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Analyse par titrimétrie et par microscopie électronique de la structure moléculaire des lipoprotéines après dissection enzymatique
BIOCHIMIE, 1974, 56, 255-262.
Analyse par titrimdtrie et par microscopie dlectronique de la structure moldculaire des lipoprotdines aprbs dissection enzymatique R. HADDAM ( ' ) , R. HELIO et D. G. DERVlCHIAN ( ' ) . I n s t i t u t P a s t e u r , 75015 Paris.
Summartj. - - Each of the three classes of lipoproteins (high, low and very low density) has been submitted systematically to the action of pronase, lipase and phospholipase A, in different orders of succession. This was to show the accessibility of the different components of the lipoproteins and to get information on the structure of their particles. The resulting effects have been examined in a parallel way both by potentiometric titration and by electron microscopy. With the HDL and LDL, triglycerides become accessible to lipase only after hydrolysis of the protein component. The protein and phospholipid components are directly accessible to their respective enzymes. Removal of the protein and of the phospholipids produces a more or less irregular increase of the size of the particles, as if there was a coalescence of the remnant components. With the VLDL, triglycerides are directly accessible to lipase and their behaviour makes them more comparable to ordinary emulsions.
INTRODUCTION. Si l'on c o n n a i t a c t u e l l e m e n t la c o m p o s i t i o n des diff6rentes classes de lipoprot6ines s6riques h u m a i n e s , leur s t r u c t u r e h l'6chelle mol6culaire, c'est-h-dire l ' o r g a n i s a t i o n des diff6rentes moldcules des c o n s t i t u a n t s au sein de la particule lipoprotdique, n'est pas 6tablie et d e m e u r e l'objet d'hypothbses. Plusieurs auteurs ont d6jh abordd ce probl6me p a r diff6rentes mdthodes. P a r microscopic 61ectronique [1], p a r spectroscopic de tluorescence [21, p a r d i s p e r s i o n optique rotatoire et d i c h r o i s m e c i r c u l a i r e [3, 4], p a r r6sonance magndtique nucl6aire [5]. P o u r des revues g6ndrales, voir R. B. Leslie [6] et A. M. Scanu et C. W i s d o m [71. Mais il n'existe pas de preuves exp6r i m e n t a l e s directes et prdcises des diff6rentes structures qui ont 6t6 propos6es. Le pr6sent travail n ' a pas la p r 6 t e n t i o n d ' a p p o r ter u n e d d m o n s t r a t i o n plus directe. I1 f o u r n i t c e p e n d a n t des r e n s e i g n e m e n t s c o m p l 6 m e n t a i r e s obtenus p a r u n e sorte de dissection e n z y m a l i q u e des lipoprotdines. Chaque type de p a r t i c u l e a 6td soumis h Faction des diff6rents enzymes sp6cifiques de ses p r i n c i p a u x constituants, prol6ase, lipase, phospholipase. De semblables 6tudes ont d6jh 6t6 effectu6es. D6jh en i947, T a y e a u et Breton I8] avait fait agir la t r y p s i n e sur le s6rum et montr6 que ]a d61ipidation favorisait l ' h y d r o l y s e des prot6ines. Camejo [9] a montr6 que l ' a p o p r o t 6 i n e des lipopro(*) Adresse aetuelle : Laboratoire de Physlologie G6n6rale, Universit~ Paris VI, 9, quai Saint Bernard, 75005 Paris.
t6ines lourdes (HDL) est aussi bien accessible h la t r y p s i n e lorsque les p a r t i c u l e s sont intactes que si elles ont 6t6 p r 6 a l a b l e m e n t d61ipid6es. E n u t i l ' s a n t la p h o s p h o l i p a s e A, il a trouv6 que la presque totalit6 des p h o s p h o l i p i d e s sont h y d r o lys6es. A s h w o r t h et Green [10] ont trouv6 que l ' h y d r o l y s e prot6ique des HDI. p e r m e t t a i t d'extraire u n e quantit6 i m p o r t a n t e des lipides neutres p a r l'6ther et que la p h o s p h o l i p a s e D pent lib6rer pr6s de 90 p. cent de la choline pr6sente dans cette m6me classe de lipoprot6ine. En ce qui c o n c e r n e les lipoprot6ines 16g6res (LDL,), Nishida [~1], d ' u n e part, Scanu et Aggerberck [12], d ' a u t r e part, ont m o n t r 6 que la presque totalit6 des p h o s p h o l i p i d e s 6tait accessible h la phospholipase A. L ' a c t i o n de la phospholipase C e n t r a i n e u n e aggr6gation des particules apr6s u n e courte i n c u b a t i o n [~1, 13, 14]. Girard et Canal [15] ont 6tudi6 les modifications de la mobilit6 61ectrophor6tiqne et des propri6t6s antig6niques des lipoprot6ines apr~s Faction de la pronase. Le pr6sent travail a 6t6 men6 d ' u n e fa~on plus syst6matique, en ce sens que c h a c u n e des trois classes de lipoprot6ines, isol6es du m6me sujet, a 6t6 soumise fl l ' a c t i o n de l ' e n z y m e prot6olytique et des enzymes lipolytiques dans des ordres de succession diff6rents, les r6actions 6rant suivies p a r des mesures potentiom6triques. De plus, dans l'espoir d ' a v o i r des r e n s e i g n e m e n t s sur la situation du cholest6rol, les lipoprot6ines ont 6t6 mises dans certains cas en pr6sence de digitonine, dont l'affinit6 p o u r le cholest6rol est c o n n u e . I1
R. H a d d a m , R. Helio el D. G. D e r v i c h i a n .
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6tait ainsi possible de se r e n d r e compte de l'accessibilit6 des diff6rents c o n s t i t u a n t s h leurs enzymes respectifs, compte t e n n de l ' o r d r e de succession des attaques.
m o y e n n e d ' i n c u b a t i o n h 37 ° a 6t6 de 12 heures ; c e p e n d a n t des 6chantillons ont 6t6 pr61ev6s h diff6rents temps d ' i n c u b a t i o n p o u r juger de l'aclion de la pronase.
Bien plus, d ' u n e faqon parall~le, e h a c u n e des lipoprot6ines a 6t6 examin6e au m i c r o s c o p e 61ect r o n i q u e aux diff6rents stades du t r a i t e m e n t , afin de mettre en 6vidence les modifications m o r p h o logiques provoqu6es p a r les actions successives des enzymes.
b) Phospholipase A. - - Celle-ci est u n e fraction isol6e p a r P. Bocquet [18] ~ p a r t i r du v e n i n de Naja nigrico!lis p a r filtration sur Sephadex 75. L ' o p 6 r a t i o n a aussi eu lieu dans u n m i l i e u t a m p o n h pH 8. Le c a l c i u m 6rant u n i m p o r t a n t cofacteur de la phospholipase, du c h l o r u r e de c a l c i u m a 6t6 ajout6 ~ u n e c o n c e n t r a t i o n de 0,05 molaire. La dur6e d ' i n c u b a t i o n ~ 37 ° 6tait aussi de l ' o r d r e de 12 heures.
TECHN[QUES.
Isolement. Les trois classes de lipoprot6ines ont 6t6 isol6es p a r des u l t r a c e n t r i f u g a t i o n s successives selon la m6thode introd..uite p a r De L alla et Goffman [16] e t en s u i v a n t le protocole d6crit p a r AyraultJ a r r i e r et al. [17]. Titrage potentiom~trique. Toutes les mesures ont 6t6 effectu6es avec u n pH-stat <>. Les p r 6 p a r a t i o n s l i p o p r o t6iques, m a i n t e n u e s sous atmosphbre d'azote ddp o u r v u de gaz c a r b o n i q u e , sont d ' a b o r d ajust6es h pH 9 par a d d i t i o n de soude. L ' e n z y m e est ensuite ajout6e h l'aide d ' u n e m i c r o s e r i n g u e . La cin6tique de l ' h y d r o l y s e est alors suivie p a r titrage c o n t i n u des acides gras lib6r6s, q u ' i l s'agisse des triglyc6rides attaqu6s p a r la lipase ou des p h o s p h o l i p i d e s p a r la phospholipase. II 6tait i m p o s s i b l e de suivre p a r cette m6thode l'attaque des l i p o p r o t 6 i n e s p a r la pronase, 6tant d o n n 6 le caract~re amphot~re des peptides lib6r6s.
c) Lipases. - - Deux sortes de lipases ont 6t6 utilis6s. L ' u n e extraite du c h a m p i g n o n Arrhizus rhizopus, a 6t6 pr6par6e p a r L a b o u r e u r et Labrousse [19]. L'autre, extraite du p a n c r 6 a s de porc, a 6t6 d6crite p a r P. Desnuelle [20]. L ' i n c u Ration a 6t6 effectu6e h 37 ° p e n d a n t 12 heures en pr6sence de c h l o r u r e de calcium. Lorsque la l i p o p r o t 6 i n e 6tait soumise ~ F a c t i o n successive de plusieurs enzymes, la p r o n a s e ne p o u v a i t m a n q u e r d ' h y d r o l y s e r la lipase et la phospholipase, qui sont elles-m6mes des prot6ines. Aussi dans tous les cas off la p r o n a s e a 6t6 mise en p r e m i e r lieu, son i n h i b i t e u r , l ' i n i p r o l , a 6t6 ajout6 p a r la suite, duns une p r o p o r t i o n vingt fois plus grande que la pronase. I ? a c t i o n de ce!le-ci 6rant alors bloqu6e, la lipase ou la p h o s p h o l i p a s e p o u v a i t 6tre ajout6e dans les m6mes p r o p o r t i o n s que pr6c6demment.
RESULTATS DU TITRAGE (fig. 1 et fig. 2).
Microscopic ~lectronique. Les observations ont 6t6 faites avec u n apparel1 Elmiskop Siemens 101. C'est la t e c h n i q u e des colorations n6gatives qui a 6t6 adopt6e. Le color a n t le plus s o u v e n t utilis6 a 6t6 le phosphotungstate de p o t a s s i u m A 4 p. cent ajust6 ~ pH 7. Toutefois, d'autres essais ont 6t6 fairs avec des colorants diff6rents et avec l'ac6tate d ' u r a n y l e 1 p. cent en p a r t i c u l i e r . Des grossissements variables de 20:0.00 h 80.000 ont 6t6 effectu6s, alors que l ' a g g r a n d i s s e m e n t s des photos a 6t6 de 4 /t 5 lois. Pour d 6 t e r m i n e r le diambtre m o y e n des particules, des mesures ont 6t6 faites sur u n certain n o m b r e de clich6s.
