Polimorfismos en el gen de la apolipoproteína E y riesgo de hipercolesterolemia: un estudio de casos y controles en una población laboral de Valencia

ORIGINALES Polimorfismos en el gen de la apolipoproteína E y riesgo de hipercolesterolemia: un estudio de casos y controles en una población laboral de Valencia Dolores Corella, Marisa Guillén, Olga Portolés, Antonio Sabater, Silvia Cortina, José Folch y Carmen Sáiz Unidad de Investigación en Epidemiología Genética y Molecular. Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública. Universitat de València. Valencia.

FUNDAMENTO: El gen de la apolipoproteína E (apoE) presenta tres variantes comunes (alelos ε2, ε3, ε4), cuya frecuencia alélica y asociación con los lípidos plasmáticos varía según las poblaciones. Nuestro objetivo fue estimar la asociación entre estas variantes genéticas y el riesgo de hipercolesterolemia en la población mediterránea española. PACIENTES Y MÉTODOS: Se ha realizado un estudio de casos y controles en una población laboral de Valencia. Se identificaron 330 casos (148 varones y 182 mujeres) con hipercolesterolemia moderada (colesterol total > 200 mg/dl o con tratamiento hipolipemiante) y un intervalo de edad entre 20-60 años. Se seleccionaron 330 controles normocolesterolémicos apareados por edad y sexo. En todos ellos se determinó el genotipo de la apoE, el índice de masa corporal, los lípidos y lipoproteínas plasmáticas, variables demográficas y de estilo de vida. RESULTADOS: La frecuencia alélica para el alelo ε2 fue estadísticamente inferior en el grupo de casos (0,033) que en el de controles (0,086), mientras que la frecuencia alélica del alelo ε4 fue superior en los casos (0,115) que en los controles (0,039). En el análisis de regresión logística crudo, el polimorfismo de la apoE se asoció (p < 0,001) con el riesgo de hipercolesterolemia. Tras ajustar por la edad, índice de masa corporal, nivel de estudios, consumo de tabaco, consumo de alcohol y ejercicio físico, el alelo ε2 se asoció con un menor riesgo de hipercolesterolemia (odds ratio [OR] = 0,36; intervalo de confianza [IC] del 95%: 0,20-0,64), mientras que el alelo ε4 se asoció con un mayor riesgo (OR = 3,04; IC del 95%: 1,82-5,06). CONCLUSIONES: En población mediterránea española, el genotipo de la apoE se asocia significativamente con el riesgo de hipercolesterolemia moderada. Palabras clave: Apolipoproteína E; E. Polimorfismo genético; Hipercolesterolemia; Gen APOE.

Apolipoprotein E polymorphisms and risk of hypercholesterolemia: a case-control study in a working population from Valencia, Spain BACKGROUND: The apolipoprotein E (apoE) gene is polymorphic with three common alleles (ε2. ε3, ε4) whose allelic frequency and association with lipid levels varies from population to population. The aim of this study was to estimate the association between these genetic variants and the risk of hypercholesterolemia in a Mediterranean Spanish population. PATIENTS AND METHODS: A case-control study in a working population from Valencia was carried out. A total of 330 cases (148 men and 182 women) with moderate hypercholesterolemia (total cholesterol > 200 mg/dl or with lipid lowering treatment) and age range 20 to 60 years, were identified. 330 normocholesterolemic controls matched by age and sex were selected. From all of them data of apoE genotype, body mass index, lipid and lipoprotein levels, socioeconomic and life-style variables were obtained. RESULTS: The ε2 allele frequency was statistically lower in cases (0.033) than in controls (0.086). The ε4 allele frequency was higher in cases (0.115) than in controls (0.039). In the crude logistic regression analysis, the apoE polymorphism was related (p < 0.001) to the risk of hypercholesterolemia. After adjustment by age, body mass index, educational level, tobacco smoking, alcohol consumption and physical activity the ε2 allele was associated with a lower risk of hypercholesterolemia (odds ratio [OR] = 0.36; 95% confidence interval (CI): 0.200.64), and the ε4 allele was associated with a higher risk (OR = 3.04; 95% CI: 1.82-5.06). CONCLUSIONS: The apoE genotype was significantly related to the risk of moderate hypercholesterolemia in the Mediterranean Spanish population.

