Aspects ultrastructuraux et signification biochimique des granulations métachromatiques et autres inclusions dans les fibroblastes en culture provenant de lipidoses et de mucopolysaccharidoses

Journal of the neurological Sciences, 1973, 19:235-253 © Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam - Printed in The Netherlands

235

Aspects Ultrastructuraux et Signification Biochimique des Granulations M6tachromatiques et Autres Inclusions dans les Fibroblastes en Culture Provenant de Lipidoses et de Mucopolysaccharidoses G. LYON, M. C. HORS-CAYLA, V. JONSSON ET P. MAROTEAUX Laboratoire de Neuropathologie, HOpitaldes Enfants-Malades, UnitOde Recherches de G~nOtiqueMddicale, INSERM--U 12--Laboratoire de Mddecine ExpOrimentale, CollOgede France, Paris (France) (Requ le 20 d6cembre 1972)

INTRODUCTION

Une 6tude ultrastructurale et biochimique a 6t6 faite sur des fibroblastes cultiv6s ~t partir de biopsies de peau pr61ev6es chez des enfants souffrant de leucodystrophie m&achromatique, de la variante d'Austin de cette maladie, de maladie de Hurler (mucopolysaccharidose type 1), de maladie de Hunter (mucopolysaccharidose type 2), de mucolipidoses, de leucodystrophie de Krabbe, de maladie de Wolman, et de maladie de Batten. Le but de cette 6tude a 6t6: (1) de voir s'il existait dans les fibroblastes en culture des aspects ultrastructuraux sp6cifiques de ces diverses maladies. (2) de d6terminer raspect ultrastructural des granulations m6tachromatiques et de discuter leur signification biochimique. Nous avons 6galement examin6 des cellules hybrides provenant de la fusion d'une lign6e h6t6roploide humaine D98 AH2 avec des fibroblastes issus de sujets normaux, de malades atteints de leucodystrophie m6tachromatique et de mucopolysaccharidose type 1, afin de voir si les "h6t6rozygotes" artificiels ainsi r6alis6s, poss6daient un ph6notype diff6rent de celui d'h6t6rozygotes naturels diploides. MAT~/RIEL ET MI~THODES

Des biopsies cutan~es ont 6t6 pr61ev6es dans 3 cas de leucodystrophie m6tachromatique (1 forme infantile pr6coce et 2 formes infantiles tardives), 1 cas de la variante d'Austin de leucodystrophie m6tachromatique (sulfatidose+mucopolysaccharidose), 2 cas de maladie de Hurler, 3 cas de maladie de Hunter, 2 cas de mucolipidose (dont 1 cas de mucolipidose type II et 1 cas de mucolipidose non class6e), 1 cas de leuco-

236

•.

LYON, M. C. HORS-CAYLA, V. JONSSON, P. MAROTEAUX

dystrophie de Krabbe, 1 cas de maladie de Batten, 1 cas de maladie de Wolman; la m6re d'un enfant atteint de leucodystrophie m6tachromatique et 3 t6moins normaux ont 6galement 6t6 6tudi~s.

Technique de culture La culture des fibroblastes a 6t6 faite ~ partir de biopsies de peau de la face ant6rieure du bras. Le milieu de culture 6tait le milieu d'Eagle (M.E.M.) additionn6 de 10~o de s6rum de veau et d'antibiotiques, renouvel6 une fois par semaine. Le repiquage s'est fait par trypsination. Fusion cellulaire La fusion cellulaire a 6t6 r6alis6e par l'ensemencement simultan6 en milieu normal de 25,000 cellules diploides et de 106 cellules de la lign6e D 98 AH2, lign6e h6t6roploide d6riv6e de la souche HeLa et provenant de l'American type culture collection. 48 hr apr+s l'ensemencement, le milieu normal a 6t6 remplac6 par du milieu HAT (contenant de l'hypoxanthine, de l'aminopt6rine et de la thymidine), pour 61iminer la souche D98 AH2. Les cellules hybrides ont 6t6 isol~es grace it leur avantage s61ectif sur les cellules parentales diplo~des. M~thodes histologiques Les fibroblastes ont 6t6 repiqu6s en tube de Leighton sur lamelles et color6s plusieurs reprises, au 46me ou 56me passage et aux m~mes dur6es de la phase stationnaire soit au 66me, 106me et 14+me jour de culture sur lamelles. Apr6s rin~age au tampon phosphate, les cellules ont 6t6 directement fix6es sur la lamelle par l'alcool m6thylique ou par le formol ~ 10~ et color6es par le bleu de toluidine, le bleu alcian, le PAS, le Scharlach et le noir Soudan et par la m6thode de Gomori pour les phosphatases acides. Des coupes semi-fines de cultures incluses dans l'Epone pour la microscopie 61ectronique ont 6t6 color6es par le bleu de toluidine et examin6es au microscope ordinaire. MOthode pour Fexamen au microscope Olectronique Apr6s trypsination, les cultures ont 6t6 fix6es directement dans les flacons avec de la glutaraldehyde ~ 2~o (tampon de S6rensen, pH 7.4) pendant 1 hr. Apr6s avoir 6t6 recueillies, elles ont 6t6 centrifug6es ~ 1000 tours, pendant 5 min. Le culot de centrifugation a 6t6 dans ha plupart des cas post-fix6/l l'acide osmique ~ 1 ~ (tampon de Millonig, pH 7.4) pendant 1 hr, puis inclus dans l'epone. Les coupes faites ~ l'ultramicrotome Reichert ont 6t6 color6es au citrate de plomb et it l'ac~tate d'uranyl selon Reynolds. Pour la mise en 6vidence des phosphatases acides, la modification de la m6thode de Gomori de Barka et Anderson (1962) a 6t6 utilis6e. MOthodes biochimiques Le taux d'arylsulfatase A (ASA) a 6t6 dos6 dans des cultures de leucodystrophie m6tachromatique, de mucopolysaccharidoses type 1 et 2, les hybrides, la souche D98 et un t6moin, par la mesure spectrophotom6trique de la quantit6 de nitrocat6chol

