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Trennung von DNA-Bausteinen auf celluloseschichten
SHORT COMMUNICATIONS
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SC 93012 T r e n n u n g von D N A - B a u s t e i n e n
auf Celluloseschichten
Ffir die Trennung von Nukleotiden, Nukleosiden und Basen hat sich die Dtinnschichtchromatographie auf Celluloseschichten bew~ihrtl, 2. Diese Methode l~il3t sich ftir eine schnelle quantitative Bestimmung der Basenzusammensetzung yon Desoxyribonukleins~iuren verwenden. Bei Kombination der Diinnschichtchromatographie mit einer Dfinnschichtelektrophorese kann man in kurzer Zeit eine zweidimensionale Trennung eines Gemisches yon I)esoxynukleotiden, Desoxynukleosiden und Basen vornehmen. Zweidimensionale Trennung: Glasplatten 2o cm × 2o cm werden rnit Cellulose (MN 3oo*) in einer Dicke von o.3-o.5 m m beschichtet und IO rain bei 8o ° getrocknet. Nach dem Erkalten werden sie mit o.05 M Formiatpuffer (pI-I 3.4) a bespriiht und die fiberstehende L6sung im kalten Luftstrom etwas angetrocknet, bis sich eine gleichmfil3ig feuchte Schicht ergibt. 5/~1 der Probel6sung werden mit einer Kunststoffpipette aufgetragen. Die Elektroden der Elektrophoreseapparatur (in unserem Falle wurde die I-Iochspannungselektrophoreseanlage nach Wieland und Pfleiderer*" benutzt) werden je 1. 5 cm weit auf die Schicht aufgelegt, mit einer Glasplatte derselben Gr613e belegt und mit der fiblichen Deckplatte beschwert. Die Elektrophorese wird bei o °, 15oo V und 25 mA in 3o rain dnrchgeftihrt. Nach dem Trocknen wird in ges~ittigter Ammoniumsulfatl6sung-I ~ Natriumcitrat-Isopropanol (8o:18:2, V/V) ehromatographiert (Laufstrecke IO cm) und die Flecken unter der UltraviolettLampe markiert. Bestimmung der Basenzusammensetzung: I m g DNA wird mit o.5 ml 88 ~oiger Ameisens~iure im Bombenrohr 3o min auf 175 ° erhitzt 4, die L6sung zur Trockene gebracht und in IOO #1 o.I N I-IC1 gel6st. Mit einer Kunststoffpipette mit diinnem Auslauf werden 5o #l in einem 2-3 m m breiten und 6 cm langem Streifen aufgetragen. Es gelingt so eine mehrmalige Auftragung auf die gleiche Stelle ohne Besch/idigung der Schicht. Chromatographiert wird in Methanol-konz. I-ICl-Wasser (65:17 : 18, V/V) fiber eine Laufstrecke yon IO em. Die Bande werden unter der Ultraviolett-Lampe Inarkiert, mit dem Spatel herausgekratzt und IO rain bei IOO° mit o.I N I-IC1 eluiert. Nach Abzentrifugieren der Cellulose wird der l~berstand photometriert. Als Vergleieh dient ein Celluloseeluat mit dem gleichen RF-Wert. Mit dem yon MARKHAM UND SMITH5 angegeben Laufmittel konnte •ANDERATH 6 Ribonukleotide auf Celluloseschichten trennen. Wie Fig. I zeigt ist es auch zur Trennung der Desoxynukleotide geeignet. Mit diesem Laufmittel gelingt auch eine Trennung der vier Desoxynukleoside, w/ihrend die Basen nicht vollst/indig getrennt werden. Mit der Elektrophorese kann bei pI-t 3.4 ebenfalls eine Trennung der Desoxynukleotide erreicht werden. Da in diesem pI-I-Bereich die Nukleotide als Anionen, die Nukleoside und Basen jedoch als Kationen vorliegen, kann man mit der Elektrophorese leicht die Nukleotide yon den * Firma Macherey, Nagel u. Co, DiJren (Germany). ** Firma Hormuth und Vetter, Heidelberg-Wiesloch (Germany). Biochim. Biophys. Acta, 87 (1964) 685-687
