento de la TB; sería el antibiograma «molecular» o «genético». Se están ensayando otra serie de métodos como la citometría de flujo 16, la utilización de sondas 17, la expresión del gen de la luciferasa, HPLC, detección de ATP, etc., cuya incorporación y aplicación a los laboratorios de TB se irá definiendo en un futuro. El estudio de la sensibilidad en MNTB no está suficientemente acreditada. A pesar de las numerosas limitaciones actuales, puede ser útil el estudio de diferentes fármacos en enfermos con micobacteriosis comprobada por M. kansasii (RMP, ETB e INH) por micobacterias del grupo M. fortuitum/chelonae (quinolonas, macrólidos, tetraciclinas, aminoglucósidos, etc.) y del grupo avium/intracellulare (rifabutina, claritromicina, etc.) 18. Orientación epidemiológica Hasta hace muy poco tiempo los estudios que se realizaban en los laboratorios de Microbiología para tratar de establecer las conexiones epidemiológicas de las cepas de M. tuberculosis aisladas en un enfermo con las aisladas en otros era realizado con fagotipia, análisis serológico, fenotipia y antibiotipia, procedimientos siempre limitados y en ocasiones equívocos. Uno de los campos de mayor aplicación de los métodos de la biología molecular en la
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TB está en la epidemiología. La digestión mediante la enzima de restricción PvII y la hibridación con sondas dirigidas a la IS6110 (de la que puede haber hasta 20 copias en el genoma de M. tuberculosis) produce numerosos patrones de restricción, un polimorfismo que con la ayuda de determinados programas de análisis de imagen permite la identificación y correlación de unas cepas con otras. Esta metodología, RFLP 19, ha constituido un gran avance que ha permitido tipificar brotes nosocomiales y en la comunidad demostrar la coinfección de diferentes cepas de M. tuberculosis en un mismo individuo, así como la posibilidad de detectar contaminaciones cruzadas en el laboratorio. En ocasiones, cuando el genoma de M. tuberculosis tiene pocas copias de la IS6110, es necesario realizar estudios complementarios como el spoligotyping 20, procedimiento en el que se utilizan 43 marcadores y que permite una mejor clasificación de estas cepas, así como diferenciarlas de M. bovis, variedad del complejo de M. tuberculosis, que en nuestro medio ha causado un brote multihospitalario de multirresistencia a numerosos fármacos antituberculosos 21, y que gracias a esta metodología ha sido perfectamente caracterizado 22. Los medios de los que en la actualidad puede disponer un laboratorio son numerosos, cada vez más complejos y sofisticados, capaces de proporcionarnos una información hasta hace poco impensable, pero al mismo tiempo considerablemente más caros, necesitados de una mayor instrumentación e infraestructura y de personal cada vez más cualificado. A pesar de todo deben ser manejados dentro del contexto de que no hay ninguno que sea el mejor y que excluya a los demás; al contrario, en la mayoría de los casos son complementarios. Son los responsables de los laboratorios (porque conocen sus medios y posibilidades) los que deben establecer las técnicas que pueden poner a disposición de los clínicos para ajustarse a las necesidades asistenciales que éstos les planteen. Como ha sido señalado 23, la constante comunicación entre responsables del laboratorio y de la clínica es uno de los pilares en el que se debe apoyar la mejora constante de la asistencia a los enfermos tuberculosos; un marco de tal colaboración podría resumirse en la tabla 1. Por último, conviene recordar que de poco serviría la aplicación de las mejores técnicas y métodos si la rapidez en la que se producen los resultados es deficiente o la gestión de la información que se genera es inadecuada.