Med Clin (Barc) 2000; 115: 170-175

Correspondencia: Dra. D. Corella. Departamento de Medicina Preventiva. Facultad de Medicina. Avda. Blasco Ibáñez, 15. 46010 Valencia. Correo electrónico: [email protected] Recibido el 28-3-2000; aceptado para su publicación el 15-6-2000

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El colesterol plasmático es uno de los principales factores de riesgo cardiovascular1,2. Dado que las enfermedades cardiovasculares son la primera causa de muerte en nuestro país, un buen conocimiento de los factores que determinan la colesterolemia constituye una información muy relevante desde el punto de vista de la salud pública. Las concentraciones plasmáticas de colesterol están a su vez determinadas por factores genéticos y ambientales3,4. Aunque los factores ambientales han sido ampliamente investigados en los estudios epidemiológicos5,6, la contribución de los determinantes genéticos a la colesterolemia en la población general está poco caracterizada7. En la última década se han descrito varias mutaciones asociadas al riesgo individual de hipercolesterolemia y de enfermedad cardiovascular8-11; sin embargo, éstas se presentan con una frecuencia muy baja y tienen, por tanto, un efecto muy limitado sobre el riesgo poblacional. Existen, por otra parte, una serie de genes que, si bien su efecto individual sobre la colesterolemia parece ser ligero, dado que sus polimorfismos son muy frecuentes, su impacto poblacional sería muy elevado7,12. El más estudiado de estos genes es el gen de la apolipoproteína E (apoE). Sus variaciones se han asociado con distintas concentraciones de lípidos plasmáticos y con un mayor riesgo de enfermedad cardiovascular13-18. El gen estructural de la apoE (gen APOE) está localizado en el cromosoma 19 (19q13.2), siendo sus variantes más comunes las conocidas como apoE2 (alelo ε2), apoE3 (alelo ε3) y apoE4 (alelo ε4). Estas variantes difieren una de otra según la presencia de arginina o de cisteína en las posiciones 112 y 1583,17,19,20. El alelo ε4 se asocia, en general, a concentraciones más elevadas de colesterol total y de colesterol ligado a lipoproteínas de baja densidad (cLDL), mientras que el alelo ε2 lo haría a concentraciones más bajas13,21-24. Sin embargo, en algunos estudios no se han encontrado estas asociaciones25-27.

D. CORELLA ET AL.– POLIMORFISMOS EN EL GEN DE LA APOLIPOPROTEÍNA E Y RIESGO DE HIPERCOLESTEROLEMIA: UN ESTUDIO DE CASOS Y CONTROLES EN UNA POBLACIÓN LABORAL DE VALENCIA

A escala mundial, la prevalencia de cada uno de los alelos difiere según el origen étnico-geográfico de la muestra28,29. En Europa, la prevalencia del alelo ε4 disminuye de norte a sur, al igual que lo hacen las tasas de mortalidad por enfermedad cardiovascular24-30. En España, dos estudios realizados en población laboral31,32 han encontrado una baja prevalencia para el alelo ε4 en nuestro país. Sin embargo, los resultados obtenidos en la asociación de este alelo con las concentraciones de lípidos plasmáticos han sido discordantes. A ello puede contribuir tanto la posible influencia de factores ambientales que modulen la expresión genotípica como los sesgos en la estimación de la asociación resultado de los diseños transversales empleados. Por esta razón, el objetivo de este estudio es estimar la asociación entre las variantes genéticas comunes en el gen de la apoE y el riesgo de hipercolesterolemia moderada en una población laboral mediterránea, a través de un diseño de casos y controles, teniendo en cuenta la influencia de otros factores, como el índice de masa corporal, el consumo de tabaco y de alcohol, el ejercicio físico y el nivel de estudios. Pacientes y métodos Pacientes y diseño del estudio Dentro de un diseño más amplio para conocer la prevalencia de factores genéticos y ambientales que contribuyan al riesgo de enfermedad cardiovascular en la Comunidad Valenciana, se ha llevado a cabo un estudio de casos y controles en una población laboral. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética en la Investigación de la Facultad de Medicina de Valencia. Mediante un muestreo aleatorio estratificado por sexo se seleccionaron 750 varones y 750 mujeres pertenecientes a un colectivo de más de 5.000 trabajadores de diversas ocupaciones que acudían a un reconocimiento rutinario de salud laboral en un centro oficial de Valencia. Se les informó de los objetivos del estudio y se solicitó su colaboración. Inicialmente, 413 varones (55%) y 528 mujeres (70%) aceptaron participar en el estudio. A partir de los datos bioquímicos y de la historia clínica obtenida durante los años 1998-1999 se identificaron como casos de hipercolesterolemia todos aquellos varones y mujeres entre 20 y 60 años, no emparentados entre sí, con un colesterol total superior a 200 mg/dl y/o en tratamiento regular con fármacos hipocolesterolemiantes. Se excluyó del estudio a los individuos diabéticos, a las mujeres embarazadas y a

