Variation du taux d'incorporation du phosphore dans des cellules en fonction de leurs concentrations et inhibition de contact

Experimental Cell Research 41, 473-482 (1966)

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VARIATION DU TAUX D'INCORPORATION DU PHOSPHORE DANS DES CELLULES EN FONCTION DE L E U R S CONCENTRATIONS ET I N H I B I T I O N DE CONTACT E. BLADE, L. H A R E L et N. H A N A N I A Centre de Recherches sur la Cellule Normale et Canc~reuse du C. N. R. S., ViUejuif, Seine, France

Requ le 14 juillet 1965

LE

p h d n o m ~ n e d ' i n h i b i t i o n de c o n t a c t a ~t~ ddcrit p a r A b e r c r o m b i e et coll. [1]. L o r s q u e des fibroblastes en culture de tissu, entrent en contact, le m o u v e m e n t de la cellule d a n s la direction d u contact est stopp6. Les cellules en c u l t u r e ne p e u v e n t se c h e v a u c h e r et f o r m e n t des c o u c h e s m o n o c e l l u l a i r e s . L o r s q u e les cultures d e v i e n n e n t confluentes, leur m u l t i p l i c a t i o n s'arr~te et il a 6t6 observ6 d e p u i s l o n g t e m p s q u ' i l est difficile de d 6 p a s s e r u n e certaine densit~ de cellules. Mais il n ' e s t p a s a c t u e l l e m e n t d d m o n t r 6 q u e l ' a r r ~ t de la m u l t i p l i c a t i o n cellulaire est u n e c o n s d q u e n c e d u p h 6 n o m ~ n e d ' i n h i b i t i o n d u m o u v e m e n t des cellules p a r contact, d6crit p a r A b e r c r o m b i e et coll. Au c o n t r a i r e , les e x p 6 r i e n c e s de S t o k e r [2] m o n t r e n t q u ' i l est n6cessaire de diff6rencier d e u x sortes d ' i n h i b i t i o n dries au c o n t a c t : l ' i n h i b i t i o n de la multip l i c a t i o n cellulaire et l ' i n h i b i t i o n d u m o u v e m e n t des cellules. P o u r n o u s l ' i n h i b i t i o n de la m u l t i p l i c a t i o n cellulaire serait li6e p r i n c i p a l e m e n t '~ la d i m i n u t i o n d u m 6 t a b o l i s m e des cellules. E n effet B h a r g a v a et coll. [3] d~s 1959 a v a i e n t o b s e r v 6 u n e v a r i a t i o n de l ' i n c o r p o r a t i o n d ' a c i d e s a m i n d s d a n s les r6ticulocytes en f o n c t i o n de la c o n c e n t r a t i o n en cellules. L e v i n e et coll. [4] m o n t r e n t q u e les vitesses des syntheses d u DNA, RNA et prot6ines sont p r o g r e s s i v e m e n t r6duites au c o u r s de la c r o i s s a n c e de la culture. Nous m ~ m e s a v o n s r @ e m m e n t publi6 des r6sultats c o n c e r n a n t la d i m i n u t i o n du t a u x d ' i n c o r p o r a t i o n d u 32p d a n s les cellules d ' a s c i t e l o r s q u e celles-ci sont i n c u b 6 e s en c o n c e n t r a t i o n s croissantes [5]. E n f i n E. C h a n y et C. A u j a r d I6] m e t t e n t en 6vidence en culture de cellules u n e d i m i n u t i o n de la t e n e u r en azote p a r cellule n o n s e u l e m e n t en fonction d e l"~ge de la culture m a i s 6 g a l e m e n t en fonction d u t a u x d ' e n s e m e n c e m e n t des cellules. Ces a u t e u r s ont aussi i n v o q u 6 le p h d n o m ~ n e d ' i n h i b i t i o n de c o n t a c t p o u r e x p l i q u e r leurs rdsultats. D a n s le prdsent article n o u s e x p o s e r o n s nos r e c h e r c h e s c o n c e r n a n t les v a r i a t i o n s du t a u x d ' i n c o r p o r a t i o n du p h o s p h o r e d a n s des cellules en culture Experimental Cell Research 41

