Aplicación de la citometría de flujo al diagnóstico y seguimiento inmunofenotípico de las leucemias agudas

REVISIÓN

Aplicación de la citometría de flujo al diagnóstico y seguimiento inmunofenotípico de las leucemias agudas

43.505

Francisco José Ortuño Ginera y Alberto Orfaob a

Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario J.M. Morales Meseguer. Murcia. Servicio General de Citometría. Departamento de Medicina y Centro de Investigación del Cáncer. Universidad de Salamanca. b

El final de las décadas de los ochenta y noventa han traído una eclosión de nuevos métodos diagnósticos que han determinado un nuevo enfoque en la clasificación de las neoplasias hematológicas. Así, en pocos años hemos pasado de las clasificaciones basadas en la morfología1-4 o en la respuesta clínica5 a un intento de clasificación basado en la etiopatogenia molecular/bioquímica6,7. Sin embargo, es evidente que todavía queda un largo camino por recorrer para completar este propósito; por este motivo, en la reciente propuesta de la Organización Mundial de la Salud (OMS)6 aún conviven entidades clasificadas con métodos muy sofisticados junto a otras perfiladas de manera más convencional. De entre las nuevas metodologías diagnósticas, la citometría de flujo, por la rapidez en la obtención de resultados y su relativa sencillez técnica, se ha revelado como una herramienta de primer orden para facilitar el diagnóstico y seguimiento de estas entidades. Su información no sólo ha permitido refinar las antiguas clasificaciones morfológicas e identificar entidades de origen y pronóstico específicos, sino que además parece asociarse, al menos en algunos casos, a alteraciones moleculares específicas, como veremos con detalle más adelante. En este trabajo intentaremos resumir los avances de mayor relevancia clínica alcanzados gracias a esta metodología en relación con el diagnóstico de las leucemias agudas, haciendo hincapié en la integración de los datos aportados por la citometría con los obtenidos mediante otras técnicas, de manera particular, por la citogenética y los estudios de genética molecular. En este sentido, es nuestro objetivo centrar la información que se revisa en los factores que afectan al diagnóstico y clasificación de las leucemias agudas y en datos útiles para el seguimiento de la enfermedad mínima residual (EMR). Análisis inmunofenotípico de las leucemias agudas: conceptos generales La identificación de la población neoplásica es fundamental en el estudio del fenotipo leucémico. Para la discriminación de las diferentes poblaciones celulares presentes en muestras leucémicas, en un primer paso resulta de gran utilidad la consideración simultánea de las características de dispersión de luz –frontal (FSC) y lateral (SSC)– de cada subpoblacion celular, en relación con el patrón de expresión del antígeno panleucocitario CD458-12. El segundo paso del aná-

Correspondencia: Dr. F.J. Ortuño Giner. Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario J.M. Morales Meseguer. Marqués de los Vélez, s/n. 30008 Murcia. Correo electrónico: [email protected] Recibido el 22-10-2001; aceptado para su publicación el 6-11-2001.

lisis consiste en la identificación antigénica de entre las subpoblaciones celulares presentes en la muestra de la clona o las clonas que contienen células neoplásicas. Los estudios inmunofenotípicos han contribuido a establecer pronósticos específicos en los diferentes subtipos de leucemias linfoblásticas agudas de línea B y, en menor grado, en las de línea T8,13-15. Además, resultan imprescindibles para el diagnóstico de las leucemias agudas no linfoblásticas (LANL) M0 y M7, y muy útiles para el diagnóstico de las formas variantes de la LANL M3. Por otra parte, también es cierto que, aunque hoy por hoy parece difícil establecer una relación estrecha entre expresión antigénica, subtipo morfológico y genotipo en la mayoría de los casos8,16-19, existe una novedosa tendencia a asociar perfiles inmunofenotípicos característicos a entidades con alteraciones biológicas específicas y que mayoritariamente presentan alteraciones citogenéticas/moleculares concretas20-26. Leucemias agudas no linfoblásticas Las LANL han sido definidas por el Grupo Europeo para la Caracterización Inmunológica de las Leucemias (EGIL) en función de la expresión de dos o más de los siguientes marcadores: mieloperoxidasa detectada por técnica inmunológicas (citMPO), CD13, CD33, CD65 y CD117, siendo probablemente citMPO el marcador más específico de la línea mieloide17,27. A este respecto, es de destacar la reciente descripción de un perfil inmunofenotípico con positividad para estos 5 marcadores mieloides (fenotipo panmieloide), no vinculado específicamente a ningún subgrupo de la clasificación French-American-British (FAB), que conformaría un grupo de LANL de buen pronóstico, con mayor supervivencia21. En nuestro entorno se sigue utilizando de un modo predominante la clasificación FAB para el diagnóstico de las LANL1,2,28. En relación con esta clasificación, los subtipos M0, M7 y, en menor grado, M6 necesitan con frecuencia para su identificación del inmunofenotipo, la LANL M3 presenta un perfil inmunofenotípico –HLADR–, CD13+ heterogéneo, CD15–/+ débil, CD34–/+ débil– que, aun no siendo completamente específico, sí es muy característico8,16,22,29, mientras que en los otros subtipos los hallazgos fenotípicos son habitualmente más heterogéneos8,16,30. Adicionalmente, determinadas características inmunofenotípicas se han relacionado con alteraciones citogenéticas (tabla 1) y manifestaciones clínicas de la enfermedad. Así, por ejemplo, dentro de este grupo de LANL la expresión de CD34, que es la característica inmunofenotípica que con mayor frecuencia se ha asociado a mal pronóstico8,31, se ha vinculado a la existencia de alteraciones citogenéticas en general, y en particular con inv(16), t(8;21), –5/5q–, 7/7q–, del(11)(q23) y alteraciones de 3q16. Otros marcadores relacionados con la existencia de alteraciones citogenéticas han sido CD2, CD9, CD10, CD15, CD19 y TdT16,19. Además, se han descrito otros Med Clin (Barc) 2002;118(11):423-36

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TABLA 1 Características citológicas, citogenéticas e inmunofenotípicas más frecuentes en las leucemias agudas no linfoblásticas Cariotipo

Inmunofenotipo asociado

Incidencia (%)

M0/M1 M2 M3 M4 M4

FAB

t(9;22)(q34;q11) o del(11)(q23) t(8;21)(q22;q22) t(15;17)(q22;q12) inv(16)(p13;q22) t(11;15)(q23;q12)

100 frente a 28 55 frente a 11 81 frente a 16 66 frente a 15

M4/M5

del(11)(q23) o t(9;11)(p11;q23)

CD19 y/o CD20 y/o CD24 CD13– CD13+/DR–/CD7–/CD19– CD13+/CD34+/CD36+ CD13+/CD14+/CD15+/CD18+/ CD33+/CD34–/CD36+/CD2+/CD9– Ag de línea B

< 1% 100 frente a 72

Tomada de Casasnovas et al16.

marcadores asociados a mal pronóstico, entre los que destacaremos CD44-6v32, CD5633 y CD11b34, y también a buen pronóstico, como CD5835. La expresión de antígenos linfoides en la LANL, muy útil para el estudio de la EMR, se ha asociado tanto a cariotipos de mal pronóstico –t(9;22), del (11)q(23)– como de pronóstico favorable –t(8;21), t(15;17) e inv(16)–, si bien considerada en conjunto no ha evidenciado cambios en el pronóstico16,3638 , pareciendo más apropiada su valoración en el contexto del perfil inmunofenotípico global y de los hallazgos citogenéticos8. Otro aspecto a considerar en el estudio fenotípico de las LANL es el hallazgo de más de una subpoblación de células leucémicas, lo que puede ocurrir en hasta el 85% de TABLA 2 Perfil inmunofenotípico de las leucemias agudas no linfoblásticas incluidas en la clasificación FAB sin alteraciones citogenéticas específicas M0

MPO ±o+ CD13 ±o+ CD34 + CD33 ± CD117 + HLA-DR + CD15 – CD14 – CD4 –o± CD11b – CD2 –o± CD7 –o± TdT ±o+ CD71 ± CD41a – CD42b – CD61 – CD56 –

M1

+ + + + + + –o± – –o± –o± – – –o± ± – – – –

M2

+ + ±o– + ±o+ + + – – ±o+ – – – ± – – – –o±

M4

+ + + + ±o+ + + + ±o+ ±o+ –o± –o± –o± ± – – –o± ±o+

M5a

± –o± ±o+ + ± + –o± ± ± ± – ± ± – – –o± ±o+

M5b

± ±o+ ±o– + – + –o± + + + – ± – ± – – –o± –o±

M6 a

+ +a ±a +a ± o +a + + – –o± –o± – – ± ++c +d +d +d –

M7b

– ± ± + + + –o± – –o± –o± – – ± –o± + + + –

a

En la fracción de blastos mieloides; ben megacarioblastos; cen elementos de serie eritroide; den megacarioblastos.

