- Email: [email protected]
Action du manganese methylcyclopentadienyle tricarbonyle (MMT) sur les mitochondries I. Effects du MMT, in vitro, sur la phosphorylation oxydative des mitochondries hepatiques de rats
Toxicology, 7 (1977) 115--122 © Elsevier/North-Holland Scientific Publishers Ltd.
ACTION DU MANGANESE METHYLCYCLOPENTADIENYLE T R I C A R B O N Y L E (MMT) S U R LES MITOCHONDRIES I. E F F E T S DU MMT, IN VITRO, S U R LA P H O S P H O R Y L A T I O N ()XYDATIVE DES MITOCHONDRIES HEPATIQUES DE RATS
NICOLE AUTISSIER, PAUL DUMAS, JOSIANE BROSSEAU et ANNIE LOIREAU Laboratoires de Biochimie CeUulaire et de Chimie Analytique, UER Nutrition -Universit$ de Dijon, Campus Universitaire --21 000 Dijon (France)
(Re~u le 7 avril, 1976) (Accept~ le 16 juillet, 1976)
SUMMARY E f f e c t s o f m e t h y l c y c l o p e n t a d i e n y l manganese tricarbonyl ( M M T ) o f rat liver m i t o c h o n d r i a . L E f f e c t s , in vitro, on the o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n .
Methylcyclopentadienyl manganese tricarbonyl (MMT) is an effective inhibitor of mitochondrial respiration associated with NAD÷-linked substrates. At concentrations which inhibit glutamate-malate oxidation {over 80% inhibition) succinate and tetramethylphenylenediamine (TMPD)-ascorbate are inhibited less than 25%. MMT inhibits both electron and energy transfer in mitochondria as revealed by the partial release of MMT inhibition by 2,4-dinitrophenol (DNP). The data indicated that the effects of MMT are supported by energy conservation at site I of the respiratory chain.
INTRODUCTION L'~tude de la toxicit~ du manganese m~thylcyclopentadi~nyle tricarbonyle ou MMT pr~sente un int~r~t particulier du fait qu'il est envisag~ de le substituer au plomb t~tra~thyle, employ~ jusqu'fi ce jour dans les carburants pour ses propri~t~s antid~tonantes. Les premiers essais effectu~s par Hysell [1] sur le Rat m o n t r e n t que le d~riv~ du manganese, administr~ par la voie orale, provoque des l~sions importantes au niveau des poumons, du foie et des reins.
Abrdviations: DNP, 2,4-dinitroph~nol;MMT, m~thylcyclopentadi~nyletricarbonyle; PMS, ph~nazine-mdthosulfate; TMPD, t~tram~thylph~nyl~nediamine.
115
~
CH 3
Mn
co Fig. 1. Manganese m~thylcyclopentadi~nyle tricarbonyle (MMT).
Nos recherches ant~rieures [2,3] sur les sels de manganese au niveau des m~canismes ~nerg~tiques des mitochondries ont ~tabli que ces d~riv~s sont susceptibles d'etre fixes par les particules selon un processus li~ aux phosphorylations oxydatives. La fixation du cation entrafne une augmentation de la respiration des mitochondries mais est pratiquement sans effet sur leur propri~t~ de synth~tiser I'ATP. Un tel r~sultat nous a incit~ ~ rechercher si le MMT, d~riv~ organom~tallique du manganese (Fig. 1), avait des propri~t~s semblables ~ celles des ions Mn 2÷ sur les particules subcellulaires h~patiques frafchement isol~es. METHODES EXPERIMENTALES
Prdparation des mitochondries hdpatiques Les mitochondries h6patiques sont isol6es par la m6thode de Schneider et Hogeboom [4] modifi6e [5] ~ partir de rats m~les Wistar pesant 150 g environ. Les particules, pr6par6es dans de saccharose 0.25 M pr6alablement tamponn6 ~ pH = 7.4 par une solution de Tris--HC1 0.1 M, sont conserv6es dans le m6me milieu pour leur emploi. Leur taux de prot~ines, d6termin6 par la m6thode de Gornall [6] apr6s solubilisation par le d6soxycholate {0.16% p/v) est de 30 mg par ml environ. Mesure de la respiration rnitochondriale La consommation d'oxyg6ne des mitochondries est d6termin6e par polarographie ~ 25°C ~ l'aide d'un oxygraphe (Gflson Medical Electronics) muni d'une 61ectrode vibrante en platine. La suspension mitochondriale (2.5 mg de prot~ines) est ajout~e ~ 1.5 ml d'une solution contenant du tampon phosphate de potassium 13 mM pH = 7.4, MgC12 6 mM, KC1 58 mM et NaC1 38 raM, le pH du milieu 6tant de 7.4. Les diff6rents substrats respiratoires utilis6s sont soit le m61ange glutamate + malate 5 mM, soit le ~-hydroxybutyrate 5 mM, soit le succinate 5 mM, soit le m61ange t~tram6thylph6nyl6ne
