Aufnahme und Umsatz exportierter Photosyntheseprodukte durch die Chloroplasten während der Assimilation von CO2

Biochem. Physiol. Pflanzen 168, S. 211-223 (1975)

Aufnahme und Umsatz exportierter Photosyntheseprodukte durch die Chloroplasten wahrend der Assimilation von CO2 U. HEBER und M. R. KIRKl) Botanisches Institut der Universitat Diisseldorf

Uptake and Reassimilation of Previously Exported Photosynthetic Products by Chloroplasts During CO 2 Reduction Key Term Index: chloroplasts, photosynthesis, CO 2 reduktion, metabolite transport, reassimilation; Spinacia oleracea.

Sunuuary Chloroplasts were permitted to reduce 14C0 2 or 14C-labeled phosphoglycerate in the light. During a subsequent tracer-chase with 12C02 14C continued to be incorporated especially into a polyglucan (starch), glycolate, pentose monophosphates and fructose diphosphate. Label was lost mainly from dihydroxyacetone phosphate, which had previously been excreted by the chloroplasts. Ribulose diphosphate still contained a significant amount of 14C even after prolonged photosynthesis in the presence of 12C0 2. The loss of label from other intermediates of the Calvin cycle was even less apparent than from ribulose diphosphate. The tracer distribution data reflect the slow export of some sugar phosphates from the chloroplasts during photosynthesis. They further show that chloroplasts are able to take up dihydroxyacetone phosphate from the medium against the flux of newly synthesized photosynthetic products and incorporate it via the carbon cycle mainly into starch. In contrast to dihydroxyacetone phosphate, little uptake and reassimilation of phosphoglycerate and of pentosemonophosphates appeared to occur during the reduction of CO 2 • The relative metabolic inactivity of external phosphoglycerate during photosynthesis is of interest in relation to current assumptions on the mechanism of photosynthesis in C.-plants. It affects the interpretation of tracer chase experiments which have led to the postulate that in such plants carbon must flow through dicarboxylates before it enters phosphoglycerate.

Einleitung

Zu den Endprodukten plastidischer Photosynthese zahlen Phosphoglycerinsaure und Dihydroxyacetonphosphat (GIBBS 1971, JENSEN and BASSHAM 1966), die in das Zytoplasma der Blattzelle exportiert und dort weiter verarbeitet werden (BASSHAM et al. 1968, BIRD et al. 1974, HEBER 1974, WALKER 1974). Gleichzeitig sind diese Verbindungen Intermediarprodukte auf dem Wege zur Regeneration des CO 2- Akzeptors. DaB: Chloroplasten nach ihrer Isolierung in vitro noch zur Photosynthese befahigt sind und dabei sogar Photosyntheseraten aufweisen, die denen im Blatt nicht nachstehen, beweist, daB der Export kontrolliert ist. Der Verlust benotigter Intermediarprodukte muBte ja den Zusammenbruch des Carbonzyklus zur Folge haben, der nicht beobachtet wird. In der Tat sind bisher 2 spezifische Anionenaustauschsysteme in der Hulle der Chloroplast en nachgewiesen worden, von den en der sog. Phosphattranslokator den FluB: 1) Herrn Prof. Dr. K. 14*

MOTHES,

zum 75. Geburtstag gewidmet.

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U. HE13BR und :\1. R.

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von Phosphat, Dihydroxyacetonphosphat und 3-Phosphoglycerat zwischen Chloroplasten und Umgebung reguliert (HELDT et al. 1970, 1974). Er sorgt dafUr, daB die intraund extraplastidischen Pools dieser ::vIetabolite in Verbindung treten, wobei cine notwendige Transportbedingung der stochiometrische Austausch von transportablem Substrat liber die Chloroplastenhlille hinweg ist. Eine vereinfachte Darstellung der plastidischen Photosynthese ist in Abb. 1 gegeben. CO 2 diffundiert in die Chloroplasten hinein (HELDT et al. 1971), wahrend Phosphat als zweiwertiges Anion liber den Translokator aufgenommen wird. Die Elektroneutralitatsbedingung wird dadurch gewahrt, daB gleichzeitig ein transportables anionisches Photosyntheseprodukt, 3-Phosphoglycerat oder Dihydroxyacetonphosphat, vom Translokator nach auBen abgegeben wird. Es findet im Licht also ein PhosphatfluB von auBen nach inn en statt, der von einem entgegengerichteten PhosphatesterfluB kompensiert wird. Naturlich werden im Blatt die Phosphatester weiter umgesetzt, so daB wieder Phosphat frei wird und somit ein begrenzter Pool an Phosphat fUr die Aufrechterhaltung des Stoffflusscs ausreicht. In diesem Beitrag berichten wir darliber, daB der PhosphatesterfluB wahrend der Photosynthese nicht nur in einer Richtung moglich ist. Bereits exporticrte Photosyntheseprodukte konnen entgegen dem generellen StofffluB von den Chloroplasten wieder ~ufgenommen und in den Photosynthesestoffwechsel einbezogen werden. Das gilt in starkem MaBe fUr Dihydroxyacetonphosphat, jedoch weniger flir 3-Phosphoglycerat und offenbar gar nicht fUr Glycolat.