ETUDE DES FIBROBLASTES

237

lib6r6 par action d'un homog6nat cellulaire ~t pH 4.9 A 37°C sur le sulfate de nitrocat6chol (Kaback et Howell 1970). Les mucopolysaccharides (MPS) ont 6t6 6tudibs sur 6.107 h 10. l0 T fibroblastes. Apr6s r6colte par trypsination les cellules ont 6t6 trait6es par la pronase. Les mucopolysaccharides extraits par pr6cipitation au bromure de c6tyl pyrimidiuln ont 6t6 s6par6s sur une colonne de Dowex et 61u6s par un gradient discontinu de C1Na. Les diff6rentes fractions ont 6t6 recueillies et les acides uroniques dos6s par le carbazol. La somme des diff6rentes fractions donne les glucosaminoglycans (GAG) totaux que l'on rapporte au nombre des cellules compt6es h la cellule de Malassez. L'analyse des lipides dans les fibroblastes de leucodystrophie m6tachromatique, d'hybride de leucodystrophie m6tachromatique, de la souche D98 et de t6moins normaux a 6t6 faite de la fagon suivante* : les lipides ont 6t6 extraits du culot de cellules avec environ 20 volumes du m61ange chloroforme-m6thanol (2:1, v/v), puis lav6s selon la m6thode de Folch, Lees et Sloane-Stanley (1957). Apr6s 6vaporation des lipides sous azote, 2 mg ont 6t6 saponifi6s par la m6thode de Schneider et Kennedy (1968). Les lipides de la fraction alcali-stable ont ensuite 6t6 identifi6s en les comparant h des standards de c6r6brosides et de sulfatides apr¢s s6paration par chromatographie ascendante en couches minces sur gel de silice G dans le syst6me de solvant chloroforme-amoniaque 2N (60 "35:8, v/v) et r6v61ation par le r6actif ~ l'anthrone (Philippart, Sarlieve, Meurant et Mechler 1971).

RESULTAT

A. Comparaison de raspect ultrastructural des fibroblastes dans les maladies ~tudi~es (1) Dans les cas de mucopolysaccharidoses type I et 2, les mucolipidoses, la maladie de Batten, la variante d'Austin de la leucodystrophie m6tachromatique, et l'h6t6rozygote de la leucodystrophie m6tachromatique, l'aspect ultrastructural est tr~s voisin et indiscernable de celui de t6moins normaux. Le cytoplasme des fibroblastes contient de nombreux inclusions d'aspects tr6s variables (Figs. 1-6): --Les uns sont totalement vides ou ne contiennent qu'une faible quantit6 d'un mat6riel floconeux dispers6 ou d'une substance granuleuse osmiophile appliqu6e la face interne de la membrane qui les limite. Ce sont les plus nombreuses. Quelques inclusions sont remplies par une substance homog6ne se pr6sentant soit comme un amas granulo-filamenteux laches, soit comme un amas ~ grains serr6s plus ou moins fortement osmiophiles, soit comme une nappe non granuleuse, peu dense aux 61ectrons ("vacuoles lipidiques"). D'autres inclusions, 6galement nombreuses, sont pl6iomorphes, et contiennent en proportion variable des amas granuleux, des structures lamellaires tr6s osmiophiles, des grains de glycog6ne et des cristaux. - - Dans les cultures plus ~g6es, on note de nombreuses vacuoles autophagiques et des mitochondries tr6s alt6r6es, contenant des amas osmiophiles et des membranes -

-

-

-

* Cette analysea 6t6 faitepar Louis Sarlieve,Centre de Neurochimie(ProfesseurMandel),Strasbourg.

238

G. LYON, M. C. HORS-CAYLA, V. JONSSON, P. MAROTEAUX

Fig. 1. Fibroblastes provenant d'une MPS I, × 17,000. Inclusions vides ou contenant une petite quantit6 de mat6riel floconneux ou granuleux et inclusions denses homog+nes ou pl6iomorphes. Aspect tr~s voisin de la Fig. I h la Fig. 6.

Fig. 2. Fibroblastes provenant d'une MPS II, x 12,500 (Voir 16gende Fig. 1.) enroul6es. Seule la persistance, s o u v e n t s e g m e n t a i r e d ' u n e d o u b l e m e m b r a n e l i m i t a n t e et de f r a g m e n t s de cr&es p e r m e t de r e c o n n a i t r e leur origine. Les v a c u o l e s ~ faible c o n t e n u g r a n u l o - f i l a m e n t e u x o u f l o c o n n e u x o n t 6t6 consi-

ETUDE DES FIBROBLASTES

239

Fig. 3. Fibroblastes provenant d'une maladie de Batten, x 16,500. (Voir 16gende Fig. 1.)

Fig. 4. Fibroblastes provenant d'une maladie d'Austin, x 15,000.(Voir 16gende Fig. 1.)

d6r6es p a r B a r t m a n n et Blanc (1970) c o m m e caract6ristiques des fibroblastes de maladie de Hurler et de Hunter. Cependant, nous n'avons pas trouv6 ce type de vacuole plus fr&tuemment dans les fibroblastes de mucopolysaccharidoses que dans

240

G. LYON, M. C. HORS-CAYI_,A, V. JONSSON, P. MAROTEAUX

Fig. 5. Fibroblastes provenant d'une mucolipidose, × 7500. (Voir 16gende Fig. 1.)