C'est avec cette classe de lipoprot6ines que l ' h y d r o l y s e des p h o s p h o l i p i d e s p a r la phospholipase se fait le plus r a p i d e m e n t . Les courbes de titrage avec la p h o s p h o l i p a s e sont e n t i 6 r e m e n t superposables, que la p r 6 p a r a t i o n air subi ou n o n l ' a c t i o n pr6alable de la pronase. Les phospholipides sont donc d i r e e t e m e n t accessib!es h leur e n z y m e sp6cifique et cette accessibilit6 n ' e s t gu~re modifi6e p a r l ' h y d r o l y s e pr6alable de la protSine. I1 n ' a p p a r a i t a u c u n e modification de l'aspect de la p r 6 p a r a t i o n i n d i q u a n t u n c h a n g e m e n t de la solubilit6 au cours de la r6action.
Origine des enzymes et mode op~ratoire. a) Pronase. - - Les diff6rentes l i p o p r o t 6 i n e s ont 6t6 mises, sous agitation mod6r6e, en pr6sence de ]a p r o n a s e (Catbiochem, 45000 pUKg) duns u n e solution tampon6e ~ p H 8, A r a i s o n de 200 ~g p o u r 4 mg d ' e x t r a i t sec de lipoprot6ine. La dur6e
Bien au c o n t r a i r e , avec la lipase, une diff6rence tr~s i m p o r t a n t e a p p a r a i t dans la vitesse d ' h y d r o lyse, s u i v a n t que la l i p o p r o t 6 i n e lourde est i n t a c t e ou modifi6e p a r l ' a c t i o n prdalable de la pronase. En effet, alors qu'avec la lipase seule, Ia courbe de titrage ne m o n t r e pas u n e vitesse plus grande
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 2.
Les lipoprot?ines lourdes (HDL).
Structure
moldculaire
que celle qui c o r r e s p o n d h l ' h y d r o l y s e spontan6e (en l ' a b s e n c e de tout enzyme) des t r i g l y c 6 r i d e s en milieu alcalin, apr~s a c t i o n de ]a p r o n a s e , ] ' h y d r o lyse des t r i g l y c 6 r i d e s p a r la l i p a s e se p r o d u i t avec une vitesse r e l a t i v e m e n t i m p o r t a n i e . Tout se passe c o m m e si la r u p t u r e de la p r o t 6 i n e e n t r a i nait un d6masquage des t r i g l y c 6 r i d e s , les r e n d a n t a c c e s s i b l e s h la lipase. ~/ mole de ,soude
des lipoprotdines.
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Une a c t i o n p r 6 a l a b l e de la p h o s p h o l i p a s e , n ' i n d u i t p a r c o n t r e pas l ' h y d r o l y s e des triglyc6r i d e s p a r la lipase. L e s l i p o p r o t ~ i n e s l~gbres ( L D L ) .
A v e c cette classe de l i p o p r o t 6 i n e s , l ' h y d r o l y s e p a r la p h o s p h o l i p a s e est m o i n s r a p i d e q u ' a v e c les HDL. Elle ne se trouve p a s modifi6e non p l u s l o r s q u e la p r o t 6 i n e est p r 6 a l a b l e m e n t h y d r o l y s 6 e p a r la p r o n a s e . Quant h r h y d r o l y s e des t r i g l y c 6 r i d e s , le m6me p h d n o m 6 n e q u ' a v e c les H D L se r e t r o u v e , c'est-hd i r e que ]a l i p a s e n ' a g i t que s u r les p a r t i c u l e s p r 6 a l a b l e m e n t attaqu6es p a r la p r o n a s e . L e s l i p o p r o t ~ i n e s tr~s ldgOres ( V L D L ) .
20
A la diff6rence des deux autres l i p o p r o t 6 i n e s , avec les VLDL l ' h y d r o l y s e des t r i g l y c 6 r i d e s p a r la l i p a s e se f a i t ~ une vitesse tr~s i m p o r t a n t e , sans qu'il soit n6cessaire de faire agir p r 6 a l a b l e m e n t la p r o n a s e . Le t r a i t e m e n t pr6alable p a r la p r o n a s e ne modifie en r i e n la c i n O i q u e enzymatique. Ceci souligne d o n c l ' a c c e s s i b i l i t 6 d i r e c t e des triglyc6r i d e s h la lipase.
10
I
I
I
I
I
4
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I
I
6
I
I
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I
I
10
I
t. mn
12
FIG. 1. - - Titrage potentiomdtrique
par la phospholipase A.
I
de l'hydrolyse
(1) HDL. (2) HDL pr6alablement hydrolys6e par la pronase. (3) LDL. (4) LDL pr6alablem~ent hydrolys6e par la pronase. (5) VLDL.
mole de soude
40
30
Les p h o s p h o l i p i d e s sont eux aussi d i r e c t e m e n t accessibles h la p h o s p h o l i p a s e . Conclusions.
En r6sum6, l'6tude p o t e n t i o m 6 t r i q u e met en 6vidence l ' i n a c e s s i b i l i t 6 des t r i g l y c 6 r i d e s h la l i p a s e dans le cas des HDL et des LDL, rant que l e u r p r o t 6 i n e est intacte. Ceci v i e n t h r a p p t d de l ' h y p o t h 6 s e souvent e x p r i m 6 e d ' u n e s t r u c t u r e des p a r t i c u l e s avec les mol6cules de t r i g l y c 6 r i d e s enfouies h l ' i n t 6 r i e u r , alors que la p r o t 6 i n e est ~t la surface. On est c o n d u i t h p e n s e r que les phosp h o l i p i d e s sont aussi localis6s d a n s la r6gion superficielle des p a r t i c u l e s , p u i s q u ' i l s sont d i r e c t e m e n t a c c e s s i b l e s h 1cur e n z y m e sp6cifique. D a n s le cas des VLDL, l ' a c c e s s i b i l i t 6 d i r e c t e des t r i g l y c 6 r i d e s h la lipase, sans qu'il soit n6cess a i r e d ' h y d r o l y s e r p r 6 a l a b l e m e n t la p r o t 6 i n e , sugg~re unc c o n s t i t u t i o n tout h fait different des p a r t i c u l e s , les t r i g l y c 6 r i d e s 6tant d a n s la m~.me s i t u a t i o n que dans une 6mulsion o r d i n a i r e . D ' a i l i e u r s , la cin6tique de la r6action r a p p e l l e celle de l ' h y d r o l y s e des 6mulsions d ' h u i l e utilis6es p o u r d o s e r ]'activit6 des p r 6 p a r a t i o n s de lipase.
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P
2
4
6
8
10
12 • 14 t. mn Fro. 2. - - Titrage potentiom~trique de l'hydrolyse par la lipase.
(1) VLDL. (2) HDL. (3) HDL pr~alablement hydrolys6e par la pronase. (4) LDL. (5) LDL pr6alablement hydrolys~e par la pronase. BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 2.
RESULTATS DE LA MICROSCOPIE ELECTRONIQUE. L e s l i p o p r o t ~ i n e s lourdes ( H D L ) .
Le clich6 de la fig. 3 est r e l a t i f aux l i p o p r o t 6 i n e s l o u r d e s avant tout t r a i t e m e n t e n z y m a t i q u e . (Colo17
258
R. Haddam,
R. Helio
e l D . G. D e r v i c h i a n .
r a t i o n n6gative au p h o s p h o t u n g s t a t e . Grossissem e n t final 200.000). Les p a r t i e u l e s l i p o p r o t 6 i q u e s a p p a r a i s s e n t en images claires r e e o u v e r t e s de granulations. La f o r m e a r r o n d i e est celle qui est Ie plus souvent r e n c o n t r 6 e , mats certaines p a r t i e u l e s ont des c o n t o u r s irr6guliers et un aspect 6toi16. Le diambtre m o y e n des particules, d6termin6 sur ces clich6s, est de 100 ~ e n v i r o n , ce qui e s t conf o r m e aux r6sultats des autres auteurs [1, 7, 21].
L'6tude des HDL p a r m i c r o s c o p i e 61ectronique a c o n d u i t F o r t e et al. Eli h p e n s e r que c h a q u e p a r t i c n l e est form6e de 4 h 5 sous-unit6s arrang6es d ' u n e fa~on variabIe. Le d i a m b t r e de ces sousunit6s seraient de 35 h 50 -*~. Une telle s t r u c t u r e en sous-unit6s semble en effet a p p a r a l t r e sur c e r t a i n e s p a r t i c u l e s de ]a figure 3, mats on ne peut pas e x c l u r e que cet aspect d ' u n c e n t r e plus dense p r o v i e n t de la possibilit6 de grains de colo-
Fw,. 3. - - H D L intacle. (Coloration n~gative h I'APT h 4 p. cent. Grossissement final 200.000L
H D L apr~s a c t i o n de la p r o n a s e . (M~me FIG. 4. coloration et m~me grossissement que la figure 3).
FIG. 5. - -
H D L aprbs a c t i o n de la p h o s p h o l i p a s e .
(Mdme coloration figure 3).
et
m~me
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 2.
grossissement
que
la
-
-
Fro. 6. - - H D L apr~s a c t i o n s s u c c e s s i u e s de la p r o n a s e et de la p h o s p h o l i p a s e . (M~me coloration et m~me
grossissement que la figure 3).
Structure
moldculaire
rants r e t e n u s p a r des anfractuosit6s h la s u r f a c e des particules. Le clich6 de la figure 4 (m6me c o l o r a t i o n et mbme g r o s s i s e m e n t que p r 6 c 6 d e m m e n t ) repr6sente les l i p o p r o t 6 i n e s l o u r d e s apr~s action d e la p r o n a s e . L ' a s p e c t g6n6ral des p a r t i c u l e s a compl6t e m e n t chang6. Ceci ne doit pas s u r p r e n d r e si l'on ne p e r d pas de vue que la moiti6 des constituants des HDL, qui est prot6ique, a 6t6 h y d r o lys6e. Une g r a n d e d i s p e r s i o n a p p a r a i t d a n s la taille des p a r t i c u l e s , qui est c e r t a i n e m e n t li6e au degr6 d ' a v a n e e m e n t de la r 6 a c t i o n e n z y m a t i q u e . De plus l ' a u g m e n t a t i o n de la laille des p a r t i c u l e s m o n t r e qu'il y a eu fusion et r 6 a r r a n g e m e n t des c o n s t i t u a n t s restants. Le clich6 de la figure 5 m o n t r e que F a c t i o n de la p h o s p h o l i p a s e , seule ou conjugu6e avec celle de la lipase, n ' e n t r a i n e que p e u de m o d i f i c a t i o n s m o r p h o l o g i q u e s quant h l ' a s p e c t g6n6ral des p a r t i cules ; mats on constate une a u g m e n t a t i o n d ' i m p o r t a n c e v a r i a b l e de la faille des p a r l i c u l e s . Quant h la lipase, agissant seule, elle n ' e n t r a i n e a u c u n e m o d i f i c a t i o n de la s t r u c t u r e de la p a r t i c u l e de HDL.
des lipoprotdines.
