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Actividad de la telomerasa en leucocitos de sangre periférica de pacientes con hipertensión arterial esencial
ORIGINALES Actividad de la telomerasa en leucocitos de sangre periférica de pacientes con hipertensión arterial esencial
48.509
Antonio Tristanoa, María Eugenia Cholleta, María L. Willsona, Haroution Adjouniana, María Fernanda Correab y Adolfo Borgesc a
Servicio de Medicina Interna. Hospital Dr. Domingo Luciani. Caracas. Laboratorio de Biología Molecular de Agentes Infecciosos. Universidad Central de Venezuela (UCV). Caracas. c Sección de Biomembranas del Instituto de Medicina Experimental (IME). Universidad Central de Venezuela (UCV). Caracas. Venezuela. b
FUNDAMENTO Y OBJETIVO: La activación primaria o secundaria de mecanismos inmunes, que lleva a una disfunción y/o proliferación de poblaciones celulares específicas, se ha implicado en la patogenia y/o complicaciones de la hipertensión arterial esencial. En vista de que la longitud de los telómeros determina el período de vida de una célula y que se han observado alteraciones replicativas en los leucocitos de sangre periférica de pacientes con hipertensión arterial esencial, investigamos la relación entre la actividad de la telomerasa en los leucocitos de sangre periférica, como un indicador del acortamiento telomérico, y la presencia de hipertensión arterial. PACIENTES Y MÉTODO: Determinamos la actividad de la telomerasa en leucocitos de sangre periférica aislados de controles normales, pacientes con hipertensión esencial controlada y no controlada. Los leucocios de sangre periférica se aislaron por gradiente de densidad, se lisaron y su ADN se amplificó por el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La actividad de la telomerasa se midió por un ELISA específico. RESULTADOS: El recuento de leucocitos fue significativamente mayor en los pacientes con hipertensión esencial en comparación con el de los individuos sanos (p < 0,05). La actividad de la telomerasa fue significativamente mayor en pacientes menores de 45 años con hipertensión no controlada, comparada con la de los individuos sanos y con los pacientes menores de 45 años con hipertensión controlada (p < 0,05). En este último grupo, la actividad de la telomerasa fue significativamente menor con respecto a los otros dos (p < 0,05). CONCLUSIONES: Nuestros resultados indican que existe una relación entre la actividad de la telomerasa en los leucocitos de sangre periférica, la proliferación de estos leucocitos y la presencia de hipertensión arterial esencial. Palabras clave: Hipertensión arterial. Leucocitos. Telomerasa. Telómero.
Telomerase activity in peripheral blood leucocytes from patients with essential hypertension BACKGROUND AND OBJECTIVE: Primary or secondary activation of the immune mechanisms that lead to proliferation and dysfunction of specific cellular groups appears to be involved in the pathogenesis and complications of essential hypertension. In view of the evidence that, on one hand, telomeric length determines the replicative capacity and life span of cells and, on the other hand, idiopathic hypertensive patients have peripheral white cell replicative disorders, we decided to investigate the relationship between the influence of telomerase activity in peripheral leukocytes as an indirect marker of telomeric length and the presence of arterial hypertension. PATIENTS AND METHOD: Telomerase activity in peripheral white blood cells was measured in healthy individuals, in effectively treated hypertensive patients and in a non-well controlled hypertensive group. White blood cells were separated through a density gradient, then lysed and their DNA amplified by a polimerase chain reaction (PCR). Telomerase activity was determined with an ELISA specific kit. RESULTS: The white blood cell count was higher in the hypertensive than the control group (p < 0.05). Telomerase activity was positive in all three groups but higher in patients under 45 yearold with bad controlled hypertension as compared with healthy individuals and patients under 45 year-old with well controlled hypertension (p < 0.05); in the latter group, telomerase activity was significantly lower than in the other groups (p < 0.05). CONCLUSIONS: Our results indicate that there exists a relationship between telomerase activity in peripheral leukocytes, the proliferation of these white blood cells and the presence of essential arterial hypertension. Key words: Arterial hypertension. Leukocytes. Telomerase. Telomere.
Correspondencia: Dr. A. Tristano. Poba International, 1-20255. P.O. Box 02.5255. Miami. Florida. 33102-5255 USA. Correo electrónico: [email protected] Recibido el 24-5-2002; aceptado para su publicación el 26-11-2002.
Se han involucrado mecanismos inmunes en la patogenia de la enfermedad hipertensiva, implicando tanto a la inmunidad celular como a la humoral1. Los leucocitos han sido objeto de gran interés en estudios sobre la patogenia de la hipertensión arterial (HTA)2. Se ha encontrado una asociación entre un número alto de leucocitos y mayor incidencia de hipertensión3-5. Igualmente, se ha demostrado un incremento de la adhesión de los leucocitos a la pared endotelial6-11 y el papel de las citocinas, tales como la interleucina 1 beta (IL-1β), interleucina 6 (IL-6) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) en el desarrollo de la aterosclerosis12-14. También se han encontrado alteraciones de la inmunidad humoral y del sistema del complemento en pacientes con HTA, principalmente hipergammaglobulinemia15-28. Por otro lado, existen evidencias experimentales que apuntan a que un reloj biológico, el telómero, podría desempeñar un papel crítico en el control del lapso de vida celular in vitro y probablemente in vivo. Los telómeros son estructuras especializadas que se encuentran al final de los cromosomas de células eucariotas y actúan en la protección de los genes localizados en regiones subteloméricas y en el posicionamiento y replicación de los cromosomas. La hipótesis telomérica del envejecimiento celular podría explicar la enigmática expresión de la HTA esencial, incluyendo la dependencia que ésta tiene con la edad y su expresión fenotípica inestable. Los individuos que heredan telómeros acortados son más propensos a desarrollar en edades más jóvenes disfunciones relacionadas con el acortamiento del telómero, incluyendo la expresión de variaciones genéticas que causan HTA28-30. Ya sea de forma primaria o secundaria, el acortamiento telomérico puede formar parte del curso clínico de la HTA esencial, bien sea aumentando la presión arterial o acelerando el envejecimiento mediado por la hipertensión de los órganos implicados en la patogenia de ese trastorno. Med Clin (Barc) 2003;120(10):365-9
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Las evidencias presentadas constituyen pruebas sólidas de que en la HTA aumenta la tasa de recambio de tipos celulares específicos, incluyendo los leucocitos de sangre periférica, y que dentro de la fisiopatología de la HTA hay anomalías inmunológicas como resultado de la disfunción y/o proliferación de poblaciones celulares específicas. En vista de que los telómeros de las células con potencial replicativo se acortan con la edad y de que se han observado alteraciones replicativas en células de sangre periférica en individuos hipertensos, estudiamos si la actividad de la telomerasa (como marcador de la longitud telomérica) en los leucocitos de sangre periférica de individuos con HTA esencial difería de la encontrada en leucocitos de individuos normotensos. Pacientes y método Pacientes Se tomaron 31 voluntarios, divididos en tres grupos: 9 con HTA esencial controlada (4 mujeres y 5 varones); 11 con HTA esencial no controlada (9 mujeres y dos varones), y 11 controles sanos (5 mujeres y 6 varones); todos fueron divididos en grupos etarios (tabla 1). Los sujetos hipertensos fueron reclutados de la consulta externa de Medicina Interna del Hospital Dr. Domingo Luciani de Caracas (Venezuela), mientras que los sujetos sanos fueron escogidos entre el personal que trabaja en la institución. Se elaboró una ficha para la recolección de datos de todos los sujetos que participaron en el proyecto previa autorización escrita de los mismos. El criterio para diagnosticar HTA esencial fue una cifra de presión arterial sistólica igual o superior a 140 mmHg y/o una presión diastólica igual o superior a 90 mm Hg31, determinada mediante un esfigmomanómetro de mercurio (ALP K2); siempre se usó el mismo instrumento para todos los sujetos. El diagnóstico de HTA se realizó después de dos lecturas de presión arterial en dos visitas sucesivas, tras la valoración inicial31. Para la lectura de la presión arterial el paciente se colocó sentado en una silla con soporte para los brazos, situados éstos a nivel del corazón. No debía haber ingerido café ni fumado por lo menos 30 min antes de la lectura. La lectura se realizó después de 5 min de reposo. Se utilizó un manguito adecuado a la circunferencia del brazo, que cubrió al menos el 80% del mismo. Los pacientes hipertensos no controlados se clasificaron según valor de la presión arterial en estadios 1 (n = 3), 2 (n = 3) y 3 (n = 5)31. Se excluyeron los pacientes con diabetes mellitus, enfermedad arterial coronaria, enfermedad cerebrovascular, neoplasias y enfermedad arterial obstructiva. Los pacientes seleccionados fueron aquellos que no tenían diagnóstico previo o hipertensos con y sin tratamiento. A todos los sujetos se les practicaron un examen de orina, determinación de urea y creatinina, electrocardiograma (ECG), radiografía de tórax posteroanterior y examen de fondo de ojo, para determinar el grado de lesión en los órganos diana. Método Se tomaron 10 ml de sangre de cada sujeto usando una inyectadora heparinizada y la muestra se colocó de inmediato en hielo. Se tomaron 8 ml de cada muestra y se colocaron en un tubo estéril; a cada uno de estos tubos se le añadieron 6 ml de Histopaque y fueron centrifugados a 2.500 rpm durante 30 min. Una vez obtenida la separación de los diferentes grupos celulares, se procedió a tomar la capa de leucocitos, que se transfirió a un nuevo tubo estéril. Se agregó a cada tubo 1 ml de solución salina buffer fosfato (PBS) y se procedió a una nueva centrifugación durante 5 min a 2.500 rpm. Posteriormente se descartó el sobrenadante y se resuspendió. Se realizó el recuento de células de
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TABLA 1 Distribución de los pacientes según grupos de edades Edad (años)
HTA no controlada (n)
HTA controlada (n)
Normotensos (n)
Total (n)
6 5 11
4 5 9
6 5 11
16 15 31
≤ 45 > 45 Total HTA: hipertensión arterial.
