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035 Localisation du CFTR dans les microdomaines lipidiques membranaires de cellules Calu3
Infection - Inflammation - Réparation
035 Localisation du CFTR dans les microdomaines lipidiques membranaires de cellules Calu3
036 Développement d'un modèle murin d'aspergillose pulmonaire
F. Borot, A. Hinzpeter, F. Brouillard, N. Bensalem, D. Tondelier, J. Fritsch, A. Edelman, M. Ollero Uniuersité Park 5, INSERM U46Z Faculté de Médecine Necker, Paris.
Introduction : La membrane cellulaire contient des microdomaines, connus sous le nom de « rafts », de composition lipidique spécifique (cholestérol et sphyngolipides). Ces structures facilitent l'interaction entre protéines ainsi que la régulation de processus de signalisation cellulaire. Nous proposons comme hypothèse que la localisation (raft ou non-raft) de CFTR détermine des interactions avec des molécules lipidiques etlou protéiques. L'environnement protéo-lipidique et ses altérations pourraient ainsi moduler les propriétés fonctionnelles de CFTR et donc être impliqués dans les défauts de transport de fluides au cours de la mucoviscidose. Méthodes : Nous avons étudié la distribution du CFTR dans les micro-domaines de membrane de cellules d'épithélium respiratoire humain Calu-3. Aprés lyse des cellules en présence de Triton X-100 1 %, les fractions solubles et insolubles au détergent sont séparées après flottaison sur gradient de densité. La détection de marqueurs spécifiques : flotilline-1 (fraction insoluble) et récepteur de transferrine (fraction soluble) a validé cette méthode. Le CFTR a été détecté dans ces fractions par western blot. Résultats : Le CFTR est localisé majoritairement dans des microdomaines solubles au Triton X-100, mais qu'une partie significative est présente dans les "rafts". L'analyse de fractions de protéines membranaires biotinylées a confirmé ce résultat. Un traitement proinflammatoire des cellules Calu3 avec l'interleukine 1-P (IL-1p) déplace le signal CFTR vers la fraction non-rafts. De plus, l'annexinel protéine anti-inflammatoire est observée majoritairement dans la fraction non-rafts en condition basale. Les concentrations croissantes d'IL-1p augmentent significativement le signal CFTR de la fraction non-rafts. Afin de déterminer les interactions protéiques, les fractions de micro-domaines solubles et insolubles de cellules Calu-3 ont été analysées par la méthode d'électrophorèse "blue native". Trois complexes protéiques ont été détectés dans les micro-domaines solubles, dont l'identification des composants est actuellement en cours. Conclusions : L'ensemble de ces résultats suggèrent (i) que le CFTR est inégalement distribué entre les différents micro-domaines membranaires en conditions basales et (ii) que sa distribution entre ces micro-domaines peut être altérée dans les cellules Calu3 en conditions pro-inflammatoires.
Parasitologie-Mycologie-MédPrinetropicale, CHRU; Tours, France. INSERM UCil8, ToÙrs, France. INRA, Nouzilb France. IFR 135, Tours, France. ~natomo~atbologie, CHRU, Tours, France. 'Pneumologie, CHRU, Tours, France.
