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Application de la chromatographie en phase gazeuse à la mesure de la proline et de l'hydroxyproline incorporées au cours de la biosynthèse du collagène
Brkves communications
BIOCHIMIE, 1974, 56, 1003-1006.
Application de la chromatographie en phase gazeuse a la mesure de la proline et de l'hydroxyproline incorpordes au cours de la biosynth6se du collag ne C. PERIER, J. FARJANEL, M. THEIIME. M. I~RUNEL et J. FREY.
Laboratoire de Biochimie, U.E.R. de Midecine, 30, rue Ferdinant Gambon, It2100 Saint-Etienne. (11-~-197!~).
INTRODUCTION. L ' h y d r o x y l a t i o n de la p r o l i n e e n h y d r o x y p r o l i n e ( ' ) e s t la t r a n s f o r m a t i o n m 6 t a b o l i q u e la p l u s u t i l i s S e p o u r e s t i m e r q u a n t i t a t i v e m e n t la h i o s y n t h 6 s e d u c o l l a g 6 n e et p l u s p a r t i e u l i 6 r e m e n t l ' a c t i v i t 6 de la p r o t o c o l l a g S n e p r o l i n e - h y d r o x y l a s e [11. Cette h y d r o x y t a t i o n e s t m i s e e n 6 v i d e n c e p a r l ' i n e o r p o r a t i o n de P r o m a r q u e e p a r u n i s o t o p e et la f o r m a t i o n d ' H y p m a r q u 6 e h p a r t i r de eette d e r n i 6 r e . L e s t e e h n i q u e s d ' e s t i m a t i o n c o m p o r t e n t t o u t e s u n e s 6 p a r a t i o n de P r o et H y p , p r d a l a b l e h la m e s u r e de l e u r t a u x de m a r q u a g e . P o u r u n e telle s 6 p a r a t i o n , n o u s n o u s s o m m e s p r o pos6s d'utiliser la chromatographie en phase gazeuse e n r a i s o n de t r o i s a v a n t a g e s p a r r a p p o r t a u x a u t r e s m 6 t h o d e s de s 6 p a r a t i o n d o n t n o t a m m e n t la c h r o m a t o g r a p h i e s u r r 6 s i n e s 6 e h a n g e u s e s de c a t i o n s : q u a n t i t 8 d ' 6 c h a n t i l l o n p l u s f a i b l e , d u r d e de c h r o m a t o g r a p h i e p l u s e o u r t e , o b t e n t i o n d ' u n e f f l u e n t g a z e u x d o n t la radioactivitd est plus facilement mesurable. Nous avons mis au point notre technique en nous appuyant s u r les m d t h o d e s a n a l y t i q u e s de s d p a r a t i o n d e s a e i d e s a m i n e s p a r e h r o m a t o g r a p h i e e n p h a s e g a z e u s e [2] et la p o s s i b i l i t 6 de e o m p t a g e de la r a d i o a e t i v i t d de cert a i n e s m o l 6 c u l e s e o m m e d e s a c i d e s g r a s o u des st6r o i d e s a p r 6 s u n e t e l l e c h r o m a t o g r a p h i e [3, 4]. Le b u t de ee t r a v a i l a e o n s i s t ~ e n l ' o b t e n t i o n d ' u n e b o n n e s d p a r a t i o n de H y p et P r o s a n s e o n t a m i n a t i o n d e s d e u x f r a c t i o n s . N o u s a v o n s v6rifl6 la r e p r o d u e t i bilit~ de la t e c h n i q u e et n o t a m m e n t le p o u r c e n t a g e d'erreur syst6matique due au rendement des synth6ses q u l p r d c 6 d e n t la c h r o m a t o g r a p h i e . N o u s a v o n s c o m p a r d les r ~ s u l t a t s avec c e u x o b t e n u s p a r c h r o m a t o g r a p h i c s u r r ~ s i n e s d c h a n g e u s e s de c a t i o n s a v e c des l o t s i d e n t i q u e s de collag~ne. Ala Asp Cys Glu Gly Hyp Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Try Tyr Val I IS PT
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
alanine. acide aspartique. cyst6ine. aeide g l u t a m i q u e . glycecolle. hydroxyproline. isoleucine. leueine. lysine. mdthionine. ph6nylalanine. proline. s~rine. thr6onine. tryptophanne. tyrosine. valine. injection. ~talon interne. p r o g r a m m a t i o n de t e m p 6 r a t u r e .
MATERIEL ET METHODES.
Matdriel. L e s c h r o m a t o g r a p h i e s e n p h a s e g a z e u s e s o n t effeet u 6 e s a u m o y e n d u F r a c t o v a p GV ( E r b a Science) m u n i d ' u n d 6 t e e t e u r h i o n i s a t i o n de f l a m m e et d ' u n m i c r o m o d u l e de p i 6 g e a g e a s s e r v i h t ' e n r e g i s t r e u r p a r u n d i s c r 6 m i n a t e u r de pies. La radioaetivit6 des fractions est mesur6e par scintillation liquide en utilisant un compteur Packard Tri-Carh muni d'un dispositif d'6talonnage externe d e s t i n 6 h e o r r i g e r le r e n d e m e n t l u m i n e u x d u s c i n t i l l a teur.
