- Email: [email protected]
92: Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells are altered in CLL
5es Journées scientifiques du CLARA
L’origine héréditaire des familles « non BRCA » pourrait être attribuée en partie à des mutations rares dans des gènes à risque relatif modéré (entre 2 et 4). Les mutations du gène hCHEK2 ont souvent été associées au cancer du sein Pourtant, leur contribution à la PHCM n’est pas totalement élucidée et peu de données sont disponibles sur l’impact fonctionnel de ces variants sur la protéine. Nous avons étudié la contribution des mutations hCHEK2 dans une population de femmes à PHCM non liée à BRCA et dans une population témoin non PHCM puis testé l’activité kinase des protéines hCHEK2 porteuse de ces variants. Sujets et méthode Les exons 4 à 12 du gène hCHEK2 ont été séquencés, pour une population de 565 femmes à PHCM ainsi que 354 femmes contrôles sans PHCM. Les variants trouvés ont été analysés bio-informatiquement afin de prédire leurs effets sur la protéine résultante. Puis, nous avons créé un système combinant mutagenèse ciblée et transformation bactérienne permettant l’expression de variants de hCHEK2 recombinants afin d’en tester l’activité kinase grâce à peptide-substrat qui fluorescent lorsqu’il est phosphorylé par hCHEK2. À titre de contrôle, 4 mutants décrits comme délétères dans la littérature ont également été recréés et testés. Résultats Notre analyse a révélé 21 mutations dont 3 dans la population contrôle. 15 ont été prédites comme délétères par les analyses in-silico et 2 considérées comme polymorphiques. Le taux de mutation est plus élevé chez les cas que les contrôles (18/565 vs 3/354, p = 0,0237) avec un OR de 3,76 (IC = 95 % [1,10 ; 12,86]). 7 mutations ont été reproduites in-vitro. Le test d’activité kinase des protéines recombinantes a permis de distinguer 3 niveaux d’activité (sauvage, intermédiaire, nulle). Ces analyses, combinées aux résultats in-silico, nous ont permis de conclure qu’un variant n’était pas délétère, ramenant le taux de mutation à 17/565 dans le groupe cas contre 2/364 chez les témoins. Cette différence reste significative (p = 0,0128) et l’OR associée à la présence d’une mutation délétère est augmenté à 5,33 (IC = 95 % [1,22 ; 23,21]. Aucun phénotype particulier n’a été noté chez familles dont un membre porte
Bull Cancer vol. 97 • N° spécial • mars 2010
une mutation hCHEK2. Cependant, nous avons noté une tendance non significative à l’augmentation de la fréquence des cancers digestifs chez ces familles. Conclusion En couplant à l’analyse in-silico les résultats du test fonctionnel d’activité kinase, nous pouvons affiner l’évaluation du risque de développer un cancer du sein associé à la présence d’une mutation du gène hCHEK2. Toutes ces études contribuent au développement d’un modèle de transmission complexe de risque héréditaire de cancer du sein. Remerciements : L’équipe du Dr D. Bernard-Gallon pour le support technique. Ce projet est financé par la Ligue contre le Cancer 63, le Conseil Régional d’Auvergne, et l’Institut National du Cancer.
92 Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells are altered in CLL Frédérique Dubois-Galopin/Janel Alexandre/Veyrat-Masson Richard/Tournilhac Olivier/Boiret-Dupré Nathalie/Coudoré Marie-Ange/Rapatel Chantal/Chassagne Jacques/Tarte Karin/ Berger Marc CHU Clermont-Ferrand/CHU Clermont-Ferrand/CHU Clermont-Ferrand/ CHU Clermont-Ferrand/CHU Clermont-Ferrand/CHU Clermont-Ferrand/ CHU Clermont-Ferrand/CHU Clermont-Ferrand/Faculté de médecine Rennes/CHU Clermont-Ferrand Contact : [email protected]
In B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL), malignant cells are not susceptible to apoptosis in vivo, while they die rapidly in vitro in the absence of specialized non-hematopoietic feeder cells, such as mesenchymal stem cells (MSC). Recent observations have suggested that there is a functional relationship between B cell clone and the bone marrow (BM) stroma. We have thus compared BM-MSC obtained from B-CLL patients (CLL-MSC) and healthy subjects. We found that most BM-MSC cultures from B-CLL patients failed under standard culture conditions, in contrast with normal BM. In agreement, CD45negCD14negCD73pos cells in unmanipulated BM samples (subset previously shown to contain CFU-F) were under the threshold of detection in most of B-CLL BM samples. In productive cultures, we found more CFU-F from B-CLL formed by large, polygonal MSC. These cells proliferated poorly and
S75
5es Journées scientifiques du CLARA
in most cases could not be further amplified. The use of soluble factors such as bFGF enabled us to detect CFU-F in most malignant samples and to amplify MSC but their frequency remained lower than in control BM. Among 384 genes tested by RQPCR (TLDAs, Applied Biosystem) for 9 expanded BM-MSC (5 untreated B-CLL; 4 normal), we identified 16 statistically up-regulated genes and 41 downregulated genes. Up-regulated genes included several growth and angiogenic factors as well as key players of the stroma - tumor cell crosstalk. Most down-regulated genes were involved in differentiation pathways. By Elisa, we observed that CLL-MSC released higher amounts of IL-6, IL-8, and VEGF a set of molecules related to senescence-associated secretory phenotype. Finally, the higher proportion of SA-EGAL positive cells and INK4a overexpression proved that CLL-MSC were senescent. These results show that CLL-MSC were quantitatively and functionally altered and could be involved in the B-CLL specific stromal cell alterations previously reported (dysregulation of cytokine secretion, angiogenesis, host-tumor relationships). These findings also suggest the possible permissive role of MSC on B-cell clone progression. Acknowledgements : This work was supported by grants from the Comité Départemental (Puy-de-Dôme) de la Ligue Contre le Cancer (Puy-de-Dôme, France), and Association Laurette Fugain, France.