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Abb. 1. Import von Phosphat und CO 2 durch Chloroplasten und Export von Dihydroxyacetonphosphat wiihrend der photosynthetischen CO 2 -Reduktion.

Material nnd Methoden Intakte Cholroplasten wurden aus Bliittern schnell wachsender Spinatpflanzen nach Vorbe· lichtung in einer Modifikation des von JENSEN und BASSHAM (1966) angegebenen Verfahrens isoliert {HEBER 1973) und im Eisbad aufbewahrt. Photosynthetische Sauerstoffentwicklung wurde mit einer Clark-Elektrode bei 20°C registriert. Das Reaktionsmedium enthielt 0,33 M Sorbit, 10 m:\INaCl, 1 mM MnCJ 2 , 1 mM MgCl 2 ,:2 m)[ 1thylendiamintetraazetrat und 50 m:\[ 2-[4-(2-HydroxyathyJ)

Aufnahme von Photosyntheseprodukten durch Chloroplasten

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piperazinyl-(l)]-athansulfonat. Der pH-Wert wurde mit 7,2 niedrig gewahlt, urn eine weitgehende Reduktion des radioaktiven Substrats zu ermoglichen (HEBER et al. 1975). Die Chloroplastenkonzentration in den Versuchen entsprach 80 Ilg Chlorophyll/ml. Belichtet wurde mit sattigendem Rotlicht (200 W m- 2 , Halbbandbreite von 630-760 nm). Das benutzte HHCO a- hatte eine spezifische Aktivitat von 56 mC/mMol, das HC-markierte Phosphoglycerat von 6 mC/mMol. Zur Bestimmung der Verteilung markierter Reaktionsprodukte wurden 100 Ill-Anteile zu verschiedenen Zeiten entnommen und in 400 III Methanol abgetotet. Die Proben wurden chromatographiert und markierte Verbindungen durch Autoradiographie lokalisiert (PEDERSEN et al. 1966). Quantitative Bestimmungen erfolgten durch Auszahlen mit einem Methandurchflullzahler, der auf den Chromatogrammen eine Ziihlausbeute von 7.5 % aufwies. Da Zuckerdiphosphate oder Glukosemonophosphate und Sedoheptulosemonophosphat nicht voneinander getrennt werden, wurden die entsprechenden Flecken eluiert und mit saurer Phosphatase der Fa. Boehringer (Mannheim) in je 25 III Azetatpuffer (0,1 ~I, pH 4.5; Enzymkonzentration 1 mg/ml) 2 h bei 37°C inkubiert. Die dann in freier Form vorliegenden Zucker wurden chromatographisch getrennt und auf die schon beschriebene Weise bestimmt. In der Arbeit werden Ergebnisse aus 2 Versuchen diskutiert, doch liegen 4 Versuche vor, die mit unterschiedlichem Chloroplastenmaterial durchgefiihrt wurden. Die Ubereinstimmung der Daten aus verschiedenen Versuchen war gut.

