Methodical problems for evidence of the hepatitis-B-surface and hepatitis-B-core antigens in tissue

Acta histoehem. Bd. 58, S. 47 -55 (1977)

II. Medizinisehe Klinik und Poliklinik del' Johannes Gutenberg-Universitat, Mainz (Direktor: Prof. Dr. P. SCHOLMERICH)

Methodische Probleme des Hepatitis-B-Surface-Antigen (HBsAg)und Hepatitis-B-Core-Antigen (HBcAg) - Nachweises auf Gewebsebene Methodical problems for evidence of the hepatitis-B-surface and hepatitis-B-core antigens in tissue Von

GEORG HESS 1)

und

WOLFGANG ARNOLD 2)

Mit 2 Abbildungen (Eingegangen am 2:3. J\Iarz 1976)

Zusammenfassung Wir haben das Leberbiopsiematerial von 22 im Serum HBsAg-positiven Patienten mit der Fluoreszierenden Antikiirpertechnik (FAT) auf die Gewebelokalisation von HBsAg und HBcAg untersucht. Fur die vergleichende Untersuehung zur Antigenitat und ortsrichtigen Lokalisation wurden folgende Gewebspraparationen untersucht: Cryostatschnitte, Gefriertrocknung/Paraffineinbettung, Kalt-Athanol-Paraffineinbettungstechnik (SAINTE-MARIE), Gefriersubstitution und isolierte Leberzcllen. Die Untersuchungen haben folgende Ergebnisse gebracht: 1. Bei Anwendung del' Kalt-Athanol-Paraffineinbettungstechnik und del' Gefriersubstitution konnten wedel' HBsAg noeh HBcAg nachgewiesen werden. 2. Bei Cryostatschnitten konnte bei 16 Patienten HBsAg im Cytoplasma und bci 8 HBcAg im Kern gefunden wcrden. 3. Mit del' Gefriertrocknung lieB sich bei denselben Fallen HBsAg und HBcAg nachweisen. Die hervorragende Morpholugie erlaubte eine korrekte Zuordnung zu del' Zellstruktur. 4. An isolierten Leberzellen lieB sich, bezogen auf die Cryostatschnitte, HBsAg in 11/16 und HBcAg in 8/8 Fallen zeigen.

Summary Liver biopsy material of 22 in the serum HBsAg positive patients was tested with the fluorescent antibody technique for the localizatiun of HBcAg and HBsAg in the liver tissue. Comparative studies were done with the following tissne preparation techniques: Cryostat technique, freeze drying, freeze substitution, cold ethanol paraffin embedding technique (SAINTE MARIE) and isolated liver cells. The investigations revealed the following results: 1. No HB-components could be detected with the cold ethanol paraffin embedding technique and freeze substitution. I) 2) Mit Unterstutzung del' Deutschen Forschungsgemeinschaft Ar 106/1, Mainz, und Schwerpunktprc gramm "Virushepa ti tisforschung" .

48

G. HESS und VV. ARNOLD

2. Using the cryostat technique HBsAg could be demonstrated in 16/22 (cytoplasmatic localization) and HBcAg in 8/22 (nuclear localization). 3. With freeze drying HBsAg and HBcAg could be found in the same cases. The excellent tissue preparation allowed a correct localization of the HB-components to the cell structure. 4. In comparison to cryostat sections in isolated liver cells HBcAg could be demonstrated in 1l/16 and HBcAg in 8/8 cases.