los casos y que, como la expresión de antígenos linfoides, tiene implicaciones para el estudio de la EMR39. A continuación revisaremos con más detalle las características fenotípicas de cada uno de los subtipos FAB (tabla 2), así como algunas de las nuevas entidades ya incluidas en la clasificación de la OMS6 y otras que, probablemente, lo serán en un futuro próximo (tabla 3). Leucemias agudas no linfoblásticas mínimamente diferenciadas o FAB M0 Los blastos de las LANL M0 característicamente presentan un FSC y SSC bajos, y habitualmente se localizan en regiones cercanas a la de los linfoblastos en los diagramas de CD45/SSC8,10,40. Hasta ahora se aceptaba que los blastos de esta entidad no presentaban positividad en ninguna tinción citoquímica, pero en ellos se detectaba en la mayoría de los casos mieloperoxidasa por técnica inmunocitoquímica (citMPO). Adicionalmente, se consideraba que expresaban un perfil mieloide inmaduro CD34+, HLA-DR+, CD117+, CD15–, CD14– con expresión variable de CD13, CD33 y CD11b, si bien su detección (incluso la positividad para más de uno de ellos) no era tan específica como la positividad para citMPO asociada a la negatividad de la mieloperoxidasa por técnica citoquímica para establecer el diagnóstico8,18,40-42. Muy recientemente se ha comunicado19 una expresión variable de citMPO en esta entidad con casi un 50% de casos negativos (menos del 10% de blastos citMPO+) y objetivándose un porcentaje más elevado de casos con positividad para CD13 que CD3319,30. Otros autores han apuntado que el perfil inmunofenotípico se relacionaría con el grupo de edad y se objetivaría más frecuentemente en adultos el fenotipo CD13+, CD33+, CD34+ y TdT+, en tanto que en niños sería algo más frecuente la negatividad o expresión débil de CD34, CD13 y, en menor grado, TdT, asociada a una expresión intensa de CD3343, aunque también se cuestionan estos datos36.

TABLA 3 Perfil inmunofenotípico de las leucemias agudas no linfoblásticas con alteraciones citogenéticas específicas MPO CD13 CD34 CD33 CD117 CD65 HLA-DR CD15 CD14 CD4 CD11b CD38 CD2 CD19 CD56 a

M2t(8;21)

M3t(15;17)

M4Eo inv(16)

t(9;22)a

–5/5q–

–7/7q–

3q21-q26

11q23

t(10;11)b

+ ±o+ + + + + + + – – +

+ + ± o – (M3v +) +o± ±o– + ±o– ±c – – ±o+

+ + + + + + + + ±o+ ±o+ ±

± + +

+ + + +

+ + + +

+ + + +

± –

±o–

±o–

+

+ ±

+ ±o–

+ –

±o–

– + ±o+

±d – ±o–

±o+ – ±o–

±o– +o± ±o–

+ ±o– ±o+ + ±o– + + + ±o– ± + + ±o– ±o– +

+ +

Leucemia aguda no linfoblástica de novo; bt(10;11) con morfología M2 y M5; cdébil; dM3 y M3v.

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Med Clin (Barc) 2002;118(11):423-36

– – ±o–

±o+ ±o+ ±o–

±o– ±o– ±o–

+ +

+

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A la vista de todo lo anterior resulta controvertida la propuesta de los siguientes criterios diagnósticos revisados para esta entidad: a) recuento de blastos apropiado para el diagnóstico de LANL; b) positividad de mieloperoxidasa (MPO) por técnica citoquímica o negro Sudán < 3%; c) negatividad para citCD3, citCD22 y citCD79, y d) positividad para CD13, CD33, CD11b, CD65 o CD117 y/o positividad para MPO estudiada mediante inmunohistoquímica, citometría o ultraestructura41. Por otra parte, la expresión de CD10 en este subgrupo se ha relacionado con t(9;22) y reordenamientos de 11q2316. Otras series objetivan la expresión de antígenos linfoides B y T en hasta un 80% de los casos de LANL escasamente diferenciadas, refiriendo expresión de TdT en entre el 30 y el 68% de los casos, de CD7 entre el 25 y el 32%, y tanto de CD2 como de CD4 hasta en un 33 y un 32% de los pacientes, respectivamente16,18,19; asimismo, algunos autores especulan con la mayor expresión de antígenos linfoides, con la excepción de TdT, en niños19 y el posible origen monocítico de algunas LANL M0 en las que se detecta coexpresión de CD4 con CD14, CD11b y/o CD11c18. Es también motivo de debate el posible significado pronóstico de la expresión de CD7 y CD34 en este grupo8,19,44. Por último, hay que destacar que éste es el subgrupo FAB en el que se ha objetivado un mayor porcentaje de elementos con fenotipo indiferenciado CD34+/CD38–, lo que podría estar relacionado con su inmadurez y mal pronóstico16,45. Leucemias agudas no linfoblásticas sin maduración o FAB M1 Las LANL M1 presentan un patrón de FSC/SSC y de CD45/SSC similar al de las leucemias M0, aunque en casos individuales pueden mostrar mayor complejidad interna y/o granularidad (SSC)8,10. Su inmunofenotipo reflejaría un grado de maduración intermedio entre las LANL M0 y M2, siendo habitualmente los blastos CD13+, CD33+, HLA-DR+ y CD117+ (el 25% de los casos pueden ser negativos para CD33 o CD13)42. En contraste con la LANL M0, la expresión de CD34, aunque habitual, es ligeramente menos frecuente; hasta en un 25% de los casos puede detectarse expresión débil de CD4 y CD15. Merece destacarse que es en el subgrupo de LANL M1 donde la expresión de CD34 parece relacionarse más claramente con la existencia de cariotipos anómalos16. Leucemias agudas no linfoblásticas con maduración o FAB M2 La mayor diferencia entre las LANL M1 y M2 estriba en la existencia de maduración y de un menor porcentaje de blastos. Característicamente se aprecia la existencia de una población heterogénea en cuanto a su dispersión de luz, presentando el diagrama CD45/SSC un continuo desde la región de mieloblastos hasta la de los elementos más maduros de la serie mieloide de línea granulocítica10. La expresión de CD34 es más débil y menos frecuente, y la de CD15, más intensa y frecuente que en las M0 y M1. La mayoría de los casos son HLA-DR+, CD33+ y CD13+, lo que confirma que se trata de neoplasias con más diferenciación que M0 y M18. Leucemias agudas no linfoblásticas con maduración o M2 y t(8;21). La LANL M2 con t(8;21) es una entidad de buen pronóstico en adultos46 y, según algunos autores, de mal pronóstico en niños47. Presenta el perfil inmunofenotípico característico, aunque no específico, CD15+, CD18+, CD34+ y HLA-DR+, al que se asocia la expresión de CD19 y, menos a menudo, de CD54 y CD56, así como una expresión variable de CD138,16,25,48; también es frecuente la ex-

presión de CD11742. Es de resaltar el valor predictivo que sobre el diagnóstico de esta entidad se ha atribuido al fenotipo CD19+/CD34+24. Estas leucemias suelen presentar un CD34 más intenso que en el resto de M2; por otra parte, suele existir negatividad para CD14 y CD436. Entre las variantes descritas cabe destacar: a) LANL M2 con t(8;21) y pérdida de un cromosoma sexual, en las que no se expresan CD19 ni otros antígenos linfoides16; b) un subgrupo con morfología M2 y t(8,21), negatividad para CD13, CD33 y CD14 pero positividad para citMPO49, y c) la variante CD56+, que se asociaría a mal pronóstico50,51. Leucemia aguda no linfoblástica promielocítica o FAB M3 o leucemia aguda no linfoblástica con t(15,17) y variantes La LANL M3 típica presenta FSC y SSC altos (ambos relativamente heterogéneos, particularmente el SSC)10. Presenta además un CD45 débil (expresión similar a la de células de médula ósea de línea de granulocito neutrófilo) y una expresión tanto de HLA-DR como, sobre todo, de CD34 menos intensa y frecuente (20-28% de los casos) que en el resto de LANL16,29. De hecho se acepta que el inmunofenotipo característico de LANL M3 asociado a la t(15;17) con reordenamiento de RARα sería CD15–/+ (débil), CD13+ (heterogéneo), CD33+, CD9+, HLA-DR–, CD34–, CD7–, CD19– y CD14–22,29,36,52. Recientemente se ha propuesto la creación de un score en función de: a) el patrón característico de maduración granulocítica con escasa o nula expresión de CD34 y bloqueo en la adquisición de CD15; b) la expresión heterogénea de CD13, y c) la existencia de una población blástica única en función de su patrón de FSC/SSC/ CD45; este score permitiría establecer de una manera sensible y específica el diagnóstico diferencial entre pacientes con LANL M3/PML-RAR α+ (score: 3) y LANL M3/PMLRAR α– (score: 0)22. El perfil inmunofenotípico descrito no es completamente específico de las M3, ya que ocasionalmente puede apreciarse en las LANL M28. En este sentido, es interesante recordar que, en comparación con los casos de M2, además de la expresión de CD34 menos intensa y frecuente, en las M3 habitualmente se objetiva una expresión ligeramente más débil y heterogénea de CD13 junto a negatividad para HLA-DR29. Por otra parte, también es importante recordar que puede apreciarse expresión de CD2 tanto en M3 típicas (28% de los casos) como en la variante microgranular (M3v); en este sentido, el fenotipo CD2+/HLA-DR– se asociaría significativamente a t(15;17), típica de buen pronóstico, independientemente de la morfología8,16, mientras que el fenotipo CD2+/CD34+ se asocia a morfología hipogranular (M3v) y a reordenamientos que involucran a bcr329. Por último, en relación con este subgrupo cabe resaltar 5 puntos: a) el patrón de dispersión de luz permitiría eventualmente distinguir la forma clásica de la variante M3v (a expensas de células más inmaduras con menor FSC/SSC), siendo también la expresión de CD34 más frecuente en este último subtipo53; b) según algunos autores, en los pacientes con perfil inmunofenotípico «típico» CD15±, HLA-DR± y CD34± en los que la citogenética no objetive t(15;17), debería descartarse obligatoriamente la existencia de reordenamiento de RARα mediante FISH y técnicas moleculares22,52; c) el tratamiento con ATRA puede asociarse al denominado síndrome del ácido retinoico, que se ha vinculado a expresión más intensa de CD13 en el diagnóstico54; d) la expresión poco frecuente de CD14+ se asocia a mal pronóstico55, y e) la expresión de CD56 se asociaría a leucemias con t(11;17)(q23;q21) y formación del gen de fusión PLZF-RARα, que son resistentes al tratamiento con ATRA56. Med Clin (Barc) 2002;118(11):423-36