cada muestra en un hemocitómetro y los leucocitos se colocaron luego en microtubos de centrífuga de 1,5 ml de capacidad, libres de DNasa y RNasa y congelados a –80 °C. Todo este procedimiento se realizó en el Laboratorio del Banco de Sangre del Hospital Dr. Domingo Luciani de Caracas (Venezuela). Para la determinación de la actividad enzimática se utilizó un kit diagnóstico de telomerasa PCR ELISA (Boehringer Mannheim), el cual contiene todos los reactivos para el análisis, de acuerdo con el método de Kim et al32. Para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizó un equipo GeneAmp PCR System 9600 Thermal Cycler (Pekin Elmer Corporation, Foster City, CA, EE.UU.). Para la purificación de leucocitos, se utilizó Histopaque de una densidad de 1.077 (SIGMA Diagnostics, St. Louis, MO, 63178 EE.UU.). Para las lecturas del enzimoinmunoanálisis se empleó un espectrofotómetro Multiskan MCC/340 (Lab Systems, Helsinki). La actividad de la telomerasa se midió en los leucocitos extraídos de sangre periférica obtenidos como se ha descrito anteriormente. Se determinó la actividad de la enzima por enzimoinmunoanálisis utilizando un ensayo basado en la PCR designado como TRAP (protocolo de amplificación para repeticiones teloméricas) desarrollado por Boehringer Mannheim, el cual es una modificación del método descrito por Kim et al32, en 1994, que se describe brevemente a continuación. En el primer paso, la telomerasa añade repeticiones teloméricas (TTAGGG) al extremo 3´ del oligonucleótido sintético P1-TS marcado con biotina. En un segundo paso, esos productos de elongación son amplificados por PCR usando los oligonucleótidos P1-TS y P2, generando productos de PCR con incrementos específicos de 6 nucleótidos. A diferencia de otros ensayos TRAP, la telomerasa PCR ELISA contiene todos los componentes requeridos para la reacción de la telomerasa y la PCR, en una reacción buffer lista para usar combinando ambas reacciones en unpaso/un-tubo-reacción. A continuación, una alícuota del producto de PCR se somete a desnaturalización y es hibridizada a una digoxigenina-(DIG)-marcada. El producto resultante es inmovilizado en una placa cubierta de estreptavidina a través del oligonucleótido marcado con biotina, incorporado al producto de PCR. Las condiciones de la prueba de detección e hibridación se han optimizado para obtener la mayor sensibilidad y especificidad. Los productos de PCR inmovilizados son luego detectados con un anticuerpo contra la digoxigenina (anti-DIG-POD) que está conjugada a una peroxidasa. Finalmente, el resultado de la prueba es visualizado en virtud de la capacidad de la peroxidasa conjugada para generar un producto de reacción coloreado. Se incorporan controles experimentales positivos y negativos con el fin de demostrar que una señal positiva en el ensayo es indicativa de la presencia de una ribonucleoproteína capaz de extender el oligonucleótido TS con tres o más repeticiones TTAGGG; la incorporación de tales controles valida el ensayo para la detección específica de la actividad de telomerasa. La telomerasa requiere de la integridad de su componente ARN interno para adicionar la secuencias de repeticiones teloméricas al primer específico32. De esa forma, la preincubación de células con RNasa destruiría completamente la actividad de la telomerasa contenida en el extracto y ofrecería un control de especificidad conveniente. Se incuban 5 µl de extracto celular, que corresponden a 5.000 células con RNasa libre de DNasa a una concentración de 1 µg/ml durante 20 min a 37 °C. Para la telomerasa PCR ELISA, se utiliza una alícuota de 1-3 µl del extracto tratado; en nuestro caso utiliza-
mos 2 µl del extracto (correspondiente a 200 células). El control positivo es parte del kit de diagnóstico y está constituido por células inmortalizadas de riñón humano, a una concentración de 1.000 células/µl. El valor de absorbancia obtenido para el control positivo (A450nm-A690nm) fue de 2,364 por encima del valor de 1,5 dado como referencia, lo que validaba el procedimiento realizado. Igualmente se realizaron controles positivos a diferentes diluciones partiendo de la muestra original, obteniéndose absorbancias menores a menores diluciones, indicativo de una menor actividad de la telomerasa, ya que progresivamente se disminuyó la concentración inicial de 1.000 células/µl. Para el control negativo, se obtuvieron valores de absorbancia de 0,055 que están por debajo del valor requerido para asegurar la eliminación de la telomerasa. Preparación de las muestras. Se transfirieron 2 × 105 células por reacción a un tubo de Eppendorf, se centrifugó a 3.000 g durante 10 min a 4 °C, posteriormente se eliminó el sobrenadante, las células se resuspendieron en PBS y se repitió la centrifugación. Se retiró de nuevo cuidadosamente el sobrenadante y se resuspendieron las células en 200 µl de reactivo de lisis; se retropipeteó al menos tres veces y se incubó en hielo durante 30 min, posteriormente se centrifugó el lisado a 16.000 g durante 20 min a 4 °C. Se tomaron 180 ml del sobrenadante y se transfirieron a un tubo limpio que se congeló a –80 °C hasta su utilización. Reacción TRAP. Para cada muestra que debía ser analizada se transfirieron 25 µl de la mezcla de reacción (solución 2 del kit) a un tubo para PCR, se añadieron 2 µl del extracto celular (corresponden a 2.000 células) y se completó hasta 50 µl con agua estéril. Todos los pasos se realizaron en hielo. Posteriormente se transfirieron los tubos a un ciclador térmico en el cual se efectuó la reacción combinada de elongación/amplificación. Hibridación y enzimoinmunoanálisis. Se tomaron 20 µl de reactivo de desnaturalización (solución 3 del kit) y se colocaron en una placa, se agregaron 5 µl del producto de amplificación y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min. Posteriormente se agregaron 225 µl de buffer de hibridación (solución 4 del kit) y se mezcló (todo este proceso se realizó para cada muestra). Se transfirieron 100 µl de la mezcla para una placa suministrada por el kit, se cubrió a fin de prevenir la evaporación y se incubó durante 2 h a 37 °C mientras se agitaba a 300 rpm. Una vez realizada la incubación, se retiró la solución completamente y se lavó con 250 µl de solución buffer (solución 5 del kit) durante 30 s cada una y se retiró el buffer cuidadosamente. Con posterioridad se añadieron 100 µl de anti-DIG-POD (solución 11 del kit), se cubrió la placa y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min mientras se agitaba a 300 rpm. Se retiró la solución completamente, se lavó nuevamente con buffer 5 veces, se retiró el buffer y se agregaron 100 µl de solución TMB (solución 8 del kit), se cubrió la placa y se dejó a temperatura ambiente durante 20 min mientras se agitaba a 300 rpm. Sin retirar el sustrato, se agregaron 100 µl de reactivo con el fin de detener la reacción (solución 9 del kit). Posteriormente con un lector de enzimoinmunoanálisis se midió la absorbancia de las muestras a 450 nm con un valor de referencia de 690 nm dentro de los 30 min después de haber detenido la reacción (A450nm-A690nm). Estos análisis se llevaron a cabo en el Laboratorio de Biología Molecular de Agentes Infecciosos del Instituto de Medicina Experimental (IME) y en el Instituto de Inmunología de la Universidad Central de Venezuela (UCV).