259
des qui ont fusionn6. Le t r a i t e m e n t p a r la phosp h o l i p a s e entraine, lui aussi, une a u g m e n t a t i o n de la taille des p a r t i c u l e s , mats sans m o d i f i c a t i o n de l ' a s p e c t g6n6ral. La p r o n a s e et la p h o s p h o l i pase utilis6es s u c c e s s i v e m e n t p r o d u i s e n t une augm e n t a t i o n trbs nette de la taille des p a r t i c u l e s (fig. 9).
Fro. 7. - - LDL intacte. (Grossissement final 160.000).
Les effets les plus i m p o r t a n t sont observ6s lorsque l'on fair agir s u r les HDL la p r o n a s e clans un p r e m i e r temps, la p h o s p h o l i p a s e ensuite. L ' a s p e c t observ6 (fig. 6) est alors c e h d de p a r t i cules s p h 6 r i q u e s 6voquant f o r t e m e n t la forme de gouttelettes d ' h u i l e dont c e r t a i n e s ont fusionn6. L e s l i p o p r o l ~ i n e s l~g~res ( L D L ) .
Le clieh6 de la figure 7 r e p r 6 s e n t e les l i p o p r o t6ines 16gbres avant tout t r a i t e m e n t enzymatique. (Coloration n6gative au p h o s p h o t u n g s t a t e . Grossissement final de 160.000). Les p a r t i e u l e s ont un c o n t o u r p o l y g o n a l et une t r a n s p a r e n c e u n i f o r m e . A p r e m i e r e vue, la forme p o l y g o n a l e p o u r r a i t ~tre impos6e p a r les c o n t r a i n t e s des p a r t i c u l e s en contact. Mats on la r e t r o u v e e n c o r e clans les pr6p a r a t i o n s b e a u c o u p p l u s dilu6es. I1 ne f a u d r a i t c e p e n d a n t pas e x c l u r e une a c t i o n du colorant, les p a r t i c u l e s 6rant globulaires clans leur 6tat n o r m a l . Le d i a m b t r e tr6s u n i f o r m e des p a t r i c u l e s a 6t6 mesur6 sur les clich6s. I1 est de l ' o r d r e de 200 250 5, ce qui est c o m p a t i b l e avec les r6sultats de n o m b r e u x auteurs [1, 22, 23, 24]. L ' a c t i o n de la p r o n a s e (fig. 8) e n t r a i n e m o i n s de m o d i f i c a t i o n s que dans le cas des HDL, ainsi que le laisse p r 6 v o i r la t e n e u r plus faible en p r o t6ines des LDL. I1 a p p a r a i t , ici encore, une nette a u g m e n t a t i o n de la taille des p a r t i c u l e s . I1 se p r o duit aussi des sortes de flaques real d6limit6es c o r r e s p o n d a n t p r o b a b l e m e n t ~ des amas de lipiBIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 2.
FIG. 8. - - LDL apr$s action de la pronase. (Grossissement final 160.000).
FIG. 9. - - LDL apr~s actions successives de la roet de la phospholipase, (Grossissement ~nral 160.000),
nase
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R . H a d d a m , R. H e l i o et D. G. D e r v i c h i a n .
Un des fairs les plus i m p o r t a n t s est l'abserbee de toute modification m o r p h o l o g i q u e lorsque l'on fait agir la l i p a s e . La d i g i t o n i n e aussi est sans effet, malgr6 la trbs forte t e n e u r en cholest6rol de ces particules. Les lipoprotkines tr~s I~g~res (VLDL).
Le clich6 de la figure 10 est relatif aux VLDL a v a n t route attaque enzymatique. (Coloration n6gative au Phosphotungstate. Grossissement de 160.000). A la diff6rence des deux autres classes de lipoprot6ines, la taille des particules est ici trbs variable. Des diam6tres de 300 h 800 ~ ont 6t6 trouv6 en accord avec les r6sultats des autres auteurs [1, 25, ~6].
Le fair le plus f r a p p a n t est l ' a c t i o n de la lipase, qui diff6rencie les VLDL des HDL et des I.DL. Avec les VLD,L, les p a r t i c u l e s sont attaqu6es p a r la lipase, elles d e v i e n n e n t petites et irr6guli6res (fig. 11). Les triglyc6rides sont donc d i r e c t e m e n t accessibles h l'enzyme. Apr6s attaque p a r ia pronase, puts p a r la lipase, on voit sur le clich6 de la figure 12 qu'il y a dissociation des p a r t i c u l e s et a p p a r i t i o n de grands areas de c o n s t i t u a n t s p r o b a b l e m e n t lipidiques. La p h o s p h o l i p a s e n ' e n t r a i n e p r a t i q u e m e n t pas de modifications de la structure de la p a r t i c u l e de VLDL. Ceci est li6 p r o b a b l e m e n t h sa t e n e u r relat i v e m e n t faible en p h o s p h o l i p i d e s p a r r a p p o r t aux triglyc6rides.
i
:
FIG. 10. - 160.000).
VLDL intactes.
(Grossissement final
FIG. 12. - - VLDL apr~s actions successioes de la pronase et de la lipase. (Grossissement final 160.000). DISCUSSION E T CONCLUSIONS GENERALES. Nous e x a m i n e r o n s d ' a b o r d le cas des tIDL et des LDL.
Fro. 11. - - VLDL apr~s action de la lipase. (Grossissement final 160.000). BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 2.
Les triglyc6rides, que ce soit dans les HDL ou dans les LDL, ne sont pas aceessibles h Faction de la lipase. Ceci est prouv6 aussi b i e n p a r les mesures titrim6triques, 06 a u c u n e h y d r o l y s e n'est mise en 6vidence, que p a r l ' o b s e r v a t i o n au microscope 61ectronique, off a u c u n e modification m o r p h o l o g i q u e n ' a p p a r a i t apr6s avoir mis ces deux classes de lipoprot~ines en pr6sence de la lipase. P a r contre, d6s que le c o n s t i t u a n t prot6ique de ces deux l i p o p r o t 6 i n e s est hydrolys6, les triglyc6rides d e v i e n n e n t accessibles /~ leur enzyme, ainsi que l'a m o n t r 6 le dosage titrim6trique. On peut d o n c c o n c l u r e que les triglyc6rides sont dissimul6s p a r la prot6ine.
Structure moldculaire des iipoprotdines. Les p h o s p h o l i p i d e s sont d i r e c t e m e n t accessibles h l ' a c t i o n de la phospholipase ainsi que le m o n t r e le titrage p o t e n t i o m 6 t r i q u e ; bien pins, u n traitement pr6alable par la p r o n a s e ne modifie en r i e n le r6sultats du titrage lors de l ' h y d r o l y s e des phosp h o l i p i d e s p a r leur enzyme. Ainsi, de ce p o i n t de vue, les p h o s p h o l i p i d e s ne sont pas dissimul6s par la prot6ine. Cependant, il faut signaler ici que, dons le cas des HDL, qui c o n t i e n n e n t 50 p. cent de prot6ine, les p o l y s a e c h a r i d e s sulfat6s ne peuvent se fixer sur les bases azot6es des phospholipides lant que la prot6ine est intacte. La destruction de celle-ei p a r la p r o n a s e p e r m e t la r6action de fixation ~27]. Avec les LDL, qui ne c o n t i e n n e n t que 25 p. cent de p r o t 6 i n e p o u r 20 p. cent de phospholipides, la fixation des p o l y s a c e h a r i d e s sulfat6s peut se faire sans avoir ~ 61iminer la prot6ine E28]. Quant au c o n s t i t u a n t prot6ique, tout ce qui vient d'6tre dit p r o u v e qu'il est accessible h la prot6ase. D'ailleurs, l ' e x a m e n p a r microscopic 61ectronique m o n t r e toujours des modifications morphologiques apr6s l ' i n c u b a t i o n des lipoprot6ines avec la pronase. Grhce h l'6tude faite d ' u n e fa~on parall61e, p a r titrage et p a r examen au microscope 61ectronique, il a 6t6 prouv6 dans ce travail que l'attaqne des p h o s p h o l i p i d e s p a r leur enzyme provoque, aussi bien avec les HDL qu'avec les LDL, une augmentation de la taille des particules. I1 e n e s t de m6me l o r s q u ' o n fair agir la pronase. Mats, c'est avec les HDL, qui e o n t i e n n e n t la plus forte p r o p o r t i o n de prot6ine, que les modifications m o r p h o l o g i q u e s sont les plus importantes. On eonstate ainsi que la d i m i n u t i o n p a r h y d r o l y s e de l ' u n ou de l ' a u t r e des e o n s t i t u a n t s h y d r o p h i l e s (prot6ine, phospholipides) se t r a d u i t p a r une a u g m e n t a t i o n d=- la faille des particules. Ceci est d ' a u t a n t plus 6tonnant, dans le cas des HDL, que la prot6ine 61imin6e p a r la p r o n a s e repr6sente la moiti6 du poids des c o n s t i t u a n t s de la particule. Un m~,me type de relation entre c o m p o s i t i o n et taille a p p a r a l t d6jh lorsque l'on consid6re les diff6rentes classes de lipoprot6ines a v a n t toute modification. On constate que le p o u r c e n t a g e de la prot6ine est i n v e r s e m e n t p r o p o r t i o n n e l h la taille des particules: il est 50 p. cent p o u r u n e taille de 100 .~ dans les HDL, de 25 p. cent p o u r u n e taille de 200 h dans les I,DL et de 10 p. cent p o u r u n e taille m o y e n n e de 500 -~ dans les VLDL. Devant ces faits, on est tout n a t u r e l l e m e n t conduit h p e n s e r que la stabilit6 des p a r t i c u l e s lipoprot6iques, c'est-h-dire leur solubilit6 en milieu aqueux, est assur6e p a r la pr6senee des prot6ines et des p h o s p h o l i p i d e s et que ces deux c o n s t i t u a n t s
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se t r o u v e n t localis6s dans la r6gion superficielle des particules. On c o m p r e n d r a i t , du m6me coup, les autres fairs observ6s, h savoir la n o n accessibilit6 ~ la lipase des triglyc6rides rant que la prot6ine qui les recouvre est intaete. On comp r e n d r a i t de m6me que l'61imination d ' n n e partie des substances h y d r o p h i l e s stabilisantes e n t r a i n e la coalescence des partieules, une a u g m e n t a t i o n de la taille et p a r cons6quent u n e d i m i n u t i o n de la surface totale. Les images des figures 6 et 9, obtenues apr6s actions suceessives de la p r o n a s e et de la phopholipase, s ' e x p l i q u e n t a i n s i facilem e n t : les lipides insolubles (triglyc6rides, esters de cholest6ryl, eholest6rol) qui ont 6t6 6pargn6s a p p a r a i s s e n t alors sous forme de gouttes qui ont t e n d a n c e h f u s i o n n e r entre elles. Les modifications de la taille des p a r t i c u l e s /i la suite de l'61imination progressive des constituants h y d r o p h i l e s 6voque le cas b i e n c o n n u des 6mulsions oh la taille des gouttelettes est inversem e n t p r o p o r t i o n n e l l e h la quantit6 relative d'6muls i o n n a n t p a r r a p p o r t h l'huile 6mulsionn6e. Mats on ne peut assimiler les HDL et les LDL h de simples 6mulsions, p u i s q u e les p r o p o r t i o n s des diff6rents c o n s t i t u a n t s sont sp6cifiques de ehaque classe de lipoprot6ine, n o n seulement en ce qui c o n e e r n e ceux qui sont h y d r o p h i l e s et qui se t r o u v e r a i e n t ~ la surface des particules, mats en ce qui c o n c e r n e ceux qui sont /i l ' i n t 6 r i e u r . Des facteurs de s t r u c t u r e doivent, trbs p r o b a b l e m e n t , 6tre pris en c o n s i d 6 r a t i o n ; d ' a u t a n t plus que la m i c r o s c o p i c 61ectronique m o n t r e que les grains de colorant sont retenus ~ la surface des particules de HDL, r6v6Iant que cette surface n'est pas c o n t i n u e comme celle d ' u n e goutte d'6mulsion. Ainsi q u ' i l a 6t6 dit plus haut, cette p a r t i c u l a r i t 6 h c o n d u i t e e r t a i n s auteurs h p r o p o s e r l'existenee de sous-unit6s dans la structure des partieules. I1 n ' e n reste pas m o i n s vrai que, m6me si la partieule est form6e de sous-unit6s, il faut t e n i r compte de t o u s l e s fairs cit6s p r 6 c 6 d e m m e n t qui i n e i t e n t fortement h admettre que la prot6ine et les phosp h o l i p i d e s se t r o u v e n t localis6s dans la r6gion superfieielle de la partieule. P a r plus d ' u n aspect les VLDL se diff6reneient des autres classes de lipoprot6ines. E n ce qui c o n c e r n e la composition, les c o n s t i t u a n t s h y d r o philes (prot6ines + phospholipides) ne repr6s e n t e n t que 28 p. cent, et, du reste n o n - h y d r o phi/e, 80 p. cent est repr6sent6 p a r des triglye6rides. Leurs p a r t i c u l e s ont des tailles tr6s variables et sont r e l a t i v e m e n t fragiles, p u i s q u ' a u t o u r s de la coloration, elles d o n n e n t n a i s s a n c e p a r coalescence h des flaques de graisse. On peut dire q u ' i c i la c o m p a r a i s o n avec les 6mulsions se fait plus ais~ment.
