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Apports de la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire des fluides dans l’étude de maladies métaboliques et neurodégénératives
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Rev Neurol (Paris) 2007 ; 163 : 10, 960-965
Maladies métaboliques Apports de la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire des fluides dans l’étude de maladies métaboliques et neurodégénératives F. Mochel1, J. Barritault2, N. Boldieu2, M. Eugène2, F. Sedel3, A. Durr1, 4, F. Seguin2 1
INSERM, Hôpital de la Salpêtrière, UMR 679, Paris. INSERM, Faculté de médecine et de pharmacie et Hôpital La Milétrie, E0324, Poitiers. 3 APHP, Hôpital de la Salpêtrière, Fédération des maladies du système nerveux, Paris. 4 APHP, Hôpital de la Salpêtrière, Département de génétique et cytogénétique, Paris. 2
RÉSUMÉ La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire — ou SRM — in vitro est une méthode d’analyse biochimique permettant l’analyse métabolique des fluides biologiques tels que le liquide céphalorachidien ou les urines. Les principaux avantages de la SRM in vitro sont la préparation minimale des échantillons avant leur analyse, la possibilité d’analyser simultanément des composés de nature différente, et les informations structurales apportées sur les métabolites présents dans l’échantillon. Au cours des dix dernières années, la SRM in vitro a ainsi permis l’identification de maladies métaboliques nouvelles, dont certaines sont accessibles à une thérapie. La recherche d’anomalies métaboliques, par SRM in vitro, chez des patients présentant une maladie neurologique inexpliquée représente donc une nouvelle approche physiopathologique, en particulier en association avec des analyses génétiques de type analyse de liaison ou recherche de gène candidat. Grâce à l’utilisation d’outils statistiques multiparamétriques, permettant de comparer l’ensemble du profil métabolique entre différents groupes, la SRM in vitro est également une méthode de choix face au défi que représente la recherche de biomarqueurs dans des maladies neurologiques connues.
Mots-clés : Erreurs innées du métabolisme • Maladies métaboliques héréditaires • Spectroscopie • Résonance magnétique nucléaire • Liquide cérébrospinal • Neurologie
SUMMARY Contribution of in vitro NMR spectroscopy to metabolic and neurodegenerative disorders. F. Mochel, J. Barritault, N. Boldieu, M. Eugène, F. Sedel, A. Durr, F. Seguin, Rev Neurol 2007; 163: 10, 960-965. In vitro Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy is a validated biochemical tool for metabolic analyses of human body fluids and diagnosis of inborn errors of metabolism in children and adults. The technique is of special interest because it requires minimal sample preparation, it can detect simultaneously compounds of different nature and it offers structural information on the metabolites present in body fluids. In the last decade, in vitro NMR spectroscopy contributed to the identification of new inborn errors of metabolism, some of which are amenable to therapeutic intervention. Standardized analyses of body fluids, especially cerebrospinal fluid, are therefore indicated in patients affected with neurodegenerative disorders of unknown etiologies, for which extensive metabolic and genetic screening failed to identify the primary defect. In addition, the use of multivariate statistical analyses allows the comparison of the whole metabolic profile between patients with a given neurodegenerative disorder and controls. This so-called metabonomic approach yields promises for the discovery of biomarkers that can help detecting disease onset and progression, as well as evaluating therapeutic efficacy. Finally, the combination of in vitro NMR spectroscopy with genetic analytical tools may constitute a successful pathophysiological approach to investigate neurological disorders of unknown etiology.
Keywords: Inborn errors of metabolism • Inherited metabolic diseases • Spectroscopy • Nuclear magnetic resonance • Cerebrospinal fluid
INTRODUCTION La Spectroscopie par Résonance Magnétique nucléaire — ou SRM — in vitro est une méthode d’analyse utilisant les propriétés magnétiques des noyaux d’atomes. Utilisée
pour l’exploration des fluides biologiques, la SRM in vitro, est une méthode non sélective ne nécessitant aucune étape d’extraction ni de dérivation. La nature variée des métabolites (c’est-à-dire petites molécules) détectés au sein d’une même analyse permet ainsi l’étude simultanée de plusieurs
Correspondance : F. MOCHEL, INSERM U679, Hôpital de la Salpêtrière, 47, boulevard de l’Hôpital, 75651 Paris CEDEX 13, France. E-mail : [email protected]
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voies métaboliques. Les données structurales qu’apporte la SRM sur les molécules observées in vitro facilitent l’identification de métabolites nouveaux. Les techniques de RMN offrent également une interface privilégiée entre l’analyse in vivo — IRM et SRM cérébrales —, et l’analyse in vitro — par SRM in vitro des fluides. La SRM in vitro des fluides peut être utilisée pour le diagnostic d’un grand nombre d’erreurs innées du métabolisme (EIM) (Burns et al., 1992 ; Engelke et al., 2004 ; Iles et al., 1985 ; Lehnert et Hunkler, 1986 ; Sewell et al., 2002 ; Wevers et al., 1999). Récemment, cette technique a aussi conduit à l’identification de nouveaux déficits enzymatiques, notamment dans le métabolisme de la créatine (Schulze 2003) ou le métabolisme des polyols (Huck et al., 2004 ; Moolenaar et al., 2001). Par ailleurs, la SRM in vitro connaît un essor important dans la caractérisation de pathologies neurodégénératives d’origine génétique. Ces études sont basées sur des approches dites métabonomiques. L’ensemble du profil métabolique est alors utilisé de façon à mettre en évidence les modifications métaboliques pouvant exister entre les groupes que l’on cherche à comparer.