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Leucemia aguda mieloide/natural killer. Esta entidad, de reciente descripción, se encuadra entre las LANL M3 por su morfología más frecuente y a menudo difícil de diferenciar de la M3v23,57. Se trata de una leucemia originada en un progenitor no bien caracterizado25, con presentación agresiva en individuos de edad avanzada y que no responde a ATRA por carecer de reordenamientos de RARα. Su inmunofenotipo más frecuente es CD56+, HLA-DR–, CD33+, CD11a+, CD13+ débil, CD34 variable (negativo o positivo débil), CD15+ débil, CD16–, CD2– y CD3–23. Esta entidad debe diferenciarse de casos con morfología M3 y M3v con fenotipo CD56+, CD33+, CD13+, CD11a+, HLA-DR–, CD34– y CD16–, y reordenamiento de PML-RARα; para ello resulta imprescindible el estudio molecular en estos pacientes57. Leucemias agudas no linfoblásticas mielomonocíticas o FAB M4 y leucemias agudas no linfoblásticas monocíticas o FAB M5a y M5b Estas dos entidades presentan mayor dispersión frontal y angular de luz que las M0 y las M1; sin embargo, las M5 presentan una imagen más homogénea, mientras que las M4 y M4Eo tienden a presentar fracciones celulares con mayor dispersión de luz8,10. Ambos grupos son similares desde el punto de vista inmunofenotípico, aunque la expresión de CD34 es más intensa y frecuente en las M4 y M5a que en las M5b. En el diagrama SSC/CD45 los elementos blásticos más diferenciados de la serie monocítica tienden a observarse en la zona normal de monocitos, siendo esto más evidente en las M5b; en cualquier caso, ambos subtipos resultan los más difíciles de diferenciar basándose únicamente en su dispersión de luz o en los diagramas SSC/CD45. En las M4, si existe un componente mieloide de tipo granulocítico diferenciado, también puede apreciarse en la zona donde se situarían los elementos normales de la serie granulocítica en estadios intermedios de maduración8. Habitualmente el fenotipo tanto de las LANL M4 como M5 presenta expresión de HLA-DR+, CD33+, CD14+ y CD15+, siendo la expresión de este último marcador más frecuente en las M4. Es característico del componente monocítico que la expresión de CD33 sea más intensa que la de CD13; de hecho el perfil CD33++, CD13–/+, CD34– se asocia al subtipo M5 (aunque no es específico de éste)8,16. La expresión de CD56 se ha asociado a diferenciación monocítica y los casos positivos para este marcador tienen tendencia a presentar mayor incidencia de anomalías de 11q23 asociados a una menor supervivencia33,48,55. También puede observarse en este grupo la expresión de CD4 y/o más débilmente de CD78,16,18. Por otra parte, en las LANL M5 se aprecia un porcentaje significativamente menor de positividad de CD117 (el 21 frente al 69-70%) que en las LANL M0 y M142; además, esta positividad estaría restringida a los estadios más inmaduros, siendo negativas para este marcador la mayoría de LANL M5b58. El fenotipo CD14+/HLA-DR– se ha asociado con mal pronóstico55. Por otra parte, recientemente se ha descrito una asociación que comprendería morfología M4, fenotipo CD2+, CD13+, CD14+, CD15+, CD18+, CD33+, CD36+, CD34– y HLA-DR+, cariotipo t(11;15)(q23;q12), sexo femenino y presentación con anemia intensa y trombocitopenia moderada16. Leucemia aguda no linfoblástica M4Eo o leucemia aguda no linfoblástica con inv(16). La inv(16) o t(16;16)(p13;q11) se asocia constantemente a LANL M4Eo y se ha considerado hasta la actualidad una alteración de buen pronóstico. Su perfil fenotípico presenta expresión simultánea de CD34 in-

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tenso en los blastos de línea de neutrófilo, CD13, CD15, CD64, CD65, CD117, HLA-DR y CD36, y con menor frecuencia (31%) expresión de CD216 y también de CD1436,59,60. De forma característica se detecta en las LANL con inv(16) sobrexpresión de citMPO tanto en los mieloblastos CD34+ como en los monoblastos y promonocitos61. Leucemia aguda no linfoblástica M5 con t(9;11). Este subgrupo cursaría con expresión de CD33 o CD65 y CD15 o CD4 y ausencia de CD34 o CD13 habitualmente asociados a expresión de CD56 y del marcador 7.136,61. Las alteraciones que afectan a 11q se recogen más detalladamente en el apartado «Leucemias agudas no linfoblásticas con otras alteraciones citogenéticas e inmunofenotípicas no relacionadas con los subtipos FAB». Leucemia agudas no linfoblástica eritroide o FAB M6 Ésta es una entidad poco frecuente y no bien definida inmunofenotípicamente. Su patrón de dispersión de luz es habitualmente similar al que se observa en las M0 con muy bajo FSC y SSC10. Suelen ser positivas para CD34+ (débil), HLA-DR+ (débil) y a menudo CD13–/+ (débil) y CD33–/+ (débil). Se puede diferenciar dos subtipos: una variante temprana o inmadura, inclasificable fenotípicamente, y una variante tardía o madura que presenta positividad para CD71 y/o la glicoforina-A17. En este sentido, se postula que la glicoforina-A no se expresaría en las BFU-E y sólo aparecería en CFU-E o estadios posteriores62. En cualquier caso, unido a la subpoblación de células blásticas, en el diagrama SSC/CD45 habitualmente se aprecia un importante componente eritroide. Leucemia aguda no linfoblástica megacarioblástica o FAB M7 La leucemia aguda megacarioblástica es, como la M6, una entidad poco frecuente que supone únicamente un pequeño porcentaje de todas las LANL. Su diagnóstico requiere la demostración de más de un 30% de blastos de línea megacariocítica entre la celularidad no eritroide. La confirmación de la línea no es posible mediante citología convencional o por citoquímica y se basa en el estudio inmunofenotípico, aunque también puede establecerse mediante demostración ultraestructural de la peroxidasa plaquetaria con microscopia electrónica28. En el análisis mediante citometría de flujo de este subgrupo, los megacarioblastos leucémicos expresarían de mayor a menor frecuencia CD61 (GpIIIa) de membrana o citoplasmático, CD41 (GpIIb/IIIa) y/o CD42 (complejo Gp Ib/V/ IX)8,17. Se ha descrito asimismo la presencia de diversos marcadores mieloides y, más raramente, la expresión de CD5648. Es muy importante descartar la existencia de falsos positivos por adhesión de plaquetas a elementos blásticos de otras líneas o por coincidencia de ambos delante del láser en el momento del análisis citométrico; para ello es recomendable confirmar los casos positivos mediante microscopia de fluorescencia, o alternativamente efectuar el estudio simultáneo de diversos anticuerpos en muestras anticoaguladas con EDTA63. Leucemias agudas no linfoblásticas con otras alteraciones citogenéticas e inmunofenotípicas no relacionadas con los subtipos FAB Leucemia aguda no linfoblástica con t(9;22). Los pacientes con LANL y t(9;22) expresan más frecuentemente antígenos linfoides (Ly) que otros pacientes con LANL (aproximada-