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R. Hadd~m,
R . H e l i o et D. G. D e r v i c h i a n .
Le fair le p l u s i m p o r t a n t est, q u ' h l a d i f f 6 r e n c e d e s d e u x a u t r e s c l a s s e s , les t r i g l y c 6 r i d e s , a i n s i q u ' i l a 616 d i t p l u s h a u t , s o n t d i r e c t e m e n t a c c e s s i b l e s h la l i p a s e , s a n s q u ' i l s o i t n 6 c e s s a i r e d ' h y d r o l y s e r p r 6 a l a b l e m e n t la p r o t 6 i n e . L ' a t t a q u e p a r la l i p a s e se f a i t d ' u n e f a ~ o n s e m b l a b l e ~ c e q u i se p a s s e a v e c les 6 m u l s i o n s o r d i n a i r e s d e t r i g l y c 6 r i d e s u t i l i s 6 s p o u r le d o s a g e d e l ' a c t i v i t 6 d e s p r 6 parations de lipase, au point de donner des courb e s de t i t r a g e d ' a l l u r e i d e n t i q u e . Si d o n c les e o n s t i t u a n t s p r o t 6 i q u e s et p h o s p h o l i p i d i q u e s se trouvent dans la r6gion superficielle des partie u l e s , ils se l a i s s e n t f a c i l e m e n t t r a v e r s e r p a r la l i p a s e , tel q u ' u n 6 m u l s i o n a n t o r d i n a i r e ; ce q u i exclut l'existence d'une structure organis6e. D e l ' e n s e m b l e d e s f a i r s o b s e r v 6 s et les d i s c u s s i o n s , il r e s s o r t q u e d a n s les t r o i s c l a s s e s d e ] i p o p r o t 6 i n e s , la p r o t 6 i n e et les p h o s p h o l i p i d e s se t r o u v e n t l o s a l i s 6 s d a n s la r 6 g i o n s u p e r f i c i e l l e d e s p a r t i c u l e s . C e p e n d a n t , la s i t u a t i o n d e l a p r o t 6 i n e et d e s p h o s p h o l i p i d e s n'est pas identique sons t o n s les r a p p o r t s . L ' h y d r o l y s e d e s p h o s p h o l i p i d e s s e u l s n e suffit p a s h r e n d r e les t r i g l y c 6 r i d e s a c c e s s i b l e s , a l o r s q u e , s a n s t o n s les cas, l ' 6 1 i m i n a t i o n d e la p r o t 6 i n e p e r m e t h la l i p a s e d ' a t t a q u e r les triglyc6rides. Mais l ' e x p 6 r i e n c e c i t 6 e p l u s h a u t , r e l a t i v e h l a f i x a t i o n d e s p o l y s a c c h a r i d e s s u l f a t 6 s [27] m o n t r e q u e les p h o s p h o , l i p i d e s s a n t a s s e z 6 t r o i t e m e n t a s s o c i 6 s h la p r o t 6 i n e . E n effet, si la p r 6 s e n c e d'une quantit6 de prot6ine aussi importante que 50 p. c e n t d a n s les H D L , n ' e m p 6 c h e p a s l a p h o s p h o l i p a s e d ' a t t e i n d r e la f o n c t i o n i n t 6 r e s s 6 e d e s m o l 6 c u l e s d e p h o s p h o l i p i d e , la f i x a t i o n d u p o l y s a c c h a r i d e s u l f a t 6 s u r la b a s e a z o t 6 e du p h o s p h o l i p i d e n e p e n t se f a i r e q u ' a p r 6 s a v o i r 61imin6 c e t t e prot6ine. II n ' e n r e s t e p a s m o i n s v r a i q u e c ' e s t la p r o t 6 i n e q u i j o u e le r61e p r i n c i p a l , a u s s i b i e n d a n s la s t a b i l i t 6 q u e d a n s la s t r u c t u r e d e s p a r t i c u l e s d e s diff6rentes classes de lipoprot6ines, puisqne, ainsi q u e n o u s l ' a v o n s s o u l i g n 6 , la t a i l l e d e s p a r t i c u l e s est e n r e l a t i o n a s s e z p r 6 c i s e a v e c le p o u r c e n t a g e de prot6ine. R~suM~.
Chacune des trois classes de lipoprot6ines (lourdes, 16g6res et tr~s 16g6res) a ~t6 soumise syst~matiquem e n t h l'action de la pronase, de la lipase et de la phospho.litmse A, clans des o.rdres de succession diff6rents. Ceci afin de m e t t r e eu ~vidence l'aeeessibilit6 des diff6rents c o n s t i t u a n t s des lipaprot6ines et d ' a v o i r des r e n s e i g n e m e n t s sur la s t r u e t u r e de leurs particules.
BIOCHIMIE, 1974, 56, n* 2.
Les effets de ces actions out $t$ suivis d'une fagon parall~le p a r titrage potenti~>m6trique et p a r o.bservation a u microscope 61eetronique. Dans le cas des HDL et des LDL, les triglyc6rides ne sont accessibtes h la lipase qu'apr6s h y d r o l y s e de la prot6ine. Celle-ei ainsi que les p h o s p h o l i p i d e s sont d i r e e t e m e n t aecessibles leurs enzymes respeetifs. L ' ~ l i m i n a t i o n de la prot~.ine et des p h o s p h o l i p i d e s e n t r a l n e unc a u g m e n t a t i o n , plus ou m g i n s irr6guli6re, de la taille des particules, eomme s'il y a v a i t coalescence des c o n s t i t u a n t s restants. Darts les VLDL, les triglyc6rides sont d i r e c t e m e n t aecessibles h la lipase et leur eo.mporteme~t les rapproehe d a v a n tage des 6mulsions ordinaires.
BIBLIOGRAPHIE. 1. Forte, G. M., Nichols, A. V. & Glaeser, R. M. (1968) Chem. Phys. Lipids, 2, 396-408. 2. Hart, C. J., Leslie, R. B. & Scanu, A. M. (1970) Chem. Phys. Lipids, 4, 367-375. 3. Scanu, A. M. (19'65) Proc. Nal. Acad. Sci. U.S.A., 54, 1699-1705. 4. Scanu, A. M. & Hirz, R. (1968) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 59, 890-894. 5. C h a p m a n , D., B a r r a t t , M. D. & Kamat, V. B. (1969) Biochem. biophys. Acta, 173, 154-163. 6. Leslie, R. B., in P l a s m a L i p o p r o t e i n s (1971), edit. b y R. M. S. Smellie, Acad. Press, p. 47-85. 7. Scanu, A. M. & W i s d o m , C (1972') An. Bey. Biochemistry, 41, 703-729. 8. Tayeau, F. & Breton, J. (1947) B a l l Soc. Chim. Biol., 29, 687-680. 9. Camejo, G. (1969) Biochim. biophys. Acta, 175, 290300. 10. Ashworth, L. A. E. & Green, C. (1963) Biochem. J., 89, 561-564. 11. Nishida, T. (1968) J. L i p i d Res., 9, 627-635. 12. Aggerberk, L. & Scanu, A. (1971) Circulation, 44, 11 (Ahst.). 13. Pollard, H., Scanu, A. M. & Taylor, E. W. (1969) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 64, 304-310. 14. Bruckdorfer, K. R. & Green, C. (19'67) Biochem. J., 104, 270-277. 15. Girard, M. L. & Canal, J. (1965) C. R. Aead. Sei. Paris, 260, 4377-4380. 16. De Lalla, O. F. & Goffman, J. W. (1954) Meth. biochem. Analysis, D. Gliek, ed., Interseience, N.Y., 1, 459-478. 17. A y r a u l t - J a r r i e r , M., Levy ~Vald, R. & Polonovski, J. (1963) Bull. Soe. Chim. Biol., 45, 349-359. 18. Bocquet, P., lzard, Y., Meaume, J. & J o u a n n e t , M. (1967) Ann. Inst. Pasteur, 112, 213-216. 19. Laboureur, P. & Labrousse, M. (1966) Bull. Soe. Chim. Biol., 48, 747-754. 20. Desnuelle, P. (1961) Adv. in E n z y m o l o g y , 23, 129. 21. Forte, T., Norum, K. R., Glomset, J. A. et Nichols, A. V. (1971) J. Clin. Inuest., 50, 1141-1148. 22. Gotto~ A. M., Levy, R. I., Rosenthal, A. S., B i r n h a u m e r , M. E. & Frederikson, D S (1968) Biochem. Biophys. Res. Commun., 31, 699-705. 23. Pollard, H., Scanu, A. M. a Taylor, E. W. (1969) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 64, 304-310. 24. Margolis, S. (19'67) J. L i p i d Res., 8, 501-507. 25. Hayes, T. L. & Heveitt, J. E. (1957) J. appl. Physiol., llL 425-428. 26. Lindgren, F. T. & Nichols, A. V. (1960) in The P l a s m a Proteins ed. F. W. P u t n a m , Acad. Press, N.Y., 2, 1-58. 27. Canal, J. & Girard, M. L. (1968) Bull. Soe. Chim. Biol., 50, 1523-1536. 28. Burstein, M. & Samaille, J. (1955) C. R. Acad. Sci. Paris, 2~1, 664.
