- Email: [email protected]
L’immuno-cytochimie : une aide au diagnostic cytologique
Annales de pathologie (2012) 32, 433—437
Disponible en ligne sur
www.sciencedirect.com
MISE AU POINT
L’immuno-cytochimie : une aide au diagnostic cytologique Immunocytochemistry as an adjunct to diagnostic cytology Monique Courtade-Saidi a,∗, Marc P. Dupre b a
UF d’histologie-cytologie, service d’anatomie pathologique et histologie-cytologie, hôpital de Rangueil, 1, avenue J.-Poulhes, TSA 50032, 31059 Toulouse cedex 9, France b Department of pathology and laboratory medicine, faculty of medicine, university of Manitoba, hôpital Général de Saint-Boniface, 409, avenue Taché, Winnipeg, R2H 2A6 Manitoba, Canada Accepté pour publication le 13 septembre 2012 Disponible sur Internet le 20 novembre 2012
MOTS CLÉS Immuno-cytochimie ; Lames d’étalement ; Cytospin ; Étalements en monocouche ; Liquides d’épanchement ; Cytoponctions à l’aiguille fine
KEYWORDS Immunocytochemistry; Smear; Cytospin; Liquid-based cytology; Effusion fluid; Fine needle aspiration
∗
Résumé L’immuno-cytochimie est une technique complémentaire qui devrait être de routine ; cela reste néanmoins loin de la réalité pour de nombreuses structures d’anatomie et cytologie pathologiques ; les raisons en sont multiples : diversité des techniques de préparation cytologique parfois au sein d’une même structure ; manque de reproductibilité du matériel cellulaire ou pauvreté cellulaire ; absence de validation de certaines techniques en cytologie ; absence de témoins etc. . .. Néanmoins, la cytopathologie ne devrait plus, de nos jours, se concevoir sans l’aide de l’immuno-cytochimie qui apporte, comme en histologie, fiabilité diagnostique et éléments pronostiques. © 2012 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
Summary Immunocytochemistry (ICC) as a routine ancillary test remains a distant reality for most diagnostic laboratories. Notable barriers to the mass deployment of ICC include: the large variety of specimen preparations, the small specimen size, lack of validation and lack of control specimens. As clinicians constantly strive to answer questions relating to diagnosis, therapy and prognosis with minimally invasive sampling techniques, the cytopathology community must endeavour to adopt ancillary specimen testing by ICC as a core element of diagnostic cytology. © 2012 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
DOI de l’article original : http://dx.doi.org/10.1016/j.annpat.2012.09.205. Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (M. Courtade-Saidi).
0242-6498/$ — see front matter © 2012 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. http://dx.doi.org/10.1016/j.annpat.2012.09.206
434
Introduction Le développement des diagnostics basés sur la cytologie a nécessité le développement de techniques ancillaires parmi lesquelles l’immuno-cytochimie (ICC) joue un rôle majeur. En dépit de plus de 20 ans de publications décrivant des protocoles standardisés et en justifiant l’utilisation, l’ICC peine à devenir une technique de routine et souffre d’un manque de standardisation des méthodes [1,2]. Nous rapportons ici une revue pratique de l’ICC en résumant les techniques applicables aux échantillons cytologiques les plus couramment rencontrés : étalements sur lames, cytospins, cytologie en milieu liquide et cytoblocs d’inclusion en paraffine.
Les spécificités techniques de l’immuno-cytochimie Une des difficultés majeures qui limite la standardisation et la généralisation de l’ICC est représentée par l’importante diversité des échantillons et des préparations cytologiques que l’on rencontre au sein des structures. Le matériel cytologique peut parvenir sous forme d’étalements séchés à l’air réalisés par le clinicien ou de liquides frais fixés ou non fixés qui seront traités selon différents protocoles techniques au laboratoire. La cytologie en milieu liquide bénéficie du recueil dans un liquide spécifique, dont la nature est variable puisqu’il existe plusieurs milieux liquides, et implique la confection de lames selon les recommandations du fournisseur. Le caractère limité des échantillons cytologiques ainsi que la grande diversité des modalités de préparation des lames sont autant de facteurs limitant la performance et la reproductibilité de l’ICC. Enfin, la nature de certaines préparations cytologiques n’autorise pas l’utilisation de certains anticorps spécifiques.
Étalements conventionnels Dans la plupart des cas, les étalements sur lames sont réalisés par le clinicien et la qualité des prélèvements peut donc être variable et représenter un facteur limitant pour l’ICC. Un prélèvement non traumatique et un bon étalement cytologique doivent être assurés afin de conserver la morphologie cellulaire et éviter la présence d’amas tridimensionnels de cellules qui seront insuffisamment marqués par l’ICC [3]. Les étalements très hémorragiques peuvent représenter un facteur limitant pour la qualité de l’ICC en raison du bruit de fond important que cela peut générer, en particulier lors de l’utilisation d’une réaction avec la peroxydase. Ce bruit de fond peut être évité en utilisant la phosphatase alcaline et une plateforme automatisée avec un anticorps secondaire lié à un polymère. C’est ainsi que de bons résultats ont été rapportés sur des étalements de sang périphérique et de moelle osseuse en utilisant cette technique [4]. Sur le plan pratique, l’utilisation de lames prétraitées afin d’augmenter l’adhérence est cruciale pour éviter la perte des cellules durant les différentes étapes de la technique. Les étalements non fixés, séchés à l’air, peuvent poser problème en ICC tant par le manque d’immunomarquage que par les faux-positifs, comme cela a été décrit notamment avec les anticorps dirigés contre des protéines du cytosquelette [3]. Même s’il a été rapporté que les antigènes de surface peuvent être détectés jusqu’à