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mente el 61 frente al 24%), por lo que ante el hallazgo de LANL Ly+, particularmente de línea B, parece recomendable el cribado de esta alteración16. Por otra parte, en los pacientes con LANL Ph+ de novo existe una menor expresión de CD11b que en los pacientes con LMC en crisis blástica, lo que puede ayudar en determinados casos a su diagnóstico diferencial; en este sentido hay que recordar que la expresión de CD11b se asocia a los estadios más maduros –posteriores al de promielocito– de la serie mieloide neutrófila16,64. Leucemia aguda no linfoblástica con –5/5q–, –7/7q– y 3q21-q26. Las LANL con estas alteraciones presentan habitualmente un fenotipo común basado en la expresión de CD13+, CD15+, CD18+, CD33+ y CD34+, difiriendo en la reactividad para CD14, CD65 y marcadores asociados a línea linfoide. Así, CD14 se expresa en la mayoría de los casos con –5/5q– mientras que es infrecuente en –7/7q– y excepcional en las alteraciones de 3q. Por el contrario, CD65 se expresa mayoritariamente en casos con alteraciones de 3q. Los marcadores linfoides tanto T como B son infrecuentes en casos con –5/5q–, en tanto que se expresan en aproximadamente la mitad de casos con –7/7q–16. Leucemia aguda no linfoblástica con trisomía 8. El inmunofenotipo de las LANL con trisomía 8 no presenta características específicas. Con respecto a otras LANL, estas leucemias expresan con algo mayor frecuencia CD13 y CD33, con una expresión similar de CD3416. Leucemia aguda no linfoblástica con reordenamientos de 11q23. Las alteraciones de 11q23 implican reordenamientos del gen MLL y se considera que están asociadas a mal pronóstico en la LANL65. Pueden presentarse como t(6;11) (q27;q23), t(9;11)(p22;q23), t(9;11;19)(p22;q23;q13.3), t(2;11)(11;17)(q37;q11q23;q11), t(11;17)(q23;q25), t(11;19) (q23;p13.1), t(11;19)(q23;p13.3) y t(1;22)(q23;q11), y a ellos se asocia morfología M4 o M566. En estos pacientes los blastos, aunque presentan maduración a línea monocítica, tienen un fenotipo relativamente heterogéneo; independientemente del subtipo morfológico, presentan positividad ≥ 80% para CD11b, CD13, CD15, CD18, CD32, CD33, CD38, CD64, HLA-DR y, con menor frecuencia (42%), para CD3466. Con respecto a la expresión de marcadores linfoides, existe cierta controversia; así, mientras que algunos autores postulan que más de la mitad de los casos expresa un marcador linfoide B (p. ej., CD19), otros indican que la presencia de marcadores linfoides asociados a células B, T o natural killer (NK) no parece significativamente diferente de la de otros pacientes con M4 o M5 sin alteraciones de 11q2316,66. Pese a ello, hay autores que han objetivado una asociación significativa entre reordenamientos de MLL y la expresión de CD56 (cuyo gen también se localiza en 11q23) en casos con diferenciación monocítica y que presentaban una tendencia a menor supervivencia33,48; en este sentido, se recomienda estudiar la existencia de reordenamientos de MLL en los pacientes con LANL de estirpe monocitaria CD56+48. Por otra parte, se discute si los pacientes con reordenamientos de MLL, t(9;11) y, a menudo, con morfología M5, que son los de relativo mejor pronóstico dentro de este subgrupo, expresan menos frecuentemente CD14, CD34 y otros marcadores linfoides B16,66,67. Recientemente se ha descrito un nuevo anticuerpo monoclonal (denominado 7.1) que sería altamente sensible y específico para la identificación por citometría de flujo de niños con leucemias agudas mieloides y linfoblásticas con reordenamientos de 11q23, mientras que en las LANL del adulto su sensibilidad y especificidad serían limitadas68.

Leucemias agudas no linfoblásticas con t(10,11). Ésta es una entidad de muy reciente descripción, definida por la existencia de reordenamientos de MLL y CALM, que acompañaría de manera constante al producto de fusión MLL/AF10 resultante de la t(10;11)(p13;q14). Esta alteración, de mal pronóstico, no estaría asociada a ningún subtipo FAB de forma particular; sin embargo, los casos que presentan diferenciación, tanto mieloide como monocítica (M2 y M5), sí parecen relacionarse con el fenotipo CD4+, CD13–, CD33+, CD65+69. Estudio de la enfermedad mínima residual en las leucemias agudas no linfoblásticas Hasta la fecha los estudios de monitorización de EMR en las LANL se han basado en el seguimiento de inmunofenotipos que, en el momento del diagnóstico, presentan alguna característica que permite diferenciarlos de las células mieloides inmaduras sanas: inmunofenotipos leucémicos. Estas alteraciones se pueden agrupar en: a) expresión aberrante de antígenos asociados a líneas no mieloides; b) expresión asincrónica de antígenos vinculados a diferentes estadios de maduración; c) sobrexpresión antigénica; d) alteraciones en el patrón de dispersión de luz de las células mieloides; e) ausencia de expresión de antígenos mieloides, y f) expansión de inmunofenotipos presentes en muestras normales en muy baja frecuencia. No existe unanimidad con respecto a qué porcentaje de pacientes con LANL presentan aberraciones antigénicas, oscilando entre el 20 y más del 80% en las series publicadas8,16,25,36,70,71. Esto podría ser debido, al menos en parte, a que en la práctica los paneles de anticuerpos, tanto para el estudio inicial como de la EMR, están sujetos a discusión y varían ampliamente entre diferentes grupos. En este sentido, algunos autores han indicado que el inmunofenotipo de las LANL es inestable, y que por ello sería necesario el uso de un amplio panel que incluya hasta 8 tubos con tres AcMo para un adecuado seguimiento de la EMR72. También se ha descrito que en las LANL en recaída existiría un menor número de aberraciones antigénicas en relación con el diagnóstico inicial, lo que haría más complejo el estudio de la EMR73. Por el contrario, otros investigadores indican que los fenotipos leucémicos son estables a lo largo de la enfermedad y permiten un adecuado seguimiento de la EMR74. En este sentido, se ha recalcado la utilidad del seguimiento de los asincronismos CD34+/CD56+, CD33–/CD15+, CD33–/CD13+, CD15+/CD117+, CD15+ (intenso)/CD34+ y CD14+/CD34+ en las LANL en general69,75,76 y, de manera particular, en pacientes con LANL M2 y t(8;21), así como en algunas M1 y M2 la utilidad de CD15/CD3476 y/o CD15/CD11724,77. La estrategia propuesta recientemente78,79 parte de un panel inicial con las asociaciones: CD15/CD117/CD34, CD15/ CD33/CD34, CD15/CD34/HLA-DR, CD34/CD38/CD19, CD34/ CD56/CD33, HLA-DR/CD33/CD13, CD7/CD13/CD19, CD65/ CD11b/CD4, CD2/CD14/CD13, CD61/glicoforinaA/CD45, CD10/ CD5/CD20 y CD71/CD11b, con el objeto de caracterizar las asociaciones inmunofenotípicas anómalas más útiles para su uso en estudios ulteriores. Con esta estrategia se han hallado múltiples fenotipos aberrantes en el momento del diagnóstico en la mayoría de los pacientes (75%), que posteriormente han permitido el seguimiento de la EMR con una sensibilidad en el entorno de 1 × 10–4. Entre los fenotipos aberrantes detectados, son de destacar por su frecuencia los asincronismos madurativos CD117+/CD33+/HLADR– (34%), CD34+/CD117+/CD33+/HLA-DR– (21%), CD34–/CD15–/CD14–/CD33+ (19%), CD34+/CD33–/CD13+ (19%), CD117+/CD11b+ (13%) y la expresión aberrante de Med Clin (Barc) 2002;118(11):423-36

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CD2 (17%), que se acompaña en la mayoría de las ocasiones de un patrón inadecuado con alta dispersión frontal y angular de luz78. Por otra parte, es importante tener en cuenta que en los pacientes con más de una población leucémica en el diagnóstico, el seguimiento de la EMR debe incluir el estudio tanto de la población predominante como el de las diferentes subpoblaciones blásticas minoritarias detectadas39. La aportación más relevante de este abordaje es la objetivación de tasas de recaída específicas, asociadas a 4 categorías de riesgo diferente, en función de la cantidad de EMR detectada (< 10-4, ≥ 10–4-≤ 10–3, ≥ 10–3-≤ 10–2 y ≥ 10–2) en el primer estudio medular con criterios de remisión morfológica tras finalizar el tratamiento de inducción79. Todo lo arriba expuesto no debe hacernos olvidar que el estudio de las EMR en las LANL es una labor compleja, y que en algunos pacientes puede llegar a ser difícil la distinción entre células inmaduras sanas y leucémicas basándose exclusivamente en sus características inmunofenotípicas79,80. En este sentido, una alternativa más simple para el seguimiento de las EMR en adultos con LANL sería el estudio de la relación entre células CD34+CD33+ y células CD34+ CD19+ en médula ósea. Así, se ha comprobado que un cociente ≥ 10 al finalizar los tratamientos citostáticos (después de la intensificación) se asocia a menor supervivencia global y supervivencia libre de enfermedad, y además predice la recaída81. Leucemias agudas linfoblásticas En los pacientes con leucemia aguda linfoblástica (LLA), los estudios inmunofenotípicos definen subgrupos de riesgo/ pronóstico específico, por lo que hoy por hoy son obligados en el diagnóstico y clasificación de estas entidades15. En este sentido, es posible determinar con gran precisión, tanto en la línea linfoide B como en la línea linfoide T, el grado de diferenciación de la célula neoplásica según la reactividad de las células leucémicas con un panel de anticuerpos8. En líneas generales, las LLA presentan características de dispersión de luz –FSC y SSC– menores que las LANL (similar o menor que los subtipos M0 y M1) y también una menor expresión de CD459. Con respecto a su inmunofenotipo, es de destacar la existencia de controversia acerca de la «estabilidad» inmunofenotípica entre el diagnóstico y la recaída. Algunos autores consideran que podrían existir cambios en el perfil inmunofenotípico hasta en un 46% de casos (más frecuentemente en las LLA de línea T); este efecto sería independiente del grupo de edad, y en su mayoría se trataría de cambios de subgrupo intralínea y pérdidas o ganancias de antígenos mieloides, que además no influirían en el pronóstico13. Otros autores defienden, por el contrario, la estabilidad fenotípica de la clona leucémica y postulan la existencia de un mínimo porcentaje de cambios62,82-84. Mencionaremos algunos puntos de interés con respecto a este grupo de entidades. En primer lugar, merece destacarse que, como noción general, se acepta que en los niños las LLA-T tienen peor pronóstico que las LLA-B y, dentro de estas últimas, las CD10+ serían las que tendrían mejor pro-

