Aplasia medular tras administración de azatioprina: papel del polimorfismo genético de la tiopurina metiltransferasa

NOTA CLÍNICA Aplasia medular tras administración de azatioprina: papel del polimorfismo genético de la tiopurina metiltransferasa Hèctor Corominasa, Montserrat Domènechb, Dolors González-Juanc, Begoña González-Suárezc, César Díaza, Joan Pujolc, Guillermo Vázqueza y Montserrat Baigetb Servicios de aMedicina Interna, bGenética y cPatología Digestiva. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Barcelona.

FUNDAMENTO: La azatioprina es un fármaco inmunodepresor ampliamente utilizado en el tratamiento de diversos procesos autoinmunes. Los efectos adversos del tratamiento están en relación con la actividad de la tiopurina metiltransferasa (TPMT), enzima que interviene en el metabolismo de la azatioprina. La existencia de variantes alélicas del gen que codifica dicha enzima permite clasificar a los pacientes en tres grupos: de riesgo leve, moderado y alto de padecer una mielodepresión tras la administración de azatioprina. PACIENTES Y MÉTODOS: Se ha realizado el estudio de las variantes alélicas del gen de la TPMT en las posiciones 460 y 719 mediante reacción en cadena de la polimerasa y digestión con enzimas de restricción, en un enfermo con enfermedad de Crohn que presentó aplasia tras la administración de azatioprina, así como de sus familiares directos disponibles. RESULTADOS: En la muestra del caso en estudio se identificó la variante alélica más frecuente del gen de la TPMT asociada a una actividad enzimática disminuida. La madre del paciente, así como su hermana, también presentaron esta variante. CONCLUSIÓN: La identificación genotípica de las variantes alélicas del gen TPMT es un método eficaz para identificar a los pacientes con riesgo leve, moderado o grave de padecer una mielodepresión tras la administración de azatioprina. Palabras clave: Azatioprina; Tiopurina metiltransferasa.

Aplasia after azathioprine administration: role of the thiopurine methyltransferase genetic polymorphism BACKGROUND: Azathioprine is an immunosuppressor drug widely used in the treatment of autoimmune diseases. Adverse effects during treatment are related to the activity of thiopurine methyltransferase (TPMT), an enzyme which plays a role in azathioprine metabolism. The presence of the allelic variants of the TPMT gene allows us to classify patients into three different groups: high, moderate and low risk of myelosuppression after receiving standard doses of azathioprine. PATIENTS AND METHODS: Study of the allelic variants of the TPMT gene in the positions 460 and 719 with PCR methods in a patient with Crohn’s disease, who developed aplasia after receiving azathioprine. The study was extended to his relatives. RESULTS: The patient under study carried the most frequent variant allele of the TPMT gene associated with low enzymatic activity. The mother and one sister of the patient were also carriers of this allelic variant. CONCLUSIONS: Genotyping the allelic variants of the TPMT gene is a useful method to identify patients at moderate or high risk of myelosuppression after administration of azathioprine. Med Clin (Barc) 2000; 115: 299-301

Correspondencia: Dra. M. Baiget. Servei de Genètica. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Avgda. Sant Antoni M.a Claret, 167. 08025 Barcelona. Correo electrónico: [email protected] Recibido el 2-3-2000; aceptado para su publicación el 4-7-2000

La azatioprina, sintetizada por primera vez en 1957, es un análogo de las purinas con actividad inmunodepresora y se utiliza para el tratamiento de procesos autoinmunitarios, entre los que se encuentra la enfermedad inflamatoria intestinal1-3. El estrecho margen entre su actividad terapéutica y la aparición de efectos secundarios se mantiene gracias al ajuste de dosis según peso corporal y al equilibrio enzimático de la vía de las tiopurinas. La azatioprina se convierte en 6-mercaptopurina, que puede ser metabolizada mediante metilación a través de la tiopurina metiltransferasa (TPMT), oxidada gracias a la xantina oxidasa (XO) a ácido tioúrico, o catabolizada hacia nucleótidos de la 6-tioguanina a través de la hipoxantina-guanina-fosforribosil transferasa. Estos últimos metabolitos son los responsables de la citotoxicidad a través de su incorporación al ADN y ARN4. La TPMT es una enzima con actividad en la metilación de compuestos aromáticos y heterocíclicos como los quimioterápicos 6-mercaptopurina (6-MP), tioguanina, y el inmunodepresor azatioprina5,6. Existe una correlación inversa entre la actividad de la TPMT y la acumulación de nucleótidos de la 6-tioguanina7, de modo que aquellos pacientes con una baja actividad enzimática que reciban dosis estándar de azatioprina pueden presentar efectos secundarios como la citotoxicidad y aplasia medular. Weinshilboum y Sladek8 describieron, en 1980, que la actividad de la TPMT está regulada por un polimorfismo genético. Estos autores demostraron que, en una población aleatorizada de 298 individuos, el 86,6% presentaban una actividad alta de TPMT, un 11,1% tenían una actividad intermedia y el 0,3% una actividad enzimática baja. Este patrón trimodal de actividad de la TPMT ha sido corroborado posteriormente por otros autores9. El gen de la TPMT se localiza en el cromosoma 6p22.3, se extiende a lo largo de unas 34kb de ADN genómico y contiene 10 exones. La identificación de tres mutaciones en dicho gen, presentes entre el 80 y el 95% de la población caucásica con actividad intermedia o baja de la