Einleitung Ftir die Differenzierung der verschiedenen HBsAg-positiven Lebererkrankungen hat der Nachweis von HBAg-Komponenten groBe Bedeutung erlangt (HOOFNAGLE et al. 1973, 1974; KRUGMAN et al. 1974; GUDAT et al. 1975; ARNOLD et al. 1975). Von verschiedenen Untersuchern wurden dabei tiber die Lokalisation von HBsAg in der Leberzelle unterschiedliche Angaben gemacht (MILLMAN et al. 1969; COYNE, ZA VATONE et al. 1970; N OWOSLA WSKI et al. 1970; EDGINGTON und RITT 1971; N IELSEN et al. 1971; N OTKINS et al. 1966; AKEY AMA et al. 1972; KRA WCZYNSKI et al. 1972; HADZYANNIS et al. 1972; MULLER et al. 1973; BRZOSKO et al. 1973; GUDAT et al. 1975). Es ist bekannt, daB es bei der tiblichen Gewebepraparationsmethode, dem Cryostatschnitt, durch Einfrieren zu erheblichen GewebszerreiBungen und Substratverschleppungen kommt, so daB eine ortsrichtige Lokalisation unmoglich werden kann (ARNOLD et al. 1974). In der vOlliegenden Arbeit wird tiber die Lokalisation der HBAg-Komponenten in Zellen berichtet. HierfUr sollen verschiedene Gewebeeinbettungsmethoden, die fUr die Fluoreszierende Antikorpertechnik (FAT) empfohlen werden, angewendet werden.

Material und Methoden Biopsiematerial Untersucht wurden durch Lcberblindpunktion gewonnene Leberpunktate von insgesamt 22 im Serum HBsAg-positiven Patienten. Davon waren 14 klinisch gesunde HBsAg-Trager, und 8 hatten histologisch eine chronisch aktive Hepatitis (CAR). ('l'abellen lund 2).

Serologische Untersuchungen HBsAg·Bestimmung erfolgte mit der Uberwanderungselektrophorese (PESENDORFER et al. 1970), der Komplementbindungsreaktion im Auto-Analyzer (EHRKE 1973) und mit dem Radioimmunoassay (Au8ria-Test)1).

Gewe bepraparationsmethoden a) Cryostatschnitte Etwa 0,5 bis I em lange Gewebszylinder (Durchmesser 1 bis 1,5 mm) wurden in Rattenleberbl6ckchen eingebettet und im bei - 20°C Cryostaten 6 bis 7 pm dicke Gewebsschnitte hergestellt und anschlief3end luftgetrockent. Die Schnitte wurden unfixiert und I min in Aceton nachfixiert verwendet. 1) Durchfiihrung der radioimmunologischen Bestimmung durch Dr. W. GERLICH, Hyg18neInstitut, G6ttingen.

49

lVIethodische Probleme des Hepatitis-B-Surface-Antigen-Nachweises LZ

Tabelle L Nachweis von HBsAg im Gewebe Patient (Initialen)

Diagnose

H. lVI.

=

Leberzellen

HBcAg

HBsAg

ANFim Serum

Cryo

Gefriertrocknung

+

0

0

0

0

+

-t-

0

0

0

0

+

+

+

0

0

0

0

ges. HBsAg Trager

+

+

0

0

0

0

0

H.H.

ges. HBsAg Trager

+

+

+

0

0

0

0

lVI. G.

ges. HBsAg Trager

+

+

+

0

0

0

0

W.T.

ges. HBsAg Trager

+

+

+

0

0

0

0

H.H.

ges. HBsAg Trager

+

+

+

0

0

0

0

R.R.

ges. HBsAg Trager

+

+

+

0

0

0

0

G. E.

ges. HB,Ag Trager

+

+

+

0

0

0

0

R.H.

ges. HBsAg Trager

+

-r-

0

0

0

I;)

0

K. G.

ges. HB,Ag Triigcr

+-

+

0

0

0

0

0

P.K.

ges. HB.sAg Trager

+

+

0

0

0

0

.0

O.W.

ges. HBsAg Trager

+

+

0

0

0

0

0

Cryo

Gefriertrocknung

ges. HBsAg Trager

+

+

L. S.

ges. HBsAg Trager

+

H. L.

ges. HBsAg Trager

C.W.