nóstico; por el contrario, en adultos las leucemias de línea T tendrían mejor pronóstico que las de línea B55. En segundo lugar, se considera que las leucemias CD2+/CD19+ en pacientes pediátricos constituirían un subgrupo específico de buen pronóstico85. En tercer lugar, se plantea que, ante un cuadro leucémico en adultos con predominio de células de aspecto linfoide con positividad de CD20 y de inmunoglobulinas de superficie (sIg) y CD10–, conviene tener presente la posibilidad de una variante blastoide de un linfoma del manto cuyo fenotipo sería además de pan B+, CD5+ y CD23–86. En cuarto lugar, tiende a considerarse la expresión intensa de CD45 en las leucemias linfoblásticas de línea B como un factor de mal pronóstico, aunque éste sigue siendo un tema abierto de debate87-89. En quinto lugar, la intensidad de expresión de CD20 parece correlacionarse negativamente con la supervivencia en las LLA de progenitores B88, y por último, merece la pena recordar que, después de una década de debate, se acepta que la expresión de marcadores mieloides no supone diferencias en el pronóstico de las LLA en niños90-93. Leucemias linfoblásticas de línea B Este grupo de leucemias se define por la expresión de, al menos, dos de los marcadores más tempranos de línea B: CD19, citCD22 o citCD79a. En función de la expresión de diversos marcadores de línea B y otros no específicos de línea, se puede establecer 4 categorías según la mayor o menor diferenciación de la clona proliferante. Por otra parte, es interesante recordar que la expresión de CD34, un marcador que no es imprescindible ni para la asignación de línea ni para la catalogación en grupos, se asocia significativamente a buen pronóstico en las LLA de línea B en niños, mientras que por el contrario en adultos su presencia está asociada a mal pronóstico94-96 (tabla 4). Leucemia pro B (EGIL B-I) (leucemia linfoblástica aguda de precursores B CD10–). Corresponde a la proliferación de las células B más inmaduras. El fenotipo es positivo para alguno de los marcadores que definen la línea linfoide B en sus estadios más tempranos: citCD22, CD19, citCD79a y en la mayoría de los casos expresan CD34. A menudo no expresan otros antígenos de diferenciación B y, por definición, no expresan CD10. Se asocian hasta en un 25% a t(4;11) incrementándose notablemente su incidencia en niños menores de un año, y son de peor pronóstico que el subtipo EGIL B-II8,17,55. Leucemia linfoblástica aguda común (EGIL B-II) (leucemia linfoblástica aguda de precursores B CD10+). Suponen el 60% de las LLA en niños y se consideran de buen pronóstico, alcanzándose hasta un 85% de remisiones a largo plazo en ese grupo de edad, aunque su pronóstico en adultos es más sombrío. Tanto en esta entidad como en la anterior, los blastos suelen ser muy pequeños, con escasa dispersión frontal (FSC) y lateral (SSC) de luz. Algunos casos tienen muy poca expresión de CD45, por lo que en el diagrama SSC/CD45 se disponen en la región de serie eritroide8,87.

TABLA 4 Perfil inmunofenotípico de las leucemias linfoblásticas de línea B (EGIL) Pro-B (E-I) Común (E-II) Pre-B (E-III) B maduras (E-IV)

citCD22

CD19

CD79a

CD34

CD10

TdT

sCD22

CD20

CD38

CD45

Cµ

SIg

+ + + +

± + + ±

+ + + +

+ ± – –

– ++ + ±

+ + + ±

± + + ±

– ± + +

++ + ± ±

± ± + +

– – + –

– – –o± +

Modificada de Jennings y Foon8, Bene et al17 y Pui et al100. EGIL: European Group for Immunophenotype of Leukemias.

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El fenotipo suele ser positivo para citCD22, citCD79a, CD19 y HLA-DR y, por definición, CD10 positivo y sIg negativo. La mayoría de los casos suelen ser además CD24+, CD34+ y TdT+. La expresión de CD22 y en mayor medida de CD20 aumenta con el grado de madurez de la clona leucémica8,15,17,55. Este grupo diagnóstico presenta un pronóstico significativamente mejor en niños menores de 12 meses y discretamente mejor en niños de un año o mayores en comparación con los grupos EGIL B-III y B-IV97. En los pacientes con fenotipo de precursor B (EGIL B-I y BII) se han descrito varias alteraciones citogenéticas que afectan al pronóstico. Las más frecuentes serían t(9;22), alteraciones de 11q23 y t(12,21), que comentaremos de forma específica en un otro apartado8,15,98. Leucemia pre B (EGIL B-III). Suponen aproximadamente un 25% de las LLA de los niños y corresponden a un estadio de maduración más tardío que las anteriores. Este grupo se define por la positividad para las cadenas pesadas µ en citoplasma, en presencia o no de reactividad para CD1015. Como en las LLA de precursores B, el fenotipo suele ser positivo para citCD22, CD19, CD10 y HLA-DR, y sIg negativo. La práctica totalidad de casos son CD24+. La reactividad para CD20 y TdT es variable, y CD34 suele ser negativo8,15,17,98. En líneas generales, se considera que este grupo tiene peor pronóstico que las LLA de precursores B (EGIL B-I y B-II), si bien este mal pronóstico se relaciona de manera particular con la presencia de t(1;19). Esta alteración se detecta en un 5% de los niños con LLA de precursores B (EGIL B-I y EGIL B-II)15 y hasta en un 25% de los adultos con fenotipo pre B99. La traslocación comporta la creación del gen de fusión E2A-PBX1 y se asocia a fenotipo cIgµ+, CD19+, CD10+, CD24+, CD9+, expresión variable de CD20 (al menos con ausencia parcial de expresión) y negatividad para CD34, fenotipo que tiene un valor predictivo para esta traslocación del 50%26. Leucemias B maduras (EGIL B-IV). Representan del 2 al 5% de todas las LLA y equivalen al linfoma de Burkitt en su fase leucémica. En la actualidad se considera una enfermedad curable, aunque de pronóstico intermedio en niños100; por el contrario, en adultos sigue siendo considerada una entidad de mal pronóstico101. En la práctica totalidad de los pacientes se objetivan reordenamientos de c-myc en el cromosoma 8, presentando la clásica t(8;14)(q24;q32) o las variantes t(2;8)(p11;q24) o t(8;22)(q24;q11) cuando las traslocaciones afectan a los genes de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas, o de las cadenas ligeras kappa o lambda, respectivamente8,17. Las células de la LLA-B tienen más dispersión frontal y angular de luz que las LLA EGIL-I a III y pueden, por consiguiente, objetivarse tanto en la región de linfocitos como de monocitos en los diagramas de SSC/CD45. El fenotipo es, en la mayoría de los casos, positivo para CD19, CD20, CD22 y CD24, y con frecuencia también para CD10+. El diagnóstico diferencial con las otras LLA de línea B se esta-