Fig. 6. Fibroblastes provenant d'un t6moin normal, x 16,000. (Voir 16gende Fig. 1.)

ceux provenant des autres maladies ci-dessus 6num6r6es ou de t6moins n o r m a u x . Le cas de mucolipidose non class6e est un peu particulier par la tr6s grande a b o n dance de vacuoles claires, le plus souvent totalement transparentes (Fig. 5).

ETUDE DES FIBROBLASTES

241

Fig. 7. Leucodystrophie m&achromatique. Inclusions denses caract6ristiques, x 13,500.

Fig. 8. Leucodystrophie m6tachromatique. D6tail des inclusions denses, x 40,500.

(2) D a n s les 3 cas de leucodystrophie m6tachromatique, la plupart des fibroblastes contiennent des inclusions nombreuses et volumineuses, diss6min6es dans le cytoplasme sauf dans la r6gion de l'appareil de Golgi. Elles sont limit6es par une m e m b r a n e

242

G. LYON, M. C. HORS-CAYLA, V. JONSSON, P. MAROTEAUX

Fig. 9. Maladie de Wolman. Inclusions multiv6siculaires, x 50,600.

et remplies par une substance finement granuleuse, homog+ne, assez dense aux 61ectrons. Certaines contiennent en outre sur un segment de leur surface des structures lamellaires rectilignes ou enroul6es de faqon variable (Figs. 7 et 8). Cet aspect coexiste avec les autres types d'inclusions, mais est tr+s nettement pr6dominant. I1 n'est pas retrouv6 dans l'h6t6rozygote de leucodystrophie m6tachromatique ni dans la variante

ETUDE DES FIBROBLASTES

243

Fig. 10. Leucodystrophie de Krabbe. Large inclusion form~e par des enroulements et agencements r6guliers de membranes, des areas denses et des grains de glycog6ne, x 23,400.

d'Austin. I1 n'a 6t6 vo qu'occasionnellement dans les mucopolysaccharidoses et dans la maladie de Batten. Dans les fibroblastes de la maladie de Wolman (Fig. 9) se voient de nombreuses inclusions, limit6es par une membrane, contenant de multiples petites v6sicules

244

G. LYON, M. C. HORS-CAYLA, V. JONSSON, P. MAROTEAUX

claires, serr6es, ~t contenu vide ou finement granuleux. Parfois l'une d'eltes est plus volumineuse et plus opaque. Ces inclusions multiv6siculaires contiennent des phosphatases acides en grande abondance. Sur les pr6parations fix6es au formol et examin6es au microscope standard, elles sont fortement soudanophiles. Dans le cas de maladie de Krabbe, il existe des amas volumineux, partiellement limit6s par une membrane, constitu6s essentiellement par des enroulements laches ou des agencements r6guliers de membranes, moyennement osmiophiles, enserrant des grains de glycog6ne et des masses denses tr6s osmiophiles dans lesquelles se diff6rencient par endroit de minces espaces clairs, rectilignes, d'allure cristalline (Fig. 10). La souche D98 est particuli6rement pauvre en inclusions intracytoplasmiques. Les hybrides D98 × mucopolysaccharidose type 2 et D98 × t~moin normal ne pr6sentent pas d'aspect particulier. Les inclusions y sont peu nombreuses. Dans l'hybride D98 × leucodystrophie mStachromatique, les inclusions denses homog6nes caract~ristiques des fibroblastes de leucodystrophie m6tachromatique ont 6t6 retrouv6es. B. La mktachromasie

Sur des pr6parations fix6es fi l'alcool m6thylique et color6es par le bleu de toluidine, d'abondantes granulations m6tachromatiques ont 6t6 roises en 6vidence dans les fibroblastes provenant des cas de mucopolysaccharidoses type 1 et type 2, de la variante d'Austin de leucodystrophie m6tachromatique, et de la maladie de Batten (Fig. 11). Elles 6taient absentes ou tr6s peu nombreuses dans les deux cas de mucolipidoses, la leucodystrophie de Krabbe, la maladie de Wolman, l'h6t6rozygote de la leucodystro-

Fig. 11. Fibroblastes de maladie de Hunter avec granulations m6tachromatiques. Fixation ~ l'alcool m6thylique. Coloration au bleu de toluidine, × 600.

ETUDE DES FIBROBLASTES

245

phie m6tachromatique et les t6moins normaux, et totalement absentes dans toutes les vari6t6s d'hybrides et la souche D98. I1 nous est apparu que l'intensit6 de la m6tachromasie variait en fonction de nombreux facteurs inh6rents aux conditions de la culture cellulaire. Nous avons notamment observ6 les faits suivants : (1) Le nombre de fibroblastes contenant des granulations m6tachromatiques est en fonction de l'gtge des souches (c'est-/l-dire du temps 6cou16 depuis leur mise en culture) et de la dur6e de la phase stationnaire au moment de l'examen. (2) La situation topographique des fibroblastes sur la lamelle entre en jeu: les cellules situ6es au bord de la face sup6rieure et ~ la face inf~rieure de la lamelle sont les plus fortement m6tachromatiques. (3) La nature du milieu de culture joue un r61e. Avec un milieu contenant du s6rum humain AB, le ph6nom6ne n'apparait pas (Hors-Cayla, Maroteaux et De Grouchy 1968). Nous avons tenu compte de ces facteurs de variation dans notre 6rude et nous nous sommes efforc6s d'appr6cier la m6tachromasie dans des conditions de culture identiques: chaque souche a 6t6 examinee au m~me ~ge, au quatri~me ou cinqui~me passage et aux m~mes dur6es de phase stationnaire. Nous avons tent6 de quantifier la m6tachromasie darts les diverses souches en les classant en trois cat6gories : cat6gorie 1 : souches non m6tachromatiques ou tr6s faiblement m6tachromatiques ayant moins de 5 ~ de cellules m6tachromatiques. ---cat6gorie 2: souches/~ m6tachromasie faible ou moyenne ayant de 5/~ 4 0 ~ des cellules m6tachromatiques. - - c a t 6 g o r i e 3: souches/t m6tachromasie forte avec plus de 4 0 ~ de cellules m6tachromatiques. Pour chaque souche, deux lamelles au 6~me, 106me et 146me jour de culture environ ont 6t6 6tudi6es; chaque lamelle 6tant not6e 1, 2 ou 3, selon que Ia metachromasie est trbs faible, moyenne ou forte et la moyenne de ces notes a 6t6 retenue. Nos r6sultats sont r6sum6s dans le Tableau 1. On peut constater sur ce tableau que plusieurs souches sont nettement plus m6tachromatiques que les autres et du mSme ordre d'intensit6: ce sont celles provenant -