M. Courtade-Saidi, M.P. Dupre trois à quatre jours après la réalisation de l’étalement en l’absence de fixation, il est admis que la fixation est essentielle pour assurer la conservation des épitopes antigéniques. Le séchage à l’air d’étalements post-fixés avant l’ICC peut également compromettre le résultat. Les méthodes de fixation sont variables. Il peut s’agir d’une immersion dans de la glutaraldéhyde à 0,05 %, dans de l’acétone, des fixateurs à base d’alcool ou de formol ou bien de l’utilisation de sprays fixateurs. La glutaraldéhyde et les fixateurs en spray ont été préférés par certains auteurs dans la mesure où ils ne modifient pas les protéines de surface des cellules [3], alors que d’autres ont critiqué les sprays fixateurs car ils ne conviennent pas systématiquement pour la fixation de tous les épitopes antigéniques [5]. L’ICC peut être réalisée avec succès sur des lames blanches non colorées, colorées au Papanicolaou ou après décoloration [6]. En comparant l’ICC réalisée sur des lames blanches et sur des lames de Papanicolaou décolorées, des résultats équivalents ou supérieurs ont été obtenus dans 84 % des cas sur les lames décolorées. Des résultats similaires peuvent être attendus quand l’ICC est réalisée directement sur des lames colorées au Papanicolaou. Toujours dans l’étude d’Abendroth et al. [6], il n’y avait pas de différence de résultat entre des lames fixées et des lames séchées à l’air. Les échantillons difficiles à interpréter en ICC en raison d’un bruit de fond lié à de la nécrose ou à un fond richement protéique bénéficient de meilleurs résultats quand l’ICC est pratiquée à partir de lames colorées au Papanicolaou ou bien décolorées [6]. La réhydratation des lames dans des alcools et la décoloration dans des bains d’alcool-acide permettent l’élimination du fond protéique. Il est intéressant de noter que même si cette technique permet de réduire le bruit de fond, la positivité peut être relativement focale et nécessite une attention particulière pour l’interprétation des lames. Des techniques de transfert de cellules ont été utilisées afin de permettre l’utilisation de plusieurs anticorps quand trop peu de matériel est disponible [7]. Les lames représentatives avec une dispersion cellulaire relativement correcte peuvent être recouvertes avec un milieu de recouvrement liquide qui, une fois durci, peut être découpé avec un couteau de diamant. Ces échantillons sont alors montés sur des lames individuelles à des fins d’ICC. Même si cette méthode est laborieuse et nécessite plusieurs étapes pour réaliser des lames supplémentaires, elle est considérée comme très peu coûteuse et possède l’avantage de générer plusieurs lames avec une perte minimale de cellules tout en préservant la morphologie cellulaire et la réactivité antigénique. Indépendamment de ces applications en ICC, le transfert de cellules peut être utile pour réparer des lames abîmées [8]. Ce transfert peut également représenter une technique intéressante afin de limiter le volume d’anticorps nécessaire pour recouvrir une lame entière. Des résultats d’ICC identiques à ceux obtenus à partir de cytoblocs d’inclusion en paraffine ont été ainsi rapportés [9]. Des étalements directs réalisés à partir du culot cellulaire recueilli après centrifugation de liquide frais présenteront de meilleurs résultats dans la mesure où le laboratoire contrôle toutes les étapes de la confection et de la fixation des lames.
Cytospins Du matériel frais (épanchements des séreuses, ponctions de kystes, liquides céphalorachidiens. . .) ou fixé (urines) envoyé au laboratoire peut être traité avec la technique en cytospin. La plupart des études immuno-cytochimiques sur lames
Immuno-cytochimie
Figure 1. Immunomarquage cytoplasmique net avec l’anticorps anti-CK20 (clone Ks 20.8, Dako ; dilution 1/200e ) de cellules adénocarcinomateuses d’origine digestive dans une ascite (× 200). CK20 (clone Ks 20.8, Dako, dilution 1/200): strong cytoplasmic immunostaining of adenocarcinomatous cells from the digestive tract in a peritoneal effusion (× 200).
de cytospin ont été réalisées à partir d’épanchements des séreuses (Figs. 1 et 2). Le matériel frais non fixé nécessite un acheminement rapide au laboratoire afin de garantir la préservation cellulaire. La quantification des cellules par mm3 de liquide est essentielle afin de confectionner des lames au niveau desquelles 50 à 100 000 cellules seront déposées par spot de 0,5 cm2 . Des agents de lyse des globules rouges ou des gradients de densité peuvent être utilisés lorsque le prélèvement est très hémorragique (> 8000 hématies par mm3 ). Même si le transport est rapide, le recueil des échantillons sur un tube contenant un anticoagulant (EDTA) est fortement recommandé pour éviter la coagulation du liquide. Les liquides céphalorachidiens seront recueillis sur un tube sec sans additif. Comme pour les étalements sur lames, des lames prétraitées sont essentielles pour assurer l’adhésion et éviter la perte de cellules en particulier durant l’étape
Figure 2. Immunomarquage nucléaire aux récepteurs oestrogéniques (RE clone 6F11, Dako ; 1/40e ) de cellules adénocarcinomateuses d’origine mammaire dans un liquide pleural (× 400). Nucleic immunostaining with estrogen receptors (ER clone 6F11, Dako; dilution 1/40) for cells from a breast carcinoma in pleural effusion (× 400).
435 de restauration antigénique. Le séchage à l’air des lames préparées (deux heures à température ambiante) est suivi d’une fixation. Une fois fixées, les lames peuvent être traitées immédiatement ou bien conservées à —20 ◦ C jusqu’à l’étape d’ICC. Une fixation à l’éthanol ou à l’acétone est préférée à une fixation au formol [9,10]. Les données de la littérature rapportent des résultats d’ICC pratiquée sur cytospins provenant d’épanchements des séreuses, identiques [11,12], meilleurs [13] ou moins bons [10] comparés à ceux obtenus sur cytobloc. Ces différences résultent très probablement de la variabilité dans les étapes techniques de fixation, de conservation, de dilution des anticorps ou de démasquage antigénique, comparées à celles des blocs d’inclusions en paraffine. Il faut remarquer que dans la dernière étude où les résultats étaient moins bons que ceux obtenus en paraffine [10], le bruit de fond qui a été observé sur des lames en cytospin ou avec la méthode en couche mince peut s’expliquer par l’utilisation d’anticorps primaires utilisés avec la même concentration que celle utilisée pour les cytoblocs. Afin d’assurer une bonne qualité technique, la concentration des anticorps doit être optimisée et validée par le laboratoire réalisant l’ICC. Les concentrations peuvent varier selon l’anticorps, le clone et la méthode de préparation des échantillons.