116
d'une solution t a m p o n de p H 7.4 renfermant Tris--HC1 0.02 M e t KC1 0.15 M. L'absorbance du milieu mesur~e & 520 nm dans une cure de I cm d'~paisseur est r~gl~e & 0.9. Le gonflement des mitochondries qui se traduit par une diminution de l'absorbance est suivie pendant 10 min & une temperature maintenue constante ~ 25°C. =
Rdactifs T o u s l e s rdactifs sont prdpards & partir de produits Merck et Sigma. Le MMT, peu soluble dans l'eau, est dissous dans de l'alcool absolu dilud au demi avec de l'eau distillde. Des t~moins sont rdalis~s avec de l'alcool dilud au demi. RESULTATS
Inhibition de l'oxydation du mdlange glutamate + malate par les mitochondries Lorsque les mitochondries sont plac$es darts l'dtat respiratoire 4, c'est-fidire en prdsence seulement de substrat, le MMT est pratiquement sans effet. En revanche, lorsque le milieu renferme, en plus du substrat, de I'ADP 240 #M (~tat respiratoire 3), le MMT inhibe la respiration des particules subcellulaires. Le schema de la Fig. 2A, repr~sentant divers enregistrements oxy-
..ADP 240#M
100,
DNP120 M
801601401-
I~7 ' 5nmoe ls02~k~2~"x
~I~
20} O[ 50
[
1oo
i~o
~o
~o
300
MMT (nmoles/mcj prot~ines)
Fig. 2. Enregistrements oxygraphiques de la respiration des mitochondries h~patiques de rats en pr4sence du m~lange glutamate + malate + malonate. (A), sont successivement ajout~s I'ADP 240 #M, le MMT ~ diverses concentrations ou son solvant co m m e t~moin (T), puis le DNP 120 #M. (B), sont successivement ajout4s le DNP 120//M, puis le MMT diffdrentes concentrations. Les diff~rentes concentrations en MMT sont : 100, 150, 200 et 300 p/M, repr~sent4es respectivement par les courbes 1, 2, 3 et 4. Les conditions exp~rimentales sont donn~es dans le texte. Fig. 3. Variation des effets du MMT en fonction du taux de prot4ines (entre 1.5 et 3 mg). Les concentrations en MMT sont comprises entre 5 0 / / M et 300 #M, Les conditions exp4rimentales sont celles indiqu~es sur la Fig. 2.
117
graphiques, illustre ce phdnom~ne. L'inhibition de la consommation d'oxyg~ne commence ~ se manifester pour des concentrations en MMT de l'ordre de 50 pM, le m a x i m u m (80% environ} 6tant obtenu ~ 300 pM. L'addition de DNP restaure, en partie, la respiration des mitochondries, mais l'ampleur de son action ddpend de la quantitd d'inhibiteur. Son effet est d ' a u t a n t plus marqud que la concentration en MMT est plus faible. Lorsque l'6tat 4 des mitochondries est activd par le DNP, le MMT (Fig. 2B) additionn6 apr6s le DNP aux concentrations de 50 pM ~ 300 pM, s'oppose ~ l'effet activateur du ddcouplant nitrd. L'intensitd de l'inhibition est analogue ~ celle que provoquent les m~mes doses de MMT avec des mitochondries respirant en prdsence d'ADP. L'inhibition de la respiration mitochondriale par le MMT varie avec la quantitd de produit lid aux protdines (Fig. 3). Elle est d ' a u t a n t plus forte que la concentration en protdines est plus faible. C'est ~ environ 120 nmoles de MMT par mg de protdines que l'on note une inhibition de l'ordre de 50%. I n h i b i , o n de l'oxydation de diffdrents substrats respiratoires par les mitochondries L'6tude de l'inhibition de la respiration mitochondriale en pr6sence de diff6rents substrats respiratoires (Fig. 4) montre que c'est avec les substrats NAD÷-lids que l'effet du MMT est le plus marqu6. N6anmoins, l'action est plus forte avec le m6lange glutamate + malate qu'avec le/3-hydroxybutyrate. En revanche, avec le succinate et le m61ange TMPD + ascorbate, le MMT se montre pratiquement sans effet. Le m a x i m u m d'inhibition ne d6passe pas 25% pour la dose la plus forte en MMT (500 pM), m~me en prdsence de faibles quantitds de substrat. Effets du M M T sur le gonflement des mitochondries par les ions phosphate et la thyroxine Les rdsultats obtenus sont illustrds par les courbes de la Fig. 5. La courbe 1 reprdsente le gonflement des mitochondries induit par les ions phosphate et par la thyroxine en prdsence de glutamate + malate. Les conditions expdrimentales sont