isoL LZ

iso1. LZ

b) Gefriertrocknung und Paraffineinbettung Gleich gro13e Gewebsstiicke wurden in N 2 -gekiihltem Isopentan eingefroren und in den vorgekiihlten Rezipienten einer WKF L 05 Gefriertrocknungsanlage iiberfiihrt, Endvakuum 10-3 Torr (24 h). Brechen des Vakuums, Rehyclrierung in cler feuchten Kammer (10 min bei 37 eC) und Einnettung in Paraffin. Hersteliung von 6 bis 7 /km dicken Sc!mitten und entparaffiniel'en mit Xylol 2 X 5 min, anschlie13end Lufttroclmung, keine Nachfixierung.

c) Kalt-Athallol-Paraffin-Einbettungstechnik

(SAINTE-MARIE

1962)

Gewebezylinder der oben beschriebenen GroBe wurden in 96%igem Athano! fixiert (16 bis 24 h bei 4 eC), in 100%iges Athano! iiberfiihrt, 4°C (2ma!, aile 2 h Wechsel des Athanols), Transfer in Xylen 4°C (Vl'echse! 3mal aIle 2 h), Vakuum-Einbettung in Paraffin. 4

Acta histochem. Bd. 58

50

G. HESS und W. ARNOLD

Tabelle 2. Nachweis von HBcAg im Gewebe Patient (Initialen)

Diagnose

S.lVI.

C.A.H.

V.J.

C.A.H.

A.H.

LZ

HBsAg

Leberzellen

=

HBcAg

Cryo

Gefrier· trocknung

iso!. LZ

Cryo

Gefriertroclmung

iso!. LZ

+ +

+ +

+ +

C.A.H.

0

0

0

J. K.

C.A.H.

0

0

0

W.F.

C.A.H.

.0

0

0

+ + + + +

K.L.

C.A.H.

0

0

0

T

B.M.

C.A.H.

0

0

0

+

G.N.

C.A.H.

0

0

0

+ + + + + + + +

+ + + + + + + +

I

ANF Serum

0 0

0 0

0 0 0

0

d) Gefriersubstitution 5mal Ibis 1,5 mm groBe Gewebsstucke wurden in N 2 -gekiihltem Isopentan eingefroren und dann in -70°C kaltem 100%igem Athanol in den Ultracryostat uberfiihrt (Colora Mej3technik, Lorch). Die Temperatur wurde schrittweise jeweils urn 10°C aile 24 h bis auf Raumtemperatur erhoht, Transfer in Chloroform und Paraffineinbettung.

e) Isolierte Leberzellen Aus Biopsiematerial wurden Hepatocyten mechanisch isoliert. Die Gewinnung del' Leberzellen erfolgte wahrend Inkubation in ElVIBA (EAGLES Medium [Serva] mit Zusatz von 2,5 % Bovin-SerumAlbumin [Behringwerke, }Iarburg]). Filtration durch Nylonwolle und Zentrifugation bei 190 g, 5 min (HoPF at a!. 1974). Anfertigen von Ausstrichpraparaten.

Fl uoreszenzhist ologie a) Konjugatherstellung IgG-Isolierung von Anti-HBs und Anti-HBc aus humanem Serum nber DEAE-Cellulose, aquilibriert mit Na-phosphat-Puffer pH = 7,5, Kopplung und Reinigung del' Konjugate nach eigenen Angaben (ARNOLD und v. :iVIAYERSBACH); Proteingehalt 5 mg/ml, Mol F/P-Raten: Anti-HBs 2,8, Anti-HBc: 3,21). Herstellung von Anti-H-IgG- und Kaninchen-IgG-Konjugaten als Negativkontrollen nach der gleichen Methode. Fur aile vergleichenden Untersuchungen wurde dasselbe Konjugat mit einheitlicher Proteinkonzentration verwendet.

b) Inkubationen Cryostatschnitte, entpal'affinierte Praparate und Ausstriche wurden bei 37°C nach Uberschichten mit f1uoreszenzmarkiertem AntiRerum 30 min in del' feuchten Kammer inkubiert. Danach 3mal 5 min waschen in PBS pH = 7,5, eindecken mit PBS-Glycerin.

c) Fluoreszenzmikroskopie Die Auswertung erfolgte mit dem Leitz-Orthoplan mit Orthomaten, Auflichtfluoreszenz mit Fluoreszenzauflichtilluminator nach PLOEM, Interferenz-BIaufilter KP 490, Dichromat-Teilerspiegel TK 510, Sperrfilter U 515, Selektionsfilter fUr FITC S 525. 1) Ein Referenzkonjugat wurde von Dr. R. H. PURCELL, National Institute of Health. Bethesda, Maryland, USA, zur VerfUgUng gestellt-.