reconstructs. To gain insight into the mechanisms of dermal invasion and in search of early prognostic markers, we compared the gene expression profiles of the two clones by oligonucleotide microarrays. One of the most abundantly expressed genes in invasive cells is TSPAN8, which encodes a tetraspanin family member not yet described in melanoma: tetraspanin 8 (Tspan8). Interestingly, Tspan8 was the only tetraspanin in which over-expression correlated with the invasive phenotype. Indeed, subsequent analysis of a panel of well-defined melanoma cell lines that recapitulate the phenotypic characteristics of melanomas at early stages of malignant progression confirmed that Tspan8 was expressed by invasive melanoma cells, but not by non-invasive melanoma cells and normal melanocytes. Tspan8 was furthermore found to be expressed by melanoma cells in patient-derived primary melanomas and metastatic lesions but not by epidermal cells in healthy skin. More importantly, the functional role of Tspan8 was demonstrated by silencing endogenous Tspan8 with siRNA, which reduces invasive outgrowth from tumor spheroids within matrigel without impact on the cell proliferation and survival. The results provide the first evidence that Tspan8 contributes to the early invasive process in cutaneous melanoma and may thus be a promising novel target for antiinvasive therapy.
93 Gene expression profiles of human melanoma cells with different invasive potential reveal TSPAN8 as a novel mediator of invasion
Acknowledgements : Manale El Kharbili was supported by a scholarship from the Ligue Nationale de Recherche Contre le Cancer (Comité de Savoie). This work was supported by specific grants from the Ligue Nationale Contre le Cancer (Comités de l’Ardèche et de la Savoie) and Lyon Science Transfert (Service de Valorisation, Université ClaudeBernard - Lyon-I, France).
Manale El Kharbili/Lamartine Jérôme/de la Fouchardière Arnaud/Pointecouteau Thomas/Le Naour François/BerthierVergnes Odile
94 TIF1g SUMOylation in TGFb signaling
MR-CNRS 5534, Villeurbanne/UMR-CNRS 5534, Villeurbanne/Centre Léon-Bérard, Lyon/UMR-CNRS 5534, Villeubanne/Inserm U602, Villejuif/ UMR-CNRS 5534, Villeurbanne Contact : [email protected]
Laurent Fattet/Ay Anne-Sophie/Jury Delphine/Teyre Guillaume/ Jallades Laurent/Hesling Cédric/Rimokh Ruth
The events occurring during penetration of melanoma cells through the dermal-epidermal junction, the first step in the metastatic process, remain ill defined. Previously, we successfully selected a pair of isogenic melanoma clones from the same parental cell line that differ in their ability to cross the dermal-epidermal junction in human skin
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Inserm, U590, Centre Léon-Bérard, IFR62, Lyon, France/Inserm, U590, Centre Léon-Bérard, IFR62, Lyon, France/Inserm, U590, Centre LéonBérard, IFR62, Lyon, France/Inserm, U590, Centre Léon-Bérard, IFR62, Lyon, France/Inserm, U590, Centre Léon-Bérard, IFR62, Lyon, France/ Inserm, U590, Centre Léon-Bérard, IFR62, Lyon, France/Inserm, U590, Centre Léon-Bérard, IFR62, Lyon, France Contact : [email protected]
TGFE participates to major cellular processes, such as proliferation, differentiation, migration, apoptosis, from embryogenesis to adulthood. With Bull Cancer vol. 97 • N° spécial • mars 2010
L’origine héréditaire des familles « non BRCA » pourrait être attribuée en partie à des mutations rares dans des gènes à risque relatif modéré (entre 2 et 4). Les mutations du gène hCHEK2 ont souvent été associées au cancer du sein Pourtant, leur contribution à la PHCM n’est pas totalement élucidée et peu de données sont disponibles sur l’impact fonctionnel de ces variants sur la protéine. Nous avons étudié la contribution des mutations hCHEK2 dans une population de femmes à PHCM non liée à BRCA et dans une population témoin non PHCM puis testé l’activité kinase des protéines hCHEK2 porteuse de ces variants. Sujets et méthode Les exons 4 à 12 du gène hCHEK2 ont été séquencés, pour une population de 565 femmes à PHCM ainsi que 354 femmes contrôles sans PHCM. Les variants trouvés ont été analysés bio-informatiquement afin de prédire leurs effets sur la protéine résultante. Puis, nous avons créé un système combinant mutagenèse ciblée et transformation bactérienne permettant l’expression de variants de hCHEK2 recombinants afin d’en tester l’activité kinase grâce à peptide-substrat qui fluorescent lorsqu’il est phosphorylé par hCHEK2. À titre de contrôle, 4 mutants décrits comme délétères dans la littérature ont également été recréés et testés. Résultats Notre analyse a révélé 21 mutations dont 3 dans la population contrôle. 