Chromatographie en phase gazeuse. Afin d ' o b t e n i r d e s c o m p o s ~ s v o l a t i l s , les a c i d e s a m i n6s s o n t t r a n s f o r m ~ s e n e s t e r s b u t y l i q u e s N - t r i f l u o r o acdtyl~s en u t i l i s a n t la m 6 t h o d e de G e r k h e [2]. Les a c i d e s a m i n d s e n s u s p e n s i o n d a n s 100 #1 de d i c h l o r o m6thane subissent suecessivement, apr6s ~vaporation d u d i c h l o r o m 6 t h a n e , u n e e s t 6 r i f l c a t i o n avee 2 m l de m~thanol anhydre satur~ en acide ehlorhydrique h t e m p 6 r a t u r e a m b i a n t e p e n d a n t 30 m i n u t e s ; a p r ~ s 6 v a p o r a t i o n s o u s a z o t e d u m ~ t h a n o l et r e p r i s e p a r 100 #1 de d i c h l o r o m 6 t h a n e 6 v a p o r 6 ~ s o n t o u r , ils s o n t s o u m i s h u n e a u t r e e s t d r i f i e a t i o n avee 2 m l d e b u t a n o l a n h y d r e s a t u r 6 e n acide e h l o r h y d r i q u e p e n d a n t 2 h e u r e s h 90 ° - 100°C e n t u b e s b o u e h d s . L e s r 6 a e t i f s s o n t de n o u v e a u ~ v a p o r ~ s a v a n t de p r o e 6 d e r h l ' a c y l a t i o n . L e s d 6 r i v 6 s r e m i s e n s o l u t i o n d a n s 500 ~tl de d i c h l o r o m 6 t h a n e s o n t a l o r s t r a i t 6 s p a r 50 ~tl d ' a n h y d r i d e t r i f l u o r o a c ~ t i q u e p e n d a n t 2 h e u r e s h 100°C en tubes boueh6s. Les e h r o m a t o g r a p h i e s s o n t effectu6es s u r 2 p,1 de ee produit. La s6paration a lieu dans une eolonne en v e r r e de 2 m de l o n g et 3 m m de d i a m 6 t r e i n t 6 r i e u r . La c o l o n n e e s t silyl6e et r e m p l i e de Gas c h r o m P 100-120 m e s h ( E r b a Science) i m p r 6 g n 6 de la p h a s e f i x e : SE - 30 ( m 6 t h y l s i l o x a n e ) 1 p. c e n t , QF1 ( m ~ t h y l fluoroa l k y l s i l i e o n e ) 3 p. cent. L a p h a s e m o b i l e e s t e o n s t i t u 6 e p a r u n flux d ' a z o t e d ' u n d 6 b i t de 40 m l p a r m i n . Les a e i d e s a m i n 6 s s o n t 61u6s e n f o n c t i o n de la t e m p 6 r a t u r e q u i e s t p r o g r a m m ~ e de 100 h 250°C h r a i s o n de 2°C p a r min. Les produits contenus dans l'effluent gazeux sont d6teet6s p a r i o n i s a t i o n de f l a m m e . Avee ce d 6 t e e t e u r , il e s t p o s s i b l e de m e s n r e r 1 n m o l e d ' u n a e i d e a m i n 6 c o n t e n u d a n s 2 ~xl d u m 6 1 a n g e e h r o m a t o g r a p h i 6 . L ' e s t i m a t i o n q u a n t i t a t i v e e s t effeetu~e p a r r a p p o r t h u n 6 t a l o n i n t e r n e , le n. h e x a d 6 c a n e [5] (Merck, q u a l i t 6 pour ehromatographie en phase gazeuse), ajout6 h l'6ehantillon.
1004
C. P e r i e r , J. F a r j a n e l , M. T h e r m e , M. B r u n e l et J. F r e g .
Alan de c o l l e c t e r c e r t a i n s a c i d e s a m i n 6 s l o r s q n ' o n c h e r c h e h e n m e s u r e r la r a d i o a c t i v i t 6 , la c o l o n n e e s t m u n i e de d e n x s o r t i e s . Le d i v i s e u r de s o r t i e e s t r6gl6 de t e l l e f a ~ o n q u e 20 p. c e n t d u g a z v e c t e u r s o i e n t d i r i g 6 s v e r s le d 6 t e c t e u r et 80 p. cen1 v e r s le c o l l e c t e u r . N o u s u t i l i s o n s u n r n i c r o c o l l e c t e u r c o m p o s 6 de 7 t u b e s r e r n p l i s d ' u n a d s o r b a n t . C h a q u e t u b e e s t reli6 a u m o d u l e de pi~geage d o n t les 6 1 e c t r o v a n n e s a s s e r v i e s l ' e n r e g i s t r e u r p e r m e t t e n t de c o l l e c t e r les d i f f 6 r e n t e s f r a c t i o n s s61ectionn6es p a r le m o d u l e d i s c r ~ m i n a t e u r de pics. Les p r o d u i t s , s e u l e m e n t v o l a t i l s St d e s t e m p 6 -
Prdparation et hydrolyse des dchantillons de collag~ne. L ' i n e o r p o r a t i o n de 4 3 H - L P r o l i n e d a n s d e s p r o t 6 i n e s e o l l a g 6 n i q u e s a 6t~ o b t e n u e <> s e l o n la t e c h n i q u e de H u t t o n , T a p p e l et U d e n f r i e n d [7] p o u r la p r 6 p a r a t i o n d u p r o t o c o l l a g ~ n e d ' e m b r y o n de p o u l e t , s u b s t r a t de la p v o t o e o l l a g ~ n e - p r o l i n e - h y d r o x y l a s e . L e s s o l u t i o n s p r o t 6 i n i q u e s St a n a l y s e r s o n t t o u t d ' a b o r d d i a l y s 6 e s e o n t r e de l ' e a u d i s t i l l 6 e afin d'~lim i n e r les i o n s m i n ~ r a u x q u i p e u v e n t m o d i f i e r l ' ~ q u i -
IS.
Set
Leu lie
Phe G,~
As~t.yp
Lys
IIInMot Pro
170 155 150 137
i l'Ir Val
100°C
FIG. 1. - - S 6 p a r a t i o n , p a r c h r o m a t o g r a p h i e e n p h a s e g a z e u s e , d e s e s t e r s b u t y ] i q u e s N - t r i f l u o r o a c 6 t y l 6 s de 19 a c i d e s a m i n 6 s . V o l u m e i n j e c t 6 : 2 u l c o n t e n a n t 5 n m o l e s de c h a q u e a c i d e a m i n 6 . D6bit d~azote : 40 m l / m i n . G r a d i e n t de ternp6r a t u r e de 80°C St 250°C s e l o n u n e p r o g r a m r n a t i o n l i n 6 a i r e de 2 ° C / r a i n . V i t e s s e d'enregistrernent : 5 mm/min.
r a t u r e s s u p ~ r i e u r e s St 100°C, se c o n d e n s e n t d a n s les t u b e s . Cette c o n d e n s a t i o n e s t f a e i l i t 6 e p a r la p r 6 s e n c e d ' u n a d s o r b a n t f i n e m e n t divis6. N o u s a v o n s e s s a y ~ s u e e e s s i v e m e n t le e h a r b o n a e t i f e n p o u d r e , le c h a r b o n a e t i f e n g r a i n , la l a i n e de v e r r e p o u r r e t e n i r eerie d e r n i ~ r e q u i n e p r o d u i t q u ' u n e p e r t e de 1 p. c e n t d u r e n d e m e n t l u m i n e u x d u s c i n t i l l a t e u r p o u r u n e activit~ c o m p r i s e e n t r e 15 000 et 20 00O d.p.m., t a n d i s q u e le c h a r b o n a c t i f e n t r a i n e d e s p e r t e s de 20 h 60 p. cent. A p r ~ s c o l l e c t i o n d e s f r a c t i o n s , les t a m p o n s de l a i n e de v e r r e s o n t d i r e c t e m e n t p l a e 6 s d a n s les f l a c o n s d u e o m p t e u r St s c i n t i l l a t i o n et i r n m e r g ~ s d a n s 13 m l de l i q u i d e de B r a y . N o u s a v o n s v6rifi6 q u e les e s t e r s b u t y liques N trifiuoroae~tylds d'acides amines 6talent bien s o l u b l e s d a n s le l i q u i d e de B r a y et q u e l e u r c o m p o s i t i o n n e m o d i f i a i t p a s les c o n d i t i o n s de e o m p t a g e .