PRINCIPES, AVANTAGES ET LIMITES DE LA TECHNIQUE DE SRM IN VITRO Les applications de la RMN, que ce soit la SRM in vivo, la SRM in vitro ou l’IRM, sont basées sur le même principe. L’application d’une impulsion radiofréquence au sein d’un champ magnétique induit l’excitation des noyaux des molécules présentes dans un milieu donné. Le signal RMN consiste en la détection par l’antenne du spectromètre du retour à l’équilibre des noyaux excités au cours du temps. La SRM in vitro apporte des informations à la fois quantitatives et structurales, basées sur trois principes physico-chimiques : (i) le déplacement chimique des pics, correspondant aux différentes parties de la molécule, (ii) le phénomène de couplage, ou interaction entre les noyaux adjacents d’une molécule (iii) et l’intensité de chacun de ces pics. Le comportement magnétique d’une molécule, en réponse à l’excitation radiofréquence au sein du champ électromagnétique, permet ainsi la caractérisation de cette molécule. Les techniques de RMN peuvent s’appliquer à l’étude de plusieurs noyaux grâce à l’utilisation d’antennes dédiées. En raison de l’abondance naturelle de ces noyaux au sein des fluides biologiques et de leur sensibilité RMN, les techniques les plus souvent utilisées en médecine humaine et animale sont la SRM du proton (1H-SRM), et dans une moindre mesure, la SRM du phosphore 31 et du carbone 13. Une grande partie de l’étude des fluides biologiques peut se faire à partir de spectre en une dimension (1D). Cependant, l’identification de métabolites complexes, ou nouveaux, peut nécessiter des analyses complémentaires en deux dimensions de fréquence (2D), permettant de mieux séparer les pics. Ces analyses 2D peuvent être homonucléaires — à partir de noyaux de même nature —, ou hété-
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ronucléaires — à partir de noyaux de nature différente — telles les techniques HSQC qui combinent les informations du proton et du carbone (Guerrini et al. 2005). Alors que la résolution de la SRM cérébrale est de l’ordre du millimolaire, l’ordre de grandeur de la SRM in vitro des fluides est le micromolaire. En dehors de l’étude des fluides — urines, plasma, liquide céphalorachidien (LCR), liquide séminal par exemple —, la SRM in vitro peut aussi s’effectuer sur des biopsies — cerveau, rein, cœur ou foie notamment — grâce aux techniques de HR-MAS (Shapiro et Gounarides, 2000). Bien que la SRM des fluides biologiques puisse être réalisée sans aucune préparation, il est recommandé : (i) d’ajuster le pH à une valeur précise, le déplacement chimique de certains groupements métaboliques étant très dépendant du pH du milieu ; (ii) d’ajouter un étalon externe, molécule ne générant pas d’interactions avec les métabolites du milieu, pour la quantification éventuelle de métabolites d’intérêt dans le spectre RMN ; (iii) et d’un solvant deutérié, D2O, pour faciliter les réglages de l’appareil. Comme pour beaucoup de méthodes d’analyse biochimique, il est important de standardiser le recueil des échantillons de façon à diminuer la variabilité individuelle générée par certains facteurs comme l’alimentation. Pour les échantillons plasmatiques et urinaires en particulier, il est recommandé de réaliser un recueil le matin à jeun. Il est également nécessaire de congeler les échantillons à – 80 °C immédiatement après leur recueil, de façon à bloquer les réactions biochimiques pouvant se produire en dehors de l’organisme. En résumé, les principaux avantages de la SRM des fluides sont : – un temps minimal de préparation ; – l’analyse simultanée de métabolites de nature différente, une centaine de résonances étant actuellement identifiées dans le LCR (Lutz et al. 1998, Wevers et al. 1995), et plus de 200 dans les urines ; – la détection de composés difficilement mis en évidence par d’autres techniques, tels que la bétaïne, la choline, le myoinositol ou encore des groupements acétylés ou sulfatés (Engelke et al. 2004, Engelke et al. 2005) ; – l’accès à des données structurales en cas de mise en évidence de pics anormaux ; – la possibilité d’associer les analyses de SRM in vitro à la SRM in vivo ; – la possibilité de coupler la SRM in vitro à d’autres techniques d’analyses type HPLC (high performance liquid chromatography) ou spectrométrie de masse. À l’inverse, les limites de la technique de 1H-SRM in vitro sont : – la détection de métabolites seulement, c’est-à-dire de composés dont le poids moléculaire n’excède pas 750 Da, ce qui exclut par exemple l’analyse des protéines ou des acides gras ; – la sensibilité, qui exclut notamment la détection des neurotransmetteurs, vitamines et autres cofacteurs ; cependant l’utilisation de champs magnétiques de plus en plus
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puissants contribue à augmenter significativement cette sensibilité de détection ; – les difficultés d’identification de certains métabolites, en raison du chevauchement important des pics dans certaines régions du spectre — même si ce problème peut souvent être résolu par les analyses en 2D —, ou du nombre insuffisant de couplages correspondant à des interactions entre noyaux voisins au sein d’une même molécule ; – l’absence de base de données internationale pour l’identification automatisée des pics, imposant à chaque équipe de constituer sa propre base de données ; – les pics supplémentaires, en particulier au niveau des spectres urinaires, provenant des thérapies délivrées aux patients, mais aussi de certains facteurs alimentaires, et qui rendent plus difficiles l’identification des métabolites.