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Fig. i. Dtinnschichtchromatographie der DNA-Bausteine auf Cellulose in AmmoniumsulfatNatriumcitrat-Isopropanol. Laufstrecke io cm. I, Cytosindesoxyribosid; 2, Thymindesoxyribosid; 3, Guanindesoxyribosid; 4, Adenindesoxyribosid; 5, Desoxycytidinmonophosphat; 6, Thymidinmonophosphat; 7, Desoxyguanosinmonophosphat; 8, Desoxyadenosinmonophosphat; 9, Cytosin; ~o, Thymin; II, Guanin; 12, Adenin. beiden anderen Gruppen abtrennen. Durch Kombination beider Verfahren l~igt sich eine Mischung aller vier Desoxyribonukleotide, Desoxynukleoside und Basen trennen (Fig. 2). Thymin kann dabei yore Thymindesoxyribosid nicht vollst~indig getrennt werden. Die gesamte Trennung ist in etwa 2 Stunden durchftihrbar. Der Substanzbedarf ist sehr gering, es werden etwa 10.2 #Mole jeder Substanz ben6tigt. Ffir quantitative Untersuchungen kann man die Flecken abkratzen; an der Platte haffende Cellulosekrfimel lassen sich mit einer durch Reibung aufgeladenen Celluloidfolie abheben und mit dem Pinsel in das Extraktionsgef~tfl bringen.
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Fig. 2. Zweidimensionale Trennung der DNA-Bausteine. Horizontal: Elektrophorese, vertikal: Chromatographie in Ammoniumsulfat-Natriumcitrat-Isopropanol. Nummerierung der Substanzen wie bei Fig. i. St, Startpunkt. Eine Bestimmung der Basenzusammensetzung einer DNA kann in etwa 3 Stunden durchgefiihrt werden. Wie Tabelle I zeigt, lassen sich die aufgetragenen Basen nahezu quantitativ aus der Cellulose zuriickgewinnen. Die Einzelabweichungen dtirften dem Pipettenfehler entsprechen. Biochim. Biophys. Acla, 87 (1964) 685-687
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SHORT COMMUNICATIONS TABELLE I R U C K G E W I N N U N G DER IglNZELN A U F G E T R A G E N E N B A S E N NACIt CHROMATOGRAPHIE IN M E T H A N O L - H C I - W A S S E R
Base
#Mole au/getragen
Adenin Guanin Cytosin Thymin Uracil
o.462 o.615 o.465 o.43o o.17o
#Mole wiederge/unden o.462 o.62o o.465 o.415 o.167
o.47° o.619 o.47° o.43o o.167
o.48o o.619 o.48o o.432 o.163
R F -
Wert
o.45 o.35 o,56 o.78 o.73
Die Dtinnschicht-chromatographische B a s e n b e s t i m m u n g ist somit der papierc h r o m a t o g r a p h i s c h e n in q u a n t i t a t i v e r I-Iinsicht ebenbfirtig u n d ihr bezfiglich Zeitu n d M a t e r i a l a u f w a n d tiberlegen. Die zweidimensionale T r e n n u n g der D N A - B a u s t e i n e dtirfte sich besonders bei autoradiographischen U n t e r s u c h u n g e n bewtihren, da die F i l m e n i c h t gr6Ber als 12 cm × 17 cm sein miissen. Die A r b e i t wurde m i t U n t e r s t f i t z u n g der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t durchgeffihrt. Radiologisches I n s t i t u t der Universitiit Freiburg i. Br. (Deutschland)
KLAUS KECK ULRICI~ HAGEN
1 I~. RANDERATH,Angew. Chem., 73 (1961) 436. I~. lC~ANDERATH,Angew. Chem., 73 (1961) 674. It. I~. RALPH, W. J. CONNORS,H. SCHALLERUND H. G. KHORANA,J. Am. Chem. Soc., 85 (1963) 1983. 4 G. IR. WYATTIJND S. S. COI-IEN, Biochem. J., 55 (1953) 774. R. MARKHAMUND J. D, SMITH, Biochem. J., 49 (1951) 4Ol. I~. I~_ANDERATH,Biochem. Biophys. Res. Commun., 6 (I961/62) 452. E i n g e g a n g e n a m 13. Mai 1964 Biochim. Biophys. dcta, 87 (1964) 685-687