Cytologie en milieu liquide Plusieurs publications ont rapporté de bons résultats d’ICC sur ce type de spécimen cytologique, la plupart des groupes rapportant leur expérience à partir de préparations de type ThinPrep® (Hologic) [14—17]. Les avantages liés à la technique ThinPrep sont représentés par l’optimisation du recueil pour des prélèvements de taille réduite et la bonne conservation cellulaire tant morphologique que des sites antigéniques. La répartition uniforme des cellules, la diminution du caractère hémorragique, l’élimination du mucus et du fond protéique dans ces préparations en monocouche représentent des avantages certains comparés à l’ICC sur des étalements traditionnels. Des dilutions plus importantes d’anticorps primaires peuvent être utilisées pour couvrir une surface réduite de l’échantillon. Les étapes de recueil de l’échantillon, le transport et la préparation des lames sont standardisés. L’ICC peut être pratiquée sur des lames préparées selon les recommandations du fournisseur. Des lames non colorées ou les lames colorées au Papanicolaou peuvent être utilisées pour l’ICC et sur la base du travail de Dabbs et al. [15], des résultats équivalents, voire meilleurs sont obtenus sur des lames colorées au Papanicolaou. Ce travail montre aussi de meilleurs résultats d’ICC sur des lames colorées au Papanicolaou ou bien non colorées en comparaison avec le même type de lames réalisées à partir d’étalements traditionnels [15]. Comme pour la cytologie conventionnelle, un prélèvement richement cellulaire représente un prérequis obligatoire afin de pouvoir réaliser plusieurs lames pour l’ICC. Si le matériel est insuffisant, les lames d’étalement en monocouche peuvent être divisées de fac ¸on à utiliser plusieurs anticorps primaires sur une même lame qui peut être sectionnée en deux avec un couteau de diamant et chaque moitié divisée en deux parties avec un crayon de cire. Les deux moitiés de la lame peuvent être recollées sur une lame traditionnelle pour l’interprétation finale [15]. Cependant, cette technique implique la présence d’un prélèvement avec une dispersion régulière des cellules. Une alternative pour les prélèvements insuffisamment cellulaires peut être
436 la confection de lames de cytospin à partir du matériel restant en milieu liquide.
Cytoblocs Les cytoblocs peuvent être réalisés à partir de nombreux échantillons et représentent une aide importante pour l’interprétation cytologique. Par exemple, des fragments tissulaires recueillis par ponction à l’aiguille sur une lame peuvent être récupérés et fixés avant l’étalement cytologique. De la même fac ¸on, les fragments tissulaires visibles à l’œil nu dans un liquide frais ou recueilli en monocouche peuvent être inclus en paraffine. Il en est de même pour des culots de centrifugation de matériel frais ou en milieu liquide, une fois que des lames cytologiques pour coloration ont été préparées [10]. Parfois, un passage d’aiguille lors d’un prélèvement cytologique sera recueilli directement dans du fixateur à base de formol afin de disposer d’un fragment à inclure pour l’ICC. Comme les cytoblocs sont généralement réalisés avec des techniques comparables à celles de l’inclusion de tissus en paraffine, il n’est pas nécessaire d’avoir un protocole spécifique d’ICC lorsque le même fixateur est utilisé. Des kits de réalisation rapide de cette technique sont actuellement disponibles. Dans ce cas, les méthodes utilisées pour l’immuno-histochimie (IHC) peuvent être directement appliquées aux culots d’inclusion en paraffine. Ainsi, le cytobloc représente une technique de choix pour de nombreux laboratoires, compte tenu des avantages qu’il présente. Plusieurs sections peuvent être réalisées à partir d’un même bloc et de nombreux anticorps peuvent être utilisés sans qu’il soit nécessaire d’adapter une méthode d’ICC. De plus, il présente moins de bruit de fond et de marquage non spécifique que lors de l’utilisation de cytospins, d’étalements cellulaires ou de lames de cytologie en milieu liquide [10].
Démasquage antigénique Le démasquage antigénique sera systématiquement pratiqué sur des lames issues de cytoblocs avec les mêmes techniques que pour l’IHC. Ce démasquage n’est pas systématiquement utilisé pour l’ICC sur des frottis conventionnels, des cytospins ou des lames de cytologie en milieu liquide dans la mesure où les antigènes cytoplasmiques ou membranaires sont directement accessibles. Cependant, l’ICC portant sur des antigènes nucléaires nécessite un démasquage antigénique à la chaleur [9,18]. Bien entendu, avant d’être utilisées sur des échantillons, toutes les techniques de démasquage antigénique doivent être initialement testées sur des échantillons témoins de fac ¸on à permettre la meilleure préservation possible de la morphologie et d’assurer une perte cellulaire minimale. Les protocoles de démasquage antigénique ne peuvent pas être systématiquement extrapolés à partir de ceux utilisés sur du matériel en paraffine et doivent être adaptés aux échantillons cytologiques.
Dilution des anticorps primaires Les dilutions d’anticorps primaires pour l’ICC sont généralement différentes de celles utilisées sur matériel inclus en paraffine. Les laboratoires qui pratiquent l’ICC doivent déterminer pour chaque échantillon une dilution adéquate de ces anticorps et, en général, elles sont beaucoup
M. Courtade-Saidi, M.P. Dupre plus importantes que celles utilisées pour les cytoblocs. L’utilisation de concentrations trop fortes d’anticorps primaire peut s’accompagner de faux-positifs ou de bruit de fond trop important. L’utilisation de concentrations d’anticorps publiées à partir du même prélèvement peut servir de référence et de point de départ pour adapter la technique [19].
Témoins La standardisation des techniques en ICC va devenir obligatoire pour l’accréditation et la certification des laboratoires. Les plateformes automatisées sont à disposition de nombreuses structures d’anatomie et cytologie pathologiques et représentent un avantage en ce qui concerne la standardisation des méthodes. Cependant, en dépit de l’automatisation, une ICC représente toujours un challenge à standardiser en raison de la variété des échantillons, des méthodes de recueil et de fixation. Il s’y ajoute la variabilité des fixateurs utilisés dans les différents laboratoires [20]. Comme pour l’IHC, des témoins positifs et négatifs sont nécessaires et ils doivent être fixés de la même fac ¸on que l’échantillon qui sera testé. Idéalement, des témoins positifs et négatifs devraient être disponibles, mais cela est rendu parfois difficile pour des tumeurs rares ou des anticorps peu utilisés. L’utilisation de lignées cellulaires a été proposée comme une alternative intéressante en tant que témoin positif [21]. Le laboratoire peut également réaliser ses propres lames témoins en préparant des mélanges de cellules provenant par exemple d’épanchements des séreuses ou en recueillant des cellules par grattage de la surface d’échantillons frais. Une goutte d’échantillon témoin peut être déposée sur la même lame que l’échantillon testé afin de s’assurer qu’il a été traité dans les mêmes conditions [22]. L’ajout d’une goutte de colorant dans l’échantillon témoin peut aider à vérifier que le témoin est interprété séparément de l’échantillon test. Ces témoins positifs conservent leur réactivité antigénique jusqu’à 40 jours après leur recueil [22]. Une enquête récente menée par la Fédération européenne des sociétés de cytologie a montré que l’utilisation d’automates, de lames témoins et de dilutions d’anticorps adaptées réduisait la variabilité des résultats et améliorait significativement la qualité de l’ICC [23]. La standardisation des techniques et l’utilisation de contrôles de qualité internes et externes sont essentielles au développement futur de l’ICC [20].