APPLICATIONS DE LA SRM IN VITRO DES FLUIDES Utilisée dans des conditions standardisées, la SRM in vitro des fluides permet le diagnostic d’un nombre important d’EIM dont des aciduries organiques, des anomalies du cycle de l’urée, des aminoacidopathies, des anomalies de la β-oxydation, des anomalies du métabolisme des purines et pyrimidines ou encore certaines pathologies lysosomales (Burns et al., 1992 ; Engelke et al., 2004 ; Iles et al,. 1985 ; Lehnert et Hunkler, 1986 ; Sewell et al., 2002 ; Wevers et al., 1999). L’étendue des métabolites détectés au sein d’une même analyse permet aussi l’étude simultanée de plusieurs voies métaboliques. Des anomalies du métabolisme des acides aminés ont ainsi été reliées au métabolisme énergétique (par le biais de la créatine) ou encore aux voies de la méthylation (par le biais de la bétaïne) (Burns et al., 1998 ; Iles et al., 1986). Dans le cadre des EIM affectant le système nerveux central, l’analyse du LCR est particulièrement indiquée. Malgré les artefacts générés par les thérapeutiques en cours et certains régimes alimentaires, les urines constituent également un fluide d’intérêt, le rein permettant de concentrer les métabolites accumulés de façon anormale dans l’organisme. En fonction des anomalies mises en évidence dans le LCR ou les urines, il peut s’avérer utile de compléter les analyses SRM à partir du sérum ou de plasma. D’autre part, les techniques de SRM in vivo couplées à la SRM in vitro des fluides ont récemment permis la mise en évidence de plusieurs maladies métaboliques, dont : – trois déficits du métabolisme de la créatine — deux déficits de synthèse et un déficit du transporteur de la créatine — impliqués dans des formes de retard mental, de syndrome autistique et/ou d’atteinte neurologique (épilepsie, dystonie) de sévérité variable (Schulze 2003), dont certains ont été observés à l’âge adulte (Caldeira Araujo et al., 2005 ; Kleefstra et al., 2005 ; Schulze et al., 2003) ; – deux déficits enzymatiques dans la voie des pentoses phosphate — déficits en transaldolase et ribulose 5-phosphate 5-isomérase — identifiés chez l’enfant dans des
tableaux d’atteinte hépatique sévère (Moolenaar et al., 2001) et/ou de leucodystrophie (Huck et al., 2004) ; – un nouveau déficit dans la voie des pyrimidines — déficit en uréidopropionase — chez des enfants présentant un tableau neurologique complexe associant une microcéphalie, une dystonie et un retard de myélinisation (Moolenaar et al., 2001) ; – un déficit enzymatique sur la voie permettant la conversion de la choline en glycine — déficit en diméthylglycine déshydrogénase — chez un adulte présentant un tableau atypique de fatigue musculaire (Moolenaar et al., 1999) ; – un déficit en aminoacylase I, dont le phénotype neurologique très hétérogène à ce jour ne permet cependant pas d’affirmer qu’il s’agit d’une nouvelle entité neurométabolique (Sass et al., 2006 ; Van Coster et al., 2005) ; – un tableau d’hypomyélinisation associée à une élévation significative d’acide N-acétylaspartylglutamique, dont l’anomalie primaire est en cours d’identification (Wolf et al. 2004). Au total, un grand nombre de maladies métaboliques peuvent être diagnostiquées à ce jour par 1H-SRM du LCR et/ou des urines (Fig. 1). Les profils métaboliques observés par SRM in vitro viennent d’être rapportés par Engelke et al. (2007) dans la 2e édition du Handbook of1H-NMR spectroscopy in inborn errors of metabolism: body fluid NMR spectrum and in vivo MR spectroscopy (Heilbronn: SPS Verlagsgesellschaft). La SRM in vitro constitue donc un outil puissant et reproductible pour le diagnostic de maladies métaboliques connues, mais aussi pour la mise en évidence d’anomalies métaboliques nouvelles pour lesquelles une thérapeutique ciblée est parfois disponible. C’est le cas des deux déficits de synthèse de la créatine accessibles à une thérapeutique simple et relativement efficace, certains symptômes tels que l’épilepsie ayant même été améliorés à l’âge adulte (Schulze et al., 2003). Enfin, les études citées ci-dessus sont applicables à l’étude de modèles animaux. La corrélation entre les anomalies métaboliques identifiées chez l’Homme et chez un modèle animal peut permettre de mieux appréhender la pertinence de ce dernier dans l’étude d’une maladie donnée (Renema et al. 2003). Ces dernières années, des développements importants ont été réalisés dans la recherche de biomarqueurs, c’est-à-dire tout paramètre — clinique, biochimique, radiologique — pouvant être associé à des processus biologiques complexes. Ainsi, dans le cadre des maladies génétiques où la cause du processus pathologique est identifiée, il est souvent difficile d’appréhender l’ensemble des perturbations biologiques qui en résultent. Cette complexité s’explique d’une part parce que l’anomalie génétique se situe en amont d’une cascade d’évènements cellulaires qui comprend de nombreux intermédiaires — transcriptionnels, protéiques, biochimiques — mais aussi parce que plusieurs voies de régulation cellulaire sont souvent perturbées simultanément. L’étude métabolique présente l’intérêt majeur de donner accès à la résultante finale de ces cascades d’évènements. Initialement dédiées aux études toxicologiques (Gartland et al., 1991), les analyses métabonomiques se
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Fig. 1. – Exemples de profils métaboliques obtenus par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire du proton (1H-SRM) à partir d’échantillons normaux (a, c, e) et d’échantillons de patients adultes présentant une maladie métabolique (b, d, f). (b) Spectre RMN à partir du LCR d’un patient présentant un déficit en dihydroptéridine réductase, montrant une élévation de phénylalanine (accolade). (d) Spectre RMN urinaire d’un patient présentant un déficit en méthylènetétrahydrofolate réductase, montrant une élévation de diméthylglycine (flèche). À noter l’excrétion urinaire importante de bétaïne (*), avec laquelle le patient est supplémenté. (f) Spectre urinaire d’un patient présentant un syndrome de Lesch-Nyhan, caractérisé par une élévation de xanthine (flèche) et d’hypoxanthine (accolade). Illustration of metabolic profiles obtained by proton nuclear magnetic resonance (1HNMR) spectroscopy, from normal samples (a, c, e) and samples from adult patients affected with metabolic diseases (b, d, f). (b) NMR spectrum from the CSF of a patient with dihydropyrimidine reductase deficiency, showing elevated phenylalanine (bracket). (d) NMR spectrum from the urine of a patient with methylenetetrahydrofolate reductase deficiency, showing an increase of dimethylglycine (arrow). Of note, the spectrum shows a high excretion of betaine (*), with which the patient is supplemented. (f) NMR spectrum from the urine of a patient with Lesch-Nyhan syndrome, characterized by elevated xanthine (arrow) and hypoxanthine (bracket).