blece basándose en la positividad para sIg, con mayor frecuencia de tipo IgM o, alternativamente, por la expresión citoplasmática de una cadena ligera, aunque es de destacar que recientemente se ha descrito la existencia de casos con t(8;14) y negatividad tanto para sIg como para cadenas ligeras citoplasmáticas102. También es de resaltar la existencia de pacientes con inmunofenotipo propio de LLA-B que no tienen morfología L3, de manera particular algunos casos con t(1;19) y t(14;18) que presentan morfología L1103. Las células blásticas de estos pacientes suelen presentar una elevada tasa proliferativa6. Leucemias linfoblásticas de línea T Las LLA de línea T tienen una importante dispersión frontal (FSC) y baja o intermedia dispersión lateral (SSC) de luz, y en los diagramas de SSC/CD45 pueden apreciarse tanto en la región de monocitos como en la de linfoblastos y/o mieloblastos8. Estas entidades se definen por la expresión citoplasmática o en membrana de CD3; en este sentido, es importante recordar que la reactividad para CD2 y/o CD7 no es suficiente para adscribir un caso como de línea T, aunque CD7 se exprese en la práctica totalidad de las LLA-T25,104. Por otra parte, es de resaltar que una característica de las neoplasias T en general, y de las LLA-T en particular, es la pérdida de antígenos de línea y la expresión aberrante de antígenos de otras líneas, lo que puede dificultar su clasificación8,17,105. Asimismo merece destacarse la baja frecuencia de positividad para los antígenos CD34 y HLA-DR, particularmente en niños92, en quienes se asocia a un peor pronóstico94. En función del grado de diferenciación tímica se definen (con diferente terminología según el origen de los autores) 4 subgrupos cuyo pronóstico es objeto de debate y que revisaremos a continuación8,14,15,17,106,107 (tabla 5). Leucemias pro T (EGIL T-I) (leucemias linfoblásticas agudas pre T). El fenotipo pro T, que podría ser el de peor pronóstico dentro de las LLA de línea T, suele presentar únicamente positividad para citCD3 y CD7, siendo negativo para CD3 en superficie (sCD3), CD4, CD8 y otros antígenos de línea T8,14,17,104. Leucemias pre T (EGIL T-II) (leucemias linfoblásticas agudas T corticales tempranas). Las LLA pre T o de fenotipo cortical temprano son el segundo grupo en incidencia dentro de las LLA-T. Su fenotipo es CD2+, habitualmente sCD3–, y presentan positividad variable para CD5, CD7 y positividad intensa para TdT8,14,17. Es de interés recordar que en las LLA de línea T la expresión de CD2 se ha asociado a buen pronóstico14. Leucemias T corticales (EGIL T-III) (leucemias linfoblásticas agudas T corticales tardías). Las LLA-T corticales o de fenotipo cortical tardío son las más frecuentes dentro de las LLA-T. Su fenotipo se define por la positividad para CD1a independientemente de la positividad para otros marcado-

TABLA 5 Perfil inmunofenotípico de las leucemias linfoblásticas de línea T (EGIL) Pro-T (E-I) Pre-T (E-II) T cortical (E-III) T maduras (E-IV)

citCD3

sCD3

CD7

CD1a

TdT*

CD2

CD5

CD4/CD8

+ + + +

– ± + +

+ + + +

– – + –

+o± +o± ± ±o–

– + + +

– + + +

–/– –/– o +/+ ±/± +/– o –/+

Modificada de Jennings y Foon8, Uckun et al14 y Bene et al17. *No es criterio diagnóstico. EGIL: European Group for Immunophenotype of Leukemias.

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res incluyendo sCD3, CD2, CD5, e incluso CD7. Algunos casos pueden presentar positividad simultánea para CD4 y CD8 y positividad débil para sCD3. La TdT es frecuentemente positiva8,14,17.

TABLA 6 Perfil inmunofenotípico de las leucemias linfoblásticas de línea B con alteraciones citogenéticas específicas a

Leucemias T maduras (EGIL T-IV) (leucemias linfoblásticas agudas T tímicas-medulares). El fenotipo medular es negativo para CD1a– y presenta positividad para sCD3 y expresión variable para CD2, CD5 y CD7, así como expresión segregada de CD4 o CD8. En algunos casos puede existir positividad débil para TdT8,14,17. Dentro de este subgrupo se distinguen LLA-Tαβ+ y LLA-Tγ/δ+. Leucemias linfoblásticas agudas T γ/δ+ La práctica totalidad de casos de LLA-T γ/δ+ presentan inmunofenotipo TdT+, CD2+, CD3+, CD5+, CD6+ y CD7+. Su perfil CD1a/CD4/CD8 es heterogéneo, siendo la mayoría CD4+/CD8– o CD4+/CD8+ y menos de un 25% CD4–/ CD8–108. Leucemias linfoblásticas agudas vinculadas con alteraciones citogenéticas específicas Leucemias linfoblásticas agudas con alteraciones de 11q23. Las traslocaciones que afectan a 11q23 ocurren en un 60% de las LLA de lactantes, en un 2% en niños y en un 3 a un 6% de adultos. Esta traslocación cursa en la mayoría de los casos con reordenamientos del gen MLL, fenotipo CD10– (EGIL-I o III), y también se asocia a expresión de antígenos mieloides8,64,98. En lactantes resulta particularmente importante determinar, por su mal pronóstico, la existencia del fenotipo CD10–, 7.1+ con expresión de CD15 y CD65 o, menos frecuentemente, de otros marcadores mieloides y reordenamientos de MLL68,109. Entre las alteraciones de 11q23 destaca t(4;11)(q21;q23). Esta alteración cursa con el gen de fusión MLL-AF4, se presenta hasta en un 25% de las LLA del grupo EGIL B-I, y son de mal pronóstico en adultos y sobre todo en niños, siendo su perfil fenotípico más habitual CD19+ y CD34+, además de CD10–15,55,90,95. Dos excepciones al mal pronóstico general de este grupo serían la t(11;19)(q23;p13.3) con reordenamiento de MLL y fenotipo de precursor B CD10– en niños de entre 1 y 9 años110 y la misma alteración con producto de fusión y asociada a fenotipo T111 (tabla 6). Leucemias linfoblásticas agudas con t(9;22) (reordenamientos de bcr/abl). Se asocia a LLA de precursores B de morfología L2 con fenotipo CD19+, CD34+, CD10+ (EGIL B-II) y frecuente (70%) coexpresión de antígenos mieloides, particularmente CD13 y CD66. Esta alteración estaría presente en un 15 a un 30% de las LLA de adultos y en un 3 a un 5% de los casos pediátricos, asociándose en ambos grupos de edad a mal pronóstico15,20,90,98. Recientemente se ha propuesto un perfil inmunofenotípico característico en el grupo de LLA con t(9;22) del adulto: CD10+ en al menos una subpoblación de los blastos y CD34+ con un patrón homogéneo, CD38+ en baja intensidad y con patrón heterogéneo, y además CD13+20. Tanto la t(9;22) como las traslocaciones que afectan a 11q23 se asocian con la expresión de antígenos mieloides, y aunque dichas coexpresiones no comportan per se mal pronóstico, su presencia en pacientes con citogenética normal hace recomendable el cribado de ambas alteraciones mediante PCR8 (tabla 6). Leucemias linfoblásticas agudas con t(12;21)(p13;q22). La t(12;21)(p13;q22) origina el producto de fusión TEL/AML1. Se objetiva mayoritariamente en LLA comunes y pre B (EGIL

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t(9;22) * 11q23 t(12;21) t(4;11) ** 19p13

CD34

+

b

c

+ + –

CD10

+ – ++ – +

TdT

+

CD13/ CD15

CD20

+/± ±/± +/±

–o±

–/–

–

CD38

CD45

+

a La mayoría de los casos son CD19+, citCD22+, HLA-DR+, 7.1+; para CD13; c bimodal.

–o± + b

Cµ

– –o± –o± – –o±

asociado a positividad

B-II y B-III), y su incidencia está en torno al 20% de los casos de LLA de la infancia, siendo una alteración poco frecuente en la LLA del adulto112. Un porcentaje importante de estos casos expresa marcadores mieloides (CD13, CD33 o CD65)112 y, de hecho, en niños se ha demostrado una asociación significativa entre la expresión de los mismos y la presencia de la alteración112-114. En este sentido, se ha descrito como característico el fenotipo CD9– (o parcialmente positivo), CD13+, CD10++, CD34+ bimodal, expresión intensa de HLA-DR y CD45 y CD20 positivos débiles o negativos115. De hecho, se ha apuntado que el fenotipo CD9–/CD20– se asocia a la traslocación de forma sensible y específica, y además tiene un notable valor predictivo (47%)114. A diferencia de las alteraciones de 11q23 y de t(9;22), este subgrupo se asocia a buen pronóstico, especialmente en los niños de entre 1 y 10 años con fenotipo CD19+, CD10+ y HLA-DR+ (EGIL B-II); de ahí la importancia de la utilización de técnicas de PCR para su cribado112 (tabla 6). Leucemias linfoblásticas agudas con alteraciones de 19p13. Recientemente se ha descrito la existencia de un grupo de adultos de intermedio o mal pronóstico que presentarían alteraciones del gen E2A localizado en 19p13, y que se presentarían con fenotipo CD19+, CD10+, TdT+ y HLA-DR+, negatividad para CD20, CD34 y para antígenos mieloides (CD13, CD14 y CD33). Estos pacientes podrían presentar diversas alteraciones citogenéticas con implicación de 19p13: t(1;19)(q23;p13) y t(17;19)(q21;p13)116. Sin embargo, en la forma más frecuente, t(1;19), puede asociarse a fenotipo de precursores o pre B117 y tiene un pronóstico intermedio, tanto en niños como en adultos15 (tabla 6). Estudio de enfermedad mínima residual en las leucemias linfoblásticas agudas Los estudios de EMR en las LLA habitualmente se basan, al igual que en las LANL, en el seguimiento de los fenotipos leucémicos detectados en el diagnóstico. Como en las LANL, las estrategias implicarían el estudio de la expresión aberrante de antígenos, asincronismos y sobrexpresión antigénica, alteraciones en el patrón de dispersión de luz, pérdida de expresión de antígenos y expansión de inmunofenotipos de baja frecuencia; además, en las LLA-T son frecuentes los fenotipos tímicos de localización ectópica en médula ósea. Dado que un porcentaje muy elevado de pacientes (entre el 91 y el 99%, según diferentes grupos) presentaría fenotipos leucémicos, combinando las anteriores aproximaciones se puede estudiar la EMR con una sensibilidad del orden de ≤ 1 × 10–4 en la práctica totalidad de los casos118. En este sentido, la detección de EMR en estudios puntuales en porcentajes relativamente elevados (≥ 1 × 10–3), o su incremento en estudios consecutivos, está asociada con la recaída tanto en las LLA de línea B como en las