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E. Blade, L. Harel et N. H a n a n i a

o u d a n s des c e l l u t e s d ' a s c i t e e n f o n c t i o n de la c o n c e n t r a t i o n e n c e l l u l e s . U n e p a r t i e d e ces r 6 s u l t a t s a fait l ' o b j e t d ' u n e n o t e p r 6 1 i m i n a i r e [5]. Nos e x p 6 r i e n c e s i n d i q u e n t q u e les d i m i n u t i o n s c o n s t a t 6 e s d u t a u x d ' i n c o r p o r a t i o n d u P h o s p h o r e d a n s des c e l l u l e s i n c u b 6 e s e n c o n c e n t r a t i o n s c r o i s s a n t e s , p o u r r a i e n t ~tre a t t r i b u 6 e s h l ' a u g m e n t a t i o n de la f r 6 q u e n c e d e s c o n t a c t s e n t r e c e l l u l e s o u h des <~f a c t e u r s a g i s s a n t h c o u r t e d i s t a n c e >>i n v o q u 6 s p a r S t o k e r [2].

MAT]~RIEL ET M]~THODES La p l u p a r t des experiences ont ~t~ r~alis~es avec des cellules d'ascite tumorale de la souris (F. L. S.). Mais nous avons aussi utilis6 d'autres souches de cellules. Des cellules de rein e m b r y o n n a i r e s de H a m s t e r , cellules B H K (C13) de Stoker [7l et des cellules d6riv~es de cette souche, transform6es par le virus du polyome et cultiv~es en suspension ou en couches monocellulaires. Le milieu de culture 6tait celui de Eagle c o n t e n a n t 10 To de tryptose phosphate b r o t h et 10 To de s6rum de veau. Pour les cellules cultiv~es en suspension le milieu de Eagle dtait enrichi en Phosphate (concentration finale 0.03 M). Les cellules d'ascite ont ~t~ prdlev6es entre le 6~me et 9~me jour apr~s l'inoculation. Elles 6taient lavdes en pr6sence de NaC1 0.14 M par centrifugation ~ basse vitesse. Les techniques d ' d v a l u a t i o n du t a u x d ' i n c o r p o r a t i o n du phosphore dans les cellules; fractions acido soluble et acido insoluble o n t 6t6 d~crites dans une prdc6dente p u b l i c a t i o n [5]. Les cellules d'ascites tumorales et les cellules cultiv6es en suspension ont dt~ incubdes ~ 37 ~ avec faible agitation. Elles ont ~t~ lav~es dans du C1Na 0.14 M comme il a ~t~ d~crit pr~c~demment [5]. Les eellules en couches monocellulaires dtaient ineub~es ~ 37 ~ sans agitation. Elles ont ~t~ lav4es avec precautions par C1Na 0.14 M par simple remplissage et ddcantation des flacons. Nous avons vdrifid que clans ces conditions la c o n t a m i n a t i o n par le a2p est tr~s faible; en effet lorsque les cellules sont eentrifug~es i m m ~ d i a t e m e n t apr~s l ' a d d i t i o n du milieu radioaetif (temps O) l'ineorporation est r~duite ~ 10 % de sa valeur. Le t a u x d ' i n e o r p o r a t i o n du Phosphore est exprim~ soit par la radioaetivitd incorporde dans l'aeido soluble et l'acido insoluble et rapport~e au mg de prot~ine ou d'azote, soit par la q u a n t i t ~ en ~g de Phosphore incorpord. Cette valeur est o b t e n u e en divisant la Radioaetivit~ des cellules par la radioactivit~ sp~eifique du phosphore du milieu d ' i n e u b a t i o n . Dans ees experiences, la radioactivit~ incorpor~e dans les eellules se retrouve p o u r 90 % e n v i r o n dans l'aeido soluble. La radioactivit~ de l'acido insoluble est proportionnelle ~ celle retrouvde dans l'aeido soluble et correspond s u i v a n t l'exp~rience 5-12 % de celle de la fraction acido soluble.