sont alors progressivement étendues à l’étude de processus physiopathologiques en médecine humaine et animale (Nicholson et al., 2002). Ainsi, l’approche métabonomique est définie aujourd’hui comme « la mesure quantitative et multiparamétrique de la réponse métabolique dynamique d’un système vivant à une substance ou à une pathologie » (Nicholson et al., 1999). Indépendamment de l’analyse individuelle de chaque spectre visant à identifier les métabolites présents au niveau de l’échantillon biologique, les analyses statistiques multiparamétriques permettent de comparer le profil métabolique d’un groupe de spectres correspondant à une catégorie A, à celui d’un autre groupe
de spectres correspondant à une catégorie B. Le spectre RMN est converti en une suite de variables proportionnelles à l’intensité du signal, par division en petits intervalles réguliers. L’analyse en composante principale — ou ACP — donne alors une représentation graphique de la dispersion de ces variables dans un espace dont le nombre de composantes est égal au nombre de variables choisies. Il est possible : (i) de déterminer si la dispersion des variables dans cet espace multiparamétrique permet de séparer les groupes à comparer ; (ii) et de repérer les variables, donc les métabolites du spectre RMN, responsables de la séparation entre ces groupes. D’autre part, l’analyse par régres-
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sion linéaire partielle — ou PLS (partial least square) — permet de rechercher une corrélation entre l’ensemble des variables du spectre RMN et une variable explicative — par exemple le score clinique pour la pathologie étudiée. Comme pour les analyses individuelles des spectres RMN, les études métabonomiques nécessitent de standardiser le recueil des échantillons de façon à diminuer les biais provenant de facteurs environnementaux et perturbant l’analyse statistique. Holmes et al. (2006) ont récemment souligné la contribution de la SRM in vitro des fluides dans plusieurs maladies neurodégénératives, et en particulier dans la maladie de Huntington (MH) où un profil procatabolique semble pouvoir être mis en évidence dès les formes précoces de la maladie (Tsang et al., 2006 ; Underwood et al., 2006) « Nous avons récemment conduit une étude clinique visant à explorer la perte de poids chez des patients à un stade très précoce de la MH et des individus présymptomatiques, comparativement à un groupe contrôle (Mochel et al., 2007). L’analyse par PLS à partir du plasma a permis de distinguer les patients atteints de MH à différents stades de la maladie, ainsi que les individus présymptomatiques du groupe contrôle. Les anomalies métaboliques responsables de cette séparation semblent confirmer l’existence d’un profil hypercatabolique à un stade précoce de la MH. L’analyse d’un nombre plus important de patients, notamment à des stades plus avancés de la maladie, est en cours afin de valider l’utilisation potentielle de ce biomarqueur, notamment dans le cadre d’essais thérapeutiques. » De même, la SRM in vitro a récemment permis l’identification de β-hydroxyisobutyrate dans le LCR de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) (Lutz et al., 2007). Ce métabolite, susceptible de servir de biomarqueur dans une maladie neurodégénérative très hétérogène, apporte également des données physiopathologiques importantes sur les voies biochimiques possiblement impliquées dans la sclérose en plaques. En dehors de ces avancées physiopathologiques, l’identification d’un biomarqueur par SRM in vitro peut : (i) apporter des éléments pronostiques importants, pouvant améliorer la prise en charge thérapeutique des patients (Hauet et al., 2000), (ii) et/ou contribuer à l’évaluation de l’efficacité thérapeutique d’une molécule, en particulier si l’on ne dispose pas de scores cliniques suffisamment sensibles pour apprécier dans un délai raisonnable le bénéfice thérapeutique pour les patients (Wild et Tabrizi, 2006). Enfin, la possibilité de combiner des analyses génétiques avec une analyse métabolique sans a priori par SRM in vitro, pourrait représenter une nouvelle approche physiopathologique chez des patients présentant une maladie neurologique familiale inexpliquée. Dans les pathologies pour lesquelles la ségrégation familiale autorise des études de liaison génétique, la recherche d’anomalies métaboliques par SRM in vitro est en effet susceptible de réduire le nombre de gènes candidats au sein des intervalles de liaison.
CONCLUSION Les indications de la SRM in vitro dans les maladies neurodégénératives peuvent donc se résumer à : – la caractérisation d’une anomalie métabolique, après la mise en évidence d’un profil anormal par SRM cérébrale in vivo ; – la recherche d’anomalies métaboliques — augmentation/diminution de métabolites connus ou détection de métabolites nouveaux — chez des patients présentant une affection neurologique complexe inexpliquée malgré des investigations extensives, ce d’autant que le phénotype singulier de ces patients et/ou son caractère isolé au sein de la famille ne permettent pas de les inclure dans une étude d’association et/ou de liaison génétique ; – la recherche de biomarqueurs dans des pathologies neurodégénératives connues, mais dont la compréhension physiopathologique reste limitée. Remerciements. Les auteurs remercient chaleureusement le Pr Ron Wevers et Udo Engelke pour leur collaboration précieuse aux études par SRM in vitro récemment réalisées au sein du Département de génétique et de la Fédération des maladies du système nerveux de l’hôpital de La Pitié-Salpêtrière. Le travail du Dr Mochel a été financé par la Fondation pour la Recherche Médicale (Paris).