Conclusion L’ICC représente une aide précieuse à la caractérisation des prélèvements cytologiques mais les étapes techniques doivent être contrôlées afin de garantir la qualité et la reproductibilité des résultats. Les cytoblocs représentent les échantillons les plus simples à standardiser dans la mesure où ils sont traités de la même fac ¸on que pour l’IHC. Il ne faut pas sous-estimer l’apport de l’ICC sur des lames d’étalement, des cytospins ou des lames provenant d’échantillons en milieu liquide si des méthodes rigoureuses sont appliquées. La fixation, le stockage des échantillons, le démasquage antigénique et les concentrations d’anticorps doivent être adaptées individuellement pour chaque anticorps au niveau de chaque laboratoire et les résultats d’ICC comparés à ceux obtenus avec une méthode de référence sur des échantillons témoins. La littérature est
Immuno-cytochimie abondante sur le sujet et chaque structure peut s’aider de ces données pour adapter sa propre technique à des fins de diagnostic. Bien que reconnue comme une technique ancillaire, le développement et la validation des méthodes d’ICC lui permettront d’être reconnue à part entière comme méthode d’aide au pronostic et à la thérapeutique. Des études prospectives menées par les sociétés internationales de Cytologie devraient permettre d’améliorer la standardisation et l’assurance qualité de cette technique.
Déclaration d’intérêts Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article.
Références [1] Chess Q, Hadju SJ. The role of immunoperoxidase staining in diagnostic cytology. Acta Cytol 1986;30:1—7. [2] Skoog L, Tani E. Immunocytochemistry: an indispensable technique in routine cytology. Cytopathology 2011;22:215—29. [3] Dinges HP, Wirnsberger G, Höfler H. Immunocytochemistry in cytology. Comparative evaluation of different techniques. Anal Quant Cytol Histol 1989;11:22—32. [4] Happerfield LC, Saward R, Grimwade L, Bloxham D, Erber WN. Automated immune-staining of cell smears: an alternative to flow cytometry. J Clin Pathol 2008;61:740—3. [5] Dalquen P, Sauter G, Epper R, Kleiber B, Feichter G, Gudat F. Immunocytochemistry in diagnostic cytology. Recent Results Cancer Res 1993;133:47—80. [6] Abendroth CS, Dabbs DJ. Immunocytochemical staining of unstained versus previously stained cytologic preparations. Acta Cytol 1995;39:379—86. [7] Sherman ME, Jimenez-Joseph D, Gangi MD, Rojas-Corona RR. Immunostaining of small cytologic specimens. Facilitation with cell transfer. Acta Cytol 1994;38:18—22. [8] Brown GC, Tao LC. Restoration of broken cytology slides and creation of multiple slides from a single smear preparation. Acta Cytol 1992;86:259—63. [9] Ikeda K, Tate G, Suzuki T, Mitsuya T. Comparison of immunocytochemical sensitivity between formalin-fixed and alcohol-fixed specimens reveals the diagnostic value of alcoholfixed cytocentrifuged preparations in malignant effusion cytology. Am J Clin Pathol 2011;136:934—42. [10] Fetsch PA, Simsir AS, Brosky K, Abati A. Comparison of three commonly used cytologic preparations in effusion immunocytochemistry. Diagn Cytopathol 2002;26:61—6.
437 [11] Arora R, Agarwal S, Mathur SR, Verma K, Iyer VK, Manju A. Utility of a limited panel of calretinin and BerEP4 immunocytochemistry on cytospin preparation of serous effusions: a cost-effective measure in resource-limited settings. Cytojournal 2011;8:14. [12] Kundu UR, Krishnamurthy S. Use of the monoclonal antibody MOC-31 as an immunomarker for detecting metastatic adenocarcinoma in effusion cytology. Cancer Cytopathol 2011;119:272—8. [13] Ueda J, Iwata T, Ono M, Takahashi M. Comparison of three cytologic preparation methods and immunocytochemistries to distinguish adenocarcinoma cells from reactive mesothelial cells in serous effusions. Diagn Cytopathol 2006;34: 6—10. [14] Leung SW, Bédard YC. Estrogen and progesterone receptor contents in ThinPrep-processed fine-needle aspirates of breast. Am J Clin Pathol 1999;112:50—6. [15] Dabbs DJ, Abendroth CS, Grenko RT, Wang X, Radcliffe GE. Immunocytochemistry on the Thinprep processor. Diagn Cytopathol 1997;17:388—92. [16] Fadda G, Rossi ED. Liquid-based cytology in fine-needle aspiration biopsies of the thyroid gland. Acta Cytol 2011;55: 389—400. [17] Cochand-Priollet B, Dahan H, Polivka M, Saada M, Herman Ph, Guillausseau PJ., et al. Immunocytochemistry with cytokeratine 19 and HBME1 increases the diagnostic accuracy of thyroid FNA: preliminary report of 150 liquid-based FNA with histological control. Thyroid 2011;21:1067—73. [18] Kakimoto K, Takekoshi S, Miyajima K, Osamura RY. Hypothesis for the mechanism for heat-induced antigen retrieval occurring on fresh frozen sections without formalin-fixation in immunohistochemistry. J Mol Hist 2008;39:389—99. [19] Fowler LJ, Lachar WA. Application of immunohistochemistry to cytology. Arch Pathol Lab Med 2008;132:373—83. [20] Kirbis IS, Maxwell P, Flezar MS, Miller K, Ibrahim M. External quality control for immunocytochemistry on cytology samples: a review of UK NEQAS ICC (cytology module) results. Cytopathology 2011;22:230—7. [21] Wiatrowska BA, Berner A, Torlakovic G, Emilsen E, Mykelbost GL, Torlakovic E. Cultured anaplastic cell lines as immunocytochemistry controls: a comparison of ThinPrep-processed smears and conventional air-dried cytospins. Diagn Cytopathol 2001;25:303—8. [22] Hansen T, Pedersen H, Brauner V, Hariri J. Control specimens for immunocytochemistry in liquid-based cytology. Cytopathology 2011;22:243—6. [23] Schmitt F, Cochand-Priollet B, Toesch M, Davidson B, Bondi A, Vielh P. Immunocytochemistry in Europe: results of the European federation of cytology societies (EFCS) inquiry. Cytopathology 2011;22:238—42.