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SC 93012 T r e n n u n g von D N A - B a u s t e i n e n
auf Celluloseschichten
Ffir die Trennung von Nukleotiden, Nukleosiden und Basen hat sich die Dtinnschichtchromatographie auf Celluloseschichten bew~ihrtl, 2. Diese Methode l~il3t sich ftir eine schnelle quantitative Bestimmung der Basenzusammensetzung yon Desoxyribonukleins~iuren verwenden. Bei Kombination der Diinnschichtchromatographie mit einer Dfinnschichtelektrophorese kann man in kurzer Zeit eine zweidimensionale Trennung eines Gemisches yon I)esoxynukleotiden, Desoxynukleosiden und Basen vornehmen. Zweidimensionale Trennung: Glasplatten 2o cm × 2o cm werden rnit Cellulose (MN 3oo*) in einer Dicke von o.3-o.5 m m beschichtet und IO rain bei 8o ° getrocknet. Nach dem Erkalten werden sie mit o.05 M Formiatpuffer (pI-I 3.4) a bespriiht und die fiberstehende L6sung im kalten Luftstrom etwas angetrocknet, bis sich eine gleichmfil3ig feuchte Schicht ergibt. 5/~1 der Probel6sung werden mit einer Kunststoffpipette aufgetragen. Die Elektroden der Elektrophoreseapparatur (in unserem Falle wurde die I-Iochspannungselektrophoreseanlage nach Wieland und Pfleiderer*" benutzt) werden je 1. 5 cm weit auf die Schicht aufgelegt, mit einer Glasplatte derselben Gr613e belegt und mit der fiblichen Deckplatte beschwert. Die Elektrophorese wird bei o °, 15oo V und 25 mA in 3o rain dnrchgeftihrt. Nach dem Trocknen wird in ges~ittigter Ammoniumsulfatl6sung-I ~ Natriumcitrat-Isopropanol (8o:18:2, V/V) ehromatographiert (Laufstrecke IO cm) und die Flecken unter der UltraviolettLampe markiert. Bestimmung der Basenzusammensetzung: I m g DNA wird mit o.5 ml 88 ~oiger Ameisens~iure im Bombenrohr 3o min auf 175 ° erhitzt 4, die L6sung zur Trockene gebracht und in IOO #1 o.I N I-IC1 gel6st. Mit einer Kunststoffpipette mit diinnem Auslauf werden 5o #l in einem 2-3 m m breiten und 6 cm langem Streifen aufgetragen. Es gelingt so eine mehrmalige Auftragung auf die gleiche Stelle ohne Besch/idigung der Schicht. Chromatographiert wird in Methanol-konz. I-ICl-Wasser (65:17 : 18, V/V) fiber eine Laufstrecke yon IO em. Die Bande werden unter der Ultraviolett-Lampe Inarkiert, mit dem Spatel herausgekratzt und IO rain bei IOO° mit o.I N I-IC1 eluiert. Nach Abzentrifugieren der Cellulose wird der l~berstand photometriert. Als Vergleieh dient ein Celluloseeluat mit dem gleichen RF-Wert. Mit dem yon MARKHAM UND SMITH5 angegeben Laufmittel konnte •ANDERATH 6 Ribonukleotide auf Celluloseschichten trennen. Wie Fig. I zeigt ist es auch zur Trennung der Desoxynukleotide geeignet. Mit diesem Laufmittel gelingt auch eine Trennung der vier Desoxynukleoside, w/ihrend die Basen nicht vollst/indig getrennt werden. Mit der Elektrophorese kann bei pI-t 3.4 ebenfalls eine Trennung der Desoxynukleotide erreicht werden. Da in diesem pI-I-Bereich die Nukleotide als Anionen, die Nukleoside und Basen jedoch als Kationen vorliegen, kann man mit der Elektrophorese leicht die Nukleotide yon den * Firma Macherey, Nagel u. Co, DiJren (Germany). ** Firma Hormuth und Vetter, Heidelberg-Wiesloch (Germany). Biochim. Biophys. Acta, 87 (1964) 685-687