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Maladies métaboliques Apports de la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire des fluides dans l’étude de maladies métaboliques et neurodégénératives F. Mochel1, J. Barritault2, N. Boldieu2, M. Eugène2, F. Sedel3, A. Durr1, 4, F. Seguin2 1
INSERM, Hôpital de la Salpêtrière, UMR 679, Paris. INSERM, Faculté de médecine et de pharmacie et Hôpital La Milétrie, E0324, Poitiers. 3 APHP, Hôpital de la Salpêtrière, Fédération des maladies du système nerveux, Paris. 4 APHP, Hôpital de la Salpêtrière, Département de génétique et cytogénétique, Paris. 2
RÉSUMÉ La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire — ou SRM — in vitro est une méthode d’analyse biochimique permettant l’analyse métabolique des fluides biologiques tels que le liquide céphalorachidien ou les urines. Les principaux avantages de la SRM in vitro sont la préparation minimale des échantillons avant leur analyse, la possibilité d’analyser simultanément des composés de nature différente, et les informations structurales apportées sur les métabolites présents dans l’échantillon. Au cours des dix dernières années, la SRM in vitro a ainsi permis l’identification de maladies métaboliques nouvelles, dont certaines sont accessibles à une thérapie. La recherche d’anomalies métaboliques, par SRM in vitro, chez des patients présentant une maladie neurologique inexpliquée représente donc une nouvelle approche physiopathologique, en particulier en association avec des analyses génétiques de type analyse de liaison ou recherche de gène candidat. Grâce à l’utilisation d’outils statistiques multiparamétriques, permettant de comparer l’ensemble du profil métabolique entre différents groupes, la SRM in vitro est également une méthode de choix face au défi que représente la recherche de biomarqueurs dans des maladies neurologiques connues.
Mots-clés : Erreurs innées du métabolisme • Maladies métaboliques héréditaires • Spectroscopie • Résonance magnétique nucléaire • Liquide cérébrospinal • Neurologie
SUMMARY Contribution of in vitro NMR spectroscopy to metabolic and neurodegenerative disorders. F. Mochel, J. Barritault, N. Boldieu, M. Eugène, F. Sedel, A. Durr, F. Seguin, Rev Neurol 2007; 163: 10, 960-965. In vitro Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy is a validated biochemical tool for metabolic analyses of human body fluids and diagnosis of inborn errors of metabolism in children and adults. The technique is of special interest because it requires minimal sample preparation, it can detect simultaneously compounds of different nature and it offers structural information on the metabolites present in body fluids. In the last decade, in vitro NMR spectroscopy contributed to the identification of new inborn errors of metabolism, some of which are amenable to therapeutic intervention. Standardized analyses of body fluids, especially cerebrospinal fluid, are therefore indicated in patients affected with neurodegenerative disorders of unknown etiologies, for which extensive metabolic and genetic screening failed to identify the primary defect. In addition, the use of multivariate statistical analyses allows the comparison of the whole metabolic profile between patients with a given neurodegenerative disorder and controls. This so-called metabonomic approach yields promises for the discovery of biomarkers that can help detecting disease onset and progression, as well as evaluating therapeutic efficacy. Finally, the combination of in vitro NMR spectroscopy with genetic analytical tools may constitute a successful pathophysiological approach to investigate neurological disorders of unknown etiology.
Keywords: Inborn errors of metabolism • Inherited metabolic diseases • Spectroscopy • Nuclear magnetic resonance • Cerebrospinal fluid
INTRODUCTION La Spectroscopie par Résonance Magnétique nucléaire — ou SRM — in vitro est une méthode d’analyse utilisant les propriétés magnétiques des noyaux d’atomes. Utilisée
pour l’exploration des fluides biologiques, la SRM in vitro, est une méthode non sélective ne nécessitant aucune étape d’extraction ni de dérivation. La nature variée des métabolites (c’est-à-dire petites molécules) détectés au sein d’une même analyse permet ainsi l’étude simultanée de plusieurs
Correspondance : F. MOCHEL, INSERM U679, Hôpital de la Salpêtrière, 47, boulevard de l’Hôpital, 75651 Paris CEDEX 13, France. E-mail : [email protected]
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voies métaboliques. Les données structurales qu’apporte la SRM sur les molécules observées in vitro facilitent l’identification de métabolites nouveaux. Les techniques de RMN offrent également une interface privilégiée entre l’analyse in vivo — IRM et SRM cérébrales —, et l’analyse in vitro — par SRM in vitro des fluides. La SRM in vitro des fluides peut être utilisée pour le diagnostic d’un grand nombre d’erreurs innées du métabolisme (EIM) (Burns et al., 1992 ; Engelke et al., 2004 ; Iles et al., 1985 ; Lehnert et Hunkler, 1986 ; Sewell et al., 2002 ; Wevers et al., 1999). Récemment, cette technique a aussi conduit à l’identification de nouveaux déficits enzymatiques, notamment dans le métabolisme de la créatine (Schulze 2003) ou le métabolisme des polyols (Huck et al., 2004 ; Moolenaar et al., 2001). Par ailleurs, la SRM in vitro connaît un essor important dans la caractérisation de pathologies neurodégénératives d’origine génétique. Ces études sont basées sur des approches dites métabonomiques. L’ensemble du profil métabolique est alors utilisé de façon à mettre en évidence les modifications métaboliques pouvant exister entre les groupes que l’on cherche à comparer.