los no nacidos en territorio español. En total se identificaron 340 casos con las anteriores características. Finalmente, se obtuvieron datos completos de 330 individuos (148 varones y 182 mujeres). Para cada caso se seleccionó un control entre 20 y 60 años, apareado por sexo (148 varones y 182 mujeres) y edad (± 3 años) con el caso, elegido de forma aleatoria a través de un programa informático, entre el resto de trabajadores reconocidos en el mismo centro que tenían colesterolemias inferiores a 200 mg/dl, y que no recibían ningún tratamiento hipolipemiante. Obtención de las muestras y determinaciones bioquímicas A cada participante se le realizó una extracción de sangre venosa periférica tras un período de ayuno de 12 h. Se empleó una alícuota para las determinaciones bioquímicas, y otra para la extracción del ADN. El colesterol total y los triglicéridos se determinaron de forma automatizada por métodos enzimáticos (Technicon Instruments, Tarrytown, Nueva York). El colesterol ligado a las proteínas de alta densidad (cHDL) se determinó en el sobrenadante tras precipitación con cloruro de magnesio. El cLDL se calculó mediante la ecuación de Friedewald et al33 en las muestras con concentraciones de triglicéridos menores de 400 mg/dl. El coeficiente de variación para cada determinación bioquímica fue siempre inferior al 5%. Extracción de ADN y genotipificación El ADN genómico de cada caso y de cada control se obtuvo a partir de leucocitos aislados de sangre periférica utilizando un protocolo estándar basado en la extracción con fenol cloroformo y posterior precipitación con etanol. El genotipo en el gen APOE se determinó según el modelo de Hixon y Vernier34. Para ello, se amplificó mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) un fragmento de 244 pares de bases (pb) incluyendo los dos lugares polimórficos. Los fragmentos amplificados se digirieron durante 3 h a 37 °C con la enzima Hha I. Los productos de digestión se sometieron a electroforesis en gel de agarosametafor al 4% y posterior visualización ultravioleta tras tinción con bromuro de etidio. Debido a las dificultades en la interpretación de los genotipos originadas por el reducido tamaño de los fragmentos, los resultados de cada electroforesis fueron interpretados independientemente por dos investigadores, repitiendo las discrepancias en caso de existir. Además, se procedió a la secuenciación directa de las muestras dudosas mediante un secuenciador automático ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencing Reaction Kit (Perkin-Elmer, PE Applied Biosystems, Foster City CA, EE.UU.). Por otra parte, el control de calidad de la genotipificación se mantuvo en cada momento, incluyendo también un control positivo y otro negativo en cada subconjunto de muestras analizadas. Datos antropométricos, clínicos y de variables del estilo de vida Mediante una balanza se determinó el peso, sin zapatos y en ropa ligera, de cada participante. La talla