Disponible en ligne sur
www.sciencedirect.com
MISE AU POINT
L’immuno-cytochimie : une aide au diagnostic cytologique Immunocytochemistry as an adjunct to diagnostic cytology Monique Courtade-Saidi a,∗, Marc P. Dupre b a
UF d’histologie-cytologie, service d’anatomie pathologique et histologie-cytologie, hôpital de Rangueil, 1, avenue J.-Poulhes, TSA 50032, 31059 Toulouse cedex 9, France b Department of pathology and laboratory medicine, faculty of medicine, university of Manitoba, hôpital Général de Saint-Boniface, 409, avenue Taché, Winnipeg, R2H 2A6 Manitoba, Canada Accepté pour publication le 13 septembre 2012 Disponible sur Internet le 20 novembre 2012
MOTS CLÉS Immuno-cytochimie ; Lames d’étalement ; Cytospin ; Étalements en monocouche ; Liquides d’épanchement ; Cytoponctions à l’aiguille fine
KEYWORDS Immunocytochemistry; Smear; Cytospin; Liquid-based cytology; Effusion fluid; Fine needle aspiration
∗
Résumé L’immuno-cytochimie est une technique complémentaire qui devrait être de routine ; cela reste néanmoins loin de la réalité pour de nombreuses structures d’anatomie et cytologie pathologiques ; les raisons en sont multiples : diversité des techniques de préparation cytologique parfois au sein d’une même structure ; manque de reproductibilité du matériel cellulaire ou pauvreté cellulaire ; absence de validation de certaines techniques en cytologie ; absence de témoins etc. . .. Néanmoins, la cytopathologie ne devrait plus, de nos jours, se concevoir sans l’aide de l’immuno-cytochimie qui apporte, comme en histologie, fiabilité diagnostique et éléments pronostiques. © 2012 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
Summary Immunocytochemistry (ICC) as a routine ancillary test remains a distant reality for most diagnostic laboratories. Notable barriers to the mass deployment of ICC include: the large variety of specimen preparations, the small specimen size, lack of validation and lack of control specimens. As clinicians constantly strive to answer questions relating to diagnosis, therapy and prognosis with minimally invasive sampling techniques, the cytopathology community must endeavour to adopt ancillary specimen testing by ICC as a core element of diagnostic cytology. © 2012 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
DOI de l’article original : http://dx.doi.org/10.1016/j.annpat.2012.09.205. Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (M. Courtade-Saidi).
0242-6498/$ — see front matter © 2012 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. http://dx.doi.org/10.1016/j.annpat.2012.09.206
434
Introduction Le développement des diagnostics basés sur la cytologie a nécessité le développement de techniques ancillaires parmi lesquelles l’immuno-cytochimie (ICC) joue un rôle majeur. En dépit de plus de 20 ans de publications décrivant des protocoles standardisés et en justifiant l’utilisation, l’ICC peine à devenir une technique de routine et souffre d’un manque de standardisation des méthodes [1,2]. Nous rapportons ici une revue pratique de l’ICC en résumant les techniques applicables aux échantillons cytologiques les plus couramment rencontrés : étalements sur lames, cytospins, cytologie en milieu liquide et cytoblocs d’inclusion en paraffine.
Les spécificités techniques de l’immuno-cytochimie Une des difficultés majeures qui limite la standardisation et la généralisation de l’ICC est représentée par l’importante diversité des échantillons et des préparations cytologiques que l’on rencontre au sein des structures. Le matériel cytologique peut parvenir sous forme d’étalements séchés à l’air réalisés par le clinicien ou de liquides frais fixés ou non fixés qui seront traités selon différents protocoles techniques au laboratoire. La cytologie en milieu liquide bénéficie du recueil dans un liquide spécifique, dont la nature est variable puisqu’il existe plusieurs milieux liquides, et implique la confection de lames selon les recommandations du fournisseur. Le caractère limité des échantillons cytologiques ainsi que la grande diversité des modalités de préparation des lames sont autant de facteurs limitant la performance et la reproductibilité de l’ICC. Enfin, la nature de certaines préparations cytologiques n’autorise pas l’utilisation de certains anticorps spécifiques.
Étalements conventionnels Dans la plupart des cas, les étalements sur lames sont réalisés par le clinicien et la qualité des prélèvements peut donc être variable et représenter un facteur limitant pour l’ICC. Un prélèvement non traumatique et un bon étalement cytologique doivent être assurés afin de conserver la morphologie cellulaire et éviter la présence d’amas tridimensionnels de cellules qui seront insuffisamment marqués par l’ICC [3]. Les étalements très hémorragiques peuvent représenter un facteur limitant pour la qualité de l’ICC en raison du bruit de fond important que cela peut générer, en particulier lors de l’utilisation d’une réaction avec la peroxydase. Ce bruit de fond peut être évité en utilisant la phosphatase alcaline et une plateforme automatisée avec un anticorps secondaire lié à un polymère. C’est ainsi que de bons résultats ont été rapportés sur des étalements de sang périphérique et de moelle osseuse en utilisant cette technique [4]. Sur le plan pratique, l’utilisation de lames prétraitées afin d’augmenter l’adhérence est cruciale pour éviter la perte des cellules durant les différentes étapes de la technique. Les étalements non fixés, séchés à l’air, peuvent poser problème en ICC tant par le manque d’immunomarquage que par les faux-positifs, comme cela a été décrit notamment avec les anticorps dirigés contre des protéines du cytosquelette [3]. Même s’il a été rapporté que les antigènes de surface peuvent être détectés jusqu’à