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0,09 Actividad de la telomerasa
Actividad de la telomerasa
0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00
HTA no controlada
0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00
≤ 45 > 45 Grupo de edad (años)
HTA controlada Actividad de la telomerasa
Sanos 0,08
≤ 45 > 45 Grupo de edad (años)
0,10 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00
≤ 45 > 45 Grupo de edad (años)
Fig. 1. Actividad de la telomerasa en pacientes con hipertensión arterial (HTA) controlada, no controlada y normotensos, agrupados por edades.
Resultados La mediana del recuento de leucocitos de los pacientes sanos (n = 11) fue de 8.100 células/µl (IC del 95%, 6.850-8.950) mientras que los pacientes con HTA (n = 20) presentaron una mediana de 23.250 células/µl (IC del 95%, 12.100-32.050), diferencia que es estadísticamente significativa (p ≤ 0,05). Se midió la absorbancia de todas las muestras (tabla 2; figs. 1 y 2) y se calculó la mediana de las mismas en cada grupo obteniéndose los siguientes resultados: para el grupo con HTA controlada y edad menor o igual a 45 años fue de 0,056; para el mismo grupo pero con edad mayor de 45 años fue de 0,081, diferencia estadísticamente significativa (p = 0,00049). Para el grupo de HTA no controlada se obtuvo una mediana de la absorbancia de 0,08 para una edad de 45 años o superior mientras que para los mayores de 45 años fue de 0,0725, con un valor de p ≤ 0,05, diferencia estadísticamente significativa. Finalmente, para el grupo de pacientes sanos (sin HTA), obtuvimos una mediana de la absorbancia de 0,071 para los de edad menor o igual a 45 años y de 0,0725 para los mayores de 45 años, diferencia no significativa (p = 0,79) (fig. 1). Cuando comparamos los grupos con una edad menor o igual a 45 años obtuvimos los siguientes resultados (fig. 2): la absorbancia para el grupo de HTA controlada fue de 0,056, mientras que en el grupo
de HTA no controlada fue de 0,08, siendo la diferencia estadísticamente significativa (p = 0,00032). La absorbancia en el grupo de sujetos sanos fue de 0,071, siendo la diferencia estadísticamente significativa tanto con el grupo con HTA controlada (p = 0,00972) como con el grupo de HTA no controlada (p ≤ 0,05, prueba de Mann-Whitney). Sin embargo, cuando comparamos los grupos de edad mayor de 45 años, encontramos que la
absorbancia en el grupo con HTA controlada fue de 0,081, mientras que en el grupo con HTA no controlada fue de 0,0725, diferencia que no es estadísticamente significativa (p = 0,097). A su vez, la absorbancia en el grupo de sujetos sanos fue de 0,0725, siendo la diferencia estadísticamente significativa con respecto al grupo de HTA controlada (p = 0,0156), pero no fue significativa con respecto al grupo de HTA no controlada (p = 0,81).
TABLA 2 Actividad de la telomerasa de los diferentes grupos estudiados y distribuidos por edad Edad (años)
≤ 45 > 45
HTA controlada (n)
HTA no controlada (n)
Sanos (n)
Mediana (intervalo)
Número
Mediana (intervalo)
Número
Mediana (intervalo)
Número
0,056 (0,05-0,064) 0,081 (0,0725-0,0875)
8 10
0,08 (0,073-0,095) 0,0725 (0,065-0,082)
12 10
0,071 (0,065-0,078) 0,073 (0,065-0,082)
12 10
Los datos se expresann como mediana con el intervalo de confianza del 95%. Análsis de la variancia de Krustal y Wallis (p = 0,015, 5 grados de libertad).
Edad ≤ 45 años 0,10 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00
Edad > 45 años 0,09 Actividad de la telomerasa
Se compararon los grupos utilizando análisis estadísticos no paramétricos (análisis de variancia de Kruskall y Wallis). Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron significativos. Se calculó la mediana con un intervalo de confianza (IC) del 95% por el método de Hodges y Lehman, y se utilizó también la prueba de Mann-Whitney (Wilcoxon). Se empleó el programa EST.exe. del entorno MS WINDOWS 98 (Microsoft, Redmont, EE.UU.).
Actividad de la telomerasa
Análisis estadístico
HTA HTA no PA controlada controlada normal Grupo de pacientes
0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00
HTA HTA no PA controlada controlada normal Grupo de pacientes
Fig. 2. Actividad de la telomerasa en pacientes con edades menores o iguales a 45 años y mayores de 45 años en los diferentes grupos estudiados. *Significación con respecto a hipertensión arterial (HTA) no controlada; **significación con respecto a normotensos. Med Clin (Barc) 2003;120(10):365-9
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Actividad de la telomerasa
0,12 0,11 0,10 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 10
20
30
40 50 60 Edad (años)
Al calcular la mediana de la absorbancia de los grupos sin tener en cuenta la edad, no encontramos diferencias estadísticamente significativas (tabla 3). En la tabla 4 y figura 3 se aprecia que existe una tendencia a la disminución de la actividad de la telomerasa con la edad en todos los grupos estudiados, con ciertas variaciones después de los 40 años de edad. No hubo diferencias estadísticamente significativas al comparar las medianas de la absorbancia entre los grupos divididos según el estadio de la HTA. Iguales resultados se obtuvieron al comparar pacientes con o sin complicaciones de la HTA. Discusión En el presente estudio se aislaron leucocitos de sangre periférica de pacientes con HTA esencial controlada, no controlada y en pacientes sin HTA (sanos). Se lisaron las células y se determinó la actividad de la telomerasa por el método de TABLA 3 Actividad de la telomerasa determinada sin tener en cuenta la edad de los pacientes Grupos
Mediana (intervalo)
HTA controlada 0,07 (0,0635-0,076) HTA no controlada 0,0725 (0,0645-0,082) Normotensos 0,069 (0,0625-0,0755)
Número
18 22 22
Los datos se expresan como mediana con el intervalo de confianza del 95%. Análisis de la variancia de Kruskal y Wallis.
70
80
Fig. 3. Tendencia de la actividad de la telomerasa a disminuir con la edad. La línea indica la curva de regresión determinada por análisis de regresión polinomial. Se incluye a todos los pacientes estudiados.
enzimoinmunoanálisis, después de amplificar por PCR las secuencias elongadas in vitro por la telomerasa presente en los extractos. Se observó que los pacientes con HTA tienen mayor cantidad de leucocitos (p ≤ 0,05) que los individuos sanos. Este hallazgo concuerda con estudios realizados por Schmid-Schonbein et al5, quienes encontraron un aumento significativo del número de leucocitos en ratas hipertensas. Igualmente Gillum y Mussolino3 observaron una asociación entre la presencia de un alto número de leucocitos y la mayor incidencia de HTA; de ahí que se involucre a los mecanismos inmunológicos en la patogenia y complicaciones de la HTA. Otro hallazgo importante fue que la actividad de la telomerasa en los leucocitos de la sangre periférica tuvo tendencia a disminuir con la edad, independientemente de la presencia o no de HTA (tabla 4, fig. 3); sin embargo, esta disminución no fue lineal, en vista de que se detectaron variaciones importantes después de los 40 años de edad, y en algunos casos con una actividad de telomerasa muy baja o ausente. Cuando sólo se determinó la relación entre la edad y la actividad de la telomerasa en los pacientes sanos, se observaron una mayor tendencia de disminución de dicha actividad antes de los 40 años y una mayor variación, incluso con aumento de la actividad, después de los 40 años de edad, lo cual hizo evidente el efecto que tiene la HTA sobre la actividad de la telomerasa (datos no ex-
TABLA 4 Actividad de la telomerasa según la edad de los pacientes HTA controlada (n)
Edad (años)
≤ 30 31-40 41-50 51-60 > 60
Media
Número
0,0535 0,048 0,0758 0,0825 0,0697
2 2 8 2 4
Datos expresados como media.