Methodische Probleme des Hepatitis-B-Surface-Antigen-Nachweises

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Ergebnisse Nachweis von HBsAg Bei 16 der untersuchten 22 Leberbiopsiezylinder lie13 sieh bei Inkubation mit AntiHBs-FITC an Cryostatschnitten HBsAg naehweisen. HBsAg war grundsatzlich im Cytoplasma von Leberzellen lokalisiert, niemals 1m Zellkern (Abb. 1 a). Mit der Gefriertrocknung + Paraffineinbettung konnte bei denselben Patienten HBsAg gezeigt werden. Die spezifische Fluoreszenz lie13 sleh eindeutig dem Cytoplasma der Leberzellen zuordnen, eine Kernfluoreszenz konnte bei Inkubation mit Anti-HBs-FITC niemals gefunden werden (Abb. 1 b). An Ausstrichen isolierter Hepatocyten lie13 sieh nur in 11 von 16 Fallen HBsAg nachweisen [(Abb. 1 c, d); (Tabelle I)]. Ein HBsAg-Naehweis konnte mit der KaltAthanol-Paraffin-Einbettungstechnik (SAINTE-MARIE) in keinem Fall erzielt werden, gleiches gilt fUr die Gefriersubstitution. Nachweis von HBcAg HBcAg konnte an Cryostatschnitten bei 8 der untersuchten 22 Biopsiezylinder im Kern der Leberzellen nachgewiesen werden (Abb. 2a). An gefriergetroclmetem und paraffineingebettetem Lebermaterial gelang bei denselben Patienten der Nachweis von HBcAg. HBcAg war stets im Leberzellkern lokalisiert (Abb. 2b). Bei der Untersuchung isolierter Hepatocyten war ebenfalls in denselben 8 Fallen HBcAg im Leberzellkern zu finden [(Abb. 2 c, d); (Tabelle 2)J. Die Kalt-Athanol-Paraffineinbettungstechnik und die Gefriersubstitution wurden gleichfalls fUr die Eignung zum Nachweis fur HBcAg untersucht. Mit diesen beiden Methoden konnte HBcAg nicht nachgewiesen werden. Bei 2 Patient en konnte HBsAg und HBcAg im Lebergewebe nachgewiesen werden. HBcAg und HBsAg waren in diesen Fallen nicht in denselben Zellen lokalisiert. 1m Serum war bei keinem der untersuchten :Falle Antinucleare Faktoren (ANF) nachweisbar. Diskussion Die vorliegende vergleichende Untersuchung hat sich mit dem Nachweis von HBsAg und HBcAg im Gewebe beschiiftigt. Eine vergleichende Untersuchung von Cryostatschnitten und BouIN-fixiertem Lebermaterial ist von RAY et al. (1975) durchgefUhrt worden. Die Autoren berichten uber positive Ergebnisse fUr den Nachweis von HBsAg mit der angegebenen Fixierungsmethode. Dies ist erstaunlif'h, da nach Untersuchungen von BRZOSKO (1975) es durch Alkoholbehandlung zu einer Zerstiirung von HBsAg kommt. Wir haben gleichfalls mit den Gewebepraparationsmethoden, bei denen ein Alkoholkontakt erfolgte (Kalt-Athanol-Paraffin-Einbettungsteehnik, SAINTE-MARIE; Gefriersubstitution), erwartungsgemal.l keine positive Reaktion fur HBsAg mehr gefunden. Das durfte durch eine Extraktion oder Denaturierung der Lipoproteine zu erklaren sein. Aus diesem Grunde lal.lt sich die Gefriersubstitution, die fur andere Fragestellungen besonders geeignet war (ARNOLD 1974), fur den Nachweis von HBsAg nicht verwenden. Bei den Ilier vorgelegten Untersuchungen hat sieh gezeigt, daG die iiblicherweise verwandten Cryostatschnitte zum Nachweis der HBAg-Komponenten geeignet sind. Allerdings ist bei der schlechten Morphologie von Cryostatschnitten eine korrekte Zuordnung zur Gewebsstruktur nicht miiglich. 4"

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G.