M. Courtade-Saidi, M.P. Dupre trois à quatre jours après la réalisation de l’étalement en l’absence de fixation, il est admis que la fixation est essentielle pour assurer la conservation des épitopes antigéniques. Le séchage à l’air d’étalements post-fixés avant l’ICC peut également compromettre le résultat. Les méthodes de fixation sont variables. Il peut s’agir d’une immersion dans de la glutaraldéhyde à 0,05 %, dans de l’acétone, des fixateurs à base d’alcool ou de formol ou bien de l’utilisation de sprays fixateurs. La glutaraldéhyde et les fixateurs en spray ont été préférés par certains auteurs dans la mesure où ils ne modifient pas les protéines de surface des cellules [3], alors que d’autres ont critiqué les sprays fixateurs car ils ne conviennent pas systématiquement pour la fixation de tous les épitopes antigéniques [5]. L’ICC peut être réalisée avec succès sur des lames blanches non colorées, colorées au Papanicolaou ou après décoloration [6]. En comparant l’ICC réalisée sur des lames blanches et sur des lames de Papanicolaou décolorées, des résultats équivalents ou supérieurs ont été obtenus dans 84 % des cas sur les lames décolorées. Des résultats similaires peuvent être attendus quand l’ICC est réalisée directement sur des lames colorées au Papanicolaou. Toujours dans l’étude d’Abendroth et al. [6], il n’y avait pas de différence de résultat entre des lames fixées et des lames séchées à l’air. Les échantillons difficiles à interpréter en ICC en raison d’un bruit de fond lié à de la nécrose ou à un fond richement protéique bénéficient de meilleurs résultats quand l’ICC est pratiquée à partir de lames colorées au Papanicolaou ou bien décolorées [6]. La réhydratation des lames dans des alcools et la décoloration dans des bains d’alcool-acide permettent l’élimination du fond protéique. Il est intéressant de noter que même si cette technique permet de réduire le bruit de fond, la positivité peut être relativement focale et nécessite une attention particulière pour l’interprétation des lames. Des techniques de transfert de cellules ont été utilisées afin de permettre l’utilisation de plusieurs anticorps quand trop peu de matériel est disponible [7]. Les lames représentatives avec une dispersion cellulaire relativement correcte peuvent être recouvertes avec un milieu de recouvrement liquide qui, une fois durci, peut être découpé avec un couteau de diamant. Ces échantillons sont alors montés sur des lames individuelles à des fins d’ICC. Même si cette méthode est laborieuse et nécessite plusieurs étapes pour réaliser des lames supplémentaires, elle est considérée comme très peu coûteuse et possède l’avantage de générer plusieurs lames avec une perte minimale de cellules tout en préservant la morphologie cellulaire et la réactivité antigénique. Indépendamment de ces applications en ICC, le transfert de cellules peut être utile pour réparer des lames abîmées [8]. Ce transfert peut également représenter une technique intéressante afin de limiter le volume d’anticorps nécessaire pour recouvrir une lame entière. Des résultats d’ICC identiques à ceux obtenus à partir de cytoblocs d’inclusion en paraffine ont été ainsi rapportés [9]. Des étalements directs réalisés à partir du culot cellulaire recueilli après centrifugation de liquide frais présenteront de meilleurs résultats dans la mesure où le laboratoire contrôle toutes les étapes de la confection et de la fixation des lames.
Cytospins Du matériel frais (épanchements des séreuses, ponctions de kystes, liquides céphalorachidiens. . .) ou fixé (urines) envoyé au laboratoire peut être traité avec la technique en cytospin. La plupart des études immuno-cytochimiques sur lames
Immuno-cytochimie
Figure 1. Immunomarquage cytoplasmique net avec l’anticorps anti-CK20 (clone Ks 20.8, Dako ; dilution 1/200e ) de cellules adénocarcinomateuses d’origine digestive dans une ascite (× 200). CK20 (clone Ks 20.8, Dako, dilution 1/200): strong cytoplasmic immunostaining of adenocarcinomatous cells from the digestive tract in a peritoneal effusion (× 200).
de cytospin ont été réalisées à partir d’épanchements des séreuses (Figs. 1 et 2). Le matériel frais non fixé nécessite un acheminement rapide au laboratoire afin de garantir la préservation cellulaire. La quantification des cellules par mm3 de liquide est essentielle afin de confectionner des lames au niveau desquelles 50 à 100 000 cellules seront déposées par spot de 0,5 cm2 . Des agents de lyse des globules rouges ou des gradients de densité peuvent être utilisés lorsque le prélèvement est très hémorragique (> 8000 hématies par mm3 ). Même si le transport est rapide, le recueil des échantillons sur un tube contenant un anticoagulant (EDTA) est fortement recommandé pour éviter la coagulation du liquide. Les liquides céphalorachidiens seront recueillis sur un tube sec sans additif. Comme pour les étalements sur lames, des lames prétraitées sont essentielles pour assurer l’adhésion et éviter la perte de cellules en particulier durant l’étape
Figure 2. Immunomarquage nucléaire aux récepteurs oestrogéniques (RE clone 6F11, Dako ; 1/40e ) de cellules adénocarcinomateuses d’origine mammaire dans un liquide pleural (× 400). Nucleic immunostaining with estrogen receptors (ER clone 6F11, Dako; dilution 1/40) for cells from a breast carcinoma in pleural effusion (× 400).
435 de restauration antigénique. Le séchage à l’air des lames préparées (deux heures à température ambiante) est suivi d’une fixation. Une fois fixées, les lames peuvent être traitées immédiatement ou bien conservées à —20 ◦ C jusqu’à l’étape d’ICC. Une fixation à l’éthanol ou à l’acétone est préférée à une fixation au formol [9,10]. Les données de la littérature rapportent des résultats d’ICC pratiquée sur cytospins provenant d’épanchements des séreuses, identiques [11,12], meilleurs [13] ou moins bons [10] comparés à ceux obtenus sur cytobloc. Ces différences résultent très probablement de la variabilité dans les étapes techniques de fixation, de conservation, de dilution des anticorps ou de démasquage antigénique, comparées à celles des blocs d’inclusions en paraffine. Il faut remarquer que dans la dernière étude où les résultats étaient moins bons que ceux obtenus en paraffine [10], le bruit de fond qui a été observé sur des lames en cytospin ou avec la méthode en couche mince peut s’expliquer par l’utilisation d’anticorps primaires utilisés avec la même concentration que celle utilisée pour les cytoblocs. Afin d’assurer une bonne qualité technique, la concentration des anticorps doit être optimisée et validée par le laboratoire réalisant l’ICC. Les concentrations peuvent varier selon l’anticorps, le clone et la méthode de préparation des échantillons.