Analyse par titrimdtrie et par microscopie dlectronique de la structure moldculaire des lipoprotdines aprbs dissection enzymatique R. HADDAM ( ' ) , R. HELIO et D. G. DERVlCHIAN ( ' ) . I n s t i t u t P a s t e u r , 75015 Paris.
Summartj. - - Each of the three classes of lipoproteins (high, low and very low density) has been submitted systematically to the action of pronase, lipase and phospholipase A, in different orders of succession. This was to show the accessibility of the different components of the lipoproteins and to get information on the structure of their particles. The resulting effects have been examined in a parallel way both by potentiometric titration and by electron microscopy. With the HDL and LDL, triglycerides become accessible to lipase only after hydrolysis of the protein component. The protein and phospholipid components are directly accessible to their respective enzymes. Removal of the protein and of the phospholipids produces a more or less irregular increase of the size of the particles, as if there was a coalescence of the remnant components. With the VLDL, triglycerides are directly accessible to lipase and their behaviour makes them more comparable to ordinary emulsions.
INTRODUCTION. Si l'on c o n n a i t a c t u e l l e m e n t la c o m p o s i t i o n des diff6rentes classes de lipoprot6ines s6riques h u m a i n e s , leur s t r u c t u r e h l'6chelle mol6culaire, c'est-h-dire l ' o r g a n i s a t i o n des diff6rentes moldcules des c o n s t i t u a n t s au sein de la particule lipoprotdique, n'est pas 6tablie et d e m e u r e l'objet d'hypothbses. Plusieurs auteurs ont d6jh abordd ce probl6me p a r diff6rentes mdthodes. P a r microscopic 61ectronique [1], p a r spectroscopic de tluorescence [21, p a r d i s p e r s i o n optique rotatoire et d i c h r o i s m e c i r c u l a i r e [3, 4], p a r r6sonance magndtique nucl6aire [5]. P o u r des revues g6ndrales, voir R. B. Leslie [6] et A. M. Scanu et C. W i s d o m [71. Mais il n'existe pas de preuves exp6r i m e n t a l e s directes et prdcises des diff6rentes structures qui ont 6t6 propos6es. Le pr6sent travail n ' a pas la p r 6 t e n t i o n d ' a p p o r ter u n e d d m o n s t r a t i o n plus directe. I1 f o u r n i t c e p e n d a n t des r e n s e i g n e m e n t s c o m p l 6 m e n t a i r e s obtenus p a r u n e sorte de dissection e n z y m a l i q u e des lipoprotdines. Chaque type de p a r t i c u l e a 6td soumis h Faction des diff6rents enzymes sp6cifiques de ses p r i n c i p a u x constituants, prol6ase, lipase, phospholipase. De semblables 6tudes ont d6jh 6t6 effectu6es. D6jh en i947, T a y e a u et Breton I8] avait fait agir la t r y p s i n e sur le s6rum et montr6 que ]a d61ipidation favorisait l ' h y d r o l y s e des prot6ines. Camejo [9] a montr6 que l ' a p o p r o t 6 i n e des lipopro(*) Adresse aetuelle : Laboratoire de Physlologie G6n6rale, Universit~ Paris VI, 9, quai Saint Bernard, 75005 Paris.
t6ines lourdes (HDL) est aussi bien accessible h la t r y p s i n e lorsque les p a r t i c u l e s sont intactes que si elles ont 6t6 p r 6 a l a b l e m e n t d61ipid6es. E n u t i l ' s a n t la p h o s p h o l i p a s e A, il a trouv6 que la presque totalit6 des p h o s p h o l i p i d e s sont h y d r o lys6es. A s h w o r t h et Green [10] ont trouv6 que l ' h y d r o l y s e prot6ique des HDI. p e r m e t t a i t d'extraire u n e quantit6 i m p o r t a n t e des lipides neutres p a r l'6ther et que la p h o s p h o l i p a s e D pent lib6rer pr6s de 90 p. cent de la choline pr6sente dans cette m6me classe de lipoprot6ine. En ce qui c o n c e r n e les lipoprot6ines 16g6res (LDL,), Nishida [~1], d ' u n e part, Scanu et Aggerberck [12], d ' a u t r e part, ont m o n t r 6 que la presque totalit6 des p h o s p h o l i p i d e s 6tait accessible h la phospholipase A. L ' a c t i o n de la phospholipase C e n t r a i n e u n e aggr6gation des particules apr6s u n e courte i n c u b a t i o n [~1, 13, 14]. Girard et Canal [15] ont 6tudi6 les modifications de la mobilit6 61ectrophor6tiqne et des propri6t6s antig6niques des lipoprot6ines apr~s Faction de la pronase. Le pr6sent travail a 6t6 men6 d ' u n e fa~on plus syst6matique, en ce sens que c h a c u n e des trois classes de lipoprot6ines, isol6es du m6me sujet, a 6t6 soumise fl l ' a c t i o n de l ' e n z y m e prot6olytique et des enzymes lipolytiques dans des ordres de succession diff6rents, les r6actions 6rant suivies p a r des mesures potentiom6triques. De plus, dans l'espoir d ' a v o i r des r e n s e i g n e m e n t s sur la situation du cholest6rol, les lipoprot6ines ont 6t6 mises dans certains cas en pr6sence de digitonine, dont l'affinit6 p o u r le cholest6rol est c o n n u e . I1
R. H a d d a m , R. Helio el D. G. D e r v i c h i a n .
256
6tait ainsi possible de se r e n d r e compte de l'accessibilit6 des diff6rents c o n s t i t u a n t s h leurs enzymes respectifs, compte t e n n de l ' o r d r e de succession des attaques.
m o y e n n e d ' i n c u b a t i o n h 37 ° a 6t6 de 12 heures ; c e p e n d a n t des 6chantillons ont 6t6 pr61ev6s h diff6rents temps d ' i n c u b a t i o n p o u r juger de l'aclion de la pronase.
Bien plus, d ' u n e faqon parall~le, e h a c u n e des lipoprot6ines a 6t6 examin6e au m i c r o s c o p e 61ect r o n i q u e aux diff6rents stades du t r a i t e m e n t , afin de mettre en 6vidence les modifications m o r p h o logiques provoqu6es p a r les actions successives des enzymes.
b) Phospholipase A. - - Celle-ci est u n e fraction isol6e p a r P. Bocquet [18] ~ p a r t i r du v e n i n de Naja nigrico!lis p a r filtration sur Sephadex 75. L ' o p 6 r a t i o n a aussi eu lieu dans u n m i l i e u t a m p o n h pH 8. Le c a l c i u m 6rant u n i m p o r t a n t cofacteur de la phospholipase, du c h l o r u r e de c a l c i u m a 6t6 ajout6 ~ u n e c o n c e n t r a t i o n de 0,05 molaire. La dur6e d ' i n c u b a t i o n ~ 37 ° 6tait aussi de l ' o r d r e de 12 heures.
TECHN[QUES.
Isolement. Les trois classes de lipoprot6ines ont 6t6 isol6es p a r des u l t r a c e n t r i f u g a t i o n s successives selon la m6thode introd..uite p a r De L alla et Goffman [16] e t en s u i v a n t le protocole d6crit p a r AyraultJ a r r i e r et al. [17]. Titrage potentiom~trique. Toutes les mesures ont 6t6 effectu6es avec u n pH-stat <
c) Lipases. - - Deux sortes de lipases ont 6t6 utilis6s. L ' u n e extraite du c h a m p i g n o n Arrhizus rhizopus, a 6t6 pr6par6e p a r L a b o u r e u r et Labrousse [19]. L'autre, extraite du p a n c r 6 a s de porc, a 6t6 d6crite p a r P. Desnuelle [20]. L ' i n c u Ration a 6t6 effectu6e h 37 ° p e n d a n t 12 heures en pr6sence de c h l o r u r e de calcium. Lorsque la l i p o p r o t 6 i n e 6tait soumise ~ F a c t i o n successive de plusieurs enzymes, la p r o n a s e ne p o u v a i t m a n q u e r d ' h y d r o l y s e r la lipase et la phospholipase, qui sont elles-m6mes des prot6ines. Aussi dans tous les cas off la p r o n a s e a 6t6 mise en p r e m i e r lieu, son i n h i b i t e u r , l ' i n i p r o l , a 6t6 ajout6 p a r la suite, duns une p r o p o r t i o n vingt fois plus grande que la pronase. I ? a c t i o n de ce!le-ci 6rant alors bloqu6e, la lipase ou la p h o s p h o l i p a s e p o u v a i t 6tre ajout6e dans les m6mes p r o p o r t i o n s que pr6c6demment.
RESULTATS DU TITRAGE (fig. 1 et fig. 2).
Microscopic ~lectronique. Les observations ont 6t6 faites avec u n apparel1 Elmiskop Siemens 101. C'est la t e c h n i q u e des colorations n6gatives qui a 6t6 adopt6e. Le color a n t le plus s o u v e n t utilis6 a 6t6 le phosphotungstate de p o t a s s i u m A 4 p. cent ajust6 ~ pH 7. Toutefois, d'autres essais ont 6t6 fairs avec des colorants diff6rents et avec l'ac6tate d ' u r a n y l e 1 p. cent en p a r t i c u l i e r . Des grossissements variables de 20:0.00 h 80.000 ont 6t6 effectu6s, alors que l ' a g g r a n d i s s e m e n t s des photos a 6t6 de 4 /t 5 lois. Pour d 6 t e r m i n e r le diambtre m o y e n des particules, des mesures ont 6t6 faites sur u n certain n o m b r e de clich6s.
C'est avec cette classe de lipoprot6ines que l ' h y d r o l y s e des p h o s p h o l i p i d e s p a r la phospholipase se fait le plus r a p i d e m e n t . Les courbes de titrage avec la p h o s p h o l i p a s e sont e n t i 6 r e m e n t superposables, que la p r 6 p a r a t i o n air subi ou n o n l ' a c t i o n pr6alable de la pronase. Les phospholipides sont donc d i r e e t e m e n t accessib!es h leur e n z y m e sp6cifique et cette accessibilit6 n ' e s t gu~re modifi6e p a r l ' h y d r o l y s e pr6alable de la protSine. I1 n ' a p p a r a i t a u c u n e modification de l'aspect de la p r 6 p a r a t i o n i n d i q u a n t u n c h a n g e m e n t de la solubilit6 au cours de la r6action.