telles que les trois sites par lesquels se fait la synth6se de I'ATP au niveau de la chai'ne respiratoire sont libres. L'addition de MMT emp6che le gonflement des particules (courbes 2 et 3), l'inhibition dtant proportionnelle ~ la quantitd de produit ajoutd. En prdsence de succinate (courbes 4 et 5), le MMT s'oppose encore au gonflement des particules mais son action est beaucoup moins marqude qu'avec le substrat prdcddent. En effet, il faut une dose de produit environ deux fois plus forte pour obtenir la m~me rdponse qu'avec le m61ange glutamate + malate. Effets du M M T sur le gonflement des mitochondries par l'intermddiaire du site P1 de la phosphorylation Nous avons voulu vdrifier que le site P~ de la phosphorylation est bien impliqud dans l'action du MMT. Nous avons donc supprimd une partie de la
118
0.3
4
O.4
100
I
0.5 E c
g
80
0 0.6 LC) .<
6O
u ~
0.7
@
:5 4 O
o
o.8
c 2O
0.9
0
1.0
,
5O
100
150 20Q MMT(#M)
250
300
T e m p s en minutes
Fig. 4. Variation des effects du MMT en f o n c t i o n du substrat respiratoire : glutamate + malate 5 mM en presence de m a l o n a t e 0 . 7 5 mM (o), ~ - h y d r o x y b u t y r a t e (H-OH) 5 mM (~), et succinate 5 mM en presence de r o t 6 n o n e 1.5 tiM (A). Chaque p o i n t c o r r e s p o n d ~ la m o y e n n e de 6 d~terminations. Les essais avec le m6lange T M P D + ascorbate ne s o n t pas repr6sent6s, les r~sultats 6tant inf6rieurs ~ 10% quelle que soit la dose de MMT. Fig. 5. Effets du MMT ~i diff~rentes c o n c e n t r a t i o n s sur Ie g o n f l e m e n t des m i t o c h o n d r i e s (1.5 mg de prot6ines) en presence du m61ange glutamate + malate 5 mM + m a l o n a t e 0 . 7 5 mM et du succinate 5 mM + r o t ~ n o n e 1.5 tiM. Le g o n f l e m e n t dfi aux ions p h o s p h a t e (2 m M ) et & la t h y r o x i n e ( 1 2 tiM) est d~clench6 apr~s 3 rain d'incubation. Les courbes 1, 2 et 3 sont o b t e n u e s avec le m61ange glutamate + malate auque] on a ajout~ 1 2 5 p M (courbe 2) et 2 5 0 pM ( c o u r b e 3) de MMT, la courbe 1 repr6sentant le t ~ m o i n avec le solvant. Les courbes 4 et 5 s o n t o b t e n u e s avec le succinate auquel on a ajout~ 2 5 0 tiM de MMT, la courbe 4 repr~sentant le t 6 m o i n avec le soivant. La courbe indiqu6e par T repr6sente le g o n f l e m e n t des m i t o c h o n d r i e s en l'absence d'agent de g o n f l e m e n t tels que les ions p h o s p h a t e et la t h y r o x i n e .
chafne respiratoire en ajoutant, aux particules subcellulaires, de l'antimycine A et des ions CN- qui bloquent le transport des ~lectrons entre les cytochromes b et cj d'une part et entre le cytochrome a3 et l'oxyg~ne de l'autre. On ajoute de la PMS qui accepte les ~lectrons lib~r~s par le substrat oxyd& Dans ces conditions, seule la phosphorylation P1 est coupl~e & l'oxydation des substrats NADt-li~s. La Fig. 6 rapporte les effets du MMT sur le gonflement des mitochondries ainsi trait6es. La courbe 1 est obtenue avec des particules intactes, la courbe 3 lorsque les sites P2 et P3 sont bloqu~s. L'addition de MMT provoque une inhibition du gonflement des mitochondries. L'effet du produit est beaucoup plus marque, dans ces conditions, que lorsque les 3 sites de phosphorylation sont libres. En effet, pour une m~me dose de MMT (125 #M), l'inhibition qui est de 20% environ avec les mitochondries non trait~es passe & plus de 50% lorsque le site P1 est seul en jeu.
119
0,3 0.4
1
E 0 oj
2
0.5
0.6 ~
2
3
0.7 4
0.8 0.9
1.0
I
3
,
i
I
6
i
,
I
9
T e m p s en m i n u t e s
Fig. 6. Effets du MMT sur le gonflement des mitochondries support~ par le site P1 de la chafne respiratoire. Les essais sont conduits en prdsence du mdlange glutamate + malate + malonate et des ions phosphate + thyroxine dans les conditions indiqudes sur la Fig. 5. Le gonflement des mitochondries intactes est reprdsentd par la courbe 1, la courbe 2 illustrant les effets de 125 tiM de MMT. Les courbes 3 et 4 sont obtenues quand on ajoute de l'antimycine A (0.15 pM) et KCN (0.5 mM), l'essai r~alisd avec MMT 125 tiM est repr~sentd par la courbe 4.