Experimental Cell Research 41

Inhibition du mdtabolisme du Phosphore

475

RI~SULTATS

Incorporation du phosphore dans les ceUules en couche monocellulaire en fonction de l'@e de la culture Ces exp6riences ont 6t6 r6alis6es a v e c des cellules B H K (Cla) cultiv6es d a n s des flacons de p h a r m a c i e d o n t la s u r f a c e est 84 a m 2. A des t e m p s v a r i a b l e s apr~,s l ' e n s e m e n c e m e n t le milieu nutritif 6tait 6cart6 et r e m p l a c 6 p a r le milieu r a d i o a e t i f s u i v a n t : T a m p o n tris 0.02 M p H 7,4, t a m p o n p h o s p h a t e 0.01 M p H 7,4 +a~p (2 h 5 # c / m l ) C12Mg 0.015 M e t K C 1 0 . 1 4 M. Apr~s 15 m i n h 37 ~ les cellules 6talent refroidies h 0~ et le p h o s p h o r e i n c o r p o r 6 dos6 apr~s l a v a g e des eellules c o m m e il a 6t6 i n d i q u 6 ei-dessus. L a e o u r b e en traits pleins de la fig. 1 d o n n e , en fonction d u n o m b r e de j o u r s apr~s le r e p i q u a g e , les quantit6s en /~g de p h o s p h o r e i n c o r p o r 6 s d a n s la f r a c t i o n acido soluble des cellules, r a p p o r t 6 e s a u m g d ' a z o t e (7.7 106 cellules B H K c o n t i e n n e n t e n v i r o n 1 m g N). On constate q u e l ' i n c o r p o r a t i o n d u p h o s p h o r e d a n s les cellules d i m i n u e au fur et ~t m e s u r e de la e r o i s s a n c e de la culture. Nous a v o n s trouv6 des rdsultats similaires d a n s des cellules de m 6 m e origine t r a n s f o r m 6 e s p a r le v i r u s d u P o l y o m e et cultivfies en t o u c h e m o n o eellulaire. Notons toutefois u n e diff6renee entre les d e u x souehes; h conc e n t r a t i o n s 6gales en cellules, les cellules t r a n s f o r m 6 e s i n c o r p o r e n t plus de p h o s p h o r e p a r m g N q u e les B H K . L o r s q u e les eellules sont confluentes les cellules t r a n s f o r m 6 e s i n c o r p o r e n t 2 fois plus de a2p que des cellules B H K d a n s les mfimes conditions.

Influence de la concentration en cellules N o u s n o u s s o m m e s d e m a n d 6 s si l ' i n h i b i t i o n de l ' i n c o r p o r a t i o n d u Phosp h o r e constat6e au fur et h m e s u r e de la c r o i s s a n c e de la culture d 6 p e n d a i t de l'Sge de la culture ou de la c o n c e n t r a t i o n cellulaire et f i n a l e m e n t des contacts entre cellules. C'est p o u r q u o i n o u s a v o n s 6tudi6 les v a r i a t i o n s de l ' i n c o r p o r a tion d u P h o s p h o r e en fonction de la c o n c e n t r a t i o n en cellules. Ces exp6riences ont 6t6 r6alis6es d ' u n e p a r t a v e c des cellules d6riv6es de la s o u c h e B H K t r a n s f o r m 6 e s p a r le virus d u P o l y o m e et cultiv6es en susp e n s i o n et d ' a u t r e p a r t a v e e des cellules d ' a s e i t e s t u m o r a l e s de la souris. Les cellules cultiv6es en s u s p e n s i o n 6talent collect6es p a r centrifugation ~t b a s s e vitesse l o r s q u e elles a v a i e n t atteint la c o n c e n t r a t i o n m a x i m u m de 107/ Experimental Cell Research

41

E. Blad~, L. Harel el N. Hanania

476

ml. Elles 6taient remises en s u s p e n s i o n dans le milieu de culture (EagleP h o s p h a t e ) additionn6 de 32p et incub6es 15 minutes 'h 37~ en concentrations d6croissantes de 1 x 107 ~ 2 x 105 cellules/ml. Elles 6talent ensuite refroidies h 0 ~ et la quantit6 de 3~p incorpor6e 6tait dos6e. Sur la fig. 2 on a port6 la radioactivit6 incorpor6e dans la fraction acido Z

Y

e

)

15.

/K\

/

/

z

\

//

10.

/

\

x\\ \~r

/

I000

/

2 / 1

2

500

//

2

3

4

Fig. 1.

5

douvs

10

'160 - Nbrede cellules/mix 105

Fig. 2.