-

TABLEAU 1 INTENSITI~DE LA MI~TACHROMASIE(¢f. texte) Maladie T6moin Mucolipidose de type II Mucolipidose ind6termin6e Hunter Hurler Leucodystrophie m6taehromatique Sulfatidose + Mucopolysaccharidose Maladie de Batten

Metachromasie 1.5 1.5 1.5 2.6 2.3 2.4 2,6 2,4

246

G. LYON, M. C. HORS-CAYLA, V. JONSSON, P. MAROTEAUX

des maladies de Hurler et de Hunter, de la maladie de Batten, de la leucodystrophie m6tachromatique et de la variante d'Austin de leucodystrophie m6tachromatique. Par contre, les t6moins, les mucolipidoses, la maladie de Wolman et la maladie de Krabbe ont peu de cellules m6tachromatiques. Les souches h6t6roploides D98 et les hybrides se situent ~ part, car dans aucune Centre elles on n'a jamais vu aucun mat6riel m6tachromatique. Les m6thodes de fixation et de coloration pour la mise en 6vidence des granulations m6tachromatiques, les caract6res morphologiques de ces granulations, leur affinit6 pour d'autres colorants que le bleu de toluidine, et la teneur en glucosaminoglycan (GAG) des fibroblastes les contenant, se sont r6v616s semblables dans les diff&entes maladies &udi&s.

Affinit~s tinctoriales--fixation La m6tachromasie n'apparait que sur des pr6parations fix6es ~ l'alcool m6thylique et jamais apr~s fLxation par une solution aqueuse de formol ~ 10~o. Elle peut aussi 6tre d6cel6e sur des coupes semi-fines d'un culot de fibroblastes f'Lx6par la glutaraldehyde 2 ~ et inclus dans l'epone. Par contre, elle est masqu6e par la fixation ~ l'acide osmique. Les inclusions se colorant en rouge par le bleu de toluidine se colorent 6galement en bleu par le bleu alcian et ~ un moindre degr6 en rouge fonc6 par le PAS apr6s fixation alcoolique. La coloration par le bleu alcian disparait apr6s fixation par le formol. Apr6s fixation au formol et coloration au Scharlach, les fibroblastes m6tachromatiques pr6sentent quelques grains soudanophiles. I1 est probable, mais tr6s difficile prouver, que certains de ces d6p6ts soudanophiles si6gent dans des inclusions m&achromatiques. Leur abondance est ~ peu pr6s identique ~ celle observ6e dans une souche t6moin du m~me fige. Les inclusions m6tachromatiques ne nous ont pas paru plus riches en phosphatases acides que les inclusions intracytoplasmiques dans les fibroblastes t6moins faiblement ou non-m&achromatiques.

M orphologie Les inclusions m6tachromatiques sont arrondies ou 16g6rement polygonales et leur taille varie assez largement dans une m~me cellule et d'une ceUule/t l'autre pour une m6me souche. I1 existe aussi, surtout dans les cellules abondamment m6tachromatiques des inclusions plus larges et irr6guli6res, en "flaque'. Elles sont r6parties de faqon diffuse dans le cytoplasme 6pargnant parfois une zone para-nucl6aire en croissant ou en triangle. Pour d6terminer leur aspect ultrastructural, nous avons dans 2 cas de maladie de Hunter, compar6 des coupes semi-fines color6es au bleu de toluidine, et des coupes ultra-fines, pr61ev~es successivement sur le m~me bloc. Ainsi, une m~me cellule pouvait &re examinge en microscopie ordinaire et en microscopie 61ectronique. I1 nous est apparu que la substance mgtachromatique si6geait dans des inclusions de morphologie ultrastructurale tr+s variable. Toutes les vari6t6s d'inclusions d6crites ci-dessus dans les mucopolysaccharidoses, la leucodystrophie m6tachromatique, la

247

ETUDE DES FIBROBLASTES

variante de leucodystrophie m6tachromatique, et la maladie de Batten, peuvent ~tre m6tachromatiques, ainsi que certaines mitochondries alt6r~es.