se midió con un tallímetro. Posteriormente, se calculó el índice de masa corporal (IMC), expresado como peso (kg)/talla2 (m). Se diseñó y validó un cuestionario que recogía información sobre sexo, edad, lugar de nacimiento, lugar de residencia, estudios, estado civil, consumo de fármacos, antecedentes familiares y personales de enfermedad cardiovascular y alteraciones lipídicas, consumo de tabaco, consumo de alcohol y ejercicio físico35. El cuestionario fue autocumplimentado durante el mismo día en que se llevó a cabo el reconocimiento médico. A partir de la información obtenida sobre el hábito tabáquico, el tiempo y la cantidad consumida, se clasificó a los participantes en fumadores actuales (los que fuman al menos un cigarrillo al día en el momento actual), ex fumadores (aquellos que fumaron al menos un cigarrillo al día pero que ya no fumaban desde hacía un mes), y no fumadores. El consumo de alcohol se evaluó a través de 22 preguntas (referidas al fin de semana y entre semana) acerca de la frecuencia y cantidad de las bebidas alcohólicas más consumidas en España. Los resultados se expresaron en gramos de alcohol/día, y posteriormente, también se creó una variable dicotómica que indicaba el consumo de alcohol: no bebedor (0 g alcohol/día) y bebedor (> 0 g alcohol/día). El ejercicio físico se estimó a través de varias preguntas acerca del tipo de deporte (natación, fútbol, ciclismo, baloncesto, gimnasia, footing, baile, tenis, etc.), días a la semana de su práctica, y tiempo dedicado cada día. En función de las respuestas, los individuos fueron clasificados como sedentarios (aquellos que no practicaban ningún deporte), actividad moderada (aquellos que dedicaban a un deporte menos de 3 h/semanales) y muy activos (los que practicaban un deporte más de 3 h/semanales, o más de 2 deportes de forma regular durante la semana). Análisis estadístico Los datos genéticos, bioquímicos, antropométricos, clínicos y de variables del estilo de vida se procesaron de manera cuidadosa para evitar errores de transcripción e interpretación. Se comprobó la normalidad de las variables continuas mediante métodos gráficos y a través de tests de contraste de hipótesis. Las concentraciones de triglicéridos y de alcohol no seguían una distribución normal, y se aplicó una transformación logarítmica y una raíz cuadrada, respectivamente. Se determinaron las frecuencias alélicas y se calcularon los intervalos de confianza del 95%. El test de la χ2 se utilizó para comparar las diferencias entre las frecuencias observadas y las esperadas, asumiendo el equilibrio de Hardy-Weinberg. Este test también se utilizó para las comparaciones de porcentajes. La significación estadística de la diferencia de medias se estimó mediante el test de la t de Student. La asociación entre variantes genéticas y el riesgo de hipercolesterolemia asociado a la presencia de los distintos alelos del polimorfismo en el gen APOE se estimó mediante regresión logística simple y múltiple, utilizando como categoría de referencia los homocigotos ε3/ε3. Los análisis estadísticos se llevaron a cabo mediante el programa SPSS, versión 9.0 para Windows, empleando el LINKAGE para el cálculo del equilibrio Hardy Weinberg.

TABLA 1 Características demográficas, antropométricas y bioquímicas en los casos de hipercolesterolemia y en los controles Casos (n = 330) Media (DE)

Sexo (varón/mujer) Edad (años) Peso (kg) Talla (m) IMC (kg/m2) Colesterol total (mg/dl) cLDL (mg/dl)* cHDL (mg/dl) Triglicéridos (mg/dl)

148/182 38,8 (9,1) 69,4 (15,1) 1,6 (0,9) 25,2 (4,3) 228,0 (27,7) 150,9 (24,1) 51,0 (12,7) 126,3 (97,3)

Controles (n = 330) Límites

21-60 44-146 1,4-1,9 1,6-46,7 167-472 79-232 23-81 39-816

Media (DE)

Límites

148/182 37,6 (8,4) 69,3 (14,7) 1,7 (0,9) 24,8 (4,1) 173,8 (18,2) 109,0 (18,3) 48,4 (11,5) 88,6 (65,5)

21-60 45-130 1,5-2,0 17,2-39,7 104-199 43-171 17-85 30-796

p**

0,128 0,990 0,087 0,242 < 0,001 < 0,001 0,007 < 0,001

*Debido a que 8 casos y 2 controles presentaron concentraciones de triglicéridos superiores a 400 mg/dl, el tamaño de muestra para esta variable fue de 322 casos y de 328 controles. **Valor de p en la comparación entre casos y controles. Test de la t de Student para la comparación de medias de grupos independientes. DE: desviación estándar. IMC: índice de masa corporal; cLDL: colesterol ligado a lipoproteínas de baja densidad; cHDL: colesterol ligado a lipoproteínas de alta densidad.