DISCUSSION L ' e n s e m b l e de nos r6sultats m o n t r e q u e le MMT est u n i n h i b i t e u r de la r e s p i r a t i o n des m i t o c h o n d r i e s h 6 p a t i q u e s mais s e u l e m e n t lorsque c e t t e derni6re est activde p a r I ' A D P . L ' a c t i o n du p r o d u i t est s u r t o u t i m p o r t a n t e avec les s u b s t r a t s NAD+-li~s tels que le m~lange g l u t a m a t e + m a l a t e ou le ~-hyd r o x y b u t y r a t e . En r e v a n c h e , avec le s u c c i n a t e et le m61ange T M P D + ascorb a t e , le M M T est p r a t i q u e m e n t sans effet. Le fait que le D N P 16ve, en partie, l ' i n h i b i t i o n d u e au MMT laisse s u p p o s e r q u e celui-ci i n t e r v i e n t 6 g a l e m e n t au niveau des 6 t a p e s de c o n s e r v a t i o n de l'6nergie. Les r6sultats des e x p 6 r i e n c e s sur le g o n f l e m e n t des p a r t i c u l e s c o n f i r m e n t c e t t e h y p o t h 6 s e . C e p e n d a n t l'act i o n i n h i b i t r i c e d u M M T vis h vis de la p r o p r i 6 t 6 p h o s p h o r v l a n t e des m i t o c h o n dries s e m b l e m o i n s m a r q u 6 e que son a c t i o n sur le t r a n s p o r t des 61ectrons. E n e f f e t , il a 6td t r o u v 6 que les doses n6cessaires p o u r freiner le g o n f l e m e n t des p a r t i c u l e s s o n t sup6rieures & celles utilisdes p o u r ralentir la c o n s o m m a t i o n d'oxyg~ne. E n ddfinitive, le MMT s'av6re 6tre u n i n h i b i t e u r & la fois du t r a n s p o r t des 61ectrons le long de la chai'ne r e s p i r a t o i r e et des m 6 c a n i s m e s 6nerg6tiques impliquds d a n s la s y n t h 6 s e de l ' A T P h p a r t i r de I ' A D P , c e t t e derni6re a c t i o n paraissant, t o u t e f o i s , 6tre m o i n s m a r q u 6 e q u e la p r e m i e r e . Les essais sur le g o n f l e m e n t des m i t o c h o n d r i e s p e r m e t t e n t de localiser le
120
Succinate MMT NADH ~
TMPD + Ascorbate
I
I
I
%~I
02
C2~I X ~I
ATP Fig. 7. Sch6ma hypoth6tique du site d'action du MMT sur la chafne respiratoire des mitochondries. Ch C2 et C3 repr6sentent des transporteurs d'61ectrons aux sites de couplage I, II et III. I e t X repr6sentent des interm6diaires inconnus [7].
point d'action ~ventuel du MMT sur la chai'ne respiratoire. Les r@sultats obtenus semblent indiquer que le MMT doit, vraisemblablement, agir au niveau du site P1. I1 aurait donc pour effet, & ce niveau de la chafne respiratoire, d'inhiber la respiration li@e & l'oxydation des substrats NAD+-li~s et, plus faiblement, de freiner la synth~se de I'ATP par action, sans doute, sur les ~tapes de couplage conduisant aux interm~diaires ~nerg~tiques C ~ I e t X ~ I impliqu@s dans la phosphorylation de I'ADP. En se r~f~rant au sch@ma classique de la chafne respiratoire mitochondriale [7], nous pouvons alors supposer que les effets du MMT se situent aux emplacements indiqu~s sur la Fig. 7. L'action du MMT sur les mitochondries est donc different de celui des ions Mn 2÷. Cette difference de comportement entre les d@riv@s du manganese est due, vraisemblablement, & la configuration ~lectronique particuli~re de l'61@ment m~tallique dans chacun d'eux. Des essais sont en cours pour v6ritier la relation qui existe entre la structure chimique de divers d~riv~s du manganese et leur activit@ biologique, voire toxicologique. REMERCIEMENTS
Ce travail a pu @tre r6alis6 grfice & l'aide du Minist~re Franqais de la Qualit~ de la Vie et de l'Environnement (contrat No. 5600-75-06). BIBLIOGRAPHIE 1 D.K. Hysell, W. Moore, J.F. Stara, R. Miller and K.I. Campbell, Environ. Res., 7 (1974) 158. 2 R. Michel, N. Autissier et P. Dumas, C.R. Soc. Biol., 161 (1967) 1515.
121
3 4 5 6 7
N. Autissier, C.R. Soc. Biol., 168 (1974) 509. W.C. Schneider and G.H. Hogeboom, J. Biol. Chem., 183 (1950) 123. J. Roche, J.E. Rall, R. Michel et S. Varrone, Biochim. Biophys. Acta, 56 (1962) 188 A.G. Gornall, C.J. Bardawill and M.M. David, J. Biol. Chem., 177 (1949) 751. B. Chance and G.R. Williams, Adv. Enzymol., 17 (1956) 65.