Etude biochimique Les r6sultats des dosages de mucopolysaccharides sont indiqu6s dans le Tableau 2. I1 y a parall61isme entre l'intensit6 de la m6tachromasie et le taux des mucopolysaccharides intra-cellulaires. Les chiffres obtenus sont du m~me ordre dans la mucopolysaccharidose type I, la mucopolysaccharidose type II, la leucodystrophie m6tachromatique et la maladie de Batten*. TABLEAU 2 TAUX DES MUCOPOLYSACCHARIDESDANS LES FIBROBLASTES(cf. texte)

Taux de M P S ~/I07 fibroblastes

Maladie "1cmoin Mucolipidose de type II Mucolipidose ind6termin6e Hunter Hurler Leucodystrophie m6tachromatique Maladie de Batten

8 21 14 36 37 37 35

L'activit6 de l'arylsulfatase dans les fibroblastes est indiqu6e dans le Tableau 3. On note ttue l'activit6 de l'arylsulfatase A est faible non seulement dans les fibroblastes de la leucodystrophie m6tachromatique, mais aussi dans la souche h6t6roploide D98 et dans les hybrides r6alis~s avec cette souche et d'une part les fibroblastes de leucodystrophie m6tachromatique, d'autre part les fibroblastes diploides normaux. L'analyse qualitative des lipides des fibroblastes provenant de sujets sains, de malades atteints de leucodystrophie m6tachromatique, de la souche h6t6roploide D98 et des hybrides D98 x leucodystrophie m6tachromatique, n'a pas permis de mettre en 6vidence de sulfatides. TABLEAU 3 ACTIVITI~DE L'ARYLSULFATASEA DANg LES FIBROBLASTESEN CULTURE

Souche T6moins Leucodystrophie m6tachromatique D98 D98 x leucodystrophie m6tachromatique D98 × normal

Moyenne ~

l~.cart type

408 25 33 33

114 8 40 35

50

27

a Nanomoles de nitrocat6chol mg/hr de prot6ines solubles. * Ces derniers r6sultats sont fournis en d6tail dans l'article de Hors-Cayla et Maroteaux (1973).

248

G. LYON, M. C. HORS-CAYLA, V. JONSSON, P. MAROTEAUX COMMENTAIRES

A. Recherche d'aspects ultrastructuraux sp~cifulues dans les fibroblastes Des aspects ultrastructuraux tr6s particuliers, sinon sp6cifiques, n'ont 6t6 observ6s que dans la leucodystrophie m6tachromatique et la maladie de Wolman. - D a n s les 3 cas de leucodystrophie mOtachromatique, ~ plusieurs examens, ~ des dates variables de culture, et dans 1 cas avant et apr+s cong61ation, nous avons 6t6 frapp6s par la pr6sence de vacuoles volumineuses limit6es par une membrane, contenant une substance finement granuleuse, homog6ne, moyennement fonc6e. Ces inclusions existent dans la majorit6 des fibroblastes et sont tr6s abondantes : de 10/t 30 par cellule. Elles n'ont pas l'aspect ultrastructural des inclusions lysosomales charg6es en sulfatide observ6es dans les cellules gliales, les cellules de Schwann et les macrophages dans le syst6me nerveux central et p6riph6rique de cette maladie. Nos constatations sont ici en contradiction avec celles de Hug, Schuler et Soukup (1970). Par ailleurs, l'analyse biochimique des fibroblastes les contenant, cultiv6s dans les conditions habituelles, n'a pas permis de d6celer de sulfatides en quantit6 appr6eiable. Sur ee point, nos r6sultats eoncordent avec eeux de Porter, Fluharty et Kihara (1971). On peut en conclure que la pr6senee de ces inclusions n'est pas li6e ~ l'accumulation de sulfatides. D'autre part, le d6ficit en arylsulfatase A n'est pas une condition suffisante ~ leur formation puisqu'elles n'ont pas 6t6 vues dans la souche D98 et dans les hybrides r6sultant de la fusion de cette souche avec une souche diploide normale. La nature de ces inclusions reste done inconnue. Bien qu'elles n'aient pas, ~t notre connaissanee, 6t6 not6es jusqu'ici dans la litt6rature, et que nous ne les ayons observ6es que dans un trop petit nombre de cas pour pouvoir leur attribuer s~rement une valeur sp6cifique, il s'agit lh d'une eonstatation morphologique int6ressante dont la fr6quence m6riterait d'&re v6rifi6e. - D a n s le cas de maladie de Wolman, la majorit6 des inclusions se pr6sente sous forme de vacuoles multiv6siculaires qui n'ont 6t6 trouv6es dans aucune des autres souches examin6es. Elles different des inclusions observ6es au microscope 61ectronique par Lough, Fawcett et Wiegenberg (1970) dans le foie d'un autre cas de cette maladie. - D a n s toutes les autres affections - - mucopolysaccharidoses, mucolipidoses, maladie de Batten, leucodystrophie de Krabbe, et variante d'Austin de la leucodystrophie m6tachromatique - - les fibroblastes en culture ont un aspect ultrastructural tr6s voisin et rien ne permet de les diff6rencier des fibroblastes provenant de t6moins normaux. Tout au plus, peut-on noter la tr6s grande abondance de vacuoles vides dans le cas de mucolipidose de type ind6termin6, et les agencements de membranes dans la maladie de Krabbe. On ne saurait attribuer ~ ces dernibres formations un caract6re sp6cifique, ni leur trouver une ressemblance avec les inclusions vues dans le syst6me nerveux (Bischoff et Ulrich 1969, Lyon, Jardin et Aicardi 1971) Cependant, nous ne les avons observ6es dans aucune autre souche. Les inclusions d6crites par Hanai, Leroy et O'Brien (1971) dans la mucolipidose type 2 nous paraissent aussi aspecifiques que celles que nous avons constat6es. Dans aucune des maladies 6tudi6es, les inclusions dans les fibroblastes en culture