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MEDICINA CLÍNICA. VOL. 115. NÚM. 5. 2000

Resultados En total se han estudiado 660 individuos (330 casos y 330 controles) apareados por edad y sexo. En la tabla 1 se exponen las características demográficas, antropométricas y bioquímicas de los casos y de los controles. La media (desviación estándar) de edad de los casos fue de 38,8 (9,1) años, sin diferencias estadísticamente significativas con el grupo de controles. Tampoco se observaron diferencias entre la media de IMC en los casos y en los controles. Sin embargo, las medias de colesterol total, cLDL, cHDL y triglicéridos fueron significativamente más altas (p < 0,01) en los casos que en los con-

troles. En el grupo de casos, la media de colesterol total no fue muy elevada, situándose en 228,0 (27,7) mg/dl, presentando el 75,2% de los casos colesterolemias inferiores a los 240 mg/dl. Aunque se detectó un valor máximo de 472 mg/dl de colesterol total, sólo 6 individuos superaron los 300 mg/dl. En cuanto al tratamiento farmacológico, el 7% de los casos (23 individuos) y el 0% de los controles seguían tratamiento con fármacos hipocolesterolemiantes. De los 23 casos tratados con dichos fármacos, sólo tres presentaron concentraciones de colesterol total inferiores a 200 mg/dl, situándose el resto entre los 204 y los 318 mg/dl. Por otra parte, un 12,8% de los casos, y un 0,6%

TABLA 2 Distribución de las variables del estilo de vida en los casos de hipercolesterolemia y en los controles Casos (n = 330)

Controles (n = 330)

n (%)

n (%)

148/182 140 (44) 56 (17) 232 (74)

148/182 129 (39) 73 (22) 218 (70)

198 (60) 89 (27) 43 (13)

184 (56) 92 (28) 54 (26)

99 (30) 172 (52) 59 (18)

105 (32) 163 (49) 62 (19)

Sexo (varón/mujer) Fumadores actuales, n (%) Ex fumadores, n (%) Consumidores de alcohol, n (%) Ejercicio físico Sedentarios, n (%) Moderado, n (%) Alto, n (%) Nivel de estudios: Estudios primarios Bachiller o diplomatura Licenciados

p*

1,000 0,265 0,271 0,137 0,258

0,842

*Valor de p en la comparación entre casos y controles: test de la χ2.

TABLA 3 Genotipos y frecuencias alélicas para el polimorfismo APOE en los casos y en los controles

Genotipos ε2/ε2 ε2/ε3 ε3/ε3 ε3/ε4 ε4/ε4 ε2/ε4 Frecuencias alélicas Alelo ε2 (IC del 95%) Alelo ε3 (IC del 95%) Alelo ε4 (IC del 95%)

Casos (n = 330)

Controles (n = 330)

n (%)

n (%)

0 (0,0) 17 (5,2) 237 (71,8) 69 (20,9) 2 (0,6) 5 (1,5)

3 (0,9) 50 (15,2) 252 (76,4) 23 (7,0) 1 (0,3) 1 (0,3)

0,033 (0,019-0,047) 0,848 (0,821-0,875) 0,115 (0,091-0,139)

0,086 (0,065-0,107) 0,874 (0,847-0,899) 0,039 (0,024-0,054)

La diferencia en la distribución de porcentajes entre casos y controles es estadísticamente significativa: p < 0,001; IC: intervalo de confianza.

de los controles (p < 0,001) refirieron antecedentes personales de hipercolesterolemia, mientras que no hubo diferencias cuando se les preguntó acerca de sus antecedentes familiares de hipercolesterolemia en sus progenitores (un 10,6% de los casos y un 10,2% de los controles). En la tabla 2 se presenta la distribución de las variables de estilo de vida (consumo de tabaco, consumo de alcohol, ejercicio físico y nivel de estudios) entre los casos y los controles. Aunque la prevalencia de fumadores es superior en el grupo de casos (44%) que en el de controles (39%), esta diferencia no alcanza la significación estadística (p = 0,265). Algo similar ocurre con el ejercicio físico, y aunque la prevalencia de individuos sedentarios es superior en los casos (60%) que en los controles (56%), la diferencia no alcanza la significación estadística. Tampoco se observaron diferencias en la distribución del nivel de estudios entre los casos y los controles. En la tabla 3 se exponen las frecuencias absolutas y relativas para cada uno de los genotipos en el gen de la apoE en los casos y en los controles. La distribución de genotipos no se apartó del equilibrio de Hardy-Weinberg en ninguno de los grupos (χ2 = 4,33 con 3 grados de libertad; p = 0,228 para los casos, y χ2 = 1,28, con 3 grados de libertad; p = 0,734 para los controles). Aunque en ambos grupos los individuos ε3/ε3 fueron los mayoritarios, se observaron importantes diferencias en la distribución de porcentajes, que alcanzaron significación estadística (p < 0,001). La frecuencia alélica estimada para el alelo ε2 fue estadísticamente inferior en el grupo de los casos (0,033; IC del 95%: 0,019-0,047) que en el de los controles (0,086; IC del 95%: 0,0650,107), mientras que el alelo ε4 fue más frecuente en los casos (0,115; IC del 95%: 0,091-0,139) que en los controles (0,039; IC del 95%: 0,024-0,054). En los análisis posteriores, debido al bajo número de individuos homocigotos para los alelos ε2 y ε4, se consideraron sólo tres grupos: E2 (ε2/ε2 + ε2/ε3), E3 (ε3/ε3) y E4 (ε3/ε4 + ε4/ε4), excluyendo los 6 individuos heterocigotos ε2/ε4. Antes de estimar la asociación entre los genotipos de la apoE y el riesgo de hipercolesterole-