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de línea T82-84,119-124. Por otra parte, es obligado tener presente a la hora de efectuar los estudios de EMR que las distintas etapas de tratamiento comportan la expansión de precursores B sanos que presentan características inmunofenotípicas específicas y distintas de las de las células leucémicas125. Como un requisito previo a los estudios de EMR, es fundamental conocer el patrón madurativo normal de la serie linfoide B. Esta línea celular presenta en ausencia de enfermedad un perfil de maduración bien definido que tiene una alta reproducibilidad y constancia entre individuos y cuyos estadios de mayor a menor inmadurez serían, por este orden: a1) CD19+ (débil) o –, CD34+, TdT+, CD10–, CD22+ (débil), CD45+ (débil) o –, CD38+ (intenso) y CD20–; a2) CD19+ (débil) o –, CD34+, TdT+, CD10+ (intenso), CD22+ (débil), CD45+ (débil) o –, CD38+ (intenso) y CD20–; b1) CD19+, CD34–, TdT–, CD10+, CD22+ (débil), CD45+, CD38+ (intenso) y CD20–; b2) CD19+, CD34–, TdT–, CD10+, CD22+ (débil), CD45+, CD38+ (intenso) y CD20+ (débil), y c) CD19+, CD34–, TdT–, CD10–, CD22+ (intenso), CD45+, CD38+ (débil) y CD20+ (intenso)124,126 y que se pueden resumir en los indicados anteriormente en los epígrafes a2, b2 y c126. Estos perfiles inmunofenotípicos presentarían variaciones en función de la edad de los pacientes; así, por debajo de los 15 años existiría un acentuado predominio de las subpoblaciones más inmaduras (a y b), y por encima de esta edad predominaría la subpoblación c madura. La representación de estos perfiles en los diagramas de puntos de los programas informáticos para análisis de datos de citometría evidenciaría la localización de las poblaciones normales siguiendo una «senda de maduración» establecida, así como la existencia de áreas «vacías» en las que eventualmente se localizarían las células leucémicas con aberraciones fenotípicas120,126. Para el estudio de las aberraciones inmunofenotípicas se han planteado diversas estrategias simplificadas y de fácil aplicación en la sistemática de un laboratorio de diagnóstico clínico. En este sentido, se ha propuesto el estudio del porcentaje de células inmaduras CD34+/CD19+ o CD20–/ CD19+127, o la utilización de combinaciones preestablecidas, como: a) CD10FITC, CD20PE, CD45PerCP, CD19APC, y b) CD34FITC, CD9PE, CD45PerCP y CD19APC; estas estrategias permitirían la detección de EMR en la práctica totalidad de los pacientes con LLA de línea B120. Otros grupos defienden el uso de combinaciones específicas para cada paciente. En este último sentido destacaríamos en las LLA de línea B la existencia de un elevado porcentaje de infidelidades de línea (estudiando CD13, CD33 y CD66); hasta un 46% de casos con asincronismo antigénico, entre los que destacaría la coexpresión de CD10 intenso con CD20 y la expresión de CD20 en células CD19+/CD45–; hasta un 38% de casos con sobrexpresión antígénica de CD10, CD38 y CD58, este último un marcador de buen pronóstico, y finalmente hasta un 30% de casos con expansión de fenotipos infrecuentes, destacando entre éstos las asociaciones CD19+/CD45–, CD19+/CD34+/CD10– y CD19+/CD10+ +/CD34–35,83,118,128. Los hallazgos anteriores se resumen en la muy reciente propuesta de un panel estandarizado de consenso para el estudio de EMR en la LLA de precursores B que permitiría, en conjunto, la detección de poblaciones aberrantes en hasta el 98% de los casos. Este panel incluiría, además de las infidelidades de línea pertinentes en los casos en los que éstas se detectaran en el momento del diagnóstico (48%), las siguientes combinaciones: TdT/CD10/CD19 (con un 78% de casos aberrantes), CD10/CD20/CD19 (64% de casos con fenotipo aberrante), CD34/CD38/CD19 (56% de aberra-

TABLA 7 Criterios para la definición de las leucemias agudas bifenotípicas Puntuación

2 1

0,5

Línea B

Línea T

Línea mieloide

CD79a cit IgM cit CD22 CD19 CD10 CD20

CitCD3/CD3s anti-TcR α/β anti TcR γ/δ CD2 CD5 CD8 CD10 TdT CD7 CD1a

Anti-MPO

TdT CD24

CD117 CD13 CD33 CD65 CD14 CD15 CD64

Puntuación ≥ 2 para asignación de cada línea. Tomada de Matutes et al27 y EGIL130.

ciones), CD34/CD22/CD19 (46%) y CD19/CD34/CD45 (22%)129. Con respecto a las LLA de línea T, es obligado recordar que presentan más alteraciones en relación con la hematopoyesis T normal que las LLA de línea B respecto a sus células homónimas sanas. Entre estas alteraciones destacaríamos la existencia de hasta un 63% de casos con infidelidad de línea (estudiando CD13, CD33 y CD19), un 44% de casos presenta asincronismos madurativos, entre los que destacaría la coexpresión de TdT+/sCD3+ y de sCD3 (débil) en casos CD7+/TcR+, un 69% de casos muestran fenotipos ectópicos y un 88% de casos tiene expansión de fenotipos infrecuentes25,82. Recientemente se ha propuesto un panel de anticuerpos monoclonales de consenso, basado en el mismo principio visto para la línea B, proponiéndose la utilización de las siguientes combinaciones antigénicas: TdT/CD7/citCD3, CD7/CD5/CD3, CD7/CD4/CD8, CD7/CD2/ CD3, y CD7/CD38/CD34; de todas ellas la primera sería la más informativa, al detectar aberraciones en hasta un 91% de los casos de LLA-T104. Leucemias agudas indiferenciadas Suponen menos del 1% del total de las leucemias agudas cuando se emplea un amplio panel de anticuerpos monoclonales frente a antígenos de superficie y de citoplasma para su diagnóstico. Estos casos suelen presentar fenotipo CD34+, HLA-DR+, CD38+, CD7+ en ausencia de otros antígenos específicos de línea. En la actualidad se debate si con estudios exhaustivos, inmunofenotípicos, citogenéticos y moleculares estas entidades existen realmente8,40,55. Leucemias agudas bifenotípicas La generalización del análisis inmunofenotípico ha llevado al reconocimiento de casos que no encajan de manera precisa ni en la línea mieloide ni en la linfoide. La incidencia real de las leucemias agudas bifenotípicas (LAB) está por debajo del 5% cuando se aplican criterios estrictos, y los casos que cumplen éstos a menudo se asocian a t(9;22), a reordenamientos de MLL en 11q23 y t(8;13). Tanto en adultos como en niños se ha objetivado una tendencia a mal pronóstico en este grupo8,27,55. El EGIL y otros grupos han definido las LAB por la expresión de una serie de marcadores a los que se ha dado puntuación en función de su especificidad para cada línea. En la tabla 7 se recogen dichos marcadores, así como la valoración asignada a cada uno de ellos. El criterio de LAB es la existencia de puntuaciones ≥ 2 para la línea mieloide y para al menos una de las dos líneas linfoides B o T17,27,130. Otros autores han postulado muy recientemente que este criterio no sería apropiaMed Clin (Barc) 2002;118(11):423-36