Fig. 1 . - - I n c o r p o r a t i o n de P h o s p h o r e darts les B H K ( C 1 3 ) e n f o n c t i o n de l'~tge de la culture. ( F r a c t i o n acido soluble.) x - - x , fig. Pi i n c o r p o r 6 / m g N ; x - - • n o m b r e de cellules. Fig. 2 . - - I n f l u e n c e de la c o n c e n t r a t i o n en cellnles sur le t a u x d'incorporation du P h o s p h o r e dans les cellules transform6es par le p o l y o m e et cultiv6es en suspension. (Fraction acido insoluble.)

i n s o l u b l e et rapport6e au mg de prot6ines (soit environ 3 x l0 s cellules), en fonction de la concentration en cellules. I1 est clair que l'incorporation du p h o s p h o r e d 6 p e n d essdntiellement de la concentration en cellules la courbe tend vers une asymptote pour des concentrations en cellules > 10 7 cellules/ml. N o u s a v o n s trouv6 des r6sultats similaires a v e c les cellules d'ascite tumorales de souris, ils sont consign6s dans le tableau I. L'incorporation du P h o s p h o r e dans l'acido soluble c o m m e dans l'acido insoluble varie avec la concentration en eellules p o u r des concentrations inf6rieures h 3 x l 0 6 cell/ml. Elle devient constante p o u r des concentrations sup6rieures h 3 x 10 8 ml. Experimental Cell Research 41

Inhibition du m~tabolisme du Phosphors

477

P o u r expliquer l'influence de la concentration en cellules sur le taux d'inc o r p o r a t i o n du p h o s p h o r e trois hypotheses peuvent 6tre faites : (1) Les cellules en concentrations ~lev6es lib~rent dans le milieu d'incubalion des substances (des produits de d~gradation par exemple) qui seraient responsables de l'inhibition de l'incorporation du phosphore. TABLEAU I. Incorporation du phosphore dans les cellules d'ascites en fonction de la concentration en cellules.

Exp.

C o n c e n t r a t i o n en cellules dans le milieu d ' i n c u b a tion (nbrelml)

E x p . I: cellules de 9 j o u r s

5 5 2

E x p . II: cellules de 7 jours

E x p . I I I : cellules de 7 jours

x 106 x 105 x 105

Pi incorpor~ dans les cellules ~--. ~A c i d o soluble Acido insoluble /~g de P i / m g de /zg de P i / m g de protdine protdine 0,8 3,5 42

0,05 0,120 0,250

2,5 • 107 1 • 106 5 x 105

0,46 2,7

4,4

0,058 0,57 1,9

3 1,5 7,5 3

0,27 0,30 0,27 0,26

0,019 0,025 0,020 0,023

x x x x

107 107 106 106

(2) La concentration dans le milieu &incubation en m6tabolites ou en oxyg~ne est un facteur limitant l'incorporation du Phosphore. (3) L'inhibition est due ~ la fr~quenee des contacts entre cellules. L'inhibition est-elle due au passage dans le milieu de substances d'origine cellulaire? Pour tester cette hypoth~se nous avons incub~ des cellules d'ascite en concentration 2 • 107 ml p e n d a n t 15 minutes dans le milieu habituel mais sans ~2p. Apr~s centrifugation des cellules h basse vitesse le surnageant ~tait d~cant~ et gard6. Des cellules d'ascite fraichement pr~lev~es ~taient alors incub~es en concentration faible (2 x 105/ml) en presence du surnageant pr~par5 com m e il est dit ci-dessus et auquel Oait ajout~ le 32p. Des cellules tSmoins Oaient incub~es darts les m~mes conditions mais en presence de milieu neuf radioactif. Experimental Cell Research 41

E. Blade, L. Harel et N. H a n a n i a

478 Les

r~sultats

d e ces e x p e r i e n c e s , d o n n ~ s d a n s le t a b l e a u II m o n t r e n t

c l a i r e m e n t q u e le s u r n a g e a n t n ' a a u c u n effet i n h i b i t e u r s u r l ' i n c o r p o r a t i o n d u P h o s p h o r e . A u c o n t r a i r e , n o u s r e m a r q u o n s u n e a u g m e n t a t i o n de l a r a d i o a c t i v i t ~ i n c o r p o r ~ e l o r s q u e les c e l l u l e s s o n t i n c u b 6 e s e n p r e s e n c e d e s u r n a g e a n t . Cette a u g m e n t a t i o n p o u r r a i t s ' e x p l i q u e r p a r u n e n r i c h i s s e m e n t TABLEAU II. asp incorpor~ dans les cellules (cps/mg prot~ine) - surnageant + surnageant Concentration des cellules d'ascites