Chromatographic sur rdsines ~changeuses de cations. L a t e c h n i q u e u t i l i s 6 e a 6t6 p v 6 e 6 d e r n r n e n t ddcrite p a r F u n de n o u s [~]. Elle co,n s i s t e e n u n e c h r o m a t o g r a p h i c s u r e o l o n n e de r 6 s i n e 6 e h a n g e u s e d ' i o n s D o w e x 50 W X 8 51u6e p a r le t a m p o n 0,1 N p y r i d i n e a e i d e a e ~ t i q u e p H 2,65. Le s o l v a n t v o l a t i l e s t 6 v a p o r 6 a v a n t la m e s u r e de la r a d i o a e t i v i t 6 d e s f r a c t i o n s recueillies.
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 6-7.
l i b r e d ' e s t 6 r i f i c a t i o n et d ' 6 1 i m i n e r a u s s i d e s m o l e c u l e s o r g a n i q u e s q u i p e u v e n ~ e n t r a i n e r des a r t ~ f a c t s a n m o m e n t de la d 6 t e c t i o n . Les p r o t 6 i n e s s o n t h y d r o l y s 6 e s e n p r 6 s e n c e d ' a e i d e e h l o r h y d r i q u e h u n e c o n c e n t r a t i o n finale de 6 N, p e n d a n t 8 h e u r e s h l ' a u t o c l a v e St 120°C s o u s u n e p r e s s i o n de 1 k g p a r e m2. L ' h y d r o l y s a t e s t a l o r s 6yaps)r6 St see s o n s v i d e e n p r 6 s e n c e d ' a n h y d r i d e p h o s p h o r i q u e et de s o u d e . Le r 6 s i d u see e s t r e m i s e n s o l u t i o n s o i t darts 100 r~l de d i c h l o r o m 6 t h a n e p o u r f a i r e l ' o b j e t d e s s y n t h 6 s e s q u i p r 6 c 6 d e n t la c h r o r n a t o g r a p h i e e n p h a s e g a z e u s e , soit d a n s 0,5 m l de t a m p o n 0,1 N p y r i d i n e a c i d e a e 6 t i q u e p H 2,0 p o u r ~tre e n s u i t e e h r o r n a t o g r a p h i 6 s u r r 6 s i n e 6 c h a n g e u s e de c a t i o n s . RESULTATS. L ' o r d r e d ' 6 1 u t i o n d e s a c i d e s a m i n 6 s a 6t6 r e c o n n u p a r d e s s u r c h a r g e s d ' 6 t a l o n s . Le c h r o m a t o g r a m m e o b t e n u a v e c u n rn61ange 6 t a l o n d ' a e i d e s a m i n 6 s d a n s le s y s t 4 m e de p h a s e QF1 3 p. c e n t - S E 30 l p. c e n t e s t r e p r 6 s e n t 6 s u r la figure 1. I1 m o n t r e q u e ce s y s t 6 m e de p h a s e p e r m e t d ' o b t e n i r u n e b o n n e s 6 p a r a t i o n de la p r o l i n e et de l ' h y d r o x y p r o l i n e s a n s r i s q u e de c o n t a -
Chromatographic de la proline el de l'hgdroxgproline. m i n a t i o n p u i s q u e la m 6 t h i o n i n e e s t 61u6e e n t r e les deux acides amin6s pr6e6dents. En outre, l'aeide glutam i q u e q u i i n t e r v i e n t p a r f o i s c o m m e u n m 6 t a b o l i t e de la p r o l i n e o u de l ' h y d r o x y p r o l i n e n e r i s q u e p a s de c o n t a m i n e r la f r a c t i o n h y d r o x y p r o l i n e p u i s q u ' i l e s t 61u~ h e a u e o u p p l u s t a r d . La s ~ p a r a t i o n e s t a u s s i h o n n e l o r s q u ' o n a a f f a i r e h u n h y d r o l y s a t de e o l l a g 6 n e (figure 2). D a n s ee cas, les pies de p r o l i n e et d ' h y d r o -
•005
u n ~ c h a n t i l l o n de p r o l i n e t r i t i 6 e p u r e d o n t l ' a c t i v i t 6 a 6t6 p r 6 a l a b l e m e n t m e s u r 6 e . L a r a d i o a c t i v i t 6 r e t r o u v 6 e d a n s la f r a c t i o n r e c u e i l l i e a p r 6 s c h r o m a t o g r a p h i e m o n t r e q u e p o u r 9 e s s a i s le r e u d e m e n t m o y e n , e s t de 81 p. c e n t de l ' a c t i v i t 6 i n i t i a l e a v e e u n 6 c a r t - t y p e de 1,8. Ce r e n d e m e n t p e u t ~tre e o n s i d 6 r 6 c o m m e t r b s c o n s t a n t p u i s q u e l ' i n t e r v a l l e de e o n f i a n e e e s t de 1,1 p. cent.