PRINCIPES, AVANTAGES ET LIMITES DE LA TECHNIQUE DE SRM IN VITRO Les applications de la RMN, que ce soit la SRM in vivo, la SRM in vitro ou l’IRM, sont basées sur le même principe. L’application d’une impulsion radiofréquence au sein d’un champ magnétique induit l’excitation des noyaux des molécules présentes dans un milieu donné. Le signal RMN consiste en la détection par l’antenne du spectromètre du retour à l’équilibre des noyaux excités au cours du temps. La SRM in vitro apporte des informations à la fois quantitatives et structurales, basées sur trois principes physico-chimiques : (i) le déplacement chimique des pics, correspondant aux différentes parties de la molécule, (ii) le phénomène de couplage, ou interaction entre les noyaux adjacents d’une molécule (iii) et l’intensité de chacun de ces pics. Le comportement magnétique d’une molécule, en réponse à l’excitation radiofréquence au sein du champ électromagnétique, permet ainsi la caractérisation de cette molécule. Les techniques de RMN peuvent s’appliquer à l’étude de plusieurs noyaux grâce à l’utilisation d’antennes dédiées. En raison de l’abondance naturelle de ces noyaux au sein des fluides biologiques et de leur sensibilité RMN, les techniques les plus souvent utilisées en médecine humaine et animale sont la SRM du proton (1H-SRM), et dans une moindre mesure, la SRM du phosphore 31 et du carbone 13. Une grande partie de l’étude des fluides biologiques peut se faire à partir de spectre en une dimension (1D). Cependant, l’identification de métabolites complexes, ou nouveaux, peut nécessiter des analyses complémentaires en deux dimensions de fréquence (2D), permettant de mieux séparer les pics. Ces analyses 2D peuvent être homonucléaires — à partir de noyaux de même nature —, ou hété-
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ronucléaires — à partir de noyaux de nature différente — telles les techniques HSQC qui combinent les informations du proton et du carbone (Guerrini et al. 2005). Alors que la résolution de la SRM cérébrale est de l’ordre du millimolaire, l’ordre de grandeur de la SRM in vitro des fluides est le micromolaire. En dehors de l’étude des fluides — urines, plasma, liquide céphalorachidien (LCR), liquide séminal par exemple —, la SRM in vitro peut aussi s’effectuer sur des biopsies — cerveau, rein, cœur ou foie notamment — grâce aux techniques de HR-MAS (Shapiro et Gounarides, 2000). Bien que la SRM des fluides biologiques puisse être réalisée sans aucune préparation, il est recommandé : (i) d’ajuster le pH à une valeur précise, le déplacement chimique de certains groupements métaboliques étant très dépendant du pH du milieu ; (ii) d’ajouter un étalon externe, molécule ne générant pas d’interactions avec les métabolites du milieu, pour la quantification éventuelle de métabolites d’intérêt dans le spectre RMN ; (iii) et d’un solvant deutérié, D2O, pour faciliter les réglages de l’appareil. Comme pour beaucoup de méthodes d’analyse biochimique, il est important de standardiser le recueil des échantillons de façon à diminuer la variabilité individuelle générée par certains facteurs comme l’alimentation. Pour les échantillons plasmatiques et urinaires en particulier, il est recommandé de réaliser un recueil le matin à jeun. Il est également nécessaire de congeler les échantillons à – 80 °C immédiatement après leur recueil, de façon à bloquer les réactions biochimiques pouvant se produire en dehors de l’organisme. En résumé, les principaux avantages de la SRM des fluides sont : – un temps minimal de préparation ; – l’analyse simultanée de métabolites de nature différente, une centaine de résonances étant actuellement identifiées dans le LCR (Lutz et al. 1998, Wevers et al. 1995), et plus de 200 dans les urines ; – la détection de composés difficilement mis en évidence par d’autres techniques, tels que la bétaïne, la choline, le myoinositol ou encore des groupements acétylés ou sulfatés (Engelke et al. 2004, Engelke et al. 2005) ; – l’accès à des données structurales en cas de mise en évidence de pics anormaux ; – la possibilité d’associer les analyses de SRM in vitro à la SRM in vivo ; – la possibilité de coupler la SRM in vitro à d’autres techniques d’analyses type HPLC (high performance liquid chromatography) ou spectrométrie de masse. À l’inverse, les limites de la technique de 1H-SRM in vitro sont : – la détection de métabolites seulement, c’est-à-dire de composés dont le poids moléculaire n’excède pas 750 Da, ce qui exclut par exemple l’analyse des protéines ou des acides gras ; – la sensibilité, qui exclut notamment la détection des neurotransmetteurs, vitamines et autres cofacteurs ; cependant l’utilisation de champs magnétiques de plus en plus
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puissants contribue à augmenter significativement cette sensibilité de détection ; – les difficultés d’identification de certains métabolites, en raison du chevauchement important des pics dans certaines régions du spectre — même si ce problème peut souvent être résolu par les analyses en 2D —, ou du nombre insuffisant de couplages correspondant à des interactions entre noyaux voisins au sein d’une même molécule ; – l’absence de base de données internationale pour l’identification automatisée des pics, imposant à chaque équipe de constituer sa propre base de données ; – les pics supplémentaires, en particulier au niveau des spectres urinaires, provenant des thérapies délivrées aux patients, mais aussi de certains facteurs alimentaires, et qui rendent plus difficiles l’identification des métabolites.