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do y que el diagnóstico de LAB debería hacerse únicamente ante positividad para citMPO superior al 3% y fenotipo linfoide completo25. Bajo este término se incluirían no sólo las verdaderas LAB, sino también leucemias agudas bilineales en las que coexisten en un mismo paciente subpoblaciones de células leucémicas de dos o más líneas diferentes. Leucemias asociadas al síndrome de Down Además de la mayor tendencia de estos pacientes a presentar LLA y LANL, estas últimas de mejor pronóstico que en la población sin trisomía 21131, se ha descrito la existencia de una entidad específica que se presentaría en niños menores de 6 años a la que se ha denominado trastorno mieloproliferativo transitorio asociado al síndrome de Down (TMTAD) y que se caracterizaría por presentar una notable diferenciación eritroide y megacariocítica y por entrar espontáneamente en remisión antes de dos meses tras el diagnóstico132. Tanto la LANL como el TMTAD tendrían en común el fenotipo CD45+, CD38+, CD33+ y mayoritariamente CD36+, CD41+, CD61+, CD34+, CD14– y CD64–132,133. Muchos casos en ambas entidades presentarían positividad de CD7 y también, aunque con menor frecuencia, para CD56. Por el contrario, CD11b y CD13 tenderían a expresarse en LANL pero no en TMTAD, y HLA-DR se expresaría más frecuentemente en TMTAD que en LANL133. Inmunofenotipo de la célula stem leucémica En las LANL se ha relacionado la presencia de poblaciones leucémicas en estadios de diferenciación muy tempranos (CD34+/CD38–) como un factor de mal pronóstico vinculado a la resistencia a citostáticos y a alteraciones citogenéticas concretas45. Sin embargo, se conoce que los progenitores leucémicos comparten con los progenitores sanos el fenotipo CD34+, CD71–, HLA-DR– y eventualmente CD38–134-136, y por tanto, aunque algunos datos preliminares apuntan a que la expresión de rIL3α(CD123) podría estar asociada a la stem cell leucémica pero no expresarse en su homónimo sano135, se puede considerar que, hoy por hoy, no se han definido características fenotípicas que discriminen claramente entre ambas poblaciones135,136. Por otra parte, esta línea de investigación ha llevado a emitir nuevas propuestas sobre las características inmunofenotípicas de los estadios más inmaduros de la hematopoyesis sana, lo que tiene implicaciones en el refinamiento de los procedimientos de selección positiva aplicados al trasplante de progenitores hematopoyéticos y en la identificación de éstos en tejidos no hematopoyéticos, con todo lo que ello implica, tanto para el tratamiento de enfermedades neoplásicas como, muy previsiblemente a corto y/o medio plazo, en el tratamiento, cuando menos, de trastornos neurológicos y cardiológicos81,137-140. Entre las aportaciones más relevantes en este campo es de destacar la nueva propuesta de estadios de diferenciación en los niveles más tempranos de la hematopoyesis, que podría resumirse de la siguiente manera: 1. Los estadios más inmaduros en los que se encuadrarían las células con capacidad de autorreplicación pero sin capacidad de diferenciación estarían definidos de mayor a menor inmadurez por los fenotipos a) CD34–, CD45–, y b) CD34–, CD45+, CD38±. 2. El estadio de células con capacidad de autorreplicación y de diferenciación incluiría: CD34++, CD90+, CD133+, CD82+, KDR (VEGFR2)+, SIRP+, CD38–, HLA-DR–, CD71–, CD117– (o positivo débil), CD135+ (débil) y gp130+ (débil).

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3. Por último, los estadios con capacidad de diferenciación pero no de autorreplicación se definirían por los fenotipos: a) CD34+, CD38+, HLA-DR+, CD71+, CD117+, CD135+, rIL6+, CD90–, CD133+, y b) CD34+ (débil), CD33+ citCD3+, Lin+81. Recomendación para el estudio de las leucemias agudas El grupo EGIL recomienda estudiar las leucemias agudas en dos pasos. El primero con el objetivo de caracterizar la línea celular proliferante como B, T o mieloide; este primer paso incluiría los marcadores más específicos y tempranos de cada una de estas líneas, así como unos pocos marcadores asociados al grado de maduración, pero no específicos de línea; un segundo panel se haría en función de los resultados del primero con el objeto de precisar el subtipo de la célula neoplásica17. En este sentido, integrando las recomendaciones más recientes para el estudio de las leucemias agudas, se propondría estudiar CD10, CD19, CD13, CD33, CD34, CD45, CD7, CD14, citMPO, citCD3, sCD3, y HLA-DR para la caracterización inicial, estudiando posteriormente: a) para la línea T: CD1a, CD2, CD5, CD4, CD8 y TdT; b) para la línea B: CD20, CD79a, CD22, CD45, IgM (cIgµ) y TdT; c) para la serie mieloide: CD15, CD11b, CD16, CD10 CD33, CD13, CD56, CD64, CD65 y CD117, además de CD19, TdT, CD2, CD7, y sCD3 para el estudio de infidelidades; d) para la serie monocítica, se analizarían complementariamente los antígenos descritos para la serie mieloide en general, CD4 y CD14; e) para la serie megacariocítica: CD61, CD41a y CD42b, y f) para la serie eritroide, CD71, CD36, glicoforina A y CD45. De entre este exhaustivo panel parece especialmente recomendable el uso de las siguientes combinaciones: CD7/CD1a/CD2, CD10/CD19/CD34, CD19/CD79a/CD10, CD33/CD13/CD45, CD45/CD34/HLADR, CD64/CD34/CD45, CD45/CD71/CD33, CD15/CD34/CD56 y CD2/CD13/CD19141,142. Para finalizar este punto, recordaremos que, además del estudio de CD79a, CD22, cIgµ, CD3 y citMPO, el estudio intracitoplasmático de los marcadores CD13 y CD33 para la línea mieloide y de CD61, CD41 y CD42 para la serie megacariocítica es más sensible que su estudio en superficie y puede ser de utilidad en leucemias poco diferenciadas55. Respecto a los criterios de positividad, el grupo EGIL recomendó establecer el punto de corte en la existencia de un 20% de elementos positivos para considerar la expresión de un marcador, con la excepción de algunos marcadores más específicos de línea (citMPO, citCD3 y citCD79a) para los que se acordó rebajar el punto de corte hasta el 10%130. Sin embargo, recientemente se ha propuesto un criterio de positividad basado en la existencia de intensidades de fluorescencia media (IFM) superiores en dos desviaciones estándar a los valores de IFM de las poblaciones de las células no marcadas, que, a título personal, nos parece menos arbitrario25. Como resumen de este apartado, parece claro que, a la vista de la información aportada, para un adecuado estudio inicial de las leucemias agudas se necesitaría evaluar entre 20 y 30 AcMo de entre los recogidos en la tabla 8, mientras que para el seguimiento sería suficiente la utilización de algunas combinaciones «específicas de paciente», que incluirían un número considerablemente menor de anticuerpos monoclonales respecto a los empleados al diagnóstico. Conclusiones En la última década, la citometría de flujo ha pasado de ser una técnica complementaria, que se limitaba a confirmar el origen de las células leucémicas, a ser un análisis de extrema importancia, que permite definir estadios de madurez

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TABLA 8 Paneles para la caracterización de las leucemias agudas Estudio básico (asignación de línea) Linfoide B Linfoide T Mieloide No específicos Estudio ampliado Sí línea B Sí línea T Sí mieloide

CD19, citCD22, citCD79a, CD10 citCD3, CD2, CD7, sCD3 Anti-MPO, CD13, CD33, CD65, CD117 TdT, CD34, HLA-DR, CD9, CD38 cIgµ, sIg, kappa, lambda, CD20 CD1a, sCD3, CD4, CD5, CD8, TcR α/β, TcR γ/δ CD14, CD15, CD41, CD42, CD61, CD64, CD36, glicoforina A, citlisozima

Modificada de Bene et al17 y Stewart et al142.

muy precisos, asociados en determinadas líneas celulares a pronósticos y tratamientos específicos. Sin embargo, una gran parte de dichos avances han sido guiados por una forma clásica de estudiar las neoplasias, basada en su expresión fenotípica, en el más amplio sentido del término (morfología, características tincionales y expresión antigénica). Recientemente se ha planteado un nuevo abordaje de los tumores en los que se considera que el hecho primordial que los definiría es la alteración genética subyacente. Las neoplasias hematológicas han sido pioneras en este enfoque y, dentro de ellas, la leucemia aguda promielocítica representa su paradigma, ya que en dicha entidad a una alteración molecular/citogénetica específica se asocian unas características morfológicas e inmunofenotípicas recurrentes. Este nuevo enfoque resulta revolucionario tanto desde el punto de vista diagnóstico como del terapéutico, ya que la propia alteración, o los productos que se generan como consecuencia de ella, se convierten en la diana del tratamiento. En este nuevo contexto «molecular», la citometría de flujo permite orientar los diagnósticos basándose en la existencia de perfiles inmunofenotípicos asociados a alteraciones moleculares específicas, con la ventaja que proporciona la rapidez de la técnica. Por todo lo arriba indicado, y teniendo en cuenta que en el momento presente coexisten ambos tipos de diagnósticos, en esta revisión hemos considerado tanto los datos más recientes y relevantes en relación con la manera «clásica» de estudiar las leucemias agudas como las posibilidades diagnósticas del análisis citométrico en este nuevo marco. Agradecimiento y recordatorio A los Dres. Joaquín Gómez Espuch, Felipe de Arriba de la Fuente, María Luisa Lozano Almela y José María Moraleda Jiménez por sus útiles críticas sobre el manuscrito. Esta revisión esta dedicada a la memoria del Dr. Jesús Soler i Sola. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galton DA, Gralnick HR, et al. Proposals for the classification of acute leukaemias. FrenchAmerican-British (FAB) co-operative group. Br J Haematol 1976;33: 451-8. 2. Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galton DA, Gralnick HR, et al. Proposed revised criteria for the classification of acute myeloid leukemia. A report of the French-American-British Cooperative Group. Ann Intern Med 1985;103:620-5. 3. Rappaport H. Tumors of the hematopoietic system. En: Atlas of tumor pathology. Washington D.C.: Armed Forces Institute of Pathology, 1966, sec. III, fasc. 8. 4. Lennert K. Classification of malignant lymphomas (European concept). En: Progress in lymphology. Thieme-Stuttgart: Ed. A. Rütimann, 1967; p. 103-9. 5. The Non-Hodgkin’s Lymphoma Classification Project. National Cancer Institute sponsored study of classifications of Non-Hodgkin’s lymphomas: summary and description of a Working Formulation for clinical usage. Cancer 1982;49:2112-35.

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