Gly
H,yp t
Pro
Asp
l
Ph 170
Val
150
137
105
-,___
90"C
Fro. 2. - - S 6 p a r a t i o n , p a r c h r o m a t o g r a p h i e e n p h a s e g a z e u s e , d e s e s t e r s b u t y l i q u e s N - t r i f l u o r o a c 6 t y l 6 s d e s a c i d e s a m i n 6 s c o n t e n u s d a n s u n h y d r o l y s a t de c o l l a g ~ n e a c i d o - s o l u h l e . L ' h y d r o l y s e et la s y n t h 6 s e s o n t p r a t i q u 6 e s s u r 2,5 m g de c o h a g 6 n e , soit 9 ~ g de l ' 6 c h a n t i l l o n de c o l l a g 6 n e d a n s 2 Ixl de s o l u t i o n u t i l i s 6 e p o u r la e h r o m a t o g r a p h i e . Les c o n d i t i o n s e x p 6 r i m e n t a l e s s o n t les m ~ m e s q u e celles u t i l i s 6 e s d a n s Ie c a s p r 6 s e n t 6 s u r la figure 1.
x y p r o l i n e s o n t p l u s n e t t e m e n t d 6 g a g 6 s e n r a i s o n de l ' a b s e n e e de c y s t 6 i n e et de la f a i b l e c o n c e n t r a t i o n e n m6thionine. Le r e n d e m e n t de l ' e n s e m b l e des o p 6 r a t i o n s de s y n t h 6 s e et de c h r o m a t o g r a p h i c a ~t6 m e s u r 6 en n t i l i s a n t TABLEAU
1.
Radioactioitd de la SH Proline mesurde sur l ' h y d r o l g s a t d'un m d m e lot de protocollagbne. R6siue 6changeuse de cations
Technique de chromatographic
Phase gazeuse
Pr61~vement des fractions ........
CONCLUSION. Mauucl
Echantillons .......
Diff6rcnts
Nombre d'exp6rienees .... Moyenne .......... Ecart-type ........
La fiabilit6 des r 6 s u l t a t s a 6t6 v~rifi6e e n e o m p a r a n t les r 6 s u l t a t s o h t e n u s p a r e h r o m a t o g r a p h i e s u r r 6 s i n e ~-changeuse de c a t i o n s h c e u x de la c h r o m a t o g r a p h i c e n p h a s e g a z e u s e . N o u s a v o n s effectu6 cette c o m p a r a i s o n s u r d e s h y d r o l y s a t s de co]lag~ne m a r q u e . L e s r6s u l t a t s p r ~ s e n t 6 s s u r te t a b l e a u I p e r m e t t e n t de cornp a r e r les v a l e u r s de la r a d i o a e t i v i t 6 de la p r o l i n e s 6 p a r 6 e p a r les d e u x m 6 t h o d e s . L e s m e s u r e s f a i t e s s u r 10 6 c h a n t i l l o n s d i f f 6 r e n t s d ' u n m 6 m e lot de collag&ne montrent, par cornparaison des variances, qu'il n'y a p a s de d i f f 6 r e n c e s s i g n i f i c a t i v e s e n t r e les d e u x t e c h n i q u e s . L a v a l e u r b a s s e de l ' ~ c a r t t y p e o b s e r v ~ e l o r s de c h r o m a t o g r a p h i e s s u c c e s s i v e s s u r le m 6 m e 6 c h a n t i l l o n i n d i q u e la b o n n e r e p r o d u c t i h i l i t 6 de la s 6 p a ration par chromatographie en phase gazeuse.
I
i
10 11 0 I
4 684 237
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 6-7.
i ,432 i
3191
AUtolnatique Unique
9
11
4 2()7
3 947
128
1H2
L a t e c h n i q u e de c h r o m a t o g r a p h i e e n p h a s e g a z e u s e q u e n o u s v e n o n s de d 6 e r i r e r 6 p o n d h i e n a u x c o n d i t i o n s a n a l y t i q u e s ff6cessaires h l ' 6 t u d e de l ' h y d r o x y l a t i o n de l a p r o l i n e e n h y d r o x y p r o l i n e a u t o u r s de la b i o s y n t h 6 s e d u e o l l a g 6 n e . E n effet, ces d e u x a c i d e s amines sont correctement s~pards sans contamination p o s s i b l e , la m/~thode e s t r e p r o d u c t i h l e c o m m e e n t6m o i g n e le r e n d e m e n t c o n s t a n t , elle d o n n e d e s r ~ s u l t a t s c o i n p a r a b l e s h c e u x de la c h r o m a t o g r a p h i c s u r r 6 s i n e 6 c h a n g e u s e de c a t i o n s . L a c h r o m a t o g r a p h i c e l l e - m S m e
100'6
C. P e r i e r , J. F a r j a n e l , M. T h e r m e , M. B r u n e l et J. F r e y .
p e u t ~tre eontr616e p a r l ' u t i l i s a t i o n d ' u n 6 t a l o n i n t e r n e et p a r la m e s u r e d e s d 6 b i t s d ' e f f l u e n t s eolleet~s. L ' i n t 6 r ~ t de la e h r o m a t o g r a p h i e e n p h a s e g a z e u s e p a r r a p p o r t a u x a u t r e s m 6 t h o d e s de s 6 p a r a t i o n de la p r o l i n e et de l ' h y d r o x y p r o l i n e e s t d ' e t r e p l u s r a p i d e , soit 1 h e u r e it 1 h e u r e et d e m i e p o u r o b t e n i r le c h r o m a t o g r a m l n e c o m p l e t , et de n ~ e e s s i t e r de tr~s f a i b l e s q u a n t i t 6 s d ' d c h a n t i l l o n de l ' o r d r e de 250 l~xg de collag6ne q u i p e r m e t t e n t n d a n m o i n s de r 6 p 6 t e r p l u s i e u r s f o i s la s 6 p a r a t i o n , t a n d i s q u e la c h r o m a t o g r a p h i e s u r 6changcurs d'ions dure plusieurs heures, consomme 1 it 2 m g d ' 6 c h a n t i l l o n et le s o l v a n t u t i l i s 6 p o u r l ' ~ l u t i o n doit 8tre, de p l u s , 6vapor6. I,e f a c t e u r l i m i t a n t e s t l ' a c t i v i t 6 sp6cifique de l ' 6 c h a n t i l l o n q u i dolt 8tre suffis a n t e p o u r p e r m e t t r e le e o m p t a g e s u r d ' a u s s i p e t i t e s quantit6s.
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 6-7.
Ce t r a v a i l a r e q u l ' a i d e d u C.N.R.S. et de la F o n d a t i o n p o u r la R e c h e r c h e M~dicale F r a n q a i s e . BIBLIOGRAPHIE. 1. G r a n t , M. E. & P r o c k o p , D. J. (1972) N. Engl. J. Med., 286, 242-249. 2. Z u m w a l t , R. W . , R o a c h , D. & G e r k h e , C. W. (1970) J. Chromalogr., 53, 171-193. 3. A p p e l q v i s t , L. ,(. (1972) J. Lipid Res., 13, 146-148. 4. W a t s o n , G. R. & W i l l i a m s , J. P. (1972) J. Chromatogr., 67, 221-226. 5. M a n m e , B..,~ P a d i e u , P. C o m m u n i c a t i o n p e r s o n n e l l e . 6. F r e y , J. & P a d i e u , P. (1967) Bull. Soc. Chim. Biol., 49, 1221-1230. 7. H n t t o n , J. J., T a p p e l , A. L. e, U d e n f r i e n d , S. (1966) Anal. Biochem., 16, 384-394.