Cytologie en milieu liquide Plusieurs publications ont rapporté de bons résultats d’ICC sur ce type de spécimen cytologique, la plupart des groupes rapportant leur expérience à partir de préparations de type ThinPrep® (Hologic) [14—17]. Les avantages liés à la technique ThinPrep sont représentés par l’optimisation du recueil pour des prélèvements de taille réduite et la bonne conservation cellulaire tant morphologique que des sites antigéniques. La répartition uniforme des cellules, la diminution du caractère hémorragique, l’élimination du mucus et du fond protéique dans ces préparations en monocouche représentent des avantages certains comparés à l’ICC sur des étalements traditionnels. Des dilutions plus importantes d’anticorps primaires peuvent être utilisées pour couvrir une surface réduite de l’échantillon. Les étapes de recueil de l’échantillon, le transport et la préparation des lames sont standardisés. L’ICC peut être pratiquée sur des lames préparées selon les recommandations du fournisseur. Des lames non colorées ou les lames colorées au Papanicolaou peuvent être utilisées pour l’ICC et sur la base du travail de Dabbs et al. [15], des résultats équivalents, voire meilleurs sont obtenus sur des lames colorées au Papanicolaou. Ce travail montre aussi de meilleurs résultats d’ICC sur des lames colorées au Papanicolaou ou bien non colorées en comparaison avec le même type de lames réalisées à partir d’étalements traditionnels [15]. Comme pour la cytologie conventionnelle, un prélèvement richement cellulaire représente un prérequis obligatoire afin de pouvoir réaliser plusieurs lames pour l’ICC. Si le matériel est insuffisant, les lames d’étalement en monocouche peuvent être divisées de fac ¸on à utiliser plusieurs anticorps primaires sur une même lame qui peut être sectionnée en deux avec un couteau de diamant et chaque moitié divisée en deux parties avec un crayon de cire. Les deux moitiés de la lame peuvent être recollées sur une lame traditionnelle pour l’interprétation finale [15]. Cependant, cette technique implique la présence d’un prélèvement avec une dispersion régulière des cellules. Une alternative pour les prélèvements insuffisamment cellulaires peut être
436 la confection de lames de cytospin à partir du matériel restant en milieu liquide.
Cytoblocs Les cytoblocs peuvent être réalisés à partir de nombreux échantillons et représentent une aide importante pour l’interprétation cytologique. Par exemple, des fragments tissulaires recueillis par ponction à l’aiguille sur une lame peuvent être récupérés et fixés avant l’étalement cytologique. De la même fac ¸on, les fragments tissulaires visibles à l’œil nu dans un liquide frais ou recueilli en monocouche peuvent être inclus en paraffine. Il en est de même pour des culots de centrifugation de matériel frais ou en milieu liquide, une fois que des lames cytologiques pour coloration ont été préparées [10]. Parfois, un passage d’aiguille lors d’un prélèvement cytologique sera recueilli directement dans du fixateur à base de formol afin de disposer d’un fragment à inclure pour l’ICC. Comme les cytoblocs sont généralement réalisés avec des techniques comparables à celles de l’inclusion de tissus en paraffine, il n’est pas nécessaire d’avoir un protocole spécifique d’ICC lorsque le même fixateur est utilisé. Des kits de réalisation rapide de cette technique sont actuellement disponibles. Dans ce cas, les méthodes utilisées pour l’immuno-histochimie (IHC) peuvent être directement appliquées aux culots d’inclusion en paraffine. Ainsi, le cytobloc représente une technique de choix pour de nombreux laboratoires, compte tenu des avantages qu’il présente. Plusieurs sections peuvent être réalisées à partir d’un même bloc et de nombreux anticorps peuvent être utilisés sans qu’il soit nécessaire d’adapter une méthode d’ICC. De plus, il présente moins de bruit de fond et de marquage non spécifique que lors de l’utilisation de cytospins, d’étalements cellulaires ou de lames de cytologie en milieu liquide [10].
Démasquage antigénique Le démasquage antigénique sera systématiquement pratiqué sur des lames issues de cytoblocs avec les mêmes techniques que pour l’IHC. Ce démasquage n’est pas systématiquement utilisé pour l’ICC sur des frottis conventionnels, des cytospins ou des lames de cytologie en milieu liquide dans la mesure où les antigènes cytoplasmiques ou membranaires sont directement accessibles. Cependant, l’ICC portant sur des antigènes nucléaires nécessite un démasquage antigénique à la chaleur [9,18]. Bien entendu, avant d’être utilisées sur des échantillons, toutes les techniques de démasquage antigénique doivent être initialement testées sur des échantillons témoins de fac ¸on à permettre la meilleure préservation possible de la morphologie et d’assurer une perte cellulaire minimale. Les protocoles de démasquage antigénique ne peuvent pas être systématiquement extrapolés à partir de ceux utilisés sur du matériel en paraffine et doivent être adaptés aux échantillons cytologiques.
Dilution des anticorps primaires Les dilutions d’anticorps primaires pour l’ICC sont généralement différentes de celles utilisées sur matériel inclus en paraffine. Les laboratoires qui pratiquent l’ICC doivent déterminer pour chaque échantillon une dilution adéquate de ces anticorps et, en général, elles sont beaucoup
M. Courtade-Saidi, M.P. Dupre plus importantes que celles utilisées pour les cytoblocs. L’utilisation de concentrations trop fortes d’anticorps primaire peut s’accompagner de faux-positifs ou de bruit de fond trop important. L’utilisation de concentrations d’anticorps publiées à partir du même prélèvement peut servir de référence et de point de départ pour adapter la technique [19].
Témoins La standardisation des techniques en ICC va devenir obligatoire pour l’accréditation et la certification des laboratoires. Les plateformes automatisées sont à disposition de nombreuses structures d’anatomie et cytologie pathologiques et représentent un avantage en ce qui concerne la standardisation des méthodes. Cependant, en dépit de l’automatisation, une ICC représente toujours un challenge à standardiser en raison de la variété des échantillons, des méthodes de recueil et de fixation. Il s’y ajoute la variabilité des fixateurs utilisés dans les différents laboratoires [20]. Comme pour l’IHC, des témoins positifs et négatifs sont nécessaires et ils doivent être fixés de la même fac ¸on que l’échantillon qui sera testé. Idéalement, des témoins positifs et négatifs devraient être disponibles, mais cela est rendu parfois difficile pour des tumeurs rares ou des anticorps peu utilisés. L’utilisation de lignées cellulaires a été proposée comme une alternative intéressante en tant que témoin positif [21]. Le laboratoire peut également réaliser ses propres lames témoins en préparant des mélanges de cellules provenant par exemple d’épanchements des séreuses ou en recueillant des cellules par grattage de la surface d’échantillons frais. Une goutte d’échantillon témoin peut être déposée sur la même lame que l’échantillon testé afin de s’assurer qu’il a été traité dans les mêmes conditions [22]. L’ajout d’une goutte de colorant dans l’échantillon témoin peut aider à vérifier que le témoin est interprété séparément de l’échantillon test. Ces témoins positifs conservent leur réactivité antigénique jusqu’à 40 jours après leur recueil [22]. Une enquête récente menée par la Fédération européenne des sociétés de cytologie a montré que l’utilisation d’automates, de lames témoins et de dilutions d’anticorps adaptées réduisait la variabilité des résultats et améliorait significativement la qualité de l’ICC [23]. La standardisation des techniques et l’utilisation de contrôles de qualité internes et externes sont essentielles au développement futur de l’ICC [20].