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HTA no controlada (n) Media
0,0725 0,09 0,0776 0,068 0,07
Sanos (n)
Número
Media
Número
2 6 8 2 4
0,074 0,0686 0,0617 0,0667 0,0745
4 6 4 4 4
puestos). Estos datos concuerdan con el estudio de Iwama et al33, quienes describieron (en pacientes sanos) que el 65% de los sujetos mayores de 40 años tenían una muy baja actividad de la telomerasa en leucocitos, mientras que en el grupo restante no se midió actividad alguna. Todo esto afianza el conocimiento de que el acortamiento del telómero lleva a un envejecimiento celular y se traduce en una menor actividad de la telomerasa (hipótesis telómero-telomerasa). La actividad de la telomerasa fue mayor en los grupos con HTA no controlada (p ≤ 0,05) y en los sanos con edad menor o igual a 45 años, siguiendo la tendencia de una mayor actividad de la telomerasa en pacientes más jóvenes, la cual disminuyó progresivamente con la edad (tabla 2, fig. 1). Así mismo, los pacientes con HTA controlada pertenecientes a este mismo grupo etario tuvieron la menor actividad de la telomerasa (p = 0,0004), inclusive al compararla con los mayores de 45 años. Esta variación pudo deberse al efecto que pudiera tener el tratamiento (dos pacientes recibían captopril, otros dos losartán y 6 enalapril) que recibieron estos pacientes sobre la actividad de la telomerasa, probablemente inhibiendo directa o indirectamente su acción y llevando a una disminución de la proliferación y activación de los leucocitos, y que ésta sea más pronunciada en el grupo de edad con mayor actividad de la misma, como son los pacientes menores de 40 años. Esto concuerda con lo referido por Chisi et al34, quienes encontraron que el tratamiento in vitro e in vivo con el antihipertensivo captopril reduce la tasa proliferativa de una serie de células hematopoyéticas mediante su acción en proteínas críticas para la progresión durante el ciclo celular. Cuando comparamos la actividad de la telomerasa entre los pacientes con HTA controlada, no controlada y sanos (fig. 2), encontramos que en el grupo de edad menor o igual a 45 años la actividad de la telomerasa fue mayor en los pacientes con HTA no controlada. Esto hace pensar que los factores que determinan la aparición de la HTA podrían igualmente activar la expresión de la telomerasa en los leucocitos de sangre periférica de estos pacientes. Alternativamente, la expresión de esta enzima podría ser un acontecimiento posterior una vez instalada la HTA. Sea como causa o efecto, ésta es la primera evidencia experimental que relaciona la HTA esencial con la actividad de la telomerasa a través del sistema inmunológico. Ello plantearía la existencia de un papel del sistema inmune en la patogenia y/o complicaciones de la HTA4-24,27,28. Sin embargo, está aún por estudiar el curso temporal de la activación de la telomerasa en pacientes con HTA con el fin de determi-
TRISTANO A, ET AL. ACTIVIDAD DE LA TELOMERASA EN LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES CON HIPERTENSIÓN ARTERIAL ESENCIAL
nar si tal activación puede ser el resultado de la producción de factores dependientes de la HTA. Otra consideración a tener en cuenta es que si la HTA llevara a un aumento de la actividad de la telomerasa en los leucocitos, y por ende a una proliferación de éstos, podría igualmente conducir a un aumento de la telomerasa en otras células afectadas durante el proceso, como las del endotelio vascular y músculo liso, y por tanto a una hiperproliferación de las mismas y de esa manera participar en la patogenia de la HTA esencial. Chang y Harlery35 presentaron evidencias que apuntan a que otras células del sistema cardiovascular podrían estar involucradas; así encontraron que células endoteliales de los vasos en humanos, como otras células replicativas, presentan una reducción en la longitud del telómero dependiente de la edad35. Por su parte Cao et al37 encontraron un aumento de la actividad de la telomerasa en aorta de ratas hipertensas espontáneas, tanto in vivo como in vitro. La inhibición de la telomerasa produjo en estas ratas una reducción en la proliferación incrementada de las células del músculo liso vascular e indujo apoptosis de las mismas. La apoptosis se redujo al incrementar la expresión de la proteína supresora de tumor p53. A su vez, Minamino y Kourembanas37 describieron que la telomerasa se expresa en células del músculo liso vascular y que el incremento de la actividad de la telomerasa se correlaciona con proliferación de estas células. En otro estudio, Minamino et al38, por medio de la hipoxia crónica, indujeron la proliferación de células musculares lisas y el remodelado de la pared vascular pulmonar, esto como consecuencia del aumento, en estas células, de la actividad de la telomerasa y de la estabilización del telómero. Existen algunas evidencias, basadas en experimentos in vitro, que demuestran que la senescencia de las células del endotelio vascular, mediada por el telómero, puede provocar disfunción endotelial, particularmente en regiones ateroscleróticas. Este efecto puede estar mediado por uno de los pocos factores que aceleran el acortamiento del telómero en estas células y en los leucocitos, como son las moléculas resultantes del estrés oxidativo. A su vez, la inflamación produce un incremento del estrés oxidativo y del recambio de leucocitos. Estas evidencias están en línea con el concepto de que la inflamación es un factor importante que incrementa el riesgo de enfermedad cardiovascular asociado con la edad39. Cuando comparamos la actividad de la telomerasa en los pacientes mayores de 45 años, encontramos muy poca diferencia entre los grupos; sólo hubo diferencia es-
tadísticamente significativa entre el grupo con HTA controlada y los sanos. Sin embargo, como ya hemos señalado, la actividad de la telomerasa es muy variable en este grupo de edad, oscilando entre valores muy bajos a nulos. Al comparar la actividad de la telomerasa en los pacientes con HTA no controlada según el estadio, no encontramos diferencias significativas, lo que plantea la posibilidad de que el grado de HTA no determine el grado de actividad de la telomerasa en los leucocitos y, por tanto, que la relación entre el sistema inmunológico y la HTA se establece independientemente del grado de esta última. Con respecto a los pacientes con complicaciones de la HTA, no se pudo establecer una comparación entre la actividad de la telomerasa y la presencia de complicaciones crónicas de la HTA, dado el bajo número de la muestra en estudio. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Sassone-Corsi P. Molecular clocks: mastering time by gene regulation. Nature 1998;392:871-74. 2. Shen K, De Lano FA, Zweifach BW, SchmidSchonbein GW. Circulating leucocyte counts, activation, and degranulation in Dahl hypertensive rats. Cir Res 1995;76:276-83. 3. Gillum RF, Mussolino ME. White blood cell count and hypertension incidence. The NHANES I epidemiologic follow-up study. J Clin Epidemiol 1994;47:911-9. 4. Bataillard A, Renaudin C, Sassard J. Silica attenuates hypertension in Lyon hypertensive rats. J Hypertens 1995;13:1581-4. 5. Schmid-Schonbein GW, Seiffge D, DeLano FA, Shen K, Zweifach BW. Leucocyte counts and activation in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Hypertension 1991;17:323-30. 6. McCarron RM, Wang L, Siren AL, Spatz M, Hallenbeck JM. Monocyte adhesion to cerebromicrovascular endothelial cells derived from hypertensive and normotensive rats. Am J Physiol 1994; 267:H2491-H7. 7. Clozel M, Kuhn H, Hefti F, Baumgartner HR. Endothelial dysfunction and subendothelial monocyte macrophages in hypertension. Hypertension 1991;18:132-4. 8. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature 1993;362: 801-9. 9. Dorffel Y, Latsch C, Stuhlmuller B, Schreiber S, Scholze S, Burmester GR, et al. Preactivated peripheral blood monocytes in patients with essential hypertension. Hypertension 1999;34:113-7. 10. Beutler B, Cerami A. The common mediator of shock, cachexia and tumor necrosis. Adv Immunol 1988;42:213-32. 11. DeSouza CA, Dengel DR, Macko RF, Cox K, Seals DR. Elevayed levels of circulanting cell adhesion molecules in uncomplicated essential hypertension. J Hypertens 1997;10:1335-41. 12. Hicks C, Breit SN, Penny R. Response of microvascular endothelial cells to biological response modifers. Immunol Cell Biol 1989;67:271-7. 13. Slowik MR, Min W, Ardito T, Karsan A, Kashgarian M, Pober JS. Evidence that tumor necrosis factor triggers apoptosis in human endothelial cells by interleukin-1-converting enzyme-likeprotease-dependent and -independent pathways. Proc Natl Acad Sci USA 1986;83:4533-7. 14. Wick G, Schett G, Amberger A, Kleindienst R, Xu Q. Is atherosclerosis an immunologically mediated disease? Immunol Today 1995;16:27-33. 15. Khraibi AA. Association between disturbances in the immune system and hypertension. Am J Hypertens 1991;4:635-41.