Ergebnisse

Intakte Chloroplasten entwickeln im Licht in Gegenwart von Bikarbonat oder 3-Phosphoglycerat Sauerstoff. Die Sauerstoffentwicklung hort in der Regel auf, bevor das Substrat vollig reduziert ist. Das AusmaJ3 der Reaktion ist pH- und Oz-abhangig (HEBER et al. 1975). Abb. 2A zeigt die Sauerstoffentwicklung von Chloroplasten in Gegenwart von 14C-markiertem Bicarbonat (0,25 mM). Nach einer Verzogerungsphase, die durch den Aufbau von Pools an Intermediarprodukten der Photosynthese bedingt ist (LATZKO and GIBBS 1969, WALKER 1974, WALKER et al. 1973), kam die Sauerstoffentwicklung in Gang. Sie horte auf, als 80 % des Bicarbonats reduziert waren. Durch Zugabe von unmarkiertem Bicarbonat (2 mM) wurde die Reaktion erneut gestartet. In einem vollig analogen Experiment (Abb. 2 B) lag zu Beginn der Belichtung nicht HI4CO a-, sondern 14C-3-Phosphoglycerat (0.5 mM, statistisch markiert) als Substrat vor. Belichtung bewirkte wiederum Sauerstoffentwicklung, die in diesem Fall Reduktion von Phosphoglycerat zum Triosephosphat anzeigte: 2 PGS -+ 2 Triosephosphat

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Nachdem die Reaktion bei Reduktion von 75% des zugegebenen Phosphoglycerats weitgehend abgeschlossen war, wurden ebenfalls 2 mM NaH12CO a zugegeben. Erneute Oz-Entwicklung zeigte nun die Reduktion von CO 2 zur Zuckerstufe an (vgl. Abb. 1). Wie die chromatographische Analyse (PEDERSEN et al. 1966) ergab, entstanden bei der 14C02 - Reduktion als markierte Produkte 3-Phosphoglycerat, die Triosephosphate Dihydroxyacetonphosphat und Glycerinaldehydphosphat, Zuckermonophosphate (Glucose-6-phosphat, Fructose-6-phosphat, Sedoheptulose-7-phosphat und Pentosemonophosphate), Zucker diphosphate (vor all em Fructose-1,6 diphosphat, Ribulosediphosphat und Sedoheptulosediphosphat), Glycolat und ein Polyglucan, das im folgenden als Starke bezeichnet wird. Die gleichen markierten Reaktionsprodukte wurden auch bei der Reduktion von 14C-Phosphoglycerat beobachtet. Aminosauren waren nicht markiert.

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Abb. 2. Sauerstoffentwicklung durch intakte Chloroplasten. A. In Gegenwart von 0,25 mM HUC0 3 - . Wiedereinsetzen der Photosynthese nach Zugabe von 2 mM H12C0 3 -. B. Analoges Experiment wie in A, jedoch lag zu Beginn der Belichtung nicht 0,25mM H14C0 3 -, sondern 0,5 mM 14C-markiertes 3-Phosphoglycerat als Substrat VOT. Angegebene Zahlen sind maximale Raten der Sauerstoffentwicklung in pMolen mg- 1 Chlorophyll/h. Das in der Abbildung wiedergegebene AusmaB der Sauerstoffentwicklung weicht von den im Text gemachten Angaben liber das AusmaB der Reduktion von 14C02 und markiertem Phosphoglycerat etwas abo Das erklart sich daraus, daB das Medium nicht viillig frei von inaktivem Bikarbonat war.

Abb. 3 zeigt den Gehalt an markiertem Kohlenstoff in einzelnen Verbindungen oder Verbindungsgruppen wahrend der Reduktion von 14C02 zu Beginn des Versuches und der dann anschlieBenden Reduktion von 12C02 (Versuchsaufbau wie in Abb. 2A). Es ware zu erwarten, daB die Markierung von Intermediarprodukten sinkt, wenn unmarkiertes CO 2 in den Photosynthesezyklus eingeschleust wird. Aus Intermediarprodukten verschwindender markierter Kohlenstoff sollte in Endprodukten der Photosynthese erscheinen. Wahrend der Photosynthese intakter Chloroplasten werden vor allem 3-Phosphoglycerat, Dihydroxyacetonphosphat und Glycolat ausgeschieden (GIBBS 1971, HEBER 1974, WALKER 1974). Wie bereits erwahnt, sind diese Verbindungen ebenso als Endprodukte zu betrachten wie Starke, die in den Chloroplasten akkumuliert wird. Das experimentelle Ergebnis entsprach den Erwartungen nur unvollstandig. Die Markierung der Intermediarprodukte Fructose-6-phosphat, Glucose-6-phosphat und Sedoheptulose-7-phosphat (letztere wurden nicht voneinander getrennt) nahm in der Tat ab, jedoch nur auf die Halfte, obwohl Abb. 2A ausweist, daB das zugegebene inaktive CO 2 einen raschen PhotosynthesefluB induziert hatte und deshalb ein schnelles "Heraussptilen" der Markierung aus Intermediarprodukten erwartet werden sollte.