^

Fraction acido soluble

Fraction acido insoluble

Fraction acido soluble

Fraction acidr insoluble

Exp. I

3 • 105 2 • l0 s

2100 1250

100 65

2500 --

115 --

Exp. II

2 • 10~ 166

~600 1400

82 60

4150 --

100 --

Exp. III

3•

880

140

1100

150

d u m i l i e u e n m ~ t a b o l i t e s libSr~s h p a r t i r des c e l l u l e s a u c o u r s de l a c e n t r i fugation.

La concentration en m~tabolites ou en oxgg~ne darts le milieu d'incubation peut-elle ~tre un facteur limitant l'incorporation du phosphore? Les c e l l u l e s d ' a s c i t e s o n t i n c u b ~ e s d a n s u n m i l i e u m i n e r a l c o n t e n a n t e s s e n t i e l l e m e n t d u KC1 d u Mg et d u P h o s p h a t e . N o u s a v o n s v6rifi6 q u e l a c o n c e n t r a t i o n e n p h o s p h o r e d a n s le m i l i e u est e n excSs. E n effet n o u s n ' a v o n s p a s t r o u v 6 d ' a u g m e n t a t i o n d u t a u x d ' i n c o r p o r a t i o n d u P h o s p h o r e d a n s les c e l l u l e s p o u r des c o n c e n t r a t i o n s e n P h o s p h o r e d a n s le m i l i e u d ' i n c u b a t i o n s u p 6 r i e u r e s h 300 # g / m l I5]. D ' a u t r e p a r t , les c e l l u l e s s o n t i n c u b 6 e s , a v e c a g i t a t i o n et d a n s des f l a c o n s assez l a r g e s p o u r p e r m e t t r e u n e b o n n e a 6 r a t i o n d u m i l i e u . N o u s a v o n s v6rifi6 q u e le t a u x d ' i n c o r p o r a t i o n d u P h o s p h o r e v a r i e p e u l o r s q u e la m S m e s u s p e n s i o n c e l l u l a i r e est i n c u b 6 e d a n s des f l a c o n s de diff~rentes s u r f a c e d e b a s e (Tableau III). B i e n q u e d a n s ces e x p e r i e n c e s l a c o n c e n t r a t i o n e n o x y g ~ n e n ' a p p a r a i s s e p a s ~tre u n f a c t e u r l i m i t a n t , n o u s a v o n s c o m p a r 6 les t a u x d ' i n c o r p o r a t i o n d u a2p l o r s q u e les c e l l u l e s s o n t i n c u b 6 e s e n p r e s e n c e d ' a i r o u e n p r 6 s e n c e d ' o x y g ~ n e : n o u s n ' a v o n s pas trouv6 de v a r i a t i o n s n o t a b l e s ( t a b l e a u IV.)

Experimental Cell Research 41

Inhibition du mdtabolisme du Phosphor2

479

Influence des contacts entre cellules D a n s le b u t d ' e x a m i n e r

si l ' i n h i b i t i o n d e l ' i n c o r p o r a t i o n

du phosphore

d ~ p e n d d e l a f r ~ q u e n c e d e s c o n t a c t s e n t r e c e l l u l e s il n o u s a p a r u i n t ~ r e s s a n t d ' ~ t u d i e r l ' i n f l u e n c e des contacts avec d ' a u t r e s milieu.

En

particulier

nous

avons

mis

des

c e l l u l e s i n t r o d u i t e s d a n s le

cellules d'ascite

en prSsence

d'~rythrocytes de mouton ou de cellules d'ascite tumorale de mSme origine m a i s t u S es p a r u n b r e f t r a i t e m e n t h l ' a l c o o l . L e s c e l l u l e s d ' a s c i t e e n c o n c e n t r a t i o n 107 m l d a n s NaC1 i s o t o n i q u e O a i e n t trait~es par 2 volumes

d ' a l c o o l h la t e m p e r a t u r e

ambiante,

c e n t r i [ u g ~ e s et

l a v S e s 1 f o i s a v e c C1Na i s o t o n i q u e a v a n t d ' e t r e r e m i s e s e n s u s p e n s i o n concentration taux

10:/ml

d'incorporation

dans du

KC1 i s o t o n i q u e .