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MEDICINA CLÍNICA. VOL. 115. NÚM. 8. 2000

Pacientes y métodos Caso clínico

I:1

II:1 TPMT1/TPMT3A

I:2 TPMT1/TPMT3A

II:2 TPMT1/TPMT1

enzima, ha impulsado el estudio genotípico de estos pacientes6. Las variantes alélicas del gen TPMT más frecuentes en población caucásica resultan de la combinación de dos mutaciones puntuales en las posiciones 460 (G → A) del exón 7 y 719 (A → G) del exón 10 (tabla 1). Estas variantes comportan cambios en la secuencia de aminoácidos de la proteína sintetizada (en la posición 154 Ala → Thr y 240 Tyr → Cys, respectivamente)10. Estudios más recientes han identificado la existencia de otros alelos menos frecuen-

II:3 TPMT1/TPMT3A

Fig. 1. Genealogía del paciente en estudio (II:1). Se indica el genotipo TPMT de los individuos analizados. La estructura de las variantes alélicas se detalla en la tabla 1.

tes que se correlacionan también con una actividad disminuida de la TPMT11,12. Estos datos indican que el análisis molecular de la TPMT puede ser un método útil para identificar a pacientes con riesgo elevado de toxicidad a las tiopurinas. En el presente trabajo, se expone el caso de un paciente con enfermedad de Crohn tratado con azatioprina, que presentó aplasia medular y en el que se ha demostrado la presencia de la variante alélica más frecuente del gen TPMT asociada a una actividad disminuida de la enzima.

TABLA 1 Variantes alélicas de la tiopurina S-metiltransferasa Designación alélica

Nucleótido en posición 460

Nucleótido en posición 719

Actividad catalítica

G460 G460 → A G460 → A G460

A719 A719 → G A719 A719 → G

Normal Pérdida completa Reducción parcial Reducción parcial

TPMT1 (wild type) TPMT3A TPMT3B TPMT3C

La mutación G460 → A produce la sustitución de aa Ala154 → Thr. La mutación A719 → G produce la sustitución de aa Tyr240 → Cys.

TABLA 2 Evolución analítica del paciente antes y después de la retirada de azatioprina Con azatioprina (mg/día)

Hemoglobina (g/l) Hematíes (× 1012/l) Reticulocitos (× 1012/l) Plaquetas (× 109/l) Leucocitos (× 109/l) Polimorfonucleares (× 109/l)

50 Enero de 1998

100 Marzo de 1998

100 16-4-1998

147 4,52 0,050 235 10,6 5,59

143 4,2 – 210 8,67 4,78

90 2,71 0,001 93 1,87 0,65

Sin azatioprina 21-4-1998

68 2,16 0,030 115 2,97 0,45

18-5-1998

17-7-1998

112 3,20 0,120 167 5,7 2,30

144 3,81 0,040 156 6,89 4,00

Fig. 2. Patrón de migración electroforética en gel de poliacrilamida de los fragmentos de ADN obtenidos mediante digestión con enzimas de restricción del producto amplificado por reacción en cadena de la polimerasa. En la parte inferior de cada carril se señalan las distintas muestras analizadas, identificadas de acuerdo con la genealogía de la figura 1.