ETUDE DES FIBROBLASTES

249

ne ressemblent g celles observ6es dans le syst6me nerveux ou dans d'autres organes atteints. Certes dans la maladie de Hurler et la maladie de Hunter, il existe une proportion variable d'inclusions ~ contenu floconneux analogues aux vacuoles trouv6es dans d'autres organes de cette maladie et notamment dans le foie (Van Hoof et Hers 1967; Loeb, Jonniaux, Resibois, Cremer, Dodion, Tondeur, Gregoire, Richard et Cieters 1968). Mais, d'apr6s notre exp6rience, ce type d'inclusion n'est pas plus abondant dans ces mucopolysaccharidoses que dans la maladie de Batten ou les t6moins normaux. On peut en conclure que dans les conditions habituelles de culture, les fibroblastes ne participent pas au processus de surcharge lysosomal propre ~t chacune de ces maladies. Par contre, l'adjonction dans le milieu de culture d'une quantit6 suffisante du substrat organique sur lequel agit ~ l'6tat normal l'enzyme d6ficiente, doit pouvoir aboutir h une r6tention de ce substrat dans le cytoplasme des fibroblastes. Ainsi, Porter et al. (1970) ont obtenu une accumulation de sulfatides dans des fibroblastes de leucodystrophie m6tachromatique cultiv~s dans un milieu riche en sulfatides. Nous nous proposons dans un prochain travail d'6tudier l'aspect ultrastructural de ce ph6nom6ne de surcharge artificielle. La maladie de Wolman constitue peut-~tre une exception. Dans notre observation, la grande abondance des vacuoles multiv6siculaires, leur richesse en phosphatases acides et leur contenu hautement soudanophile, nous conduit fi penser que les fibroblastes participent vraisemblablement ici au processus de surcharge lipidique sp6cifique de cette affection. B. La m~tachromasie

Dans toutes les affections off nous les avons trouv6es - - maladie de Hurler, maladie de Hunter, leucodystrophie m6tachromatique, variante d'Austin de leucodystrophie m6tachromatique, maladie de Batten - - les inclusions m6tachromatiques dans les fibroblastes en culture ont des caract6res morphologiques et biochimiques identiques. Le pourcentage des cellules m6tachromatiques, ainsi que l'abondance et la r6partition intra-cellulaire des granulations sont les m~mes, leur solubilit6 dans les fixateurs aqueux et leur affinit6 pour le bleu alcian et le PAS identiques. Dans une de ses 6tudes, Porter et al. (1971) signalent que les fibroblastes de la leucodystrophie m6tachromatique cultiv~s dans des conditions standards ne sont pas m6tachromatiques. Ceci tient sfirement ~ l'utilisation dans leur exp6rience d'une fixation par le formol qui dissout les mucopolysaccharides m6tachromatiques. La comparaison des donn6es de la microscopie optique et de la microscopie 61ectronique a montr6 que la substance m6tachromatique est contenue dans des lysosomes ayant les aspects ultrastructuraux les plus vari6s et souvent analogues ceux observ6s dans des fibroblastes non m6tachromatiques normaux. Les vacuoles vides ou ~ contenu floconneux habituellement consid6r6es comme caract6ristiques des lysosomes surcharg6s en mucopolysaccharides ne repr6sentaient qu'une fraction des inclusions m&achromatiques. Elles ne sont pas plus abondantes dans les mucopolysaccharidoses type 1 et type 2 que dans la plupart des autres souches examin6es. II nous a sembl6, comme ~ Duckett, Christian et Thompson (1969) que des mitochondries alt6r6es peuvent 6galement &re m6tachromatiques. Ainsi "les granulations

250

G. LYON, M. C. HORS-CAYLA, V. JONSSON, P. MAROTEAUX

m6tachromatiques" n'ont-elles pas une morphologie ultrastructurale univoque. La substance m6tachromatique accumul6e paraR bien ~tre de nature mucopolysaccharidique. Elle en ales caract6res de solubilit6 et les affinit6s tinctoriales. Des taux 61ev6s de mucopolysaccharides ont 6t6 mis en 6vidence dans les fibroblastes des deux types de mucopolysaccharidoses, de la leucodystrophie m6tachromatique et de la maladie de Batten. Dans les souches provenant de ces maladies, le taux de mucopolysaccharide 6tait de m6me ordre (Tableau 1) et nous n'avons pas trouv6 de diff6rence appr6ciable dans la r6partition relative des diff6rentes fractions (Hors-Cayla et Maroteaux 1973). L'accumulation de mucopolysaccharides m6tachromatiques dans les fibroblastes en culture peut ~tre, soit en relation directe avec le d6ficit enzymatique primaire responsable de la maladie, soit une cons6quence indirecte, non sp6cifique de cette d6ficience. Le premier m6canisme est de toute 6vidence envisageable dans les mucopolysaccharidoses. I1 l'est aussi dans la forme typique de leucodystrophie m&achromatique o/a des mucopolysaccharides ont 6t6 d6cel~es par des m6thodes histochimiques dans les cellules gliales (R6sibois-Gr6goire 1967). Ceci se convait puisque l'arylsulfatase A est capable d'agir sur deux substrats naturels: les c6r6brosides sulfates et la chondroitine-4-sulfate (Tappel 1969). Cependant, l'ensemble de nos constatations morphologiques et biochimiques plaide tr6s nettement en faveur d'un m6canisme indirect et notamment le fait que, dans notre mat6riel, l'aspect ultrastructural 6tait tr~s voisin et le contenu en mucopolysaccharides identique dans les fibroblastes provenant des mucopolysaccharidoses et de la maladie de Batten. Dans cette derni6re maladie, en effet, une surcharge de l'organisme en mucopolysaccharides n'a jamais 6t~ mise en 6vidence. D6s lors, on peut penser que dans les maladies de Hurler et de Hunter, l'accumulation de mucopolysaccharides dans les organes et l'accumulation de mucopolysaccharides dans les fibroblastes en culture rel6vent de m6canismes diff6rents. Par ailleurs, il existe d'autres affections pr6sentant le ph6nom6ne de la m6tachromasie des fibroblastes comme la maladie de Pompe (Tarconi, Baccichetti, Zachello et Sartori 1970) et la maladie de Gaucher (Danes et Beam 1968), dans lesquelles le d6ficit enzymatique primaire ne semble pas pouvoir aboutir ~t une r6tention de mucopolysaccharides (Philippart 1972). Finalement, la simple constatation de la multiplicit6 des affections dans lesquelles des granulations m6tachromatiques ont 6t6 vues dans les fibroblastes en culture (Taysi, Kistenmacher, Punnet et Mellman 1969), plaide largement en faveur de la non-sp6cificit6 de ce ph6nom6ne. On peut pour conclure envisager l'explication suivante: la m6tachromasie est provoqu6e par une r6tention intra-lysosomiale de mucopolysaccharides form6s partir du milieu de culture, ~ la suite d'un dysfonctionnement secondaire et asp6cifique de l'appareil vacuolaire de la cellule. Cette anomalie peut se rencontrer darts des maladies diverses, peut-&re plus sp6cialement dans celles qui r6sultent du d6ficit d'une enzyme lysosomiale. L'absence totale de m6tachromasie chez les hybrides soul6ve un autre probl6me. Les h6t6rozygotes artificiels h6t6roploides diff6rent sur ce point des h6t6rozygotes diploides naturels puisque ceux-ci peuvent &re m6tachromatiques (Danes et Bearn 1966).