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48.509
Antonio Tristanoa, María Eugenia Cholleta, María L. Willsona, Haroution Adjouniana, María Fernanda Correab y Adolfo Borgesc a
Servicio de Medicina Interna. Hospital Dr. Domingo Luciani. Caracas. Laboratorio de Biología Molecular de Agentes Infecciosos. Universidad Central de Venezuela (UCV). Caracas. c Sección de Biomembranas del Instituto de Medicina Experimental (IME). Universidad Central de Venezuela (UCV). Caracas. Venezuela. b
FUNDAMENTO Y OBJETIVO: La activación primaria o secundaria de mecanismos inmunes, que lleva a una disfunción y/o proliferación de poblaciones celulares específicas, se ha implicado en la patogenia y/o complicaciones de la hipertensión arterial esencial. En vista de que la longitud de los telómeros determina el período de vida de una célula y que se han observado alteraciones replicativas en los leucocitos de sangre periférica de pacientes con hipertensión arterial esencial, investigamos la relación entre la actividad de la telomerasa en los leucocitos de sangre periférica, como un indicador del acortamiento telomérico, y la presencia de hipertensión arterial. PACIENTES Y MÉTODO: Determinamos la actividad de la telomerasa en leucocitos de sangre periférica aislados de controles normales, pacientes con hipertensión esencial controlada y no controlada. Los leucocios de sangre periférica se aislaron por gradiente de densidad, se lisaron y su ADN se amplificó por el método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La actividad de la telomerasa se midió por un ELISA específico. RESULTADOS: El recuento de leucocitos fue significativamente mayor en los pacientes con hipertensión esencial en comparación con el de los individuos sanos (p < 0,05). La actividad de la telomerasa fue significativamente mayor en pacientes menores de 45 años con hipertensión no controlada, comparada con la de los individuos sanos y con los pacientes menores de 45 años con hipertensión controlada (p < 0,05). En este último grupo, la actividad de la telomerasa fue significativamente menor con respecto a los otros dos (p < 0,05). CONCLUSIONES: Nuestros resultados indican que existe una relación entre la actividad de la telomerasa en los leucocitos de sangre periférica, la proliferación de estos leucocitos y la presencia de hipertensión arterial esencial. Palabras clave: Hipertensión arterial. Leucocitos. Telomerasa. Telómero.
Telomerase activity in peripheral blood leucocytes from patients with essential hypertension BACKGROUND AND OBJECTIVE: Primary or secondary activation of the immune mechanisms that lead to proliferation and dysfunction of specific cellular groups appears to be involved in the pathogenesis and complications of essential hypertension. In view of the evidence that, on one hand, telomeric length determines the replicative capacity and life span of cells and, on the other hand, idiopathic hypertensive patients have peripheral white cell replicative disorders, we decided to investigate the relationship between the influence of telomerase activity in peripheral leukocytes as an indirect marker of telomeric length and the presence of arterial hypertension. PATIENTS AND METHOD: Telomerase activity in peripheral white blood cells was measured in healthy individuals, in effectively treated hypertensive patients and in a non-well controlled hypertensive group. White blood cells were separated through a density gradient, then lysed and their DNA amplified by a polimerase chain reaction (PCR). Telomerase activity was determined with an ELISA specific kit. RESULTS: The white blood cell count was higher in the hypertensive than the control group (p < 0.05). Telomerase activity was positive in all three groups but higher in patients under 45 yearold with bad controlled hypertension as compared with healthy individuals and patients under 45 year-old with well controlled hypertension (p < 0.05); in the latter group, telomerase activity was significantly lower than in the other groups (p < 0.05). CONCLUSIONS: Our results indicate that there exists a relationship between telomerase activity in peripheral leukocytes, the proliferation of these white blood cells and the presence of essential arterial hypertension. Key words: Arterial hypertension. Leukocytes. Telomerase. Telomere.
Correspondencia: Dr. A. Tristano. Poba International, 1-20255. P.O. Box 02.5255. Miami. Florida. 33102-5255 USA. Correo electrónico: [email protected] Recibido el 24-5-2002; aceptado para su publicación el 26-11-2002.
Se han involucrado mecanismos inmunes en la patogenia de la enfermedad hipertensiva, implicando tanto a la inmunidad celular como a la humoral1. Los leucocitos han sido objeto de gran interés en estudios sobre la patogenia de la hipertensión arterial (HTA)2. Se ha encontrado una asociación entre un número alto de leucocitos y mayor incidencia de hipertensión3-5. Igualmente, se ha demostrado un incremento de la adhesión de los leucocitos a la pared endotelial6-11 y el papel de las citocinas, tales como la interleucina 1 beta (IL-1β), interleucina 6 (IL-6) y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) en el desarrollo de la aterosclerosis12-14. También se han encontrado alteraciones de la inmunidad humoral y del sistema del complemento en pacientes con HTA, principalmente hipergammaglobulinemia15-28. Por otro lado, existen evidencias experimentales que apuntan a que un reloj biológico, el telómero, podría desempeñar un papel crítico en el control del lapso de vida celular in vitro y probablemente in vivo. Los telómeros son estructuras especializadas que se encuentran al final de los cromosomas de células eucariotas y actúan en la protección de los genes localizados en regiones subteloméricas y en el posicionamiento y replicación de los cromosomas. La hipótesis telomérica del envejecimiento celular podría explicar la enigmática expresión de la HTA esencial, incluyendo la dependencia que ésta tiene con la edad y su expresión fenotípica inestable. Los individuos que heredan telómeros acortados son más propensos a desarrollar en edades más jóvenes disfunciones relacionadas con el acortamiento del telómero, incluyendo la expresión de variaciones genéticas que causan HTA28-30. Ya sea de forma primaria o secundaria, el acortamiento telomérico puede formar parte del curso clínico de la HTA esencial, bien sea aumentando la presión arterial o acelerando el envejecimiento mediado por la hipertensión de los órganos implicados en la patogenia de ese trastorno. Med Clin (Barc) 2003;120(10):365-9
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TRISTANO A, ET AL. ACTIVIDAD DE LA TELOMERASA EN LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES CON HIPERTENSIÓN ARTERIAL ESENCIAL
Las evidencias presentadas constituyen pruebas sólidas de que en la HTA aumenta la tasa de recambio de tipos celulares específicos, incluyendo los leucocitos de sangre periférica, y que dentro de la fisiopatología de la HTA hay anomalías inmunológicas como resultado de la disfunción y/o proliferación de poblaciones celulares específicas. En vista de que los telómeros de las células con potencial replicativo se acortan con la edad y de que se han observado alteraciones replicativas en células de sangre periférica en individuos hipertensos, estudiamos si la actividad de la telomerasa (como marcador de la longitud telomérica) en los leucocitos de sangre periférica de individuos con HTA esencial difería de la encontrada en leucocitos de individuos normotensos. Pacientes y método Pacientes Se tomaron 31 voluntarios, divididos en tres grupos: 9 con HTA esencial controlada (4 mujeres y 5 varones); 11 con HTA esencial no controlada (9 mujeres y dos varones), y 11 controles sanos (5 mujeres y 6 varones); todos fueron divididos en grupos etarios (tabla 1). Los sujetos hipertensos fueron reclutados de la consulta externa de Medicina Interna del Hospital Dr. Domingo Luciani de Caracas (Venezuela), mientras que los sujetos sanos fueron escogidos entre el personal que trabaja en la institución. Se elaboró una ficha para la recolección de datos de todos los sujetos que participaron en el proyecto previa autorización escrita de los mismos. El criterio para diagnosticar HTA esencial fue una cifra de presión arterial sistólica igual o superior a 140 mmHg y/o una presión diastólica igual o superior a 90 mm Hg31, determinada mediante un esfigmomanómetro de mercurio (ALP K2); siempre se usó el mismo instrumento para todos los sujetos. El diagnóstico de HTA se realizó después de dos lecturas de presión arterial en dos visitas sucesivas, tras la valoración inicial31. Para la lectura de la presión arterial el paciente se colocó sentado en una silla con soporte para los brazos, situados éstos a nivel del corazón. No debía haber ingerido café ni fumado por lo menos 30 min antes de la lectura. La lectura se realizó después de 5 min de reposo. Se utilizó un manguito adecuado a la circunferencia del brazo, que cubrió al menos el 80% del mismo. Los pacientes hipertensos no controlados se clasificaron según valor de la presión arterial en estadios 1 (n = 3), 2 (n = 3) y 3 (n = 5)31. Se excluyeron los pacientes con diabetes mellitus, enfermedad arterial coronaria, enfermedad cerebrovascular, neoplasias y enfermedad arterial obstructiva. Los pacientes seleccionados fueron aquellos que no tenían diagnóstico previo o hipertensos con y sin tratamiento. A todos los sujetos se les practicaron un examen de orina, determinación de urea y creatinina, electrocardiograma (ECG), radiografía de tórax posteroanterior y examen de fondo de ojo, para determinar el grado de lesión en los órganos diana. Método Se tomaron 10 ml de sangre de cada sujeto usando una inyectadora heparinizada y la muestra se colocó de inmediato en hielo. Se tomaron 8 ml de cada muestra y se colocaron en un tubo estéril; a cada uno de estos tubos se le añadieron 6 ml de Histopaque y fueron centrifugados a 2.500 rpm durante 30 min. Una vez obtenida la separación de los diferentes grupos celulares, se procedió a tomar la capa de leucocitos, que se transfirió a un nuevo tubo estéril. Se agregó a cada tubo 1 ml de solución salina buffer fosfato (PBS) y se procedió a una nueva centrifugación durante 5 min a 2.500 rpm. Posteriormente se descartó el sobrenadante y se resuspendió. Se realizó el recuento de células de
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Med Clin (Barc) 2003;120(10):365-9
TABLA 1 Distribución de los pacientes según grupos de edades Edad (años)
HTA no controlada (n)
HTA controlada (n)
Normotensos (n)
Total (n)
6 5 11
4 5 9
6 5 11
16 15 31
≤ 45 > 45 Total HTA: hipertensión arterial.