122
ACTION DU MANGANESE METHYLCYCLOPENTADIENYLE T R I C A R B O N Y L E (MMT) S U R LES MITOCHONDRIES I. E F F E T S DU MMT, IN VITRO, S U R LA P H O S P H O R Y L A T I O N ()XYDATIVE DES MITOCHONDRIES HEPATIQUES DE RATS
NICOLE AUTISSIER, PAUL DUMAS, JOSIANE BROSSEAU et ANNIE LOIREAU Laboratoires de Biochimie CeUulaire et de Chimie Analytique, UER Nutrition -Universit$ de Dijon, Campus Universitaire --21 000 Dijon (France)
(Re~u le 7 avril, 1976) (Accept~ le 16 juillet, 1976)
SUMMARY E f f e c t s o f m e t h y l c y c l o p e n t a d i e n y l manganese tricarbonyl ( M M T ) o f rat liver m i t o c h o n d r i a . L E f f e c t s , in vitro, on the o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n .
Methylcyclopentadienyl manganese tricarbonyl (MMT) is an effective inhibitor of mitochondrial respiration associated with NAD÷-linked substrates. At concentrations which inhibit glutamate-malate oxidation {over 80% inhibition) succinate and tetramethylphenylenediamine (TMPD)-ascorbate are inhibited less than 25%. MMT inhibits both electron and energy transfer in mitochondria as revealed by the partial release of MMT inhibition by 2,4-dinitrophenol (DNP). The data indicated that the effects of MMT are supported by energy conservation at site I of the respiratory chain.
INTRODUCTION L'~tude de la toxicit~ du manganese m~thylcyclopentadi~nyle tricarbonyle ou MMT pr~sente un int~r~t particulier du fait qu'il est envisag~ de le substituer au plomb t~tra~thyle, employ~ jusqu'fi ce jour dans les carburants pour ses propri~t~s antid~tonantes. Les premiers essais effectu~s par Hysell [1] sur le Rat m o n t r e n t que le d~riv~ du manganese, administr~ par la voie orale, provoque des l~sions importantes au niveau des poumons, du foie et des reins.
Abrdviations: DNP, 2,4-dinitroph~nol;MMT, m~thylcyclopentadi~nyletricarbonyle; PMS, ph~nazine-mdthosulfate; TMPD, t~tram~thylph~nyl~nediamine.
115
~
CH 3
Mn
co Fig. 1. Manganese m~thylcyclopentadi~nyle tricarbonyle (MMT).
Nos recherches ant~rieures [2,3] sur les sels de manganese au niveau des m~canismes ~nerg~tiques des mitochondries ont ~tabli que ces d~riv~s sont susceptibles d'etre fixes par les particules selon un processus li~ aux phosphorylations oxydatives. La fixation du cation entrafne une augmentation de la respiration des mitochondries mais est pratiquement sans effet sur leur propri~t~ de synth~tiser I'ATP. Un tel r~sultat nous a incit~ ~ rechercher si le MMT, d~riv~ organom~tallique du manganese (Fig. 1), avait des propri~t~s semblables ~ celles des ions Mn 2÷ sur les particules subcellulaires h~patiques frafchement isol~es. METHODES EXPERIMENTALES
Prdparation des mitochondries hdpatiques Les mitochondries h6patiques sont isol6es par la m6thode de Schneider et Hogeboom [4] modifi6e [5] ~ partir de rats m~les Wistar pesant 150 g environ. Les particules, pr6par6es dans de saccharose 0.25 M pr6alablement tamponn6 ~ pH = 7.4 par une solution de Tris--HC1 0.1 M, sont conserv6es dans le m6me milieu pour leur emploi. Leur taux de prot~ines, d6termin6 par la m6thode de Gornall [6] apr6s solubilisation par le d6soxycholate {0.16% p/v) est de 30 mg par ml environ. Mesure de la respiration rnitochondriale La consommation d'oxyg6ne des mitochondries est d6termin6e par polarographie ~ 25°C ~ l'aide d'un oxygraphe (Gflson Medical Electronics) muni d'une 61ectrode vibrante en platine. La suspension mitochondriale (2.5 mg de prot~ines) est ajout~e ~ 1.5 ml d'une solution contenant du tampon phosphate de potassium 13 mM pH = 7.4, MgC12 6 mM, KC1 58 mM et NaC1 38 raM, le pH du milieu 6tant de 7.4. Les diff6rents substrats respiratoires utilis6s sont soit le m61ange glutamate + malate 5 mM, soit le ~-hydroxybutyrate 5 mM, soit le succinate 5 mM, soit le m61ange t~tram6thylph6nyl6ne
116