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Fig. i. Dtinnschichtchromatographie der DNA-Bausteine auf Cellulose in AmmoniumsulfatNatriumcitrat-Isopropanol. Laufstrecke io cm. I, Cytosindesoxyribosid; 2, Thymindesoxyribosid; 3, Guanindesoxyribosid; 4, Adenindesoxyribosid; 5, Desoxycytidinmonophosphat; 6, Thymidinmonophosphat; 7, Desoxyguanosinmonophosphat; 8, Desoxyadenosinmonophosphat; 9, Cytosin; ~o, Thymin; II, Guanin; 12, Adenin. beiden anderen Gruppen abtrennen. Durch Kombination beider Verfahren l~igt sich eine Mischung aller vier Desoxyribonukleotide, Desoxynukleoside und Basen trennen (Fig. 2). Thymin kann dabei yore Thymindesoxyribosid nicht vollst~indig getrennt werden. Die gesamte Trennung ist in etwa 2 Stunden durchftihrbar. Der Substanzbedarf ist sehr gering, es werden etwa 10.2 #Mole jeder Substanz ben6tigt. Ffir quantitative Untersuchungen kann man die Flecken abkratzen; an der Platte haffende Cellulosekrfimel lassen sich mit einer durch Reibung aufgeladenen Celluloidfolie abheben und mit dem Pinsel in das Extraktionsgef~tfl bringen.
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Fig. 2. Zweidimensionale Trennung der DNA-Bausteine. Horizontal: Elektrophorese, vertikal: Chromatographie in Ammoniumsulfat-Natriumcitrat-Isopropanol. Nummerierung der Substanzen wie bei Fig. i. St, Startpunkt. Eine Bestimmung der Basenzusammensetzung einer DNA kann in etwa 3 Stunden durchgefiihrt werden. Wie Tabelle I zeigt, lassen sich die aufgetragenen Basen nahezu quantitativ aus der Cellulose zuriickgewinnen. Die Einzelabweichungen dtirften dem Pipettenfehler entsprechen. Biochim. Biophys. Acla, 87 (1964) 685-687
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SHORT COMMUNICATIONS TABELLE I R U C K G E W I N N U N G DER IglNZELN A U F G E T R A G E N E N B A S E N NACIt CHROMATOGRAPHIE IN M E T H A N O L - H C I - W A S S E R
Base
#Mole au/getragen
Adenin Guanin Cytosin Thymin Uracil
o.462 o.615 o.465 o.43o o.17o
#Mole wiederge/unden o.462 o.62o o.465 o.415 o.167
o.47° o.619 o.47° o.43o o.167
o.48o o.619 o.48o o.432 o.163
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Wert
o.45 o.35 o,56 o.78 o.73
Die Dtinnschicht-chromatographische B a s e n b e s t i m m u n g ist somit der papierc h r o m a t o g r a p h i s c h e n in q u a n t i t a t i v e r I-Iinsicht ebenbfirtig u n d ihr bezfiglich Zeitu n d M a t e r i a l a u f w a n d tiberlegen. Die zweidimensionale T r e n n u n g der D N A - B a u s t e i n e dtirfte sich besonders bei autoradiographischen U n t e r s u c h u n g e n bewtihren, da die F i l m e n i c h t gr6Ber als 12 cm × 17 cm sein miissen. Die A r b e i t wurde m i t U n t e r s t f i t z u n g der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t durchgeffihrt. Radiologisches I n s t i t u t der Universitiit Freiburg i. Br. (Deutschland)
KLAUS KECK ULRICI~ HAGEN
1 I~. RANDERATH,Angew. Chem., 73 (1961) 436. I~. lC~ANDERATH,Angew. Chem., 73 (1961) 674. It. I~. RALPH, W. J. CONNORS,H. SCHALLERUND H. G. KHORANA,J. Am. Chem. Soc., 85 (1963) 1983. 4 G. IR. WYATTIJND S. S. COI-IEN, Biochem. J., 55 (1953) 774. R. MARKHAMUND J. D, SMITH, Biochem. J., 49 (1951) 4Ol. I~. I~_ANDERATH,Biochem. Biophys. Res. Commun., 6 (I961/62) 452. E i n g e g a n g e n a m 13. Mai 1964 Biochim. Biophys. dcta, 87 (1964) 685-687