cada muestra en un hemocitómetro y los leucocitos se colocaron luego en microtubos de centrífuga de 1,5 ml de capacidad, libres de DNasa y RNasa y congelados a –80 °C. Todo este procedimiento se realizó en el Laboratorio del Banco de Sangre del Hospital Dr. Domingo Luciani de Caracas (Venezuela). Para la determinación de la actividad enzimática se utilizó un kit diagnóstico de telomerasa PCR ELISA (Boehringer Mannheim), el cual contiene todos los reactivos para el análisis, de acuerdo con el método de Kim et al32. Para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizó un equipo GeneAmp PCR System 9600 Thermal Cycler (Pekin Elmer Corporation, Foster City, CA, EE.UU.). Para la purificación de leucocitos, se utilizó Histopaque de una densidad de 1.077 (SIGMA Diagnostics, St. Louis, MO, 63178 EE.UU.). Para las lecturas del enzimoinmunoanálisis se empleó un espectrofotómetro Multiskan MCC/340 (Lab Systems, Helsinki). La actividad de la telomerasa se midió en los leucocitos extraídos de sangre periférica obtenidos como se ha descrito anteriormente. Se determinó la actividad de la enzima por enzimoinmunoanálisis utilizando un ensayo basado en la PCR designado como TRAP (protocolo de amplificación para repeticiones teloméricas) desarrollado por Boehringer Mannheim, el cual es una modificación del método descrito por Kim et al32, en 1994, que se describe brevemente a continuación. En el primer paso, la telomerasa añade repeticiones teloméricas (TTAGGG) al extremo 3´ del oligonucleótido sintético P1-TS marcado con biotina. En un segundo paso, esos productos de elongación son amplificados por PCR usando los oligonucleótidos P1-TS y P2, generando productos de PCR con incrementos específicos de 6 nucleótidos. A diferencia de otros ensayos TRAP, la telomerasa PCR ELISA contiene todos los componentes requeridos para la reacción de la telomerasa y la PCR, en una reacción buffer lista para usar combinando ambas reacciones en unpaso/un-tubo-reacción. A continuación, una alícuota del producto de PCR se somete a desnaturalización y es hibridizada a una digoxigenina-(DIG)-marcada. El producto resultante es inmovilizado en una placa cubierta de estreptavidina a través del oligonucleótido marcado con biotina, incorporado al producto de PCR. Las condiciones de la prueba de detección e hibridación se han optimizado para obtener la mayor sensibilidad y especificidad. Los productos de PCR inmovilizados son luego detectados con un anticuerpo contra la digoxigenina (anti-DIG-POD) que está conjugada a una peroxidasa. Finalmente, el resultado de la prueba es visualizado en virtud de la capacidad de la peroxidasa conjugada para generar un producto de reacción coloreado. Se incorporan controles experimentales positivos y negativos con el fin de demostrar que una señal positiva en el ensayo es indicativa de la presencia de una ribonucleoproteína capaz de extender el oligonucleótido TS con tres o más repeticiones TTAGGG; la incorporación de tales controles valida el ensayo para la detección específica de la actividad de telomerasa. La telomerasa requiere de la integridad de su componente ARN interno para adicionar la secuencias de repeticiones teloméricas al primer específico32. De esa forma, la preincubación de células con RNasa destruiría completamente la actividad de la telomerasa contenida en el extracto y ofrecería un control de especificidad conveniente. Se incuban 5 µl de extracto celular, que corresponden a 5.000 células con RNasa libre de DNasa a una concentración de 1 µg/ml durante 20 min a 37 °C. Para la telomerasa PCR ELISA, se utiliza una alícuota de 1-3 µl del extracto tratado; en nuestro caso utiliza-
mos 2 µl del extracto (correspondiente a 200 células). El control positivo es parte del kit de diagnóstico y está constituido por células inmortalizadas de riñón humano, a una concentración de 1.000 células/µl. El valor de absorbancia obtenido para el control positivo (A450nm-A690nm) fue de 2,364 por encima del valor de 1,5 dado como referencia, lo que validaba el procedimiento realizado. Igualmente se realizaron controles positivos a diferentes diluciones partiendo de la muestra original, obteniéndose absorbancias menores a menores diluciones, indicativo de una menor actividad de la telomerasa, ya que progresivamente se disminuyó la concentración inicial de 1.000 células/µl. Para el control negativo, se obtuvieron valores de absorbancia de 0,055 que están por debajo del valor requerido para asegurar la eliminación de la telomerasa. Preparación de las muestras. Se transfirieron 2 × 105 células por reacción a un tubo de Eppendorf, se centrifugó a 3.000 g durante 10 min a 4 °C, posteriormente se eliminó el sobrenadante, las células se resuspendieron en PBS y se repitió la centrifugación. Se retiró de nuevo cuidadosamente el sobrenadante y se resuspendieron las células en 200 µl de reactivo de lisis; se retropipeteó al menos tres veces y se incubó en hielo durante 30 min, posteriormente se centrifugó el lisado a 16.000 g durante 20 min a 4 °C. Se tomaron 180 ml del sobrenadante y se transfirieron a un tubo limpio que se congeló a –80 °C hasta su utilización. Reacción TRAP. Para cada muestra que debía ser analizada se transfirieron 25 µl de la mezcla de reacción (solución 2 del kit) a un tubo para PCR, se añadieron 2 µl del extracto celular (corresponden a 2.000 células) y se completó hasta 50 µl con agua estéril. Todos los pasos se realizaron en hielo. Posteriormente se transfirieron los tubos a un ciclador térmico en el cual se efectuó la reacción combinada de elongación/amplificación. Hibridación y enzimoinmunoanálisis. Se tomaron 20 µl de reactivo de desnaturalización (solución 3 del kit) y se colocaron en una placa, se agregaron 5 µl del producto de amplificación y se incubó a temperatura ambiente durante 10 min. Posteriormente se agregaron 225 µl de buffer de hibridación (solución 4 del kit) y se mezcló (todo este proceso se realizó para cada muestra). Se transfirieron 100 µl de la mezcla para una placa suministrada por el kit, se cubrió a fin de prevenir la evaporación y se incubó durante 2 h a 37 °C mientras se agitaba a 300 rpm. Una vez realizada la incubación, se retiró la solución completamente y se lavó con 250 µl de solución buffer (solución 5 del kit) durante 30 s cada una y se retiró el buffer cuidadosamente. Con posterioridad se añadieron 100 µl de anti-DIG-POD (solución 11 del kit), se cubrió la placa y se incubó a temperatura ambiente durante 30 min mientras se agitaba a 300 rpm. Se retiró la solución completamente, se lavó nuevamente con buffer 5 veces, se retiró el buffer y se agregaron 100 µl de solución TMB (solución 8 del kit), se cubrió la placa y se dejó a temperatura ambiente durante 20 min mientras se agitaba a 300 rpm. Sin retirar el sustrato, se agregaron 100 µl de reactivo con el fin de detener la reacción (solución 9 del kit). Posteriormente con un lector de enzimoinmunoanálisis se midió la absorbancia de las muestras a 450 nm con un valor de referencia de 690 nm dentro de los 30 min después de haber detenido la reacción (A450nm-A690nm). Estos análisis se llevaron a cabo en el Laboratorio de Biología Molecular de Agentes Infecciosos del Instituto de Medicina Experimental (IME) y en el Instituto de Inmunología de la Universidad Central de Venezuela (UCV).