Conclusion L’ICC représente une aide précieuse à la caractérisation des prélèvements cytologiques mais les étapes techniques doivent être contrôlées afin de garantir la qualité et la reproductibilité des résultats. Les cytoblocs représentent les échantillons les plus simples à standardiser dans la mesure où ils sont traités de la même fac ¸on que pour l’IHC. Il ne faut pas sous-estimer l’apport de l’ICC sur des lames d’étalement, des cytospins ou des lames provenant d’échantillons en milieu liquide si des méthodes rigoureuses sont appliquées. La fixation, le stockage des échantillons, le démasquage antigénique et les concentrations d’anticorps doivent être adaptées individuellement pour chaque anticorps au niveau de chaque laboratoire et les résultats d’ICC comparés à ceux obtenus avec une méthode de référence sur des échantillons témoins. La littérature est
Immuno-cytochimie abondante sur le sujet et chaque structure peut s’aider de ces données pour adapter sa propre technique à des fins de diagnostic. Bien que reconnue comme une technique ancillaire, le développement et la validation des méthodes d’ICC lui permettront d’être reconnue à part entière comme méthode d’aide au pronostic et à la thérapeutique. Des études prospectives menées par les sociétés internationales de Cytologie devraient permettre d’améliorer la standardisation et l’assurance qualité de cette technique.
Déclaration d’intérêts Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article.
Références [1] Chess Q, Hadju SJ. The role of immunoperoxidase staining in diagnostic cytology. Acta Cytol 1986;30:1—7. [2] Skoog L, Tani E. Immunocytochemistry: an indispensable technique in routine cytology. Cytopathology 2011;22:215—29. [3] Dinges HP, Wirnsberger G, Höfler H. Immunocytochemistry in cytology. Comparative evaluation of different techniques. Anal Quant Cytol Histol 1989;11:22—32. [4] Happerfield LC, Saward R, Grimwade L, Bloxham D, Erber WN. Automated immune-staining of cell smears: an alternative to flow cytometry. J Clin Pathol 2008;61:740—3. [5] Dalquen P, Sauter G, Epper R, Kleiber B, Feichter G, Gudat F. Immunocytochemistry in diagnostic cytology. Recent Results Cancer Res 1993;133:47—80. [6] Abendroth CS, Dabbs DJ. Immunocytochemical staining of unstained versus previously stained cytologic preparations. Acta Cytol 1995;39:379—86. [7] Sherman ME, Jimenez-Joseph D, Gangi MD, Rojas-Corona RR. Immunostaining of small cytologic specimens. Facilitation with cell transfer. Acta Cytol 1994;38:18—22. [8] Brown GC, Tao LC. Restoration of broken cytology slides and creation of multiple slides from a single smear preparation. Acta Cytol 1992;86:259—63. [9] Ikeda K, Tate G, Suzuki T, Mitsuya T. Comparison of immunocytochemical sensitivity between formalin-fixed and alcohol-fixed specimens reveals the diagnostic value of alcoholfixed cytocentrifuged preparations in malignant effusion cytology. Am J Clin Pathol 2011;136:934—42. [10] Fetsch PA, Simsir AS, Brosky K, Abati A. Comparison of three commonly used cytologic preparations in effusion immunocytochemistry. Diagn Cytopathol 2002;26:61—6.
437 [11] Arora R, Agarwal S, Mathur SR, Verma K, Iyer VK, Manju A. Utility of a limited panel of calretinin and BerEP4 immunocytochemistry on cytospin preparation of serous effusions: a cost-effective measure in resource-limited settings. Cytojournal 2011;8:14. [12] Kundu UR, Krishnamurthy S. Use of the monoclonal antibody MOC-31 as an immunomarker for detecting metastatic adenocarcinoma in effusion cytology. Cancer Cytopathol 2011;119:272—8. [13] Ueda J, Iwata T, Ono M, Takahashi M. Comparison of three cytologic preparation methods and immunocytochemistries to distinguish adenocarcinoma cells from reactive mesothelial cells in serous effusions. Diagn Cytopathol 2006;34: 6—10. [14] Leung SW, Bédard YC. Estrogen and progesterone receptor contents in ThinPrep-processed fine-needle aspirates of breast. Am J Clin Pathol 1999;112:50—6. [15] Dabbs DJ, Abendroth CS, Grenko RT, Wang X, Radcliffe GE. Immunocytochemistry on the Thinprep processor. Diagn Cytopathol 1997;17:388—92. [16] Fadda G, Rossi ED. Liquid-based cytology in fine-needle aspiration biopsies of the thyroid gland. Acta Cytol 2011;55: 389—400. [17] Cochand-Priollet B, Dahan H, Polivka M, Saada M, Herman Ph, Guillausseau PJ., et al. Immunocytochemistry with cytokeratine 19 and HBME1 increases the diagnostic accuracy of thyroid FNA: preliminary report of 150 liquid-based FNA with histological control. Thyroid 2011;21:1067—73. [18] Kakimoto K, Takekoshi S, Miyajima K, Osamura RY. Hypothesis for the mechanism for heat-induced antigen retrieval occurring on fresh frozen sections without formalin-fixation in immunohistochemistry. J Mol Hist 2008;39:389—99. [19] Fowler LJ, Lachar WA. Application of immunohistochemistry to cytology. Arch Pathol Lab Med 2008;132:373—83. [20] Kirbis IS, Maxwell P, Flezar MS, Miller K, Ibrahim M. External quality control for immunocytochemistry on cytology samples: a review of UK NEQAS ICC (cytology module) results. Cytopathology 2011;22:230—7. [21] Wiatrowska BA, Berner A, Torlakovic G, Emilsen E, Mykelbost GL, Torlakovic E. Cultured anaplastic cell lines as immunocytochemistry controls: a comparison of ThinPrep-processed smears and conventional air-dried cytospins. Diagn Cytopathol 2001;25:303—8. [22] Hansen T, Pedersen H, Brauner V, Hariri J. Control specimens for immunocytochemistry in liquid-based cytology. Cytopathology 2011;22:243—6. [23] Schmitt F, Cochand-Priollet B, Toesch M, Davidson B, Bondi A, Vielh P. Immunocytochemistry in Europe: results of the European federation of cytology societies (EFCS) inquiry. Cytopathology 2011;22:238—42.