15 ont été prédites comme délétères par les analyses in-silico et 2 considérées comme polymorphiques. Le taux de mutation est plus élevé chez les cas que les contrôles (18/565 vs 3/354, p = 0,0237) avec un OR de 3,76 (IC = 95 % [1,10 ; 12,86]). 7 mutations ont été reproduites in-vitro. Le test d’activité kinase des protéines recombinantes a permis de distinguer 3 niveaux d’activité (sauvage, intermédiaire, nulle). Ces analyses, combinées aux résultats in-silico, nous ont permis de conclure qu’un variant n’était pas délétère, ramenant le taux de mutation à 17/565 dans le groupe cas contre 2/364 chez les témoins. Cette différence reste significative (p = 0,0128) et l’OR associée à la présence d’une mutation délétère est augmenté à 5,33 (IC = 95 % [1,22 ; 23,21]. Aucun phénotype particulier n’a été noté chez familles dont un membre porte
Bull Cancer vol. 97 • N° spécial • mars 2010
une mutation hCHEK2. Cependant, nous avons noté une tendance non significative à l’augmentation de la fréquence des cancers digestifs chez ces familles. Conclusion En couplant à l’analyse in-silico les résultats du test fonctionnel d’activité kinase, nous pouvons affiner l’évaluation du risque de développer un cancer du sein associé à la présence d’une mutation du gène hCHEK2. Toutes ces études contribuent au développement d’un modèle de transmission complexe de risque héréditaire de cancer du sein. Remerciements : L’équipe du Dr D. Bernard-Gallon pour le support technique. Ce projet est financé par la Ligue contre le Cancer 63, le Conseil Régional d’Auvergne, et l’Institut National du Cancer.
92 Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells are altered in CLL Frédérique Dubois-Galopin/Janel Alexandre/Veyrat-Masson Richard/Tournilhac Olivier/Boiret-Dupré Nathalie/Coudoré Marie-Ange/Rapatel Chantal/Chassagne Jacques/Tarte Karin/ Berger Marc CHU Clermont-Ferrand/CHU Clermont-Ferrand/CHU Clermont-Ferrand/ CHU Clermont-Ferrand/CHU Clermont-Ferrand/CHU Clermont-Ferrand/ CHU Clermont-Ferrand/CHU Clermont-Ferrand/Faculté de médecine Rennes/CHU Clermont-Ferrand Contact : [email protected]
In B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL), malignant cells are not susceptible to apoptosis in vivo, while they die rapidly in vitro in the absence of specialized non-hematopoietic feeder cells, such as mesenchymal stem cells (MSC). Recent observations have suggested that there is a functional relationship between B cell clone and the bone marrow (BM) stroma. We have thus compared BM-MSC obtained from B-CLL patients (CLL-MSC) and healthy subjects. We found that most BM-MSC cultures from B-CLL patients failed under standard culture conditions, in contrast with normal BM. In agreement, CD45negCD14negCD73pos cells in unmanipulated BM samples (subset previously shown to contain CFU-F) were under the threshold of detection in most of B-CLL BM samples. In productive cultures, we found more CFU-F from B-CLL formed by large, polygonal MSC. These cells proliferated poorly and
S75
5es Journées scientifiques du CLARA