TRISTANO A, ET AL. ACTIVIDAD DE LA TELOMERASA EN LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES CON HIPERTENSIÓN ARTERIAL ESENCIAL
0,09 Actividad de la telomerasa
Actividad de la telomerasa
0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00
HTA no controlada
0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00
≤ 45 > 45 Grupo de edad (años)
HTA controlada Actividad de la telomerasa
Sanos 0,08
≤ 45 > 45 Grupo de edad (años)
0,10 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00
≤ 45 > 45 Grupo de edad (años)
Fig. 1. Actividad de la telomerasa en pacientes con hipertensión arterial (HTA) controlada, no controlada y normotensos, agrupados por edades.
Resultados La mediana del recuento de leucocitos de los pacientes sanos (n = 11) fue de 8.100 células/µl (IC del 95%, 6.850-8.950) mientras que los pacientes con HTA (n = 20) presentaron una mediana de 23.250 células/µl (IC del 95%, 12.100-32.050), diferencia que es estadísticamente significativa (p ≤ 0,05). Se midió la absorbancia de todas las muestras (tabla 2; figs. 1 y 2) y se calculó la mediana de las mismas en cada grupo obteniéndose los siguientes resultados: para el grupo con HTA controlada y edad menor o igual a 45 años fue de 0,056; para el mismo grupo pero con edad mayor de 45 años fue de 0,081, diferencia estadísticamente significativa (p = 0,00049). Para el grupo de HTA no controlada se obtuvo una mediana de la absorbancia de 0,08 para una edad de 45 años o superior mientras que para los mayores de 45 años fue de 0,0725, con un valor de p ≤ 0,05, diferencia estadísticamente significativa. Finalmente, para el grupo de pacientes sanos (sin HTA), obtuvimos una mediana de la absorbancia de 0,071 para los de edad menor o igual a 45 años y de 0,0725 para los mayores de 45 años, diferencia no significativa (p = 0,79) (fig. 1). Cuando comparamos los grupos con una edad menor o igual a 45 años obtuvimos los siguientes resultados (fig. 2): la absorbancia para el grupo de HTA controlada fue de 0,056, mientras que en el grupo
de HTA no controlada fue de 0,08, siendo la diferencia estadísticamente significativa (p = 0,00032). La absorbancia en el grupo de sujetos sanos fue de 0,071, siendo la diferencia estadísticamente significativa tanto con el grupo con HTA controlada (p = 0,00972) como con el grupo de HTA no controlada (p ≤ 0,05, prueba de Mann-Whitney). Sin embargo, cuando comparamos los grupos de edad mayor de 45 años, encontramos que la
absorbancia en el grupo con HTA controlada fue de 0,081, mientras que en el grupo con HTA no controlada fue de 0,0725, diferencia que no es estadísticamente significativa (p = 0,097). A su vez, la absorbancia en el grupo de sujetos sanos fue de 0,0725, siendo la diferencia estadísticamente significativa con respecto al grupo de HTA controlada (p = 0,0156), pero no fue significativa con respecto al grupo de HTA no controlada (p = 0,81).
TABLA 2 Actividad de la telomerasa de los diferentes grupos estudiados y distribuidos por edad Edad (años)
≤ 45 > 45
HTA controlada (n)
HTA no controlada (n)
Sanos (n)
Mediana (intervalo)
Número
Mediana (intervalo)
Número
Mediana (intervalo)
Número
0,056 (0,05-0,064) 0,081 (0,0725-0,0875)
8 10
0,08 (0,073-0,095) 0,0725 (0,065-0,082)
12 10
0,071 (0,065-0,078) 0,073 (0,065-0,082)
12 10
Los datos se expresann como mediana con el intervalo de confianza del 95%. Análsis de la variancia de Krustal y Wallis (p = 0,015, 5 grados de libertad).
Edad ≤ 45 años 0,10 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00
Edad > 45 años 0,09 Actividad de la telomerasa
Se compararon los grupos utilizando análisis estadísticos no paramétricos (análisis de variancia de Kruskall y Wallis). Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron significativos. Se calculó la mediana con un intervalo de confianza (IC) del 95% por el método de Hodges y Lehman, y se utilizó también la prueba de Mann-Whitney (Wilcoxon). Se empleó el programa EST.exe. del entorno MS WINDOWS 98 (Microsoft, Redmont, EE.UU.).
Actividad de la telomerasa
Análisis estadístico
HTA HTA no PA controlada controlada normal Grupo de pacientes
0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,00
HTA HTA no PA controlada controlada normal Grupo de pacientes
Fig. 2. Actividad de la telomerasa en pacientes con edades menores o iguales a 45 años y mayores de 45 años en los diferentes grupos estudiados. *Significación con respecto a hipertensión arterial (HTA) no controlada; **significación con respecto a normotensos. Med Clin (Barc) 2003;120(10):365-9
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TRISTANO A, ET AL. ACTIVIDAD DE LA TELOMERASA EN LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES CON HIPERTENSIÓN ARTERIAL ESENCIAL
Actividad de la telomerasa
0,12 0,11 0,10 0,09 0,08 0,07 0,06 0,05 0,04 10
20
30
40 50 60 Edad (años)
Al calcular la mediana de la absorbancia de los grupos sin tener en cuenta la edad, no encontramos diferencias estadísticamente significativas (tabla 3). En la tabla 4 y figura 3 se aprecia que existe una tendencia a la disminución de la actividad de la telomerasa con la edad en todos los grupos estudiados, con ciertas variaciones después de los 40 años de edad. No hubo diferencias estadísticamente significativas al comparar las medianas de la absorbancia entre los grupos divididos según el estadio de la HTA. Iguales resultados se obtuvieron al comparar pacientes con o sin complicaciones de la HTA. Discusión En el presente estudio se aislaron leucocitos de sangre periférica de pacientes con HTA esencial controlada, no controlada y en pacientes sin HTA (sanos). Se lisaron las células y se determinó la actividad de la telomerasa por el método de TABLA 3 Actividad de la telomerasa determinada sin tener en cuenta la edad de los pacientes Grupos
Mediana (intervalo)
HTA controlada 0,07 (0,0635-0,076) HTA no controlada 0,0725 (0,0645-0,082) Normotensos 0,069 (0,0625-0,0755)
Número
18 22 22
Los datos se expresan como mediana con el intervalo de confianza del 95%. Análisis de la variancia de Kruskal y Wallis.
70
80
Fig. 3. Tendencia de la actividad de la telomerasa a disminuir con la edad. La línea indica la curva de regresión determinada por análisis de regresión polinomial. Se incluye a todos los pacientes estudiados.
enzimoinmunoanálisis, después de amplificar por PCR las secuencias elongadas in vitro por la telomerasa presente en los extractos. Se observó que los pacientes con HTA tienen mayor cantidad de leucocitos (p ≤ 0,05) que los individuos sanos. Este hallazgo concuerda con estudios realizados por Schmid-Schonbein et al5, quienes encontraron un aumento significativo del número de leucocitos en ratas hipertensas. Igualmente Gillum y Mussolino3 observaron una asociación entre la presencia de un alto número de leucocitos y la mayor incidencia de HTA; de ahí que se involucre a los mecanismos inmunológicos en la patogenia y complicaciones de la HTA. Otro hallazgo importante fue que la actividad de la telomerasa en los leucocitos de la sangre periférica tuvo tendencia a disminuir con la edad, independientemente de la presencia o no de HTA (tabla 4, fig. 3); sin embargo, esta disminución no fue lineal, en vista de que se detectaron variaciones importantes después de los 40 años de edad, y en algunos casos con una actividad de telomerasa muy baja o ausente. Cuando sólo se determinó la relación entre la edad y la actividad de la telomerasa en los pacientes sanos, se observaron una mayor tendencia de disminución de dicha actividad antes de los 40 años y una mayor variación, incluso con aumento de la actividad, después de los 40 años de edad, lo cual hizo evidente el efecto que tiene la HTA sobre la actividad de la telomerasa (datos no ex-
TABLA 4 Actividad de la telomerasa según la edad de los pacientes HTA controlada (n)
Edad (años)
≤ 30 31-40 41-50 51-60 > 60
Media
Número
0,0535 0,048 0,0758 0,0825 0,0697
2 2 8 2 4
Datos expresados como media.