Introduction : L'aspergillose pulmonaire est un problème préoccupant chez les patients immunodéprimés et souffre d'un déficit en terme de connaissance physiopathologique, de fiabilité diagnostique et de démarche thérapeutique, conduisant à une létalité pouvant dépasser 80 % dans certaines séries. Le développement d'un modèle animal performant peut contribuer à palier ces insuffisances. Méthodes : Des rats Sprague-Dawley males de 6-8 semaines sont immunodéprimés par des injections de cyclophosphamide associées à une alimentation hypoprotéinée. Ils sont infestés à l'aide d'une suspension de spores d'Aspergillusfùmigatus par différentes voies : IV, intra-trachéale via trachéotomie, aérosolisation intra-trachéale à l'aide d'un ~ i c r o s ~ r a ~ e ou r @respiration , de spores en atmosphère confinée. Le suivi s'effectue sur des éléments cliniques (aspect, poids) biologique (NFS, antigènémie aspergillaire) et histologique. Nous développons par ailleurs un procédé de révélation scintigraphique de l'affection à l'aide d'un peptide antifongique original marqué au technétium 99-m. Résultats : Le cyclophosphamide entraîne en deux injections une leucopénie inférieure à 1,5 GIL avec une neutropénie inférieure à 0,l Gl1, et l'alimentation hypoprotéinée conduit à une stagnation de la courbe de poids. Une infection hépatique mortelle est constatée en 2 jours à la suite de l'injection des spores par voie intraveineuse, sans que l'affection puisse atteindre les poumons. Les deux voies intra trachéales permettent de développer des infections pulmonaires qu'il est possible de suivre avec l'apparition des antigènes circulants et l'inflexion de la courbe de poids avant confirmation par anatomopathologie ; l'utilisation du ~ i c r o s ~ r a ~ eest r@ cependant plus aisée, plus rapide et moins traumatisante pour les animaux que la trachéotomie. Enfin, dans le cas de l'inhalation passive de spores en atmosphère confinée, modèle le plus proche de la voie d'infestation chez l'Homme, la grande hétérogénéité des résultats oblige à l'utilisation d'un grand nombre d'animaux. Les tests i n vitro de stabilité et de spécificité de notre peptide sont encourageants et devraient rapidement nous permettre de débuter les essais sur le modèle. Conclusions : Les différents outils que nous développons pour l'optimisation du modèle murin d'aspergillose pulmonaire devraient nous permettre à court terme d'améliorer la connaissance et donc la prise en charge de cette redoutable affection fongique. Autorisation d'étude : Comité Régional &Ethique /Expérimentation Animale Centre-Limousin (UNI 37-005). Soutiens :IFR 135, @zer@, ~ a l l i i a c k v o d t ~ .
pour
O 2005 SPLF, tous droits réservés
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035 Localisation du CFTR dans les microdomaines lipidiques membranaires de cellules Calu3
036 Développement d'un modèle murin d'aspergillose pulmonaire
F. Borot, A. Hinzpeter, F. Brouillard, N. Bensalem, D. Tondelier, J. Fritsch, A. Edelman, M. Ollero Uniuersité Park 5, INSERM U46Z Faculté de Médecine Necker, Paris.
Introduction : La membrane cellulaire contient des microdomaines, connus sous le nom de « rafts », de composition lipidique spécifique (cholestérol et sphyngolipides). Ces structures facilitent l'interaction entre protéines ainsi que la régulation de processus de signalisation cellulaire. Nous proposons comme hypothèse que la localisation (raft ou non-raft) de CFTR détermine des interactions avec des molécules lipidiques etlou protéiques. L'environnement protéo-lipidique et ses altérations pourraient ainsi moduler les propriétés fonctionnelles de CFTR et donc être impliqués dans les défauts de transport de fluides au cours de la mucoviscidose. Méthodes : Nous avons étudié la distribution du CFTR dans les micro-domaines de membrane de cellules d'épithélium respiratoire humain Calu-3. Aprés lyse des cellules en présence de Triton X-100 1 %, les fractions solubles et insolubles au détergent sont séparées après flottaison sur gradient de densité. La détection de marqueurs spécifiques : flotilline-1 (fraction insoluble) et récepteur de transferrine (fraction soluble) a validé cette méthode. Le CFTR a été détecté dans ces fractions par western blot. Résultats : Le CFTR est localisé majoritairement dans des microdomaines solubles au Triton X-100, mais qu'une partie significative est présente dans les "rafts". L'analyse de fractions de protéines membranaires biotinylées a confirmé ce résultat. Un traitement proinflammatoire des cellules Calu3 avec l'interleukine 1-P (IL-1p) déplace le signal CFTR vers la fraction non-rafts. De plus, l'annexinel protéine anti-inflammatoire est observée majoritairement dans la fraction non-rafts en condition basale. Les concentrations croissantes d'IL-1p augmentent significativement le signal CFTR de la fraction non-rafts. Afin de déterminer les interactions protéiques, les fractions de micro-domaines solubles et insolubles de cellules Calu-3 ont été analysées par la méthode d'électrophorèse "blue native". Trois complexes protéiques ont été détectés dans les micro-domaines solubles, dont l'identification des composants est actuellement en cours. Conclusions : L'ensemble de ces résultats suggèrent (i) que le CFTR est inégalement distribué entre les différents micro-domaines membranaires en conditions basales et (ii) que sa distribution entre ces micro-domaines peut être altérée dans les cellules Calu3 en conditions pro-inflammatoires.