d'une solution t a m p o n de p H 7.4 renfermant Tris--HC1 0.02 M e t KC1 0.15 M. L'absorbance du milieu mesur~e & 520 nm dans une cure de I cm d'~paisseur est r~gl~e & 0.9. Le gonflement des mitochondries qui se traduit par une diminution de l'absorbance est suivie pendant 10 min & une temperature maintenue constante ~ 25°C. =
Rdactifs T o u s l e s rdactifs sont prdpards & partir de produits Merck et Sigma. Le MMT, peu soluble dans l'eau, est dissous dans de l'alcool absolu dilud au demi avec de l'eau distillde. Des t~moins sont rdalis~s avec de l'alcool dilud au demi. RESULTATS
Inhibition de l'oxydation du mdlange glutamate + malate par les mitochondries Lorsque les mitochondries sont plac$es darts l'dtat respiratoire 4, c'est-fidire en prdsence seulement de substrat, le MMT est pratiquement sans effet. En revanche, lorsque le milieu renferme, en plus du substrat, de I'ADP 240 #M (~tat respiratoire 3), le MMT inhibe la respiration des particules subcellulaires. Le schema de la Fig. 2A, repr~sentant divers enregistrements oxy-
..ADP 240#M
100,
DNP120 M
801601401-
I~7 ' 5nmoe ls02~k~2~"x
~I~
20} O[ 50
[
1oo
i~o
~o
~o
300
MMT (nmoles/mcj prot~ines)
Fig. 2. Enregistrements oxygraphiques de la respiration des mitochondries h~patiques de rats en pr4sence du m~lange glutamate + malate + malonate. (A), sont successivement ajout~s I'ADP 240 #M, le MMT ~ diverses concentrations ou son solvant co m m e t~moin (T), puis le DNP 120 #M. (B), sont successivement ajout4s le DNP 120//M, puis le MMT diffdrentes concentrations. Les diff~rentes concentrations en MMT sont : 100, 150, 200 et 300 p/M, repr~sent4es respectivement par les courbes 1, 2, 3 et 4. Les conditions exp~rimentales sont donn~es dans le texte. Fig. 3. Variation des effets du MMT en fonction du taux de prot4ines (entre 1.5 et 3 mg). Les concentrations en MMT sont comprises entre 5 0 / / M et 300 #M, Les conditions exp4rimentales sont celles indiqu~es sur la Fig. 2.
117
graphiques, illustre ce phdnom~ne. L'inhibition de la consommation d'oxyg~ne commence ~ se manifester pour des concentrations en MMT de l'ordre de 50 pM, le m a x i m u m (80% environ} 6tant obtenu ~ 300 pM. L'addition de DNP restaure, en partie, la respiration des mitochondries, mais l'ampleur de son action ddpend de la quantitd d'inhibiteur. Son effet est d ' a u t a n t plus marqud que la concentration en MMT est plus faible. Lorsque l'6tat 4 des mitochondries est activd par le DNP, le MMT (Fig. 2B) additionn6 apr6s le DNP aux concentrations de 50 pM ~ 300 pM, s'oppose ~ l'effet activateur du ddcouplant nitrd. L'intensitd de l'inhibition est analogue ~ celle que provoquent les m~mes doses de MMT avec des mitochondries respirant en prdsence d'ADP. L'inhibition de la respiration mitochondriale par le MMT varie avec la quantitd de produit lid aux protdines (Fig. 3). Elle est d ' a u t a n t plus forte que la concentration en protdines est plus faible. C'est ~ environ 120 nmoles de MMT par mg de protdines que l'on note une inhibition de l'ordre de 50%. I n h i b i , o n de l'oxydation de diffdrents substrats respiratoires par les mitochondries L'6tude de l'inhibition de la respiration mitochondriale en pr6sence de diff6rents substrats respiratoires (Fig. 4) montre que c'est avec les substrats NAD÷-lids que l'effet du MMT est le plus marqu6. N6anmoins, l'action est plus forte avec le m6lange glutamate + malate qu'avec le/3-hydroxybutyrate. En revanche, avec le succinate et le m61ange TMPD + ascorbate, le MMT se montre pratiquement sans effet. Le m a x i m u m d'inhibition ne d6passe pas 25% pour la dose la plus forte en MMT (500 pM), m~me en prdsence de faibles quantitds de substrat. Effets du M M T sur le gonflement des mitochondries par les ions phosphate et la thyroxine Les rdsultats obtenus sont illustrds par les courbes de la Fig. 5. La courbe 1 reprdsente le gonflement des mitochondries induit par les ions phosphate et par la thyroxine en prdsence de glutamate + malate. Les conditions expdrimentales sont telles que les trois sites par lesquels se fait la synth6se de I'ATP au niveau de la chai'ne