HESS

und 'V.

ARNOLD

Abb. 1. Nachweis von im Cytoplasma lokalisiertem HBsAg am: a) Cryostatschnitt (300: 1). b) Schnitt von gefricrgetrocknetem Lebergewebe (300: 1). c) und d) isolierte Leberzelle (c = 300: 1; d = 400: 1).

Methodische Probleme des Hepatitis-B-Surface-Antigen-Nachweises

Abb_ 2_ Nachweis von intranuclearem HBcAg im a) Cryostatschnitt (300: l), b) Schnitt von gefriergetroelmetem Lebergewebe (300: 1), 0) und d) isolierten Leberzellen (0 = 300: 1; d = 540: 1).

53

54

G. HESS und W. ARNOLD

Isolierte Loberzellen sind zweifcllos fur den Nachweis von HBAg-Komponenten gut geeignet. Nachteilig ist allerdings die niedrige Frequenz fUr den Nachweis von HBsAg. Dies kiinnte durch cine leichtere Zerstiirbarkeit HBsAg-positiver Zellen bei der Praparation und durch die oft geringe Anzahl HBsAg-positiver Leberzellen erklart werden. \Vie Voruntersuchungen gezeigt haben, haben sich jedoch isolierte Leberzellen fur bestimmte Fragestellungen - insbesondere fUr ::\Iembranstudien an der intakten Zelle - besonders bewahrt (ARNOLD 1974; Hon 1974). Die besten RQsultato konnten wir mit der Gefriertrocknung Paraffineinbettung erzielen. Die Vorteile der Gefriertroclmung mit Paraffineinbettung fUr den Nachweis von HBcAg und HB-s Ag lassen sich wie folgt, zusammonfassen:

+

1. Es findet sich eine hervorragende Erhaltung der Gewebsmorphologie; Substanzverschleppungen werden \'ermiedon, dadurch ist eine prazise Lokalisation des Antigens miiglich. 2. Gefrierartefakte durch Eiskristallbildung trcten nicht auf. :3. Gefriergetrocknetes und in Paraffin eingebettetes Gewebe ist lange lagerbar, ohne dal.l es zu einem Verlust cles Nachweisos cler HBAG-Komponenten kommt. Das erscheint fur Referenz- und V crgleichsuntersuchungen yon Be(leutung. 4. Das Anfortigen \'on Serienschnitten auch unt,er Einbeziehung von anderen Farbetechniken (HE-Farbung, Aldehydthioninfarbnng) ist miiglich. 5. Bei gleich intensiver spezifischcr Fluoreszenz finclet sich, vcrglichen mit gleichbehandelten Cryostatschnitton, eine deutlich geringere unspezifische Hintergrundfluoreszenz. Zusammonfasseml lttl.lt sich sagen, dal.l Cryostatsclmitte ohne Nachfixation zum schnellen und einfachen Nachweis von HBAg-Komponenten geeignet sind. Man sollte sich jedoch nicht verleiten lassen, eine "exakte" Lokalisation der HBAg-Komponenten an Cryostatschnitten durchzufUhren. Bekanntlich tretcn durch Eiskristallbildung starke Gewebszerreil.lungen und Substanzverschleppungen auf. Um einc korrekte Lokalisation vornehmen zu kiinnen, sollte deshalb auf eine differenzierte Tech nik mit relativ hohem zeitlichem und technischem Aufwand, wie sie die Gefriertrocknung darstellt, nicht verzichtet werden.

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