APPLICATIONS DE LA SRM IN VITRO DES FLUIDES Utilisée dans des conditions standardisées, la SRM in vitro des fluides permet le diagnostic d’un nombre important d’EIM dont des aciduries organiques, des anomalies du cycle de l’urée, des aminoacidopathies, des anomalies de la β-oxydation, des anomalies du métabolisme des purines et pyrimidines ou encore certaines pathologies lysosomales (Burns et al., 1992 ; Engelke et al., 2004 ; Iles et al,. 1985 ; Lehnert et Hunkler, 1986 ; Sewell et al., 2002 ; Wevers et al., 1999). L’étendue des métabolites détectés au sein d’une même analyse permet aussi l’étude simultanée de plusieurs voies métaboliques. Des anomalies du métabolisme des acides aminés ont ainsi été reliées au métabolisme énergétique (par le biais de la créatine) ou encore aux voies de la méthylation (par le biais de la bétaïne) (Burns et al., 1998 ; Iles et al., 1986). Dans le cadre des EIM affectant le système nerveux central, l’analyse du LCR est particulièrement indiquée. Malgré les artefacts générés par les thérapeutiques en cours et certains régimes alimentaires, les urines constituent également un fluide d’intérêt, le rein permettant de concentrer les métabolites accumulés de façon anormale dans l’organisme. En fonction des anomalies mises en évidence dans le LCR ou les urines, il peut s’avérer utile de compléter les analyses SRM à partir du sérum ou de plasma. D’autre part, les techniques de SRM in vivo couplées à la SRM in vitro des fluides ont récemment permis la mise en évidence de plusieurs maladies métaboliques, dont : – trois déficits du métabolisme de la créatine — deux déficits de synthèse et un déficit du transporteur de la créatine — impliqués dans des formes de retard mental, de syndrome autistique et/ou d’atteinte neurologique (épilepsie, dystonie) de sévérité variable (Schulze 2003), dont certains ont été observés à l’âge adulte (Caldeira Araujo et al., 2005 ; Kleefstra et al., 2005 ; Schulze et al., 2003) ; – deux déficits enzymatiques dans la voie des pentoses phosphate — déficits en transaldolase et ribulose 5-phosphate 5-isomérase — identifiés chez l’enfant dans des
tableaux d’atteinte hépatique sévère (Moolenaar et al., 2001) et/ou de leucodystrophie (Huck et al., 2004) ; – un nouveau déficit dans la voie des pyrimidines — déficit en uréidopropionase — chez des enfants présentant un tableau neurologique complexe associant une microcéphalie, une dystonie et un retard de myélinisation (Moolenaar et al., 2001) ; – un déficit enzymatique sur la voie permettant la conversion de la choline en glycine — déficit en diméthylglycine déshydrogénase — chez un adulte présentant un tableau atypique de fatigue musculaire (Moolenaar et al., 1999) ; – un déficit en aminoacylase I, dont le phénotype neurologique très hétérogène à ce jour ne permet cependant pas d’affirmer qu’il s’agit d’une nouvelle entité neurométabolique (Sass et al., 2006 ; Van Coster et al., 2005) ; – un tableau d’hypomyélinisation associée à une élévation significative d’acide N-acétylaspartylglutamique, dont l’anomalie primaire est en cours d’identification (Wolf et al. 2004). Au total, un grand nombre de maladies métaboliques peuvent être diagnostiquées à ce jour par 1H-SRM du LCR et/ou des urines (Fig. 1). Les profils métaboliques observés par SRM in vitro viennent d’être rapportés par Engelke et al. (2007) dans la 2e édition du Handbook of1H-NMR spectroscopy in inborn errors of metabolism: body fluid NMR spectrum and in vivo MR spectroscopy (Heilbronn: SPS Verlagsgesellschaft). La SRM in vitro constitue donc un outil puissant et reproductible pour le diagnostic de maladies métaboliques connues, mais aussi pour la mise en évidence d’anomalies métaboliques nouvelles pour lesquelles une thérapeutique ciblée est parfois disponible. C’est le cas des deux déficits de synthèse de la créatine accessibles à une thérapeutique simple et relativement efficace, certains symptômes tels que l’épilepsie ayant même été améliorés à l’âge adulte (Schulze et al., 2003). Enfin, les études citées ci-dessus sont applicables à l’étude de modèles animaux. La corrélation entre les anomalies métaboliques identifiées chez l’Homme et chez un modèle animal peut permettre de mieux appréhender la pertinence de ce dernier dans l’étude d’une maladie donnée (Renema et al. 2003). Ces dernières années, des développements importants ont été réalisés dans la recherche de biomarqueurs, c’est-à-dire tout paramètre — clinique, biochimique, radiologique — pouvant être associé à des processus biologiques complexes. Ainsi, dans le cadre des maladies génétiques où la cause du processus pathologique est identifiée, il est souvent difficile d’appréhender l’ensemble des perturbations biologiques qui en résultent. Cette complexité s’explique d’une part parce que l’anomalie génétique se situe en amont d’une cascade d’évènements cellulaires qui comprend de nombreux intermédiaires — transcriptionnels, protéiques, biochimiques — mais aussi parce que plusieurs voies de régulation cellulaire sont souvent perturbées simultanément. L’étude métabolique présente l’intérêt majeur de donner accès à la résultante finale de ces cascades d’évènements. Initialement dédiées aux études toxicologiques (Gartland et al., 1991), les analyses métabonomiques se
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a b c d e f
Fig. 1. – Exemples de profils métaboliques obtenus par spectroscopie par résonance magnétique nucléaire du proton (1H-SRM) à partir d’échantillons normaux (a, c, e) et d’échantillons de patients adultes présentant une maladie métabolique (b, d, f). (b) Spectre RMN à partir du LCR d’un patient présentant un déficit en dihydroptéridine réductase, montrant une élévation de phénylalanine (accolade). (d) Spectre RMN urinaire d’un patient présentant un déficit en méthylènetétrahydrofolate réductase, montrant une élévation de diméthylglycine (flèche). À noter l’excrétion urinaire importante de bétaïne (*), avec laquelle le patient est supplémenté. (f) Spectre urinaire d’un patient présentant un syndrome de Lesch-Nyhan, caractérisé par une élévation de xanthine (flèche) et d’hypoxanthine (accolade). Illustration of metabolic profiles obtained by proton nuclear magnetic resonance (1HNMR) spectroscopy, from normal samples (a, c, e) and samples from adult patients affected with metabolic diseases (b, d, f). (b) NMR spectrum from the CSF of a patient with dihydropyrimidine reductase deficiency, showing elevated phenylalanine (bracket). (d) NMR spectrum from the urine of a patient with methylenetetrahydrofolate reductase deficiency, showing an increase of dimethylglycine (arrow). Of note, the spectrum shows a high excretion of betaine (*), with which the patient is supplemented. (f) NMR spectrum from the urine of a patient with Lesch-Nyhan syndrome, characterized by elevated xanthine (arrow) and hypoxanthine (bracket).