368
Med Clin (Barc) 2003;120(10):365-9
HTA no controlada (n) Media
0,0725 0,09 0,0776 0,068 0,07
Sanos (n)
Número
Media
Número
2 6 8 2 4
0,074 0,0686 0,0617 0,0667 0,0745
4 6 4 4 4
puestos). Estos datos concuerdan con el estudio de Iwama et al33, quienes describieron (en pacientes sanos) que el 65% de los sujetos mayores de 40 años tenían una muy baja actividad de la telomerasa en leucocitos, mientras que en el grupo restante no se midió actividad alguna. Todo esto afianza el conocimiento de que el acortamiento del telómero lleva a un envejecimiento celular y se traduce en una menor actividad de la telomerasa (hipótesis telómero-telomerasa). La actividad de la telomerasa fue mayor en los grupos con HTA no controlada (p ≤ 0,05) y en los sanos con edad menor o igual a 45 años, siguiendo la tendencia de una mayor actividad de la telomerasa en pacientes más jóvenes, la cual disminuyó progresivamente con la edad (tabla 2, fig. 1). Así mismo, los pacientes con HTA controlada pertenecientes a este mismo grupo etario tuvieron la menor actividad de la telomerasa (p = 0,0004), inclusive al compararla con los mayores de 45 años. Esta variación pudo deberse al efecto que pudiera tener el tratamiento (dos pacientes recibían captopril, otros dos losartán y 6 enalapril) que recibieron estos pacientes sobre la actividad de la telomerasa, probablemente inhibiendo directa o indirectamente su acción y llevando a una disminución de la proliferación y activación de los leucocitos, y que ésta sea más pronunciada en el grupo de edad con mayor actividad de la misma, como son los pacientes menores de 40 años. Esto concuerda con lo referido por Chisi et al34, quienes encontraron que el tratamiento in vitro e in vivo con el antihipertensivo captopril reduce la tasa proliferativa de una serie de células hematopoyéticas mediante su acción en proteínas críticas para la progresión durante el ciclo celular. Cuando comparamos la actividad de la telomerasa entre los pacientes con HTA controlada, no controlada y sanos (fig. 2), encontramos que en el grupo de edad menor o igual a 45 años la actividad de la telomerasa fue mayor en los pacientes con HTA no controlada. Esto hace pensar que los factores que determinan la aparición de la HTA podrían igualmente activar la expresión de la telomerasa en los leucocitos de sangre periférica de estos pacientes. Alternativamente, la expresión de esta enzima podría ser un acontecimiento posterior una vez instalada la HTA. Sea como causa o efecto, ésta es la primera evidencia experimental que relaciona la HTA esencial con la actividad de la telomerasa a través del sistema inmunológico. Ello plantearía la existencia de un papel del sistema inmune en la patogenia y/o complicaciones de la HTA4-24,27,28. Sin embargo, está aún por estudiar el curso temporal de la activación de la telomerasa en pacientes con HTA con el fin de determi-
TRISTANO A, ET AL. ACTIVIDAD DE LA TELOMERASA EN LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA DE PACIENTES CON HIPERTENSIÓN ARTERIAL ESENCIAL
nar si tal activación puede ser el resultado de la producción de factores dependientes de la HTA. Otra consideración a tener en cuenta es que si la HTA llevara a un aumento de la actividad de la telomerasa en los leucocitos, y por ende a una proliferación de éstos, podría igualmente conducir a un aumento de la telomerasa en otras células afectadas durante el proceso, como las del endotelio vascular y músculo liso, y por tanto a una hiperproliferación de las mismas y de esa manera participar en la patogenia de la HTA esencial. Chang y Harlery35 presentaron evidencias que apuntan a que otras células del sistema cardiovascular podrían estar involucradas; así encontraron que células endoteliales de los vasos en humanos, como otras células replicativas, presentan una reducción en la longitud del telómero dependiente de la edad35. Por su parte Cao et al37 encontraron un aumento de la actividad de la telomerasa en aorta de ratas hipertensas espontáneas, tanto in vivo como in vitro. La inhibición de la telomerasa produjo en estas ratas una reducción en la proliferación incrementada de las células del músculo liso vascular e indujo apoptosis de las mismas. La apoptosis se redujo al incrementar la expresión de la proteína supresora de tumor p53. A su vez, Minamino y Kourembanas37 describieron que la telomerasa se expresa en células del músculo liso vascular y que el incremento de la actividad de la telomerasa se correlaciona con proliferación de estas células. En otro estudio, Minamino et al38, por medio de la hipoxia crónica, indujeron la proliferación de células musculares lisas y el remodelado de la pared vascular pulmonar, esto como consecuencia del aumento, en estas células, de la actividad de la telomerasa y de la estabilización del telómero. Existen algunas evidencias, basadas en experimentos in vitro, que demuestran que la senescencia de las células del endotelio vascular, mediada por el telómero, puede provocar disfunción endotelial, particularmente en regiones ateroscleróticas. Este efecto puede estar mediado por uno de los pocos factores que aceleran el acortamiento del telómero en estas células y en los leucocitos, como son las moléculas resultantes del estrés oxidativo. A su vez, la inflamación produce un incremento del estrés oxidativo y del recambio de leucocitos. Estas evidencias están en línea con el concepto de que la inflamación es un factor importante que incrementa el riesgo de enfermedad cardiovascular asociado con la edad39. Cuando comparamos la actividad de la telomerasa en los pacientes mayores de 45 años, encontramos muy poca diferencia entre los grupos; sólo hubo diferencia es-
tadísticamente significativa entre el grupo con HTA controlada y los sanos. Sin embargo, como ya hemos señalado, la actividad de la telomerasa es muy variable en este grupo de edad, oscilando entre valores muy bajos a nulos. Al comparar la actividad de la telomerasa en los pacientes con HTA no controlada según el estadio, no encontramos diferencias significativas, lo que plantea la posibilidad de que el grado de HTA no determine el grado de actividad de la telomerasa en los leucocitos y, por tanto, que la relación entre el sistema inmunológico y la HTA se establece independientemente del grado de esta última. Con respecto a los pacientes con complicaciones de la HTA, no se pudo establecer una comparación entre la actividad de la telomerasa y la presencia de complicaciones crónicas de la HTA, dado el bajo número de la muestra en estudio. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Sassone-Corsi P. Molecular clocks: mastering time by gene regulation. Nature 1998;392:871-74. 2. Shen K, De Lano FA, Zweifach BW, SchmidSchonbein GW. Circulating leucocyte counts, activation, and degranulation in Dahl hypertensive rats. Cir Res 1995;76:276-83. 3. Gillum RF, Mussolino ME. White blood cell count and hypertension incidence. The NHANES I epidemiologic follow-up study. J Clin Epidemiol 1994;47:911-9. 4. Bataillard A, Renaudin C, Sassard J. Silica attenuates hypertension in Lyon hypertensive rats. J Hypertens 1995;13:1581-4. 5. Schmid-Schonbein GW, Seiffge D, DeLano FA, Shen K, Zweifach BW. Leucocyte counts and activation in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Hypertension 1991;17:323-30. 6. McCarron RM, Wang L, Siren AL, Spatz M, Hallenbeck JM. Monocyte adhesion to cerebromicrovascular endothelial cells derived from hypertensive and normotensive rats. Am J Physiol 1994; 267:H2491-H7. 7. Clozel M, Kuhn H, Hefti F, Baumgartner HR. Endothelial dysfunction and subendothelial monocyte macrophages in hypertension. Hypertension 1991;18:132-4. 8. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature 1993;362: 801-9. 9. Dorffel Y, Latsch C, Stuhlmuller B, Schreiber S, Scholze S, Burmester GR, et al. Preactivated peripheral blood monocytes in patients with essential hypertension. Hypertension 1999;34:113-7. 10. Beutler B, Cerami A. The common mediator of shock, cachexia and tumor necrosis. Adv Immunol 1988;42:213-32. 11. DeSouza CA, Dengel DR, Macko RF, Cox K, Seals DR. Elevayed levels of circulanting cell adhesion molecules in uncomplicated essential hypertension. J Hypertens 1997;10:1335-41. 12. Hicks C, Breit SN, Penny R. Response of microvascular endothelial cells to biological response modifers. Immunol Cell Biol 1989;67:271-7. 13. Slowik MR, Min W, Ardito T, Karsan A, Kashgarian M, Pober JS. Evidence that tumor necrosis factor triggers apoptosis in human endothelial cells by interleukin-1-converting enzyme-likeprotease-dependent and -independent pathways. Proc Natl Acad Sci USA 1986;83:4533-7. 14. Wick G, Schett G, Amberger A, Kleindienst R, Xu Q. Is atherosclerosis an immunologically mediated disease? Immunol Today 1995;16:27-33. 15. Khraibi AA. Association between disturbances in the immune system and hypertension. Am J Hypertens 1991;4:635-41.
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