Parasitologie-Mycologie-MédPrinetropicale, CHRU; Tours, France. INSERM UCil8, ToÙrs, France. INRA, Nouzilb France. IFR 135, Tours, France. ~natomo~atbologie, CHRU, Tours, France. 'Pneumologie, CHRU, Tours, France.
Introduction : L'aspergillose pulmonaire est un problème préoccupant chez les patients immunodéprimés et souffre d'un déficit en terme de connaissance physiopathologique, de fiabilité diagnostique et de démarche thérapeutique, conduisant à une létalité pouvant dépasser 80 % dans certaines séries. Le développement d'un modèle animal performant peut contribuer à palier ces insuffisances. Méthodes : Des rats Sprague-Dawley males de 6-8 semaines sont immunodéprimés par des injections de cyclophosphamide associées à une alimentation hypoprotéinée. Ils sont infestés à l'aide d'une suspension de spores d'Aspergillusfùmigatus par différentes voies : IV, intra-trachéale via trachéotomie, aérosolisation intra-trachéale à l'aide d'un ~ i c r o s ~ r a ~ e ou r @respiration , de spores en atmosphère confinée. Le suivi s'effectue sur des éléments cliniques (aspect, poids) biologique (NFS, antigènémie aspergillaire) et histologique. Nous développons par ailleurs un procédé de révélation scintigraphique de l'affection à l'aide d'un peptide antifongique original marqué au technétium 99-m. Résultats : Le cyclophosphamide entraîne en deux injections une leucopénie inférieure à 1,5 GIL avec une neutropénie inférieure à 0,l Gl1, et l'alimentation hypoprotéinée conduit à une stagnation de la courbe de poids. Une infection hépatique mortelle est constatée en 2 jours à la suite de l'injection des spores par voie intraveineuse, sans que l'affection puisse atteindre les poumons. Les deux voies intra trachéales permettent de développer des infections pulmonaires qu'il est possible de suivre avec l'apparition des antigènes circulants et l'inflexion de la courbe de poids avant confirmation par anatomopathologie ; l'utilisation du ~ i c r o s ~ r a ~ eest r@ cependant plus aisée, plus rapide et moins traumatisante pour les animaux que la trachéotomie. Enfin, dans le cas de l'inhalation passive de spores en atmosphère confinée, modèle le plus proche de la voie d'infestation chez l'Homme, la grande hétérogénéité des résultats oblige à l'utilisation d'un grand nombre d'animaux. Les tests i n vitro de stabilité et de spécificité de notre peptide sont encourageants et devraient rapidement nous permettre de débuter les essais sur le modèle. Conclusions : Les différents outils que nous développons pour l'optimisation du modèle murin d'aspergillose pulmonaire devraient nous permettre à court terme d'améliorer la connaissance et donc la prise en charge de cette redoutable affection fongique. Autorisation d'étude : Comité Régional &Ethique /Expérimentation Animale Centre-Limousin (UNI 37-005). Soutiens :IFR 135, @zer@, ~ a l l i i a c k v o d t ~ .
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