sont alors progressivement étendues à l’étude de processus physiopathologiques en médecine humaine et animale (Nicholson et al., 2002). Ainsi, l’approche métabonomique est définie aujourd’hui comme « la mesure quantitative et multiparamétrique de la réponse métabolique dynamique d’un système vivant à une substance ou à une pathologie » (Nicholson et al., 1999). Indépendamment de l’analyse individuelle de chaque spectre visant à identifier les métabolites présents au niveau de l’échantillon biologique, les analyses statistiques multiparamétriques permettent de comparer le profil métabolique d’un groupe de spectres correspondant à une catégorie A, à celui d’un autre groupe
de spectres correspondant à une catégorie B. Le spectre RMN est converti en une suite de variables proportionnelles à l’intensité du signal, par division en petits intervalles réguliers. L’analyse en composante principale — ou ACP — donne alors une représentation graphique de la dispersion de ces variables dans un espace dont le nombre de composantes est égal au nombre de variables choisies. Il est possible : (i) de déterminer si la dispersion des variables dans cet espace multiparamétrique permet de séparer les groupes à comparer ; (ii) et de repérer les variables, donc les métabolites du spectre RMN, responsables de la séparation entre ces groupes. D’autre part, l’analyse par régres-
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sion linéaire partielle — ou PLS (partial least square) — permet de rechercher une corrélation entre l’ensemble des variables du spectre RMN et une variable explicative — par exemple le score clinique pour la pathologie étudiée. Comme pour les analyses individuelles des spectres RMN, les études métabonomiques nécessitent de standardiser le recueil des échantillons de façon à diminuer les biais provenant de facteurs environnementaux et perturbant l’analyse statistique. Holmes et al. (2006) ont récemment souligné la contribution de la SRM in vitro des fluides dans plusieurs maladies neurodégénératives, et en particulier dans la maladie de Huntington (MH) où un profil procatabolique semble pouvoir être mis en évidence dès les formes précoces de la maladie (Tsang et al., 2006 ; Underwood et al., 2006) « Nous avons récemment conduit une étude clinique visant à explorer la perte de poids chez des patients à un stade très précoce de la MH et des individus présymptomatiques, comparativement à un groupe contrôle (Mochel et al., 2007). L’analyse par PLS à partir du plasma a permis de distinguer les patients atteints de MH à différents stades de la maladie, ainsi que les individus présymptomatiques du groupe contrôle. Les anomalies métaboliques responsables de cette séparation semblent confirmer l’existence d’un profil hypercatabolique à un stade précoce de la MH. L’analyse d’un nombre plus important de patients, notamment à des stades plus avancés de la maladie, est en cours afin de valider l’utilisation potentielle de ce biomarqueur, notamment dans le cadre d’essais thérapeutiques. » De même, la SRM in vitro a récemment permis l’identification de β-hydroxyisobutyrate dans le LCR de patients atteints de sclérose en plaques (SEP) (Lutz et al., 2007). Ce métabolite, susceptible de servir de biomarqueur dans une maladie neurodégénérative très hétérogène, apporte également des données physiopathologiques importantes sur les voies biochimiques possiblement impliquées dans la sclérose en plaques. En dehors de ces avancées physiopathologiques, l’identification d’un biomarqueur par SRM in vitro peut : (i) apporter des éléments pronostiques importants, pouvant améliorer la prise en charge thérapeutique des patients (Hauet et al., 2000), (ii) et/ou contribuer à l’évaluation de l’efficacité thérapeutique d’une molécule, en particulier si l’on ne dispose pas de scores cliniques suffisamment sensibles pour apprécier dans un délai raisonnable le bénéfice thérapeutique pour les patients (Wild et Tabrizi, 2006). Enfin, la possibilité de combiner des analyses génétiques avec une analyse métabolique sans a priori par SRM in vitro, pourrait représenter une nouvelle approche physiopathologique chez des patients présentant une maladie neurologique familiale inexpliquée. Dans les pathologies pour lesquelles la ségrégation familiale autorise des études de liaison génétique, la recherche d’anomalies métaboliques par SRM in vitro est en effet susceptible de réduire le nombre de gènes candidats au sein des intervalles de liaison.
CONCLUSION Les indications de la SRM in vitro dans les maladies neurodégénératives peuvent donc se résumer à : – la caractérisation d’une anomalie métabolique, après la mise en évidence d’un profil anormal par SRM cérébrale in vivo ; – la recherche d’anomalies métaboliques — augmentation/diminution de métabolites connus ou détection de métabolites nouveaux — chez des patients présentant une affection neurologique complexe inexpliquée malgré des investigations extensives, ce d’autant que le phénotype singulier de ces patients et/ou son caractère isolé au sein de la famille ne permettent pas de les inclure dans une étude d’association et/ou de liaison génétique ; – la recherche de biomarqueurs dans des pathologies neurodégénératives connues, mais dont la compréhension physiopathologique reste limitée. Remerciements. Les auteurs remercient chaleureusement le Pr Ron Wevers et Udo Engelke pour leur collaboration précieuse aux études par SRM in vitro récemment réalisées au sein du Département de génétique et de la Fédération des maladies du système nerveux de l’hôpital de La Pitié-Salpêtrière. Le travail du Dr Mochel a été financé par la Fondation pour la Recherche Médicale (Paris).
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