TABLA 4 Asociación entre el polimorfismo en el gen APOE y riesgo de hipercolesterolemia (> 200 mg/dl). Análisis de regresión logística, simple y múltiple Regresión logística simple

Variable

Polimorfismo APOE Alelo ε2 (ε2/ε2 + ε2/ε3) Alelo ε4 (ε3/ε4 + ε4/ε4) Alelo ε3 (ε3/ε3)

Bcrudo

p

–1,080 1,142 Referencia

< 0,001 < 0,001 < 0,001 –

Regresión logística múltiple* OR (IC del 95%)

0,34 (0,19-0,60) 3,13 (1,91-5,14) –

Bajustado*

–1,033 1,112 Referencia

p

< 0,001 0,006 0,001 –

OR* (IC del 95%)

0,36 (0,20-0,64) 3,04 (1,82-5,06) –

*Coeficientes ajustados por el efecto de la edad, sexo, índice de masa corporal, consumo de tabaco, consumo de alcohol, ejercicio físico y nivel de estudios. B: coeficiente de regresión; OR: odds ratio; IC: intervalo de confianza.

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D. CORELLA ET AL.– POLIMORFISMOS EN EL GEN DE LA APOLIPOPROTEÍNA E Y RIESGO DE HIPERCOLESTEROLEMIA: UN ESTUDIO DE CASOS Y CONTROLES EN UNA POBLACIÓN LABORAL DE VALENCIA

mia, de manera descriptiva se estudió el efecto de cada uno de los tres alelos sobre las variables lipídicas. Así, al considerar conjuntamente el grupo de casos y de controles se observaron diferencias de medias (p < 0,001) de colesterol total entre los individuos E2 (179,0 [31,5] mg/dl), E3 (200,3 [33,3] mg/dl) y E4 (216,6 [32,6] mg/dl). Al considerar las concentraciones de cLDL se observaron también diferencias de medias estadísticamente significativas (p < 0,001) entre los tres grupos: E2 (110,7 [28,6] mg/dl, E3 (130,7 [29,0] mg/dl) y E4 (140,6 [30,6] mg/dl). No se encontraron diferencias en las concentraciones de cHDL, mientras que los valores de triglicéridos sólo fueron más elevados en el grupo E4, en comparación con los grupos E2 y E3, que no difirieron entre sí. Para estimar la asociación entre los genotipos de la apoE y el riesgo de hipercolesterolemia moderada se aplicó un análisis de regresión logística simple, calculando la odds ratio (OR) de exposición de los casos en comparación con la de exposición de los controles para cada alelo, tomando como referencia los homocigotos ε3/ε3. En la tabla 4 se observa que los portadores del alelo ε2 presentan un menor riesgo de hipercolesterolemia estadísticamente significativo (ORcruda = 0,34; IC del 95%: 0,19-0,60), mientras que los portadores del alelo ε4 presentan un mayor riesgo (ORcruda = 3,13; IC del 95%: 1,91-5,14). Cuando estos valores se ajustaron considerando la edad, el sexo, el IMC y las variables del estilo de vida (consumo de tabaco, consumo de alcohol, ejercicio físico y nivel de estudios), el genotipo APOE se mantuvo estadísticamente significativo, demostrando así que su asociación con la hipercolesterolemia es independiente de las anteriores variables. Además, la magnitud de los coeficientes crudos sólo se modificó ligeramente, manteniendo el alelo ε4 un importante efecto como factor de riesgo (ORajustada = 3,04; IC del 95%: 1,82-5,06), y el alelo ε2, como factor protector (ORajustada = 0,36; IC del 95%: 0,20-0,64). Por último, para conocer la magnitud de dicha asociación en cada uno de los géneros se replicó el procedimiento anterior estratificando para varones y mujeres. En los varones, el análisis de regresión logística simple proporcionó las siguientes estimaciones del riesgo: ORcruda = 0,24; IC del 95%: 0,09-0,59, para el alelo ε2, y ORcruda = 2,78; IC del 95%: 1,32-5,82, para el alelo ε4. Al ajustar por la edad, IMC, tabaco, alcohol, ejercicio y nivel de estudios, los resultados obtenidos fueron: ORajustada = 0,25; IC del 95%: 0,10-0,63 y ORajustada = 2,55; IC del 95%: 1,19-5,47, para los alelos ε2 y ε4, respectivamente. En las mujeres se observó un menor efecto del alelo ε2 y un efecto mayor para