ETUDE DES F1BROBLASTES

251

Cette absence de m6tachromasie peut trouver plusieurs explications: (a) La premi6re hypoth6se est la perte par les cellules hybrides des chromosomes responsables de la synth6se des GAG. Cette explication est peu probable car nous avons montr6 que ces hybrides perdaient peu de chromosomes (Hors-Cayla, Trebuchet et Heuertz 1972). (b) I1 est possible, d'autre part, que la d6gradation des GAG de la souche D98 compense la r6tention de ces produits provoqu6e par la d6ficience du g6nome diploide. (c) Enfin, on peut penser que la synth6se des GAG est bloqu6e dans la cellule D98 par un facteur capable de diffuser dans la cellule hybride de fa~on ~ inhiber la synth6se des GAG m6tachromatiques par le g6nome du parent diploide. I1 s'agirait 1/t d'un contr61e n6gatif dont il existe de nombreux exemples (Davidson 1971). Ce m6canisme peut 6galement fitre invoqu6 pour expliquer l'absence d'arylsulfatase A dans l'hybride r6sultant de la fusion de la souche D98 avec une souche diploide normale. REMERCIEMENTS

Nous remercions vivement Louis Sarlieve, Solange Heuertz, Genevieve Jean et le Docteur Philippe Evrard pour l'aide qu'ils nous ont apport~e. R~SUM~ Les auteurs ont 6tudi6 des fibroblastes en culture provenant de plusieurs types de lipidoses et mucopolysaccharidoses aim d'y rechercher des aspects ultrastructuraux sp6cifiques et de comprendre la signification des granulations m6tachromatiques. Dans aucun cas, les inclusions observ&s au microscope 61ectronique dans les fibroblastes ne sont identiques aux lysosomes surcharg6s d6crits dans le syst6me nerveux et dans d'autres organes de ces maladies. Dans la leucodystrophie m6tachromatique et la maladie de Wolman, des inclusions d'un type particulier ont 6t6 mises en 6vidence. Cette derni~re affection est la seule dans laquelle les fibroblastes semblent participer au processus de surcharge sp6cifique de la maladie. L'aspect ultrastructural des fibroblastes dans les maladies de Hurler et de Hunter, la maladie de Batten, la vari6t6 d'Austin de leucodystrophie m6tachromatique, les mucolipidoses, la leucodystrophie de Krabbe, et les t6moins normaux, ne diff6re pas de fa~on significative. Le taux de mucopolysaccharides est identique dans les fibroblastes provenant des mucopolysaccharidoses, de la leucodystrophie m6tachromatique, et de la maladie de Batten. Les fibroblastes de la leucodystrophie m6tachromatique ne contiennent pas de quantit6 d6tectable de sulfatides. De l'&ude ultrastructurale et biochimique des fibroblastes contenant des mucopolysaccharides m6tachromatiques, il ressort que ce ph6nom~ne n'est pas le r6sultat direct du d6ficit enzymatique primaire propre ~t chacune des affections off il est observ6, mais vraisemblablement la cons6quence d'un dysfonctionnement non sp6cifique de l'appareil vacuolaire. Le r6sultat de diverses exp6riences d'hybridation est discut6.