BIBLIOGRAFÍA 1. Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. Procedimientos en Microbiología Clínica. Nº 9. Diagnóstico microbiológico de las infecciones por micobacterias. Co. M. Casal; 2000. 2. American Thoracic Association. Diagnostic standards and classification of tuberculosis in adults and children. Am J Respir Crit Care Med 2000; 1161:1376-95. 3. Salfinger M, Pfyffer GE.The new diagnostic mycobacteriology laboratory. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994;13:961-79. 4. Sacenau CA, Pfeiffer NC, McLean T. Evaluation of sputum smears concentrated by citocentrifugation for detection of acid fast bacilli. J Clin Microbiol 1993;31:2371-4. 5. Oliver A, Maiz L, Cantón R, Escobar H, Navas E, Baquero F, et al. Non tuberculous mycobacteria colonization/infection in cystic fibrosis patients. XIII International Cystic Fibrosis Congress; 2000 June; Stockholm. 6. American Thoracic Association Workshop. Rapid diagnostic test for tuberculosis. What is the appropiate use? Ed. Catanzaro A. Am J Respir Crit Care Med 1997;155:1804-14. 7. Gamboa F, Domínguez J, Padilla E, Manterola JM, Gazapo E, Lonca J, et al. Rapid diagnosis of extrapulmonary tuberculosis by ligase chain reaction amplification. J Clin Microbiol 1998;36:1324-9. 8. Espinosa de los Monteros LE, Gómez-Mampaso E, Cobo J, Guerrero A, Baquero F, Blázquez J. Laboratory diagnosis of antibiotic resistance Mycobacterium bovis within 48 h; a qualitative change in the approach to mycobacterial diseases in AIDS patients. AIDS 1997;11:827-8. 9. Gómez-Mampaso E, Palenque E, Sánchez M, Rivera MJ, De la Torre F, González EA, et al. Detección de anticuerpos IgG frente al antígeno 60 para el diagnóstico de la tuberculosis humana: resultados de un estudio multicéntrico. Rev Esp Microbiol Clin 1991;6:456-63. 10. Gómez Mampaso E, Diéguez A, Muñoz T. Cultivo y detección de micobacterias mediante el sistema ESP II. Comparación con el medio de Coletsos. VII Reunión de la GEM, Zaragoza, 1996. 11. Huerga H, López Vélez R, Navas E, Gómez Mampaso E. Clinicoepidemiologicals features of inmigrants with tuberculosis living in Madrid, Spain. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2000;19:236-40. 12. Pablos-Mendez A, Raviglione MC, Laszlo A, Binkin N, Rieder HR, Bustreo F, et al. Global surveillance for antituberculosis-drug resistance, 19941997. N Engl J Med 1998;338:1641-9. 13. Cannetti G, Rist N, Grosset J. Mesure de la sensibilité du bacille tuberculeux aux drogues antibacillaires para la méthode des proportions: méthodologie, critéres de résistance, résultats, interprétation. Rev Tuberc 1963;27:217-72. 14. Díaz-Infantes MS, Ruiz-Serrano MJ, Martínez-Sánchez L, Ortega A, Bouza E. Evaluation of M/Bact T Mycobacterium detection system for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol 2000; 38:1988-9. 15. Musser JM. Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria: molecular genetics insights. Clin Microbio Rev 1995;8:496-514. 16. Kirk S, Mazurek GH, Callister SM, Moore AV, Schell RF. Mycobacteriun tuberculosis susceptibility results in 24 hours by using flow cytometry. Clin Microbiol Newsletter 1998;20:83-90. 17. Marti-Casabona N, Mimo X, González T, Roselló J, Arcalís L. Rapid method for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis by using DNA probes. J Clin Microbiol 1997;35:2521-5. 18. Salfinger M, Wallace R. Susceptibility testing for nontuberculous mycobacteria: should it be performed? Clin Microbiol Newsletter 1997;19:68-70. 19. Van Embdem JD, Cave MD, Crawford JT, Dale JW, Eisenach KD, Gicquel B, et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting; recomendations for standardized methodology. J Clin Microbiol 1993;31:406-9. 20. Kammerbeek JL, Schouls L, Kolk A, van Agterveld M, Van Soloingen D, Kuijper S, et al. Simultaneous detection and strain differentiation of Mycobacterium tuberculosis for diagnosis and epidemiology. J Clin Microbiol 1997;35:907-14. 21. Guerrero A, Cobo J, Fortún J, Navas E, Quereda C, Asensio A, et al. Nosocomial transmisión of Mycobacterium bovis resistant to 11 drugs in people with advanced HIV-1 infection. Lancet 1997;350:1738-42. 22. Blázquez J, Espinosa de los Monteros LE, Samper S, Martín C, Guerrero A, Cobo J, et al. Genetic characterization of multidrug-resistant Mycobacterium bovis strains from a hospital involving human immunodeficiency virus-positive patients. J Clin Microbiol 1997;35:1390-3. 23. Salfinger M. Role of the laboratory in evaluating patients with mycobacterial disease. Clin Microbiol Newsletter 1995; 17:108-10.
Rev Clin Esp 2002;202(1):16-9
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