in most cases could not be further amplified. The use of soluble factors such as bFGF enabled us to detect CFU-F in most malignant samples and to amplify MSC but their frequency remained lower than in control BM. Among 384 genes tested by RQPCR (TLDAs, Applied Biosystem) for 9 expanded BM-MSC (5 untreated B-CLL; 4 normal), we identified 16 statistically up-regulated genes and 41 downregulated genes. Up-regulated genes included several growth and angiogenic factors as well as key players of the stroma - tumor cell crosstalk. Most down-regulated genes were involved in differentiation pathways. By Elisa, we observed that CLL-MSC released higher amounts of IL-6, IL-8, and VEGF a set of molecules related to senescence-associated secretory phenotype. Finally, the higher proportion of SA-EGAL positive cells and INK4a overexpression proved that CLL-MSC were senescent. These results show that CLL-MSC were quantitatively and functionally altered and could be involved in the B-CLL specific stromal cell alterations previously reported (dysregulation of cytokine secretion, angiogenesis, host-tumor relationships). These findings also suggest the possible permissive role of MSC on B-cell clone progression. Acknowledgements : This work was supported by grants from the Comité Départemental (Puy-de-Dôme) de la Ligue Contre le Cancer (Puy-de-Dôme, France), and Association Laurette Fugain, France.
reconstructs. To gain insight into the mechanisms of dermal invasion and in search of early prognostic markers, we compared the gene expression profiles of the two clones by oligonucleotide microarrays. One of the most abundantly expressed genes in invasive cells is TSPAN8, which encodes a tetraspanin family member not yet described in melanoma: tetraspanin 8 (Tspan8). Interestingly, Tspan8 was the only tetraspanin in which over-expression correlated with the invasive phenotype. Indeed, subsequent analysis of a panel of well-defined melanoma cell lines that recapitulate the phenotypic characteristics of melanomas at early stages of malignant progression confirmed that Tspan8 was expressed by invasive melanoma cells, but not by non-invasive melanoma cells and normal melanocytes. Tspan8 was furthermore found to be expressed by melanoma cells in patient-derived primary melanomas and metastatic lesions but not by epidermal cells in healthy skin. More importantly, the functional role of Tspan8 was demonstrated by silencing endogenous Tspan8 with siRNA, which reduces invasive outgrowth from tumor spheroids within matrigel without impact on the cell proliferation and survival. The results provide the first evidence that Tspan8 contributes to the early invasive process in cutaneous melanoma and may thus be a promising novel target for antiinvasive therapy.
93 Gene expression profiles of human melanoma cells with different invasive potential reveal TSPAN8 as a novel mediator of invasion
Acknowledgements : Manale El Kharbili was supported by a scholarship from the Ligue Nationale de Recherche Contre le Cancer (Comité de Savoie). This work was supported by specific grants from the Ligue Nationale Contre le Cancer (Comités de l’Ardèche et de la Savoie) and Lyon Science Transfert (Service de Valorisation, Université ClaudeBernard - Lyon-I, France).
Manale El Kharbili/Lamartine Jérôme/de la Fouchardière Arnaud/Pointecouteau Thomas/Le Naour François/BerthierVergnes Odile
94 TIF1g SUMOylation in TGFb signaling
MR-CNRS 5534, Villeurbanne/UMR-CNRS 5534, Villeurbanne/Centre Léon-Bérard, Lyon/UMR-CNRS 5534, Villeubanne/Inserm U602, Villejuif/ UMR-CNRS 5534, Villeurbanne Contact : [email protected]
Laurent Fattet/Ay Anne-Sophie/Jury Delphine/Teyre Guillaume/ Jallades Laurent/Hesling Cédric/Rimokh Ruth
The events occurring during penetration of melanoma cells through the dermal-epidermal junction, the first step in the metastatic process, remain ill defined. Previously, we successfully selected a pair of isogenic melanoma clones from the same parental cell line that differ in their ability to cross the dermal-epidermal junction in human skin
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Inserm, U590, Centre Léon-Bérard, IFR62, Lyon, France/Inserm, U590, Centre Léon-Bérard, IFR62, Lyon, France/Inserm, U590, Centre LéonBérard, IFR62, Lyon, France/Inserm, U590, Centre Léon-Bérard, IFR62, Lyon, France/Inserm, U590, Centre Léon-Bérard, IFR62, Lyon, France/ Inserm, U590, Centre Léon-Bérard, IFR62, Lyon, France/Inserm, U590, Centre Léon-Bérard, IFR62, Lyon, France Contact : [email protected]
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