Phosphore

dans

en

O n a 6tudi~ s i m u l t a n ~ m e n t le

les c e l l u l e s d ' a s c i t e n o n t r a i t ~ e s

et i n c u b ~ e s h d i f f ~ r e n t e s c o n c e n t r a t i o n s ; d a n s les ~ r y t h r o c y t e s s e u l s i n c u b u s en concentration

10:/ml --

d a n s les c e l l u l e s d ' a s c i t e tu~es h l ' a l c o o l et i n -

c u b ~ e s e n c o n c e n t r a t i o n 10 v m l ; et e n f i n d a n s d e s s y s t ~ m e s o n ces 2 s o r t e s d e cellules

~taient

m~langSes.

Les

cellules

d'ascite

en

concentration

faible

TABLEAU I I I . 32p ineorpord dans les cellules (cps/mg protdine) Concentration des cellules d'ascite

Surface d'a6ration Fraction aeido en em 2 soluble

Fraction acido insoluble

M~me suspension de cellules en conc. 2 • 10v

7 28

1545 1440

193 160

M~me suspension de cellules en conc. 16~

28 50

7000 7750

1775 2000

TABLEAU IV. 32p incorpor~ dans la fraction acido insoluble (coups/rag protdine) Concentration des cellules Exp. I

+ air

+ oxyg~ne

3 • l0 s 1,5 • 105

500 5160

600

107 • 105

201 825

189

Exp. II 5

Experimental Cell Research 41

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E. Bladd, L. Harel et N. H a n a n i a

( 1 0 6 / m l ) 6 t a i e n t r a i s e s e n p r 6 s e n c e soit d ' 6 r y t h r o c y t e s e n c o n c e n t r a t i o n 1 0 7 f ral, soit d e s c e l l u l e s d ' a s c i t e t u 6 e s h l ' a l c o o l et e n c o n c e n t r a t i o n 1 0 7 / m l . L e s r 6 s u l t a t s d e ces e x p 6 r i e n c e s s o n t d o n n 6 s d a n s le t a b l e a u V. N o u s n o t o n s e n c o r e u n e fois n n e a u g m e n t a t i o n d u t a u x d ' i n c o r p o r a t i o n d u p h o s p h o r e clans les c e l l u l e s d ' a s c i t e l o r s q u e c e l l e s - c i s o n t i n c u b 6 e s e n c o n c e n t r a TABLEAU V. Influence des contacts avec d'autres cellules. 3~p ineorpord dans les cellules (coups/mg prot6ine) Concentration des cellules/ml Cellules d'ascite 107 Cellules d'ascite 106 Cellules d'ascite 2 9 105 Erythrocytes 107 Cellules d'ascite en prSsence d'~rythrocytes 107/mi 103 Cellules d'ascite tu~es l'alcool 10~ Cellules d'ascite non trait@s en presence de ce]lules d'ascite tu6es h l'alcool 107/ml 106

Exp. I A. soluble

Exp. I A. insoluble

Exp. II A. insoluble

2100 4000 9000 130

140 230 730 34

284 635 880 30

4200 a

260a

620a

400

40

56

4100 a

---

650 a

a Ces valeurs ont dr6 calcul6es en tenant compte de la radioactivitd incorpor6e par les 6rythrocytes seuls ou les cellules tu6es h l'alcool seules.