BIOCHIMIE, 1974, 56, 1003-1006.
Application de la chromatographie en phase gazeuse a la mesure de la proline et de l'hydroxyproline incorpordes au cours de la biosynth6se du collag ne C. PERIER, J. FARJANEL, M. THEIIME. M. I~RUNEL et J. FREY.
Laboratoire de Biochimie, U.E.R. de Midecine, 30, rue Ferdinant Gambon, It2100 Saint-Etienne. (11-~-197!~).
INTRODUCTION. L ' h y d r o x y l a t i o n de la p r o l i n e e n h y d r o x y p r o l i n e ( ' ) e s t la t r a n s f o r m a t i o n m 6 t a b o l i q u e la p l u s u t i l i s S e p o u r e s t i m e r q u a n t i t a t i v e m e n t la h i o s y n t h 6 s e d u c o l l a g 6 n e et p l u s p a r t i e u l i 6 r e m e n t l ' a c t i v i t 6 de la p r o t o c o l l a g S n e p r o l i n e - h y d r o x y l a s e [11. Cette h y d r o x y t a t i o n e s t m i s e e n 6 v i d e n c e p a r l ' i n e o r p o r a t i o n de P r o m a r q u e e p a r u n i s o t o p e et la f o r m a t i o n d ' H y p m a r q u 6 e h p a r t i r de eette d e r n i 6 r e . L e s t e e h n i q u e s d ' e s t i m a t i o n c o m p o r t e n t t o u t e s u n e s 6 p a r a t i o n de P r o et H y p , p r d a l a b l e h la m e s u r e de l e u r t a u x de m a r q u a g e . P o u r u n e telle s 6 p a r a t i o n , n o u s n o u s s o m m e s p r o pos6s d'utiliser la chromatographie en phase gazeuse e n r a i s o n de t r o i s a v a n t a g e s p a r r a p p o r t a u x a u t r e s m 6 t h o d e s de s 6 p a r a t i o n d o n t n o t a m m e n t la c h r o m a t o g r a p h i e s u r r 6 s i n e s 6 e h a n g e u s e s de c a t i o n s : q u a n t i t 8 d ' 6 c h a n t i l l o n p l u s f a i b l e , d u r d e de c h r o m a t o g r a p h i e p l u s e o u r t e , o b t e n t i o n d ' u n e f f l u e n t g a z e u x d o n t la radioactivitd est plus facilement mesurable. Nous avons mis au point notre technique en nous appuyant s u r les m d t h o d e s a n a l y t i q u e s de s d p a r a t i o n d e s a e i d e s a m i n e s p a r e h r o m a t o g r a p h i e e n p h a s e g a z e u s e [2] et la p o s s i b i l i t 6 de e o m p t a g e de la r a d i o a e t i v i t d de cert a i n e s m o l 6 c u l e s e o m m e d e s a c i d e s g r a s o u des st6r o i d e s a p r 6 s u n e t e l l e c h r o m a t o g r a p h i e [3, 4]. Le b u t de ee t r a v a i l a e o n s i s t ~ e n l ' o b t e n t i o n d ' u n e b o n n e s d p a r a t i o n de H y p et P r o s a n s e o n t a m i n a t i o n d e s d e u x f r a c t i o n s . N o u s a v o n s v6rifl6 la r e p r o d u e t i bilit~ de la t e c h n i q u e et n o t a m m e n t le p o u r c e n t a g e d'erreur syst6matique due au rendement des synth6ses q u l p r d c 6 d e n t la c h r o m a t o g r a p h i e . N o u s a v o n s c o m p a r d les r ~ s u l t a t s avec c e u x o b t e n u s p a r c h r o m a t o g r a p h i c s u r r ~ s i n e s d c h a n g e u s e s de c a t i o n s a v e c des l o t s i d e n t i q u e s de collag~ne. Ala Asp Cys Glu Gly Hyp Ile Leu Lys Met Phe Pro Ser Thr Try Tyr Val I IS PT
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
alanine. acide aspartique. cyst6ine. aeide g l u t a m i q u e . glycecolle. hydroxyproline. isoleucine. leueine. lysine. mdthionine. ph6nylalanine. proline. s~rine. thr6onine. tryptophanne. tyrosine. valine. injection. ~talon interne. p r o g r a m m a t i o n de t e m p 6 r a t u r e .
MATERIEL ET METHODES.
Matdriel. L e s c h r o m a t o g r a p h i e s e n p h a s e g a z e u s e s o n t effeet u 6 e s a u m o y e n d u F r a c t o v a p GV ( E r b a Science) m u n i d ' u n d 6 t e e t e u r h i o n i s a t i o n de f l a m m e et d ' u n m i c r o m o d u l e de p i 6 g e a g e a s s e r v i h t ' e n r e g i s t r e u r p a r u n d i s c r 6 m i n a t e u r de pies. La radioaetivit6 des fractions est mesur6e par scintillation liquide en utilisant un compteur Packard Tri-Carh muni d'un dispositif d'6talonnage externe d e s t i n 6 h e o r r i g e r le r e n d e m e n t l u m i n e u x d u s c i n t i l l a teur.