Origine des enzymes et mode op~ratoire. a) Pronase. - - Les diff6rentes l i p o p r o t 6 i n e s ont 6t6 mises, sous agitation mod6r6e, en pr6sence de ]a p r o n a s e (Catbiochem, 45000 pUKg) duns u n e solution tampon6e ~ p H 8, A r a i s o n de 200 ~g p o u r 4 mg d ' e x t r a i t sec de lipoprot6ine. La dur6e
Bien au c o n t r a i r e , avec la lipase, une diff6rence tr~s i m p o r t a n t e a p p a r a i t dans la vitesse d ' h y d r o lyse, s u i v a n t que la l i p o p r o t 6 i n e lourde est i n t a c t e ou modifi6e p a r l ' a c t i o n prdalable de la pronase. En effet, alors qu'avec la lipase seule, Ia courbe de titrage ne m o n t r e pas u n e vitesse plus grande
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 2.
Les lipoprot?ines lourdes (HDL).
Structure
moldculaire
que celle qui c o r r e s p o n d h l ' h y d r o l y s e spontan6e (en l ' a b s e n c e de tout enzyme) des t r i g l y c 6 r i d e s en milieu alcalin, apr~s a c t i o n de ]a p r o n a s e , ] ' h y d r o lyse des t r i g l y c 6 r i d e s p a r la l i p a s e se p r o d u i t avec une vitesse r e l a t i v e m e n t i m p o r t a n i e . Tout se passe c o m m e si la r u p t u r e de la p r o t 6 i n e e n t r a i nait un d6masquage des t r i g l y c 6 r i d e s , les r e n d a n t a c c e s s i b l e s h la lipase. ~/ mole de ,soude
des lipoprotdines.
257
Une a c t i o n p r 6 a l a b l e de la p h o s p h o l i p a s e , n ' i n d u i t p a r c o n t r e pas l ' h y d r o l y s e des triglyc6r i d e s p a r la lipase. L e s l i p o p r o t ~ i n e s l~gbres ( L D L ) .
A v e c cette classe de l i p o p r o t 6 i n e s , l ' h y d r o l y s e p a r la p h o s p h o l i p a s e est m o i n s r a p i d e q u ' a v e c les HDL. Elle ne se trouve p a s modifi6e non p l u s l o r s q u e la p r o t 6 i n e est p r 6 a l a b l e m e n t h y d r o l y s 6 e p a r la p r o n a s e . Quant h r h y d r o l y s e des t r i g l y c 6 r i d e s , le m6me p h d n o m 6 n e q u ' a v e c les H D L se r e t r o u v e , c'est-hd i r e que ]a l i p a s e n ' a g i t que s u r les p a r t i c u l e s p r 6 a l a b l e m e n t attaqu6es p a r la p r o n a s e . L e s l i p o p r o t ~ i n e s tr~s ldgOres ( V L D L ) .
20
A la diff6rence des deux autres l i p o p r o t 6 i n e s , avec les VLDL l ' h y d r o l y s e des t r i g l y c 6 r i d e s p a r la l i p a s e se f a i t ~ une vitesse tr~s i m p o r t a n t e , sans qu'il soit n6cessaire de faire agir p r 6 a l a b l e m e n t la p r o n a s e . Le t r a i t e m e n t pr6alable p a r la p r o n a s e ne modifie en r i e n la c i n O i q u e enzymatique. Ceci souligne d o n c l ' a c c e s s i b i l i t 6 d i r e c t e des triglyc6r i d e s h la lipase.
10
I
I
I
I
I
4
2
I
I
6
I
I
8
I
I
10
I
t. mn
12
FIG. 1. - - Titrage potentiomdtrique
par la phospholipase A.
I
de l'hydrolyse
(1) HDL. (2) HDL pr6alablement hydrolys6e par la pronase. (3) LDL. (4) LDL pr6alablem~ent hydrolys6e par la pronase. (5) VLDL.
mole de soude
40
30
Les p h o s p h o l i p i d e s sont eux aussi d i r e c t e m e n t accessibles h la p h o s p h o l i p a s e . Conclusions.
En r6sum6, l'6tude p o t e n t i o m 6 t r i q u e met en 6vidence l ' i n a c e s s i b i l i t 6 des t r i g l y c 6 r i d e s h la l i p a s e dans le cas des HDL et des LDL, rant que l e u r p r o t 6 i n e est intacte. Ceci v i e n t h r a p p t d de l ' h y p o t h 6 s e souvent e x p r i m 6 e d ' u n e s t r u c t u r e des p a r t i c u l e s avec les mol6cules de t r i g l y c 6 r i d e s enfouies h l ' i n t 6 r i e u r , alors que la p r o t 6 i n e est ~t la surface. On est c o n d u i t h p e n s e r que les phosp h o l i p i d e s sont aussi localis6s d a n s la r6gion superficielle des p a r t i c u l e s , p u i s q u ' i l s sont d i r e c t e m e n t a c c e s s i b l e s h 1cur e n z y m e sp6cifique. D a n s le cas des VLDL, l ' a c c e s s i b i l i t 6 d i r e c t e des t r i g l y c 6 r i d e s h la lipase, sans qu'il soit n6cess a i r e d ' h y d r o l y s e r p r 6 a l a b l e m e n t la p r o t 6 i n e , sugg~re unc c o n s t i t u t i o n tout h fait different des p a r t i c u l e s , les t r i g l y c 6 r i d e s 6tant d a n s la m~.me s i t u a t i o n que dans une 6mulsion o r d i n a i r e . D ' a i l i e u r s , la cin6tique de la r6action r a p p e l l e celle de l ' h y d r o l y s e des 6mulsions d ' h u i l e utilis6es p o u r d o s e r ]'activit6 des p r 6 p a r a t i o n s de lipase.
20
10
P
2
4
6
8
10
12 • 14 t. mn Fro. 2. - - Titrage potentiom~trique de l'hydrolyse par la lipase.
(1) VLDL. (2) HDL. (3) HDL pr~alablement hydrolys6e par la pronase. (4) LDL. (5) LDL pr6alablement hydrolys~e par la pronase. BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 2.
RESULTATS DE LA MICROSCOPIE ELECTRONIQUE. L e s l i p o p r o t ~ i n e s lourdes ( H D L ) .
Le clich6 de la fig. 3 est r e l a t i f aux l i p o p r o t 6 i n e s l o u r d e s avant tout t r a i t e m e n t e n z y m a t i q u e . (Colo17
258
R. Haddam,
R. Helio
e l D . G. D e r v i c h i a n .
r a t i o n n6gative au p h o s p h o t u n g s t a t e . Grossissem e n t final 200.000). Les p a r t i e u l e s l i p o p r o t 6 i q u e s a p p a r a i s s e n t en images claires r e e o u v e r t e s de granulations. La f o r m e a r r o n d i e est celle qui est Ie plus souvent r e n c o n t r 6 e , mats certaines p a r t i e u l e s ont des c o n t o u r s irr6guliers et un aspect 6toi16. Le diambtre m o y e n des particules, d6termin6 sur ces clich6s, est de 100 ~ e n v i r o n , ce qui e s t conf o r m e aux r6sultats des autres auteurs [1, 7, 21].
L'6tude des HDL p a r m i c r o s c o p i e 61ectronique a c o n d u i t F o r t e et al. Eli h p e n s e r que c h a q u e p a r t i c n l e est form6e de 4 h 5 sous-unit6s arrang6es d ' u n e fa~on variabIe. Le d i a m b t r e de ces sousunit6s seraient de 35 h 50 -*~. Une telle s t r u c t u r e en sous-unit6s semble en effet a p p a r a l t r e sur c e r t a i n e s p a r t i c u l e s de ]a figure 3, mats on ne peut pas e x c l u r e que cet aspect d ' u n c e n t r e plus dense p r o v i e n t de la possibilit6 de grains de colo-
Fw,. 3. - - H D L intacle. (Coloration n~gative h I'APT h 4 p. cent. Grossissement final 200.000L
H D L apr~s a c t i o n de la p r o n a s e . (M~me FIG. 4. coloration et m~me grossissement que la figure 3).
FIG. 5. - -
H D L aprbs a c t i o n de la p h o s p h o l i p a s e .
(Mdme coloration figure 3).
et
m~me
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 2.
grossissement
que
la
-
-
Fro. 6. - - H D L apr~s a c t i o n s s u c c e s s i u e s de la p r o n a s e et de la p h o s p h o l i p a s e . (M~me coloration et m~me
grossissement que la figure 3).
Structure
moldculaire
rants r e t e n u s p a r des anfractuosit6s h la s u r f a c e des particules. Le clich6 de la figure 4 (m6me c o l o r a t i o n et mbme g r o s s i s e m e n t que p r 6 c 6 d e m m e n t ) repr6sente les l i p o p r o t 6 i n e s l o u r d e s apr~s action d e la p r o n a s e . L ' a s p e c t g6n6ral des p a r t i c u l e s a compl6t e m e n t chang6. Ceci ne doit pas s u r p r e n d r e si l'on ne p e r d pas de vue que la moiti6 des constituants des HDL, qui est prot6ique, a 6t6 h y d r o lys6e. Une g r a n d e d i s p e r s i o n a p p a r a i t d a n s la taille des p a r t i c u l e s , qui est c e r t a i n e m e n t li6e au degr6 d ' a v a n e e m e n t de la r 6 a c t i o n e n z y m a t i q u e . De plus l ' a u g m e n t a t i o n de la laille des p a r t i c u l e s m o n t r e qu'il y a eu fusion et r 6 a r r a n g e m e n t des c o n s t i t u a n t s restants. Le clich6 de la figure 5 m o n t r e que F a c t i o n de la p h o s p h o l i p a s e , seule ou conjugu6e avec celle de la lipase, n ' e n t r a i n e que p e u de m o d i f i c a t i o n s m o r p h o l o g i q u e s quant h l ' a s p e c t g6n6ral des p a r t i cules ; mats on constate une a u g m e n t a t i o n d ' i m p o r t a n c e v a r i a b l e de la faille des p a r l i c u l e s . Quant h la lipase, agissant seule, elle n ' e n t r a i n e a u c u n e m o d i f i c a t i o n de la s t r u c t u r e de la p a r t i c u l e de HDL.
des lipoprotdines.
259
des qui ont fusionn6. Le t r a i t e m e n t p a r la phosp h o l i p a s e entraine, lui aussi, une a u g m e n t a t i o n de la taille des p a r t i c u l e s , mats sans m o d i f i c a t i o n de l ' a s p e c t g6n6ral. La p r o n a s e et la p h o s p h o l i pase utilis6es s u c c e s s i v e m e n t p r o d u i s e n t une augm e n t a t i o n trbs nette de la taille des p a r t i c u l e s (fig. 9).
Fro. 7. - - LDL intacte. (Grossissement final 160.000).