300

Varón de 30 años con enfermedad de Crohn de dos años de evolución, diagnosticado mediante fibrocolonoscopia más biopsia. Durante la evolución de la enfermedad presentó escasa respuesta al tratamiento con mesalazina y glucocorticoides. En enero de 1998 se decidió iniciar tratamiento con 50 mg/día de azatioprina. A los dos meses se incrementó la dosis hasta 100 mg/día (en marzo del mismo año) y, un mes más tarde, consultó por un cuadro de palidez cutáneomucosa y astenia intensa. Se practicó analítica, donde se objetivó citopenia, con una hemoglobina de 90 g/l, plaquetas de 93 × 109/l y 1,87 × 109/l leucocitos, con 0,65 × 109/l neutrófilos, y se decidió suspender la azatioprina. A los tres días se practicó una analítica de control, que ofreció los siguientes datos: hemoglobina, 68 × g/l; leucocitos, 2,97 × 109/l; neutrófilos, 0,45 × 109/l, y plaquetas, 115 × 109/l. Se orientó el cuadro como probable pancitopenia asociada a azatioprina o bien aplasia medular inmune en un paciente con enfermedad de Crohn. Se transfundieron dos concentrados de hematíes, y el paciente presentó una mejoría clínica franca. Se practicaron un mielograma y una biopsia de médula ósea, donde destacaba una médula ósea hipocelular, sin presencia de blastos ni paro madurativo. El estudio de glucoproteínas de membrana eritrocitarias CD55 y CD59 fue normal, sin imágenes de doble población, y la inmunofluorescencia directa en las subpoblaciones linfoides de médula ósea fue así mismo normal. Al mes de la retirada de la azatioprina, el paciente presentó una mejoría clínica progresiva, acompañada de una recuperación de los parámetros analíticos: 5,7 × 109/l leucocitos, con 2,3 × 109/l neutrófilos, 167 × 109/l plaquetas y hemoglobina de 112 g/l (tabla 2). Se diagnosticó pancitopenia secundaria a azatioprina. Al mes siguiente se observó normalización de los parámetros analíticos. En el contexto de un estudio sobre el polimorfismo genético de la TPMT en pacientes tratados con azatioprina que se lleva a cabo en el Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, se analizó de forma retrospectiva la muestra de ADN de dicho paciente y de los miembros disponibles de su familia. Métodos El ADN se obtuvo a partir de leucocitos de 5 ml de sangre periférica mediante métodos convencionales13, y se analizó la presencia de las variantes alélicas en los nucleótidos 460 y 719 mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y digestión posterior del producto de amplificación con enzimas de restricción específicas6. La separación electroforética de los fragmentos de ADN generados se efectuó en un gel de poliacrilamida (Gene Gel Excel 12.5/24; Amesham Pharmacia Biotech Europe GmbH, Parc Tecnològic del Vallès, Cerdanyola, Barcelona). El patrón de migración permite identificar las variantes más frecuentes del gen TPMT.

Resultados En la muestra de ADN del caso en estudio se identificó la presencia de dos variantes alélicas frecuentes del gen TPMT asociadas a una actividad de la enzima disminuida: G460A y A719G. Para aclarar si estas dos variantes estaban presentes en el mismo alelo TPMT (disposición en trans y denominado TPMT3A) y, por tanto, habían sido heredadas de un progenitor, o si las mutaciones se localizaban en cis (una en cada alelo TPMT y denominadas TPMT3B, TMPT3C) y fueron transmitidas independientemente por cada uno de los dos progenitores, se efectuó un estudio familiar. La figura 1 muestra la genealogía y el genotipo TPMT de los familiares analizados. La

H. COROMINAS ET AL.– APLASIA MEDULAR TRAS ADMINISTRACIÓN DE AZATIOPRINA: PAPEL DEL POLIMORFISMO GENÉTICO DE LA TIOPURINA METILTRANSFERASA

madre, I-2, posee en uno de los alelos la variante TMPT3A, que ha transmitido al caso índice II-1 y a una hermana, II-3. La figura 2 muestra el patrón electroforético de cada uno de los miembros de la familia. El caso en estudio es heterocigoto para el alelo TPMT3A, que es el más prevalente en la raza blanca y está asociado a una disminución de la actividad catalítica de la TPMT. Discusión Un estudio de población seleccionada y aleatorizada demostró que un 88,6% de la población eran homocigotos para un alelo de actividad enzimática alta de la TPMT (TPMTHH), uno de cada 300 sujetos (0,3%) era homocigoto para el alelo de actividad enzimática baja (TPMTLL) y el 11% restante eran heterocigotos con actividad enzimática intermedia (TPMTLH)8. Así, se establecen dos patrones de actividad enzimática diferenciados: individuos normales sin riesgo de toxicidad (TPMTHH), e individuos con riesgo moderado (TPMTLH) o alto (TPMTLL) de padecer una mielodepresión grave. Existen diferentes alelos del gen de la TPMT, de los cuales la variante TPMT3A, debida a una mutación en las posiciones G460A y A719G del gen de la TPMT, es la más frecuente en la población caucásica10. En un estudio de población española en que analizamos un total de 105 donantes de sangre, se identificaron 10 individuos portadores heterocigotos de un alelo no funcional (9,5%). Uno de ellos era portador del alelo TPMT3B, cuatro eran portadores de alelo TPMT3C y el más prevalente del dichos alelos fue el TMTP3A, que apareció en cinco de los 10 heterocigotos. La frecuencia de las variantes alélicas en población española es similar a la comunicada en la población caucásica. Un individuo heterocigoto para alguna de las diferentes variantes alélicas del gen de