Chromatographie en phase gazeuse. Afin d ' o b t e n i r d e s c o m p o s ~ s v o l a t i l s , les a c i d e s a m i n6s s o n t t r a n s f o r m ~ s e n e s t e r s b u t y l i q u e s N - t r i f l u o r o acdtyl~s en u t i l i s a n t la m 6 t h o d e de G e r k h e [2]. Les a c i d e s a m i n d s e n s u s p e n s i o n d a n s 100 #1 de d i c h l o r o m6thane subissent suecessivement, apr6s ~vaporation d u d i c h l o r o m 6 t h a n e , u n e e s t 6 r i f l c a t i o n avee 2 m l de m~thanol anhydre satur~ en acide ehlorhydrique h t e m p 6 r a t u r e a m b i a n t e p e n d a n t 30 m i n u t e s ; a p r ~ s 6 v a p o r a t i o n s o u s a z o t e d u m ~ t h a n o l et r e p r i s e p a r 100 #1 de d i c h l o r o m 6 t h a n e 6 v a p o r 6 ~ s o n t o u r , ils s o n t s o u m i s h u n e a u t r e e s t d r i f i e a t i o n avee 2 m l d e b u t a n o l a n h y d r e s a t u r 6 e n acide e h l o r h y d r i q u e p e n d a n t 2 h e u r e s h 90 ° - 100°C e n t u b e s b o u e h d s . L e s r 6 a e t i f s s o n t de n o u v e a u ~ v a p o r ~ s a v a n t de p r o e 6 d e r h l ' a c y l a t i o n . L e s d 6 r i v 6 s r e m i s e n s o l u t i o n d a n s 500 ~tl de d i c h l o r o m 6 t h a n e s o n t a l o r s t r a i t 6 s p a r 50 ~tl d ' a n h y d r i d e t r i f l u o r o a c ~ t i q u e p e n d a n t 2 h e u r e s h 100°C en tubes boueh6s. Les e h r o m a t o g r a p h i e s s o n t effectu6es s u r 2 p,1 de ee produit. La s6paration a lieu dans une eolonne en v e r r e de 2 m de l o n g et 3 m m de d i a m 6 t r e i n t 6 r i e u r . La c o l o n n e e s t silyl6e et r e m p l i e de Gas c h r o m P 100-120 m e s h ( E r b a Science) i m p r 6 g n 6 de la p h a s e f i x e : SE - 30 ( m 6 t h y l s i l o x a n e ) 1 p. c e n t , QF1 ( m ~ t h y l fluoroa l k y l s i l i e o n e ) 3 p. cent. L a p h a s e m o b i l e e s t e o n s t i t u 6 e p a r u n flux d ' a z o t e d ' u n d 6 b i t de 40 m l p a r m i n . Les a e i d e s a m i n 6 s s o n t 61u6s e n f o n c t i o n de la t e m p 6 r a t u r e q u i e s t p r o g r a m m ~ e de 100 h 250°C h r a i s o n de 2°C p a r min. Les produits contenus dans l'effluent gazeux sont d6teet6s p a r i o n i s a t i o n de f l a m m e . Avee ce d 6 t e e t e u r , il e s t p o s s i b l e de m e s n r e r 1 n m o l e d ' u n a e i d e a m i n 6 c o n t e n u d a n s 2 ~xl d u m 6 1 a n g e e h r o m a t o g r a p h i 6 . L ' e s t i m a t i o n q u a n t i t a t i v e e s t effeetu~e p a r r a p p o r t h u n 6 t a l o n i n t e r n e , le n. h e x a d 6 c a n e [5] (Merck, q u a l i t 6 pour ehromatographie en phase gazeuse), ajout6 h l'6ehantillon.
1004
C. P e r i e r , J. F a r j a n e l , M. T h e r m e , M. B r u n e l et J. F r e g .
Alan de c o l l e c t e r c e r t a i n s a c i d e s a m i n 6 s l o r s q n ' o n c h e r c h e h e n m e s u r e r la r a d i o a c t i v i t 6 , la c o l o n n e e s t m u n i e de d e n x s o r t i e s . Le d i v i s e u r de s o r t i e e s t r6gl6 de t e l l e f a ~ o n q u e 20 p. c e n t d u g a z v e c t e u r s o i e n t d i r i g 6 s v e r s le d 6 t e c t e u r et 80 p. cen1 v e r s le c o l l e c t e u r . N o u s u t i l i s o n s u n r n i c r o c o l l e c t e u r c o m p o s 6 de 7 t u b e s r e r n p l i s d ' u n a d s o r b a n t . C h a q u e t u b e e s t reli6 a u m o d u l e de pi~geage d o n t les 6 1 e c t r o v a n n e s a s s e r v i e s l ' e n r e g i s t r e u r p e r m e t t e n t de c o l l e c t e r les d i f f 6 r e n t e s f r a c t i o n s s61ectionn6es p a r le m o d u l e d i s c r ~ m i n a t e u r de pics. Les p r o d u i t s , s e u l e m e n t v o l a t i l s St d e s t e m p 6 -
Prdparation et hydrolyse des dchantillons de collag~ne. L ' i n e o r p o r a t i o n de 4 3 H - L P r o l i n e d a n s d e s p r o t 6 i n e s e o l l a g 6 n i q u e s a 6t~ o b t e n u e <
IS.
Set
Leu lie
Phe G,~
As~t.yp
Lys
IIInMot Pro
170 155 150 137
i l'Ir Val
100°C
FIG. 1. - - S 6 p a r a t i o n , p a r c h r o m a t o g r a p h i e e n p h a s e g a z e u s e , d e s e s t e r s b u t y ] i q u e s N - t r i f l u o r o a c 6 t y l 6 s de 19 a c i d e s a m i n 6 s . V o l u m e i n j e c t 6 : 2 u l c o n t e n a n t 5 n m o l e s de c h a q u e a c i d e a m i n 6 . D6bit d~azote : 40 m l / m i n . G r a d i e n t de ternp6r a t u r e de 80°C St 250°C s e l o n u n e p r o g r a m r n a t i o n l i n 6 a i r e de 2 ° C / r a i n . V i t e s s e d'enregistrernent : 5 mm/min.
r a t u r e s s u p ~ r i e u r e s St 100°C, se c o n d e n s e n t d a n s les t u b e s . Cette c o n d e n s a t i o n e s t f a e i l i t 6 e p a r la p r 6 s e n c e d ' u n a d s o r b a n t f i n e m e n t divis6. N o u s a v o n s e s s a y ~ s u e e e s s i v e m e n t le e h a r b o n a e t i f e n p o u d r e , le c h a r b o n a e t i f e n g r a i n , la l a i n e de v e r r e p o u r r e t e n i r eerie d e r n i ~ r e q u i n e p r o d u i t q u ' u n e p e r t e de 1 p. c e n t d u r e n d e m e n t l u m i n e u x d u s c i n t i l l a t e u r p o u r u n e activit~ c o m p r i s e e n t r e 15 000 et 20 00O d.p.m., t a n d i s q u e le c h a r b o n a c t i f e n t r a i n e d e s p e r t e s de 20 h 60 p. cent. A p r ~ s c o l l e c t i o n d e s f r a c t i o n s , les t a m p o n s de l a i n e de v e r r e s o n t d i r e c t e m e n t p l a e 6 s d a n s les f l a c o n s d u e o m p t e u r St s c i n t i l l a t i o n et i r n m e r g ~ s d a n s 13 m l de l i q u i d e de B r a y . N o u s a v o n s v6rifi6 q u e les e s t e r s b u t y liques N trifiuoroae~tylds d'acides amines 6talent bien s o l u b l e s d a n s le l i q u i d e de B r a y et q u e l e u r c o m p o s i t i o n n e m o d i f i a i t p a s les c o n d i t i o n s de e o m p t a g e .