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Der 14C-Gehalt von Ribulosediphosphat sank starker ab als der von Fructose-6-phosphat bzw. von Glucose-6-phosphat und Seduheptulose-7-phosphat. Es wurde schnell ein "Grundpegel" an HC erreicht, der bei etwa 25 % des ursprtinglichen Tracergehaltes ag (Abb. -1). Er wurde wahrend der Versuchszeit nicht unterschritten. Auf Grund des Verdtinnens von H14C0 3 -, das zum Ende der Markierungsphase noch vorhanden war (etwa 0,05 mM), durch zugegebenes Hl2C0 3 - (2 mM), sollte demgegentiber bei vollstandiger ,.Sptilung" die Endmarkierung bei nur etwa 2,5 % des htichsten Markierungsstandes in Ribulosediphosphat liegen. 1m gesamten Zuckerdiphosphat-Pool, der im wesentlichen Fructosediphosphat umfaBt und yon dem Ribulosediphosphat nur einen sehr kleinen Teil ausmacht, war keine signifikante Erniedrigung der Markierung festzustellen (Abb. 3). Das gleiche galt fUr die Pentosemonophosphate, die selbst wiihrend der Reduktion von 12C02 noch HC inkorporierten. Von der Glycolatsynthese ist bekannt, daB sie kompetitiv durch CO 2 gehemmt wird (ComIBs and WHlTTINGHA:\I 1966, GIBBS 1971). Glycolat wird von Chloroplasten nicht wciter metabolisiert (CHAN and BASSHAM 1967). Das sehr langsame Anstcigen der lVlarkierung im Endprodukt Glycolat wahrend der 12C02-Assimilation ent-

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spricht also der Erwartung. Starke nahm 14C auch in Gegenwart von 12C02 noch rasch auf. Sehr unerwartet war das schwache Absinken des 14C-Gehaltes im 3-Phosphoglycerat und das drastische Absinken im Dihydroxyacetonphosphat wahrcnd dcr Reduktion von 12C02 • Beide Verbindungen Iiegcn ganz iiberwiegend au13erhalb der Chloroplasten ist vor, wie aus den Untersuchungcn von BASSHAllI, KIRK und JENSEN (1968) bekannt und in eigenen Kontrollversuchen bestatigt wurde (Abtrenncn dcr Chloroplasten vom . Medium durch schnelle Zentrifugation). In den Experimenten der Abb. 4 (obere Kurven) und 5 ist die Markierung verschie· dener Produkte wahrencl der Reduktion erst vom markierten Phosphoglycerat nnd an-

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Abb. 4. Markierung von Ribulosediphosphat und Sedohepiulosediphosphal. Untere Kurven: Wiihrend anfiinglicher Photosynthese in Gcgenwart von 14C0 2 uud fortgesetzter Photosynthese in Gegenwart von 12C0 2. V crsuchsaufbau ,,"ie in Abb. :2 A bzw.3, jedoeh liingere Photosynthesezeit in Gegenwart von 14C0 2 • Obere Kurven: Bei anfiinglicher Beliehtung in Gegenwart VOil 14C-markiertem Phosphoglycerat. Nach 9 min Zugabe von 2 lU1I1 H12C0 3 -. Versuchsaufbau wie in Abb. :2 B. SuDP = Sedoheptulosediphosphat; RuDP = Ribulosediphosphat.