la TPMT tendrá una actividad enzimática disminuida y se engloba dentro del grupo de enfermos con riesgo moderado de padecer una mielodepresión tras la administración de azatioprina. Un individuo homocigoto para dichas variantes tendrá una capacidad nula de metabolizar dicho fármaco, por lo que presentará un elevado riesgo de toxicidad si recibe azatioprina6,10. En este trabajo, se ha identificado como portador heterocigoto del alelo TPMT3A a un paciente con enfermedad de Crohn que presentó una pancitopenia secundaria a la administración de azatioprina. Este cuadro responde a una disminución de la actividad de la enzima TPMT debida a la presencia de la variante TPMT3A. La identificación genotípica de las variantes alélicas de la TPMT mediante PCR es un método eficaz, sencillo, económico y reproducible para identificar a los pacientes con un riesgo moderado/alto de padecer una mielodepresión tras la administración de azatioprina. Este tipo de estudio, previo al tratamiento, que ha sido propuesto por otros autores14, permite ajustar la dosis de fármaco en caso de que se debe administrar a enfermos heterocigotos u homocigotos para los diferentes alelos de la TPMT. Agradecimiento Los autores agradecen la inestimable y desinteresada colaboración del Dr. Manuel Brufal Mojica y expresan su gratitud a los miembros de la familia estudiada. Este trabajo ha sido parcialmente financiado con la colaboración de Laboratoris Uriach (Barcelona) y Merck, Sharp & Dohme, España.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Present DH. 6-Mercaptopurine and other immunosuppressive agents in the treatment of Crohn’s disease and ulcerative colitis. Gastroentrol Clin N Am 1989; 18: 57-71.

2. Sandborn WJ, Van OE, Zins BJ, Tremaine WJ, Mays DC, Lipsky JJ. An Intravenous loading dose of azathioprine decreases the time to response in patients with Crohn’s disease. Gastroenterology 1995; 109: 1808-1817. 3. D’Haens G, Geboes K, Ponette E, Penninckx F, Rutgeerts P. Healing of severe recurrent ileitis with azathioprine therapy in patients with Crohn’s disease. Gastroenterology 1997; 112: 1475-1481. 4. Snow JL, Gibson LE. The role of genetic variation in thiopurine methyltransferase activity and the efficacy and/or side effects of azathioprine therapy in dermatologic patients. Arch Dermatol 1995; 131: 193-197. 5. Remy CN. Metabolism of thiopyrimidines and thyopurines: S-methylation with S-adenosylmethionine transmethylase and catabolism in mammalin tissue. J Biol Chem 1963; 238: 1078-1084. 6. Yates CR, Krynetski EY, Loennechen T, Fessing MY, Tai JL, Pui CH et al. Molecular diagnosis of thiopurine S-methyltransferase deficiency: genetic basis for azathioprine and mercaptopurine intolerance. Ann Intern Med 1997; 126: 608-614. 7. Lennard L, Van Loon JA, Weinshilboum RM. Pharmacogenetics of acute azathioprine toxicity: relationship to thiopurine methyltransferase genetic polymorphism. Clin Pharmacol Ther 1989; 46: 149-154. 8. Weinshilboum RM, Sladek SL. Mercaptopurine pharmacogenetics: monogenic inheritance of erythrocyte thiopurine methyltransferasa activity. Am J Hum Genet 1980; 32: 651-662. 9. McLeod HL, Lin JS, Scott EP, Pui CH, Evans WE. Thiopurine methyltransferase activity in American white subjects and black subjects. Clin Pharmacol Ther 1994; 55: 15-20. 10. Tai HL, Krynetski EY, Yates CR, Loennechen T, Fessing MY, Krynetskaia NF et al. Thiopurine Smethyltransferase deficiency: two nucleotide transitions define the most prevalent mutant allele associated with loss of catalytic activity in Caucasians. Am J Hum Genet 1996; 58: 694-702. 11. Otterness DM, Szumlanski CL, Wood TC, Weinshilboum RM. Human thiopurine methyltransferase pharmacogenetics. Kindred with a terminal exon splice junction mutation that results in loss of activity. J Clin Invest 1998; 101: 1036-1044. 12. Spire-Vayron de la Moureyre C, Debuysere H, Sabbagh N, Marez D. Vinner E, Chevalier ED et al. Detection of known and new mutations in the thiopurine S-methyltransferase gene by single-strand conformation polymorphism analysis. Hum Mutat 1990; 12: 177-185. 13. Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988; 16: 1215. 14. Jackson AP, Hall AG, McLelland J. Thiopurine methyltranferase levels should be measured before commencing patients on azathioprine. Br J Dermatol 1997; 136: 132-148.

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