252

G. LYON, M. C. HORS-CAYLA, V. JONSSON, P. MAROTEAUX SUMMARY

Cultured fibroblasts from different varieties of lipidosis and mucopolysaccharidosis have been studied with the object of determining possible specific ultrastructural appearances and of understanding the significance of metachromatic granules. In no case were the inclusions seen in the fibroblasts identical to the intralysosomal inclusions existing in the nervous system and in other organs of patients with these diseases. Intrafibroblastic inclusions from metachromatic leucodystrophy and Wolman's disease showed notable peculiarities. The latter disease is the only one in which the cultured fibroblasts seem to participate in the process of lipid accumulation seen in other organs. In Hurler's and Hunter's disease, in Austin's variant of metachromatic leucodystrophy, mucolipidosis, Batten's disease, Krabbe's leucodystrophy and in normal controls, the ultrastructural appearances of cultured fibroblasts did not differ significantly. The content of mucopolysaccharides was identical in fibroblasts from mucopolysaccharidosis, metachromatic leucodystrophy and Batten's disease. Fibroblasts from cases of metachromatic leucodystrophy did not contain detectable amounts of sulfatides. From this ultrastructural and biochemical study of the cultured fibroblasts containing metachromatic granules, it appears that the granules are not a direct result of the primary enzymatic defect specific for the diseases in which they are observed, but rather that they are the consequence of a non-specific dysfunction of the vacuolar system of the cell. The results of different experiments on hybridization are also discussed. BIBLIOGRAPHIE BARKA, T. ET J. P. ANDERSON (1962) Histochemical methods for acid phosphatase using Hexazonium pararosanilinas coupler, J. Histochem. Cytochem., 10: 741-753. BARTMAN, J. ET W. A. BLANC (1970) Fibroblast cultures in Hurler's and Hunter's syndrome. An ultrastructural study, Arch. Path., 89: 279-286. BISCHOFF,A. ET J. ULRICH (1969) Peripheral neuropathy in globoid cell leukodystrophy (Krabbe's disease). Ultrastructural and histochemical findings, Brain, 92:861 870. DANES, B. S. ETA. G. BEARN (1966) Hurler's syndrome. A genetic study in cell culture, J. exp. Med., 123 : 1-16. DANES, B. S. ETA. G. BEARN (l 968) Gaucher's disease: a genetic disease detected in skin fibroblast culture, Science, 161: 1247-1348. DAVIDSON, R. L. (1971) Regulation of differentiation in cell hybrids, Fed. Proc., 30: 926-929. DUCKETT, S., CHRISTIAN, J. C. ET J. N. THOMPSON (1969) The ultrastructure of metachromatic bodies in cultured fibroblasts in Hunter's syndrome, Develop. Med. Child. Neurol., I l : 764--770. FOLCH, J., LEES, M. ET G. M. SLOANE-STANLEY(1957) A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues, J. biol. Chem., 226: 497-509. HANAI, J., LEROY, J. ET J. S. O'BRIEN (1971) Ultrastructure of cultured fibroblasts in I cell disease, Amer. J. Dis. Child., 122: 34-38. HORS-CAYLA, M. C. Ex P. MAROTEAUX(1973) Signification de la m6tachromasie duns les cellules hybrides et les fibroblastes des mucopolysaccharidoses et lipidoses, Ann. Biol. din., A para~tre. HORS-CAYLA, M. C., P. MAROTEAUXET J. DE GROUCHY (1968) Fibroblastes en culture au cours des mucopolysaccharidoses: influence du s6rum sur la m6tachromasie, Ann. G~n~t., 11: 265-266. HORS-CAYLA, M. C., TREBUCHET, C. ET S. HEUERTZ (1972) L'6volution caryotypique des cellules hybrides Homme × Homme, Ann. G~nkt., 15 : 153-158.

ETUDE DES FIBROBLASTES

253

HUG, G., SCHULER,W. K. ET S. SOUKUP (1970) Ultrastructure and deficient arylsulfatase A in fibroblast cultures of metachromatic leucodystrophy, J. Pediat., 76: 970-971. KABACK, M. M. ET R. R. HOWELL (1970) Infantile metachromatic leukodystrophy, New Engl. J. Med., 282: 1336-1340. LOEB, H.,G. JONNIAUX,A. RESIBOIS,N. CREMER, J. DODION, M. TONDEUR, P. E. GREGOIRE, J. RICHARD ET P. OETERS (1968) Biochemical and ultrastructural studies in Hurler's syndrome, J. Pediat., 73: 860874. LOUGH, J., J. FAWCETT ET B. WIEGENBERG (1970) Wolman's disease. An electron microscopic, histochemical and biochemical study, Arch. Path., 89: 103-110. LYOn, G., L.,JARDIN ET J. AICARDI (1971 ) Etude au microscope 61ectronique d'un neff p6riph6rique dans un cas de leucodystrophie de Krabbe, J. neurol. Sci., 12: 263-274. PHILIPPART, M. (1972) Glycolipid. Dans: K. ZAMBOTTI,G. TETTAMANTIET M. ARRIGONI (R6ds.), Glycoproteins and Mucopolysaccharides of the Nervous System, Plenum Publ. Corp., New York, N.Y., pp. 231-154. PHILIPPAgT, M., L. SAgUEVE, C. MEURANT ET L. MECHLER (1971) Human urinary sulfatides in patients with sulfatidosis (metachromatic leucodystrophy), J. Lipid Res., 12: 43~ 4~1. PORTER, M. T., A. L. FLUI-IAgTYET H. KmARA (1971) Correction of abnormal cerebroside sulfate metabolism in cultured metachromate-leucodystrophy fibroblasts, Science, 172: 1263-1265. PORTER, M. Y., A. L. FLUHARTY, J. E. HAgNIS ET H. KIHARA (1970) The accumulation of cerebroside sulfates by fibroblasts in culture from patients with late infantile metachromatic leukodystrophy, Arch. Biochem. Biophys., 138: 646-652. RESIBOIS-GRI~GOIRE, A. (1967) Electron-microscopic studies of metachromatic leucodystrophy, Acta neuropath. (Berl.), 9: 244-253. SCHNEIDER,P. B. ET E. P. KENNEDY (1968) Metabolism of labeled dihydrosphingomyelin in vivo, J. Lipid Res., 9: 58-64. TAPPEL, A. L. (1969) Lysosomal enzymes and other Components. Dans: T. J. DINGLE ET H. B. FELL (R6ds.), Lysosomes in Biology and Pathology, Vol. 2, North-Holland Publ. Comp., Amsterdam, Ch. 9, pp. 207-244. TARCONI, R., C. BACCICHETTI,F. ZACCHELLOEl" E. SARTORI(1970) Metachromasia in cultured fibroblasts of subject with glycogenosis type II, Experientia (Basel), 26: 1238-1239. TAYSI, K., M. C. KISTENMACHER,H. H. PUNNETTET W. J. M ELLMAN(1969) Limitation of metachromasia as a diagnostic aid in pediatrics, New Enol. J. Med., 281:1108-1111. VAN HOOF, F. ET H. G. HERS (1967) L'ultrastructure du foie dans certaines th6saurismoses, Rev. int. Hdpat., 17: 815-826.