el alelo ε4 en comparación con los varones. Dichas estimaciones fueron: ORcruda = 0,44; IC del 95%: 0,21-0,93, para el alelo ε2, y ORcruda = 3,45; IC del 95%: 1,77-6,72, para el alelo ε4. Tras ajustar por la edad, IMC, tabaco, alcohol, ejercicio y nivel de estudios, los resultados fueron: ORajustada = 0,49; IC del 95%: 0,221,03 y ORajustada = 3,40; IC del 95%: 1,69-6,83, para los alelos ε2 y ε4, respectivamente. Discusión En este estudio se ha estimado la asociación entre los alelos comunes en el gen de la apoE y el riesgo de hipercolesterolemia moderada en una muestra aleatoria de población laboral de Valencia a través de un diseño de casos y controles. El tamaño de muestra ha sido elevado teniendo e cuenta la baja prevalencia para el alelo ε4 encontrada en otros estudios realizados en población laboral española31,32. Esta baja prevalencia responde al gradiente norte-sur previamente descrito en Europa para la prevalencia de dicho alelo30, según el cual la frecuencia alélica para el alelo ε4 en los países del norte estaría en torno al 20%, mientras que en los países mediterráneos se situaría por debajo del 10%24,29,30,36-38. Aunque el estudio EARS (European Atherosclerosis Research Study)24 ha confirmado este gradiente, en otras estimaciones procedentes de estudios aislados la selección de la muestra hubiera podido influir en la prevalencia final estimada, ya que según los resultados obtenidos en el presente estudio, la prevalencia del alelo ε4 sería mucho mayor entre los individuos con colesterolemia superior a 200 mg/dl. Por otra parte, aunque la prevalencia del alelo ε2 tampoco ha sido uniforme en las distintas poblaciones, no se ha descrito ningún gradiente claro para este alelo. En nuestro estudio, su frecuencia alélica ha sido claramente superior en el grupo de controles (0,086) que en el grupo de los casos (0,033). De esta forma, el alelo ε2 se ha asociado de manera estadísticamente significativa a una reducción de 3 veces en el riesgo de hipercolesterolemia moderada en esta población mediterránea, mientras que el alelo ε4 se ha asociado a un aumento del riesgo de 3 veces. Aunque podría existir un sesgo de clasificación errónea no diferencial, éste sería de pequeña magnitud y actuaría infraestimando el riesgo. Por otra parte, la magnitud del efecto del polimorfismo puede ser también función del criterio de clasificación de los individuos y variar, por tanto, al elegir un punto de corte distinto para clasificar los casos de hipercolesterolemia. En nuestro estudio hemos optado por elegir un criterio laxo, basado en valores deseables, y de esta forma he-