respiratoire sont libres. L'addition de MMT emp6che le gonflement des particules (courbes 2 et 3), l'inhibition dtant proportionnelle ~ la quantitd de produit ajoutd. En prdsence de succinate (courbes 4 et 5), le MMT s'oppose encore au gonflement des particules mais son action est beaucoup moins marqude qu'avec le substrat prdcddent. En effet, il faut une dose de produit environ deux fois plus forte pour obtenir la m~me rdponse qu'avec le m61ange glutamate + malate. Effets du M M T sur le gonflement des mitochondries par l'intermddiaire du site P1 de la phosphorylation Nous avons voulu vdrifier que le site P~ de la phosphorylation est bien impliqud dans l'action du MMT. Nous avons donc supprimd une partie de la
118
0.3
4
O.4
100
I
0.5 E c
g
80
0 0.6 LC) .<
6O
u ~
0.7
@
:5 4 O
o
o.8
c 2O
0.9
0
1.0
,
5O
100
150 20Q MMT(#M)
250
300
T e m p s en minutes
Fig. 4. Variation des effects du MMT en f o n c t i o n du substrat respiratoire : glutamate + malate 5 mM en presence de m a l o n a t e 0 . 7 5 mM (o), ~ - h y d r o x y b u t y r a t e (H-OH) 5 mM (~), et succinate 5 mM en presence de r o t 6 n o n e 1.5 tiM (A). Chaque p o i n t c o r r e s p o n d ~ la m o y e n n e de 6 d~terminations. Les essais avec le m6lange T M P D + ascorbate ne s o n t pas repr6sent6s, les r~sultats 6tant inf6rieurs ~ 10% quelle que soit la dose de MMT. Fig. 5. Effets du MMT ~i diff~rentes c o n c e n t r a t i o n s sur Ie g o n f l e m e n t des m i t o c h o n d r i e s (1.5 mg de prot6ines) en presence du m61ange glutamate + malate 5 mM + m a l o n a t e 0 . 7 5 mM et du succinate 5 mM + r o t ~ n o n e 1.5 tiM. Le g o n f l e m e n t dfi aux ions p h o s p h a t e (2 m M ) et & la t h y r o x i n e ( 1 2 tiM) est d~clench6 apr~s 3 rain d'incubation. Les courbes 1, 2 et 3 sont o b t e n u e s avec le m61ange glutamate + malate auque] on a ajout~ 1 2 5 p M (courbe 2) et 2 5 0 pM ( c o u r b e 3) de MMT, la courbe 1 repr6sentant le t ~ m o i n avec le solvant. Les courbes 4 et 5 s o n t o b t e n u e s avec le succinate auquel on a ajout~ 2 5 0 tiM de MMT, la courbe 4 repr~sentant le t 6 m o i n avec le soivant. La courbe indiqu6e par T repr6sente le g o n f l e m e n t des m i t o c h o n d r i e s en l'absence d'agent de g o n f l e m e n t tels que les ions p h o s p h a t e et la t h y r o x i n e .
chafne respiratoire en ajoutant, aux particules subcellulaires, de l'antimycine A et des ions CN- qui bloquent le transport des ~lectrons entre les cytochromes b et cj d'une part et entre le cytochrome a3 et l'oxyg~ne de l'autre. On ajoute de la PMS qui accepte les ~lectrons lib~r~s par le substrat oxyd& Dans ces conditions, seule la phosphorylation P1 est coupl~e & l'oxydation des substrats NADt-li~s. La Fig. 6 rapporte les effets du MMT sur le gonflement des mitochondries ainsi trait6es. La courbe 1 est obtenue avec des particules intactes, la courbe 3 lorsque les sites P2 et P3 sont bloqu~s. L'addition de MMT provoque une inhibition du gonflement des mitochondries. L'effet du produit est beaucoup plus marque, dans ces conditions, que lorsque les 3 sites de phosphorylation sont libres. En effet, pour une m~me dose de MMT (125 #M), l'inhibition qui est de 20% environ avec les mitochondries non trait~es passe & plus de 50% lorsque le site P1 est seul en jeu.
119
0,3 0.4
1
E 0 oj
2
0.5
0.6 ~
2
3
0.7 4
0.8 0.9
1.0
I
3
,
i
I
6
i
,
I
9
T e m p s en m i n u t e s
Fig. 6. Effets du MMT sur le gonflement des mitochondries support~ par le site P1 de la chafne respiratoire. Les essais sont conduits en prdsence du mdlange glutamate + malate + malonate et des ions phosphate + thyroxine dans les conditions indiqudes sur la Fig. 5. Le gonflement des mitochondries intactes est reprdsentd par la courbe 1, la courbe 2 illustrant les effets de 125 tiM de MMT. Les courbes 3 et 4 sont obtenues quand on ajoute de l'antimycine A (0.15 pM) et KCN (0.5 mM), l'essai r~alisd avec MMT 125 tiM est repr~sentd par la courbe 4.