Chromatographic sur rdsines ~changeuses de cations. L a t e c h n i q u e u t i l i s 6 e a 6t6 p v 6 e 6 d e r n r n e n t ddcrite p a r F u n de n o u s [~]. Elle co,n s i s t e e n u n e c h r o m a t o g r a p h i c s u r e o l o n n e de r 6 s i n e 6 e h a n g e u s e d ' i o n s D o w e x 50 W X 8 51u6e p a r le t a m p o n 0,1 N p y r i d i n e a e i d e a e ~ t i q u e p H 2,65. Le s o l v a n t v o l a t i l e s t 6 v a p o r 6 a v a n t la m e s u r e de la r a d i o a e t i v i t 6 d e s f r a c t i o n s recueillies.
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 6-7.
l i b r e d ' e s t 6 r i f i c a t i o n et d ' 6 1 i m i n e r a u s s i d e s m o l e c u l e s o r g a n i q u e s q u i p e u v e n ~ e n t r a i n e r des a r t ~ f a c t s a n m o m e n t de la d 6 t e c t i o n . Les p r o t 6 i n e s s o n t h y d r o l y s 6 e s e n p r 6 s e n c e d ' a e i d e e h l o r h y d r i q u e h u n e c o n c e n t r a t i o n finale de 6 N, p e n d a n t 8 h e u r e s h l ' a u t o c l a v e St 120°C s o u s u n e p r e s s i o n de 1 k g p a r e m2. L ' h y d r o l y s a t e s t a l o r s 6yaps)r6 St see s o n s v i d e e n p r 6 s e n c e d ' a n h y d r i d e p h o s p h o r i q u e et de s o u d e . Le r 6 s i d u see e s t r e m i s e n s o l u t i o n s o i t darts 100 r~l de d i c h l o r o m 6 t h a n e p o u r f a i r e l ' o b j e t d e s s y n t h 6 s e s q u i p r 6 c 6 d e n t la c h r o r n a t o g r a p h i e e n p h a s e g a z e u s e , soit d a n s 0,5 m l de t a m p o n 0,1 N p y r i d i n e a c i d e a e 6 t i q u e p H 2,0 p o u r ~tre e n s u i t e e h r o r n a t o g r a p h i 6 s u r r 6 s i n e 6 c h a n g e u s e de c a t i o n s . RESULTATS. L ' o r d r e d ' 6 1 u t i o n d e s a c i d e s a m i n 6 s a 6t6 r e c o n n u p a r d e s s u r c h a r g e s d ' 6 t a l o n s . Le c h r o m a t o g r a m m e o b t e n u a v e c u n rn61ange 6 t a l o n d ' a e i d e s a m i n 6 s d a n s le s y s t 4 m e de p h a s e QF1 3 p. c e n t - S E 30 l p. c e n t e s t r e p r 6 s e n t 6 s u r la figure 1. I1 m o n t r e q u e ce s y s t 6 m e de p h a s e p e r m e t d ' o b t e n i r u n e b o n n e s 6 p a r a t i o n de la p r o l i n e et de l ' h y d r o x y p r o l i n e s a n s r i s q u e de c o n t a -
Chromatographic de la proline el de l'hgdroxgproline. m i n a t i o n p u i s q u e la m 6 t h i o n i n e e s t 61u6e e n t r e les deux acides amin6s pr6e6dents. En outre, l'aeide glutam i q u e q u i i n t e r v i e n t p a r f o i s c o m m e u n m 6 t a b o l i t e de la p r o l i n e o u de l ' h y d r o x y p r o l i n e n e r i s q u e p a s de c o n t a m i n e r la f r a c t i o n h y d r o x y p r o l i n e p u i s q u ' i l e s t 61u~ h e a u e o u p p l u s t a r d . La s ~ p a r a t i o n e s t a u s s i h o n n e l o r s q u ' o n a a f f a i r e h u n h y d r o l y s a t de e o l l a g 6 n e (figure 2). D a n s ee cas, les pies de p r o l i n e et d ' h y d r o -
•005
u n ~ c h a n t i l l o n de p r o l i n e t r i t i 6 e p u r e d o n t l ' a c t i v i t 6 a 6t6 p r 6 a l a b l e m e n t m e s u r 6 e . L a r a d i o a c t i v i t 6 r e t r o u v 6 e d a n s la f r a c t i o n r e c u e i l l i e a p r 6 s c h r o m a t o g r a p h i e m o n t r e q u e p o u r 9 e s s a i s le r e u d e m e n t m o y e n , e s t de 81 p. c e n t de l ' a c t i v i t 6 i n i t i a l e a v e e u n 6 c a r t - t y p e de 1,8. Ce r e n d e m e n t p e u t ~tre e o n s i d 6 r 6 c o m m e t r b s c o n s t a n t p u i s q u e l ' i n t e r v a l l e de e o n f i a n e e e s t de 1,1 p. cent.
Gly
H,yp t
Pro
Asp
l
Ph 170
Val
150
137
105
-,___
90"C
Fro. 2. - - S 6 p a r a t i o n , p a r c h r o m a t o g r a p h i e e n p h a s e g a z e u s e , d e s e s t e r s b u t y l i q u e s N - t r i f l u o r o a c 6 t y l 6 s d e s a c i d e s a m i n 6 s c o n t e n u s d a n s u n h y d r o l y s a t de c o l l a g ~ n e a c i d o - s o l u h l e . L ' h y d r o l y s e et la s y n t h 6 s e s o n t p r a t i q u 6 e s s u r 2,5 m g de c o h a g 6 n e , soit 9 ~ g de l ' 6 c h a n t i l l o n de c o l l a g 6 n e d a n s 2 Ixl de s o l u t i o n u t i l i s 6 e p o u r la e h r o m a t o g r a p h i e . Les c o n d i t i o n s e x p 6 r i m e n t a l e s s o n t les m ~ m e s q u e celles u t i l i s 6 e s d a n s Ie c a s p r 6 s e n t 6 s u r la figure 1.
x y p r o l i n e s o n t p l u s n e t t e m e n t d 6 g a g 6 s e n r a i s o n de l ' a b s e n e e de c y s t 6 i n e et de la f a i b l e c o n c e n t r a t i o n e n m6thionine. Le r e n d e m e n t de l ' e n s e m b l e des o p 6 r a t i o n s de s y n t h 6 s e et de c h r o m a t o g r a p h i c a ~t6 m e s u r 6 en n t i l i s a n t TABLEAU
1.