t i o n s d e p l u s e n p l u s f a i b l e s . E n p a r t i c u l i e r le t a u x d ' i n c o r p o r a t i o n est m u l t i p l i 6 p a r d e u x l o r s q u e l a c o n c e n t r a t i o n c e l l u l a i r e p a s s e d e 107 h 106/ral. L a p r 6 s e n c e d ' ~ r y t h r o c y t e s ( e n c o n c e n t r a t i o n 107/ral) n e c h a n g e p a s le taux d'incorporation dans les cellules d'ascite incub~es en concentration 106/ral, E n effet l a r a d i o a c t i v i t 6 i n c o r p o r 6 e p a r les c e l l u l e s d ' a s c i t e , c a l c u l 6 e e n t e n a n t c o m p t e d e l a r a d i o a c t i v i t 6 i n c o r p o r ~ e p a r les 6 r y t h r o c y t e s s e u l s ( c e t t e r a d i o a c t i v i t 6 est f a i b l e ce q u i p e r m e t u n e i n t e r p r O a t i o n f a c i l e d e s r 6 s u l t a t s ) est i d e n t i q u e h c e l l e i n c o r p o r 6 e p a r les c e l l u l e s d ' a s c i t e s e u l e s i n c u b 6 e s e n c o n c e n t r a t i o n 106/ml. I1 e n e s t d e r a S r a e l o r s q u e les c e l l u l e s d ' a s c i t e s o n t m i s e s e n p r 6 s e n c e d e cellules tu6es par l'alcool. Les cellules d'ascite non trait6es, incub6es en c o n c e n t r a t i o n 106/ml, e n p r 6 s e n c e d e c e l l u l e s t u 6 e s et e n c o n c e n t r a t i o n 10v/ m l i n c o r p o r e n t l a m S m e q u a n t i t 6 d e P h o s p h o r e q u e les c e l l u l e s d ' a s c i t e s e u l e s , i n c u b 6 e s e n c o n c e n t r a t i o n 106/ral.

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Inhibition du mdtabolisme du Phosphore

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A u t r e m e n t dit, d a n s ces expdriences, seules les cellules d'ascite vivantes exercent u n effet d ' i n h i b i t i o n de l ' i n e o r p o r a t i o n d u P h o s p h o r e . Nous p e n s o n s r @ d t e r ces expdriences avec diffdrentes s o u c h e s de eellules n o r m a l e s et t u m o r a l e s . DISCUSSION

Nous avons mis en 6vidence u n e d i m i n u t i o n d u t a u x d ' i n c o r p o r a t i o n d u p h o s p h o r e d a n s des cellules en cultures de tissus au fur et h m e s u r e de la croissanee de la culture, ee qui rejoint les c o n c l u s i o n s des autres a u t e u r s et n o t a m m e n t de L e v i n e et coll. [4]. Nous a v o n s m o n t r 6 q u e eette d i m i n u t i o n du m 6 t a b o l i s m e d u p h o s p h o r e est a t t r i b u a b l e tout au m o i n s en partie, "5 la c o n c e n t r a t i o n cellulaire. E n effet n o u s a v o n s constat6 q u e des eellules ineub6es p e n d a n t u n t e m p s c o u r t (15 m i n ) d a n s u n milieu ~ p H 7,4 e o n t e n a n t d u P h o s p h a t e 0,01 M, prdsentent u n t a u x d ' i n c o r p o r a t i o n d u P h o s p h o r e qui d @ e n d essentiellement de la conc e n t r a t i o n en eellules. II peut ~tre multipli6 p a r 10 ou m ~ m e p a r 30 l o r s q u e la c o n c e n t r a t i o n en eellules est divisde p a r 50. Nous a v o n s p u voir q u e l ' i n h i b i t i o n de l ' i n e o r p o r a t i o n d u p h o s p h o r e d a n s les eellules ineub6es en c o n c e n t r a t i o n s 61evdes ( > 3. 106/ml) ne p o u v a i t ~tre attribude au passage d a n s le milieu d ' i n e u b a t i o n de s u b s t a n c e s inhibitrices libdr6es p a r les eellules. Cette inhibition ne s a u r a i t ~tre e x p l i q u d e , n o n plus, p a r u n e limitation de la c o n c e n t r a t i o n en oxyg6ne ou en p h o s p h a t e d a n s le milieu d ' i n e u b a t i o n . Elle n o u s p a r a i t plus v r a i s e m b l a b l e m e n t lide ?a la f r d q u e n e e des contacts entre eellules ou ~ des <> [2]. C e p e n d a n t nous a v o n s r e m a r q u 6 q u e les contacts entre eellules d'aseite n o n traitdes et eellules tudes p a r u n bref t r a i t e m e n t h l'aleool ne sont pas inhibiteurs d u m d t a b o l i s m e du p h o s p h o r e . I1 en est de m ~ m e des contacts entre eellules d'aseite et 6rythroeytes. Aussi p e n s o n s - n o u s q u ' i l serait int6ressant d ' d t u d i e r l'influenee des contacts avee d ' a u t r e s eellules n o r m a l e s el eane6reuses a v a n t de conelure. D ' a u t r e p a r t p u i s q u e la dilution des eellules a u n effet i m m d d i a t sur le t a u x d ' i n e o r p o r a t i o n d u p h o s p h o r e , il nous p a r a i t p r o b a b l e q u e ee phdn o m 6 n e est lid au d @ a r t ~ u n e a u g m e n t a t i o n d u t r a n s p o r t aetif d u p h o s p h o r e et d ' a u t r e s substrats ~ travers la m e m b r a n e . L e c o n t a c t entre eellules ar%te c o m m e il a 6t6 dit [l ] les m o u v e m e n t s de la m e m b r a n e ; on peut d o n e s u p p o s e r q u e le t r a n s p o r t aetif, de eertains ions n o t a m m e n t , serait fonetion de ees m o u v e m e n t s - - p o u r u n e m ~ m e s u r f a c e libre. Nous essayons de vdrifier ces hypoth6ses.