Les effets les plus i m p o r t a n t sont observ6s lorsque l'on fair agir s u r les HDL la p r o n a s e clans un p r e m i e r temps, la p h o s p h o l i p a s e ensuite. L ' a s p e c t observ6 (fig. 6) est alors c e h d de p a r t i cules s p h 6 r i q u e s 6voquant f o r t e m e n t la forme de gouttelettes d ' h u i l e dont c e r t a i n e s ont fusionn6. L e s l i p o p r o l ~ i n e s l~g~res ( L D L ) .
Le clieh6 de la figure 7 r e p r 6 s e n t e les l i p o p r o t6ines 16gbres avant tout t r a i t e m e n t enzymatique. (Coloration n6gative au p h o s p h o t u n g s t a t e . Grossissement final de 160.000). Les p a r t i e u l e s ont un c o n t o u r p o l y g o n a l et une t r a n s p a r e n c e u n i f o r m e . A p r e m i e r e vue, la forme p o l y g o n a l e p o u r r a i t ~tre impos6e p a r les c o n t r a i n t e s des p a r t i c u l e s en contact. Mats on la r e t r o u v e e n c o r e clans les pr6p a r a t i o n s b e a u c o u p p l u s dilu6es. I1 ne f a u d r a i t c e p e n d a n t pas e x c l u r e une a c t i o n du colorant, les p a r t i c u l e s 6rant globulaires clans leur 6tat n o r m a l . Le d i a m b t r e tr6s u n i f o r m e des p a t r i c u l e s a 6t6 mesur6 sur les clich6s. I1 est de l ' o r d r e de 200 250 5, ce qui est c o m p a t i b l e avec les r6sultats de n o m b r e u x auteurs [1, 22, 23, 24]. L ' a c t i o n de la p r o n a s e (fig. 8) e n t r a i n e m o i n s de m o d i f i c a t i o n s que dans le cas des HDL, ainsi que le laisse p r 6 v o i r la t e n e u r plus faible en p r o t6ines des LDL. I1 a p p a r a i t , ici encore, une nette a u g m e n t a t i o n de la taille des p a r t i c u l e s . I1 se p r o duit aussi des sortes de flaques real d6limit6es c o r r e s p o n d a n t p r o b a b l e m e n t ~ des amas de lipiBIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 2.
FIG. 8. - - LDL apr$s action de la pronase. (Grossissement final 160.000).
FIG. 9. - - LDL apr~s actions successives de la roet de la phospholipase, (Grossissement ~nral 160.000),
nase
260
R . H a d d a m , R. H e l i o et D. G. D e r v i c h i a n .
Un des fairs les plus i m p o r t a n t s est l'abserbee de toute modification m o r p h o l o g i q u e lorsque l'on fait agir la l i p a s e . La d i g i t o n i n e aussi est sans effet, malgr6 la trbs forte t e n e u r en cholest6rol de ces particules. Les lipoprotkines tr~s I~g~res (VLDL).
Le clich6 de la figure 10 est relatif aux VLDL a v a n t route attaque enzymatique. (Coloration n6gative au Phosphotungstate. Grossissement de 160.000). A la diff6rence des deux autres classes de lipoprot6ines, la taille des particules est ici trbs variable. Des diam6tres de 300 h 800 ~ ont 6t6 trouv6 en accord avec les r6sultats des autres auteurs [1, 25, ~6].
Le fair le plus f r a p p a n t est l ' a c t i o n de la lipase, qui diff6rencie les VLDL des HDL et des I.DL. Avec les VLD,L, les p a r t i c u l e s sont attaqu6es p a r la lipase, elles d e v i e n n e n t petites et irr6guli6res (fig. 11). Les triglyc6rides sont donc d i r e c t e m e n t accessibles h l'enzyme. Apr6s attaque p a r ia pronase, puts p a r la lipase, on voit sur le clich6 de la figure 12 qu'il y a dissociation des p a r t i c u l e s et a p p a r i t i o n de grands areas de c o n s t i t u a n t s p r o b a b l e m e n t lipidiques. La p h o s p h o l i p a s e n ' e n t r a i n e p r a t i q u e m e n t pas de modifications de la structure de la p a r t i c u l e de VLDL. Ceci est li6 p r o b a b l e m e n t h sa t e n e u r relat i v e m e n t faible en p h o s p h o l i p i d e s p a r r a p p o r t aux triglyc6rides.
i
:
FIG. 10. - 160.000).
VLDL intactes.
(Grossissement final
FIG. 12. - - VLDL apr~s actions successioes de la pronase et de la lipase. (Grossissement final 160.000). DISCUSSION E T CONCLUSIONS GENERALES. Nous e x a m i n e r o n s d ' a b o r d le cas des tIDL et des LDL.
Fro. 11. - - VLDL apr~s action de la lipase. (Grossissement final 160.000). BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 2.
Les triglyc6rides, que ce soit dans les HDL ou dans les LDL, ne sont pas aceessibles h Faction de la lipase. Ceci est prouv6 aussi b i e n p a r les mesures titrim6triques, 06 a u c u n e h y d r o l y s e n'est mise en 6vidence, que p a r l ' o b s e r v a t i o n au microscope 61ectronique, off a u c u n e modification m o r p h o l o g i q u e n ' a p p a r a i t apr6s avoir mis ces deux classes de lipoprot~ines en pr6sence de la lipase. P a r contre, d6s que le c o n s t i t u a n t prot6ique de ces deux l i p o p r o t 6 i n e s est hydrolys6, les triglyc6rides d e v i e n n e n t accessibles /~ leur enzyme, ainsi que l'a m o n t r 6 le dosage titrim6trique. On peut d o n c c o n c l u r e que les triglyc6rides sont dissimul6s p a r la prot6ine.
Structure moldculaire des iipoprotdines. Les p h o s p h o l i p i d e s sont d i r e c t e m e n t accessibles h l ' a c t i o n de la phospholipase ainsi que le m o n t r e le titrage p o t e n t i o m 6 t r i q u e ; bien pins, u n traitement pr6alable par la p r o n a s e ne modifie en r i e n le r6sultats du titrage lors de l ' h y d r o l y s e des phosp h o l i p i d e s p a r leur enzyme. Ainsi, de ce p o i n t de vue, les p h o s p h o l i p i d e s ne sont pas dissimul6s par la prot6ine. Cependant, il faut signaler ici que, dons le cas des HDL, qui c o n t i e n n e n t 50 p. cent de prot6ine, les p o l y s a e c h a r i d e s sulfat6s ne peuvent se fixer sur les bases azot6es des phospholipides lant que la prot6ine est intacte. La destruction de celle-ei p a r la p r o n a s e p e r m e t la r6action de fixation ~27]. Avec les LDL, qui ne c o n t i e n n e n t que 25 p. cent de p r o t 6 i n e p o u r 20 p. cent de phospholipides, la fixation des p o l y s a c e h a r i d e s sulfat6s peut se faire sans avoir ~ 61iminer la prot6ine E28]. Quant au c o n s t i t u a n t prot6ique, tout ce qui vient d'6tre dit p r o u v e qu'il est accessible h la prot6ase. D'ailleurs, l ' e x a m e n p a r microscopic 61ectronique m o n t r e toujours des modifications morphologiques apr6s l ' i n c u b a t i o n des lipoprot6ines avec la pronase. Grhce h l'6tude faite d ' u n e fa~on parall61e, p a r titrage et p a r examen au microscope 61ectronique, il a 6t6 prouv6 dans ce travail que l'attaqne des p h o s p h o l i p i d e s p a r leur enzyme provoque, aussi bien avec les HDL qu'avec les LDL, une augmentation de la taille des particules. I1 e n e s t de m6me l o r s q u ' o n fair agir la pronase. Mats, c'est avec les HDL, qui e o n t i e n n e n t la plus forte p r o p o r t i o n de prot6ine, que les modifications m o r p h o l o g i q u e s sont les plus importantes. On eonstate ainsi que la d i m i n u t i o n p a r h y d r o l y s e de l ' u n ou de l ' a u t r e des e o n s t i t u a n t s h y d r o p h i l e s (prot6ine, phospholipides) se t r a d u i t p a r une a u g m e n t a t i o n d=- la faille des particules. Ceci est d ' a u t a n t plus 6tonnant, dans le cas des HDL, que la prot6ine 61imin6e p a r la p r o n a s e repr6sente la moiti6 du poids des c o n s t i t u a n t s de la particule. Un m~,me type de relation entre c o m p o s i t i o n et taille a p p a r a l t d6jh lorsque l'on consid6re les diff6rentes classes de lipoprot6ines a v a n t toute modification. On constate que le p o u r c e n t a g e de la prot6ine est i n v e r s e m e n t p r o p o r t i o n n e l h la taille des particules: il est 50 p. cent p o u r u n e taille de 100 .~ dans les HDL, de 25 p. cent p o u r u n e taille de 200 h dans les I,DL et de 10 p. cent p o u r u n e taille m o y e n n e de 500 -~ dans les VLDL. Devant ces faits, on est tout n a t u r e l l e m e n t conduit h p e n s e r que la stabilit6 des p a r t i c u l e s lipoprot6iques, c'est-h-dire leur solubilit6 en milieu aqueux, est assur6e p a r la pr6senee des prot6ines et des p h o s p h o l i p i d e s et que ces deux c o n s t i t u a n t s
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se t r o u v e n t localis6s dans la r6gion superficielle des particules. On c o m p r e n d r a i t , du m6me coup, les autres fairs observ6s, h savoir la n o n accessibilit6 ~ la lipase des triglyc6rides rant que la prot6ine qui les recouvre est intaete. On comp r e n d r a i t de m6me que l'61imination d ' n n e partie des substances h y d r o p h i l e s stabilisantes e n t r a i n e la coalescence des partieules, une a u g m e n t a t i o n de la taille et p a r cons6quent u n e d i m i n u t i o n de la surface totale. Les images des figures 6 et 9, obtenues apr6s actions suceessives de la p r o n a s e et de la phopholipase, s ' e x p l i q u e n t a i n s i facilem e n t : les lipides insolubles (triglyc6rides, esters de cholest6ryl, eholest6rol) qui ont 6t6 6pargn6s a p p a r a i s s e n t alors sous forme de gouttes qui ont t e n d a n c e h f u s i o n n e r entre elles. Les modifications de la taille des p a r t i c u l e s /i la suite de l'61imination progressive des constituants h y d r o p h i l e s 6voque le cas b i e n c o n n u des 6mulsions oh la taille des gouttelettes est inversem e n t p r o p o r t i o n n e l l e h la quantit6 relative d'6muls i o n n a n t p a r r a p p o r t h l'huile 6mulsionn6e. Mats on ne peut assimiler les HDL et les LDL h de simples 6mulsions, p u i s q u e les p r o p o r t i o n s des diff6rents c o n s t i t u a n t s sont sp6cifiques de ehaque classe de lipoprot6ine, n o n seulement en ce qui c o n e e r n e ceux qui sont h y d r o p h i l e s et qui se t r o u v e r a i e n t ~ la surface des particules, mats en ce qui c o n c e r n e ceux qui sont /i l ' i n t 6 r i e u r . Des facteurs de s t r u c t u r e doivent, trbs p r o b a b l e m e n t , 6tre pris en c o n s i d 6 r a t i o n ; d ' a u t a n t plus que la m i c r o s c o p i c 61ectronique m o n t r e que les grains de colorant sont retenus ~ la surface des particules de HDL, r6v6Iant que cette surface n'est pas c o n t i n u e comme celle d ' u n e goutte d'6mulsion. Ainsi q u ' i l a 6t6 dit plus haut, cette p a r t i c u l a r i t 6 h c o n d u i t e e r t a i n s auteurs h p r o p o s e r l'existenee de sous-unit6s dans la structure des partieules. I1 n ' e n reste pas m o i n s vrai que, m6me si la partieule est form6e de sous-unit6s, il faut t e n i r compte de t o u s l e s fairs cit6s p r 6 c 6 d e m m e n t qui i n e i t e n t fortement h admettre que la prot6ine et les phosp h o l i p i d e s se t r o u v e n t localis6s dans la r6gion superfieielle de la partieule. P a r plus d ' u n aspect les VLDL se diff6reneient des autres classes de lipoprot6ines. E n ce qui c o n c e r n e la composition, les c o n s t i t u a n t s h y d r o philes (prot6ines + phospholipides) ne repr6s e n t e n t que 28 p. cent, et, du reste n o n - h y d r o phi/e, 80 p. cent est repr6sent6 p a r des triglye6rides. Leurs p a r t i c u l e s ont des tailles tr6s variables et sont r e l a t i v e m e n t fragiles, p u i s q u ' a u t o u r s de la coloration, elles d o n n e n t n a i s s a n c e p a r coalescence h des flaques de graisse. On peut dire q u ' i c i la c o m p a r a i s o n avec les 6mulsions se fait plus ais~ment.