DISCUSSION L ' e n s e m b l e de nos r6sultats m o n t r e q u e le MMT est u n i n h i b i t e u r de la r e s p i r a t i o n des m i t o c h o n d r i e s h 6 p a t i q u e s mais s e u l e m e n t lorsque c e t t e derni6re est activde p a r I ' A D P . L ' a c t i o n du p r o d u i t est s u r t o u t i m p o r t a n t e avec les s u b s t r a t s NAD+-li~s tels que le m~lange g l u t a m a t e + m a l a t e ou le ~-hyd r o x y b u t y r a t e . En r e v a n c h e , avec le s u c c i n a t e et le m61ange T M P D + ascorb a t e , le M M T est p r a t i q u e m e n t sans effet. Le fait que le D N P 16ve, en partie, l ' i n h i b i t i o n d u e au MMT laisse s u p p o s e r q u e celui-ci i n t e r v i e n t 6 g a l e m e n t au niveau des 6 t a p e s de c o n s e r v a t i o n de l'6nergie. Les r6sultats des e x p 6 r i e n c e s sur le g o n f l e m e n t des p a r t i c u l e s c o n f i r m e n t c e t t e h y p o t h 6 s e . C e p e n d a n t l'act i o n i n h i b i t r i c e d u M M T vis h vis de la p r o p r i 6 t 6 p h o s p h o r v l a n t e des m i t o c h o n dries s e m b l e m o i n s m a r q u 6 e que son a c t i o n sur le t r a n s p o r t des 61ectrons. E n e f f e t , il a 6td t r o u v 6 que les doses n6cessaires p o u r freiner le g o n f l e m e n t des p a r t i c u l e s s o n t sup6rieures & celles utilisdes p o u r ralentir la c o n s o m m a t i o n d'oxyg~ne. E n ddfinitive, le MMT s'av6re 6tre u n i n h i b i t e u r & la fois du t r a n s p o r t des 61ectrons le long de la chai'ne r e s p i r a t o i r e et des m 6 c a n i s m e s 6nerg6tiques impliquds d a n s la s y n t h 6 s e de l ' A T P h p a r t i r de I ' A D P , c e t t e derni6re a c t i o n paraissant, t o u t e f o i s , 6tre m o i n s m a r q u 6 e q u e la p r e m i e r e . Les essais sur le g o n f l e m e n t des m i t o c h o n d r i e s p e r m e t t e n t de localiser le
120
Succinate MMT NADH ~
TMPD + Ascorbate
I
I
I
%~I
02
C2~I X ~I
ATP Fig. 7. Sch6ma hypoth6tique du site d'action du MMT sur la chafne respiratoire des mitochondries. Ch C2 et C3 repr6sentent des transporteurs d'61ectrons aux sites de couplage I, II et III. I e t X repr6sentent des interm6diaires inconnus [7].
point d'action ~ventuel du MMT sur la chai'ne respiratoire. Les r@sultats obtenus semblent indiquer que le MMT doit, vraisemblablement, agir au niveau du site P1. I1 aurait donc pour effet, & ce niveau de la chafne respiratoire, d'inhiber la respiration li@e & l'oxydation des substrats NAD+-li~s et, plus faiblement, de freiner la synth~se de I'ATP par action, sans doute, sur les ~tapes de couplage conduisant aux interm~diaires ~nerg~tiques C ~ I e t X ~ I impliqu@s dans la phosphorylation de I'ADP. En se r~f~rant au sch@ma classique de la chafne respiratoire mitochondriale [7], nous pouvons alors supposer que les effets du MMT se situent aux emplacements indiqu~s sur la Fig. 7. L'action du MMT sur les mitochondries est donc different de celui des ions Mn 2÷. Cette difference de comportement entre les d@riv@s du manganese est due, vraisemblablement, & la configuration ~lectronique particuli~re de l'61@ment m~tallique dans chacun d'eux. Des essais sont en cours pour v6ritier la relation qui existe entre la structure chimique de divers d~riv~s du manganese et leur activit@ biologique, voire toxicologique. REMERCIEMENTS
Ce travail a pu @tre r6alis6 grfice & l'aide du Minist~re Franqais de la Qualit~ de la Vie et de l'Environnement (contrat No. 5600-75-06). BIBLIOGRAPHIE 1 D.K. Hysell, W. Moore, J.F. Stara, R. Miller and K.I. Campbell, Environ. Res., 7 (1974) 158. 2 R. Michel, N. Autissier et P. Dumas, C.R. Soc. Biol., 161 (1967) 1515.
121
3 4 5 6 7
N. Autissier, C.R. Soc. Biol., 168 (1974) 509. W.C. Schneider and G.H. Hogeboom, J. Biol. Chem., 183 (1950) 123. J. Roche, J.E. Rall, R. Michel et S. Varrone, Biochim. Biophys. Acta, 56 (1962) 188 A.G. Gornall, C.J. Bardawill and M.M. David, J. Biol. Chem., 177 (1949) 751. B. Chance and G.R. Williams, Adv. Enzymol., 17 (1956) 65.
122