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et N . H a n a n i a

R]~S UM]~ L ' i n c o r p o r a t i o n du p h o s p h o r e , d a n s des cellules de H a m s t e r en culture ou d a n s des cellules d'aseite t u m o r a l e , a ~t~ ~tudi6e au eours de l ' i n c u b a t i o n des eellules p e n d a n t 15 minutes en pr6sence de 32p d a n s u n milieu inorganique tamponn~. Le t a u x d ' i n c o r p o r a t i o n d u p h o s p h o r e dans les cellules en culture d i m i n u e au fur et ta m e s u r e de la croissanee de la culture. Cette d i m i n u t i o n p e u t surtout ~tre a t t r i b u t e h l ' a u g m e n t a t i o n de la densit6 cellulaire. E n effet le taux d ' i n e o r p o r a t i o n d u P h o s p h o r e d a n s des cellules en culture ou d a n s des eellules d'aseite t u m o r a l e d @ e n d essentiellement de la c o n c e n t r a t i o n en eellules. I1 peut ~tre divis~ p a r 10 ou plus lorsque la c o n c e n t r a t i o n en cellules est multipli~e p a r 50. L ' i n h i b i t i o n de l ' i n e o r p o r a t i o n d u p h o s p h o r e d a n s les cellules incub~es en fortes c o n c e n t r a t i o n s ne peut ~tre expliqu~e, ni p a r u n e t e n e u r insuffisante en oxygSne ou en mStabolites d u milieu d ' i n c u b a t i o n , ni p a r la prdsence dans ce milieu de substances inhibitriees libSrSes p a r les cellules. Elle nous p a r a i t plus v r a i s e m b l a b l e m e n t li~e h la fr~quence des contacts entre cellules.

SUMMARY I n t r a c e l l u l a r i n c o r p o r a t i o n of s2p d u r i n g brief i n c u b a t i o n periods has been studied in h a m s t e r cells cultivated in suspension, a n d in m o u s e ascites t u m o r cells. T h e i n c u b a t i o n m e d i u m consisted of b a l a n c e d solutions free of organic substances. I n h a m s t e r cells i n c o r p o r a t i o n of 3~p d i m i n i s h e d in the course of the e x p o n e n t i a l g r o w t h of the cultures until a m i n i m u m level, c o r r e s p o n d i n g to the " p l a t e a u " of the g r o w t h curve, was r e a c h e d . Decrease in the i n c o r p o r a t i o n of ~ P could be attributed to increase in the c o n c e n t r a tion of cells. O u r e x p e r i m e n t s h a v e s h o w n that i n c o r p o r a t i o n of 3~p both into cultivated h a m s t e r cells a n d into m o u s e aseites t u m o r cells was essentially c o r r e l a t e d to cell concentration. F o r e x a m p l e w h e n cell c o n c e n t r a t i o n was a u g m e n t e d b y a factor of 50, ~ P i n c o r p o r a t i o n w a s d e c r e a s e d b y a factor of 10. Other e x p e r i m e n t s h a v e d e m o n s t r a t e d that in our condition the dep e n d e n c y of cellular u p t a k e on cell c o n c e n t r a t i o n m a y not likely be attrib u t e d to limiting factors s u c h as the q u a n t i t y of o x y g e n or metabolites or to the l e a k a g e out of cells of diffusible inhibitors. I n h i b i t i o n of 32p u p t a k e seems to be r a t h e r c o n n e c t e d with the f r e q u e n c y of direct contacts b e t w e e n cells.

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