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R. Hadd~m,
R . H e l i o et D. G. D e r v i c h i a n .
Le fair le p l u s i m p o r t a n t est, q u ' h l a d i f f 6 r e n c e d e s d e u x a u t r e s c l a s s e s , les t r i g l y c 6 r i d e s , a i n s i q u ' i l a 616 d i t p l u s h a u t , s o n t d i r e c t e m e n t a c c e s s i b l e s h la l i p a s e , s a n s q u ' i l s o i t n 6 c e s s a i r e d ' h y d r o l y s e r p r 6 a l a b l e m e n t la p r o t 6 i n e . L ' a t t a q u e p a r la l i p a s e se f a i t d ' u n e f a ~ o n s e m b l a b l e ~ c e q u i se p a s s e a v e c les 6 m u l s i o n s o r d i n a i r e s d e t r i g l y c 6 r i d e s u t i l i s 6 s p o u r le d o s a g e d e l ' a c t i v i t 6 d e s p r 6 parations de lipase, au point de donner des courb e s de t i t r a g e d ' a l l u r e i d e n t i q u e . Si d o n c les e o n s t i t u a n t s p r o t 6 i q u e s et p h o s p h o l i p i d i q u e s se trouvent dans la r6gion superficielle des partie u l e s , ils se l a i s s e n t f a c i l e m e n t t r a v e r s e r p a r la l i p a s e , tel q u ' u n 6 m u l s i o n a n t o r d i n a i r e ; ce q u i exclut l'existence d'une structure organis6e. D e l ' e n s e m b l e d e s f a i r s o b s e r v 6 s et les d i s c u s s i o n s , il r e s s o r t q u e d a n s les t r o i s c l a s s e s d e ] i p o p r o t 6 i n e s , la p r o t 6 i n e et les p h o s p h o l i p i d e s se t r o u v e n t l o s a l i s 6 s d a n s la r 6 g i o n s u p e r f i c i e l l e d e s p a r t i c u l e s . C e p e n d a n t , la s i t u a t i o n d e l a p r o t 6 i n e et d e s p h o s p h o l i p i d e s n'est pas identique sons t o n s les r a p p o r t s . L ' h y d r o l y s e d e s p h o s p h o l i p i d e s s e u l s n e suffit p a s h r e n d r e les t r i g l y c 6 r i d e s a c c e s s i b l e s , a l o r s q u e , s a n s t o n s les cas, l ' 6 1 i m i n a t i o n d e la p r o t 6 i n e p e r m e t h la l i p a s e d ' a t t a q u e r les triglyc6rides. Mais l ' e x p 6 r i e n c e c i t 6 e p l u s h a u t , r e l a t i v e h l a f i x a t i o n d e s p o l y s a c c h a r i d e s s u l f a t 6 s [27] m o n t r e q u e les p h o s p h o , l i p i d e s s a n t a s s e z 6 t r o i t e m e n t a s s o c i 6 s h la p r o t 6 i n e . E n effet, si la p r 6 s e n c e d'une quantit6 de prot6ine aussi importante que 50 p. c e n t d a n s les H D L , n ' e m p 6 c h e p a s l a p h o s p h o l i p a s e d ' a t t e i n d r e la f o n c t i o n i n t 6 r e s s 6 e d e s m o l 6 c u l e s d e p h o s p h o l i p i d e , la f i x a t i o n d u p o l y s a c c h a r i d e s u l f a t 6 s u r la b a s e a z o t 6 e du p h o s p h o l i p i d e n e p e n t se f a i r e q u ' a p r 6 s a v o i r 61imin6 c e t t e prot6ine. II n ' e n r e s t e p a s m o i n s v r a i q u e c ' e s t la p r o t 6 i n e q u i j o u e le r61e p r i n c i p a l , a u s s i b i e n d a n s la s t a b i l i t 6 q u e d a n s la s t r u c t u r e d e s p a r t i c u l e s d e s diff6rentes classes de lipoprot6ines, puisqne, ainsi q u e n o u s l ' a v o n s s o u l i g n 6 , la t a i l l e d e s p a r t i c u l e s est e n r e l a t i o n a s s e z p r 6 c i s e a v e c le p o u r c e n t a g e de prot6ine. R~suM~.
Chacune des trois classes de lipoprot6ines (lourdes, 16g6res et tr~s 16g6res) a ~t6 soumise syst~matiquem e n t h l'action de la pronase, de la lipase et de la phospho.litmse A, clans des o.rdres de succession diff6rents. Ceci afin de m e t t r e eu ~vidence l'aeeessibilit6 des diff6rents c o n s t i t u a n t s des lipaprot6ines et d ' a v o i r des r e n s e i g n e m e n t s sur la s t r u e t u r e de leurs particules.
BIOCHIMIE, 1974, 56, n* 2.
Les effets de ces actions out $t$ suivis d'une fagon parall~le p a r titrage potenti~>m6trique et p a r o.bservation a u microscope 61eetronique. Dans le cas des HDL et des LDL, les triglyc6rides ne sont accessibtes h la lipase qu'apr6s h y d r o l y s e de la prot6ine. Celle-ei ainsi que les p h o s p h o l i p i d e s sont d i r e e t e m e n t aecessibles leurs enzymes respeetifs. L ' ~ l i m i n a t i o n de la prot~.ine et des p h o s p h o l i p i d e s e n t r a l n e unc a u g m e n t a t i o n , plus ou m g i n s irr6guli6re, de la taille des particules, eomme s'il y a v a i t coalescence des c o n s t i t u a n t s restants. Darts les VLDL, les triglyc6rides sont d i r e c t e m e n t aecessibles h la lipase et leur eo.mporteme~t les rapproehe d a v a n tage des 6mulsions ordinaires.
BIBLIOGRAPHIE. 1. Forte, G. M., Nichols, A. V. & Glaeser, R. M. (1968) Chem. Phys. Lipids, 2, 396-408. 2. Hart, C. J., Leslie, R. B. & Scanu, A. M. (1970) Chem. Phys. Lipids, 4, 367-375. 3. Scanu, A. M. (19'65) Proc. Nal. Acad. Sci. U.S.A., 54, 1699-1705. 4. Scanu, A. M. & Hirz, R. (1968) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 59, 890-894. 5. C h a p m a n , D., B a r r a t t , M. D. & Kamat, V. B. (1969) Biochem. biophys. Acta, 173, 154-163. 6. Leslie, R. B., in P l a s m a L i p o p r o t e i n s (1971), edit. b y R. M. S. Smellie, Acad. Press, p. 47-85. 7. Scanu, A. M. & W i s d o m , C (1972') An. Bey. Biochemistry, 41, 703-729. 8. Tayeau, F. & Breton, J. (1947) B a l l Soc. Chim. Biol., 29, 687-680. 9. Camejo, G. (1969) Biochim. biophys. Acta, 175, 290300. 10. Ashworth, L. A. E. & Green, C. (1963) Biochem. J., 89, 561-564. 11. Nishida, T. (1968) J. L i p i d Res., 9, 627-635. 12. Aggerberk, L. & Scanu, A. (1971) Circulation, 44, 11 (Ahst.). 13. Pollard, H., Scanu, A. M. & Taylor, E. W. (1969) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 64, 304-310. 14. Bruckdorfer, K. R. & Green, C. (19'67) Biochem. J., 104, 270-277. 15. Girard, M. L. & Canal, J. (1965) C. R. Aead. Sei. Paris, 260, 4377-4380. 16. De Lalla, O. F. & Goffman, J. W. (1954) Meth. biochem. Analysis, D. Gliek, ed., Interseience, N.Y., 1, 459-478. 17. A y r a u l t - J a r r i e r , M., Levy ~Vald, R. & Polonovski, J. (1963) Bull. Soe. Chim. Biol., 45, 349-359. 18. Bocquet, P., lzard, Y., Meaume, J. & J o u a n n e t , M. (1967) Ann. Inst. Pasteur, 112, 213-216. 19. Laboureur, P. & Labrousse, M. (1966) Bull. Soe. Chim. Biol., 48, 747-754. 20. Desnuelle, P. (1961) Adv. in E n z y m o l o g y , 23, 129. 21. Forte, T., Norum, K. R., Glomset, J. A. et Nichols, A. V. (1971) J. Clin. Inuest., 50, 1141-1148. 22. Gotto~ A. M., Levy, R. I., Rosenthal, A. S., B i r n h a u m e r , M. E. & Frederikson, D S (1968) Biochem. Biophys. Res. Commun., 31, 699-705. 23. Pollard, H., Scanu, A. M. a Taylor, E. W. (1969) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 64, 304-310. 24. Margolis, S. (19'67) J. L i p i d Res., 8, 501-507. 25. Hayes, T. L. & Heveitt, J. E. (1957) J. appl. Physiol., llL 425-428. 26. Lindgren, F. T. & Nichols, A. V. (1960) in The P l a s m a Proteins ed. F. W. P u t n a m , Acad. Press, N.Y., 2, 1-58. 27. Canal, J. & Girard, M. L. (1968) Bull. Soe. Chim. Biol., 50, 1523-1536. 28. Burstein, M. & Samaille, J. (1955) C. R. Acad. Sci. Paris, 2~1, 664.