Radioactioitd de la SH Proline mesurde sur l ' h y d r o l g s a t d'un m d m e lot de protocollagbne. R6siue 6changeuse de cations
Technique de chromatographic
Phase gazeuse
Pr61~vement des fractions ........
CONCLUSION. Mauucl
Echantillons .......
Diff6rcnts
Nombre d'exp6rienees .... Moyenne .......... Ecart-type ........
La fiabilit6 des r 6 s u l t a t s a 6t6 v~rifi6e e n e o m p a r a n t les r 6 s u l t a t s o h t e n u s p a r e h r o m a t o g r a p h i e s u r r 6 s i n e ~-changeuse de c a t i o n s h c e u x de la c h r o m a t o g r a p h i c e n p h a s e g a z e u s e . N o u s a v o n s effectu6 cette c o m p a r a i s o n s u r d e s h y d r o l y s a t s de co]lag~ne m a r q u e . L e s r6s u l t a t s p r ~ s e n t 6 s s u r te t a b l e a u I p e r m e t t e n t de cornp a r e r les v a l e u r s de la r a d i o a e t i v i t 6 de la p r o l i n e s 6 p a r 6 e p a r les d e u x m 6 t h o d e s . L e s m e s u r e s f a i t e s s u r 10 6 c h a n t i l l o n s d i f f 6 r e n t s d ' u n m 6 m e lot de collag&ne montrent, par cornparaison des variances, qu'il n'y a p a s de d i f f 6 r e n c e s s i g n i f i c a t i v e s e n t r e les d e u x t e c h n i q u e s . L a v a l e u r b a s s e de l ' ~ c a r t t y p e o b s e r v ~ e l o r s de c h r o m a t o g r a p h i e s s u c c e s s i v e s s u r le m 6 m e 6 c h a n t i l l o n i n d i q u e la b o n n e r e p r o d u c t i h i l i t 6 de la s 6 p a ration par chromatographie en phase gazeuse.
I
i
10 11 0 I
4 684 237
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 6-7.
i ,432 i
3191
AUtolnatique Unique
9
11
4 2()7
3 947
128
1H2
L a t e c h n i q u e de c h r o m a t o g r a p h i e e n p h a s e g a z e u s e q u e n o u s v e n o n s de d 6 e r i r e r 6 p o n d h i e n a u x c o n d i t i o n s a n a l y t i q u e s ff6cessaires h l ' 6 t u d e de l ' h y d r o x y l a t i o n de l a p r o l i n e e n h y d r o x y p r o l i n e a u t o u r s de la b i o s y n t h 6 s e d u e o l l a g 6 n e . E n effet, ces d e u x a c i d e s amines sont correctement s~pards sans contamination p o s s i b l e , la m/~thode e s t r e p r o d u c t i h l e c o m m e e n t6m o i g n e le r e n d e m e n t c o n s t a n t , elle d o n n e d e s r ~ s u l t a t s c o i n p a r a b l e s h c e u x de la c h r o m a t o g r a p h i c s u r r 6 s i n e 6 c h a n g e u s e de c a t i o n s . L a c h r o m a t o g r a p h i c e l l e - m S m e
100'6
C. P e r i e r , J. F a r j a n e l , M. T h e r m e , M. B r u n e l et J. F r e y .
p e u t ~tre eontr616e p a r l ' u t i l i s a t i o n d ' u n 6 t a l o n i n t e r n e et p a r la m e s u r e d e s d 6 b i t s d ' e f f l u e n t s eolleet~s. L ' i n t 6 r ~ t de la e h r o m a t o g r a p h i e e n p h a s e g a z e u s e p a r r a p p o r t a u x a u t r e s m 6 t h o d e s de s 6 p a r a t i o n de la p r o l i n e et de l ' h y d r o x y p r o l i n e e s t d ' e t r e p l u s r a p i d e , soit 1 h e u r e it 1 h e u r e et d e m i e p o u r o b t e n i r le c h r o m a t o g r a m l n e c o m p l e t , et de n ~ e e s s i t e r de tr~s f a i b l e s q u a n t i t 6 s d ' d c h a n t i l l o n de l ' o r d r e de 250 l~xg de collag6ne q u i p e r m e t t e n t n d a n m o i n s de r 6 p 6 t e r p l u s i e u r s f o i s la s 6 p a r a t i o n , t a n d i s q u e la c h r o m a t o g r a p h i e s u r 6changcurs d'ions dure plusieurs heures, consomme 1 it 2 m g d ' 6 c h a n t i l l o n et le s o l v a n t u t i l i s 6 p o u r l ' ~ l u t i o n doit 8tre, de p l u s , 6vapor6. I,e f a c t e u r l i m i t a n t e s t l ' a c t i v i t 6 sp6cifique de l ' 6 c h a n t i l l o n q u i dolt 8tre suffis a n t e p o u r p e r m e t t r e le e o m p t a g e s u r d ' a u s s i p e t i t e s quantit6s.
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 6-7.
Ce t r a v a i l a r e q u l ' a i d e d u C.N.R.S. et de la F o n d a t i o n p o u r la R e c h e r c h e M~dicale F r a n q a i s e . BIBLIOGRAPHIE. 1. G r a n t , M. E. & P r o c k o p , D. J. (1972) N. Engl. J. Med., 286, 242-249. 2. Z u m w a l t , R. W . , R o a c h , D. & G e r k h e , C. W. (1970) J. Chromalogr., 53, 171-193. 3. A p p e l q v i s t , L. ,(. (1972) J. Lipid Res., 13, 146-148. 4. W a t s o n , G. R. & W i l l i a m s , J. P. (1972) J. Chromatogr., 67, 221-226. 5. M a n m e , B..,~ P a d i e u , P. C o m m u n i c a t i o n p e r s o n n e l l e . 6. F r e y , J. & P a d i e u , P. (1967) Bull. Soc. Chim. Biol., 49, 1221-1230. 7. H n t t o n , J. J., T a p p e l , A. L. e, U d e n f r i e n d , S. (1966) Anal. Biochem., 16, 384-394.