mos clasificado como hipercolesterolémicos (casos) a todos aquellos individuos con colesterol plasmático total superior a 200 mg/dl o que recibían tratamiento con fármacos hipocolesterolemiantes, teniendo en cuenta que se trata de una población laboral joven y sana, y siguiendo las recomendaciones del National Cholesterol Education Program39 y de la Sociedad Española de Arteriosclerosis40. Aunque la elección del punto de corte en 240 mg/dl clasificaría de una manera más rigurosa a los individuos con hipercolesterolemia, en la actualidad está ampliamente aceptado que a partir de 200 mg/dl, comienza a elevarse de forma exponencial el riesgo coronario, como se describió en el MRFIT (Multiple Risk Factors Intervention Trial)41; por ello, resulta de mayor interés en salud pública conocer qué factores actúan como determinantes de estas concentraciones plasmáticas, con el objeto de poder actuar de manera temprana sobre ellos y garantizar una reducción efectiva del riesgo. En este sentido, sería importante tener en cuenta los resultados del estudio DRECE42, según los cuales en la población española entre 5-60 años, los valores medios y la desviación estándar de colesterol total son de 190,1 (42,4) y 192,8 (44,8) mg/dl, para mujeres y varones, respectivamente. Por otra parte, considerando el origen de nuestra muestra y el tipo de muestreo realizado, el número de sujetos con hiperlipemia familiar combinada, o con hipercolesterolemia familiar, clasificados como casos en el presente estudio, será muy bajo dada la prevalencia estimada de estas alteraciones en la población general. Así, la prevalencia de la forma heterocigota para la hipercolesterolemia familiar se estima en un caso por cada 500 individuos9,43, mientras que la hiperlipemia familiar combinada tiene una prevalencia aproximada de un caso por cada 100 individuos44. Considerando también que los pacientes con hipercolesterolemia familiar suelen presentar unas cifras de colesterol total superiores a 300 mg/dl45, en nuestro estudio, el número de portadores de estas alteraciones genéticas con una clara manifestación fenotípica sería inferior a 10 individuos. Por ello, la mayoría de los sujetos clasificados como casos presentarían hipercolesterolemias moderadas, con contribuciones genéticas y/o ambientales diversas, entre las cuales los polimorfismos comunes en el gen APOE han demostrado una asociación de elevada magnitud y significación estadística. Aunque apenas existen estudios de casos y controles que evalúen el riesgo de hipercolesterolemia asociada a los alelos ε2 y ε4, sí que son numerosos los resultados procedentes de estudios transversales en los que cada uno de estos alelos se ha asociado a unas concentraciones

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medias distintas de colesterol total, cLDL o, incluso, valores de triglicéridos13,17,24,46-48. En la mayoría de estos estudios, el alelo ε4 se ha asociado a concentraciones medias más elevadas de colesterol total y cLDL, mientras que el alelo ε2 lo haría con valores más bajos, en comparación con los homocigotos para el alelo ε3. Respecto a la bioquímica, la influencia del genotipo APOE en las concentraciones plasmáticas del cLDL está mediada por varios mecanismos, y entre ellos, el más aceptado es el que responde a la hipótesis inicial de Brewer23. En conclusión, los resultados del presente estudio, indican que en la población mediterránea española las variantes genéticas comunes en el gen de la apoE se asocian a un mayor (portadores del alelo ε4) o menor riesgo (portadores del alelo ε2) de hipercolesterolemia moderada. Es importante considerar esta contribución genética a la hipercolesterolemia desde la perspectiva de la epidemiología molecular7,49,50. No se trata simplemente de la identificación de un factor de riesgo genético no modificable, sino que cada día es más evidente la interacción entre los factores genéticos y ambientales como determinantes del fenotipo final. En este sentido, aunque los individuos portadores del alelo ε4 poseen un mayor riesgo de hipercolesterolemia, una vez identificados y sometidos a intervención dietética con una dieta baja en grasas parecen ser los más respondedores a dicha intervención51,52. Por otra parte, se han descrito también diferencias en la respuesta a distintos fármacos hipolipemiantes en función del genotipo APOE53,54. Menos caracterizada está la respuesta hipolipemiante al ejercicio físico y a otras variables ambientales55,56, pero sin duda a corto plazo se generará una gran cantidad de información sobre estas interacciones gen-ambiente que supondrá un considerable avance, no sólo para el individuo, sino desde el punto de vista de la salud pública. Agradecimiento Deseamos expresar nuestro agradecimiento a F. Mulet, M.D. Pérez-Merelo, O. Coltell y a F. Giménez-Fernández por su colaboración en este estudio. Marisa Guillén y Silvia Cortina son becarias del Instituto de Salud Carlos III. Este trabajo ha sido financiado por la Consellería de Cultura, Educació i Ciència de la Generalitat Valenciana (GV98-12-123).

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