Aufnahme von Photosyntheseprodukten durch Chloroplasten

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schlieBend vom unmarkierten Bikarbonat gezeigt (Versuchsaufbau wie in Abb .. 2 B). Die Ergebnisse weichen nur in einigen Details von den en ab, die bei der Reduktion von 14C02 und der anschlieBenden Photosynthese in Gegenwart von 12C02 beobachtet wurden. Ubereinstimmung besteht darin, daB der 14C-Gehalt der Pentosemonophosphate wahrend des "Spiilens" mit unmarkiertem Kohlenstoff nicht absank, sondern anstieg. Ein Anstieg der Markierung wurde auch bei Glycolat und Starke wahrend der Photosynthese in Gegenwart von 12C02 gefunden. Ribulosediphosphat, das bei der Reduktion von 14C-markiertem 3-Phosphoglycerat in Abwesenheit von CO 2 akkumuliert wird und deshalb starker markiert erschien als im 14C0 2-Experiment der Abb. 4, verlor seine Markierung bei Anlaufen der 12C02 - Reduktion schnell, doch wurde wieder ein Markie-

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rungspegel beibehalten, der bei etwa 25 % der urspriinglichen Markierung lag (Abb. 4, oberste Kurve). Sedoheptulosediphosphat zeigte, ebenso wie im Parallel experiment mit 14C02, demgegeniiber eine schwachere Abnahme des 14C-Gehaltes. Die Abnahme der Markierung von Dihydroxyacetonphosphat, dem Hauptprodukt der Reduktion von 14C-3-Phosphoglycerat, war wahrend der Reduktion von lZCO Z betrachtlich (Abb. 5). Fructose-1,6-diphosphat war mit mehr als 80 % Hauptbestandteil der Zuckerdiphosphate. Beim starken Anstieg des 14C-Gehaltes von Fructose-1,6-diphosphat auch wahrend der Reduktion von 12COZ kam das Absinken der Markierung von Ribulosediphosph at in der Gesamtmarkierung der Zuckerdiphosphate iiberhaupt nicht zur Geltung. Solange 3-Phosphoglycerat einziges reduzierbares Substrat war, wurde es im Lichte schnell in andere Verbindungen umgesetzt(Abb. 5, erste 7 min). Mit dem Ingangkommen der Reduktion von 12CO Z erfolgte jedoch sogar ein Wiederanstieg des 14C-Gehaltes von 3-Phosphoglycerat. Auch die Markierung der Gruppe der Hexose- bzw. Heptulosemonophosphate stieg im 3-Phosphoglycerat-Experiment selbst wahrend der Photosynthese in Gegenwart von lZC0 2 noch an. Demgegeniiber war unter sonst gleichen Bedingungen ein Abfall der Markierung im 14COz-Experiment beobachtet worden (Abb. 3). Diskussion

Zum Ende der Markierungsphase betrug der Pool von Ribulosediphosphat im CO z Experiment etwa 12m.u-Atome 14C mg- 1Chlorophyll (Abb. 4). Die nach Zugabe von H12CO a- beobachtete Photosyntheserate lag bei 39 .u-Molen mg-lChlorophylljh. Das entspricht einem FluB durch Ribulosediphosphat in der Hohe von 650 m.u-Atomen 12C mg- 1 Chlorophyll/min. Der Vergleich dieser FluBrate mit der PoolgroBe illustriert deutlich die Diskrepanz zwischen dem erwarteten schnellen und nahezu vollstandigen Verschwinden der Markierung aus Ribulosediphosphat wahrend der Photosynthese in Gegenwart von 12C02 und der Beobachtung eines langsameren und nur unvollstandigen Verlustes. Ganz ahnliche Befunde ergaben sich fiir das 3-Phosphoglycerat-Experiment. Es liegen zwei Deutungen fUr das Markierungsverhalten von Ribulosediphosphat auf der Hand:

1. Einem stoffwechselaktiven Pool an Ribulosediphosphat steht ein inaktiver Pool gegeniiber, der am Umsatz nicht teilhat und deshalb seinen Gehalt an Tracer auch beim Umstellen der Photosynthese auf unmarkiertes Substrat nicht andert. 2. Es gibt nur einen Pool an Ribulosediphosphat, in den indessen auch nach Umstellen der Photosynthese auf die Assimilation von 12COz immer noch markiertes Substrat einflieBt, so daB ein gewisser Markierungspegel fUr langere Zeit erhalten bleibt. Die erste Interpretation ist schwer mit friiher gemachten Beobachtungen in Einklang zu bringen (BASSHAM et al. 1968, HEBER 1974, HEBER et al. 1967b, WALKER 1974). Dazu kommt, daB nur die zweite ein Verstandnis aller Beobachtungen ermoglicht. Wir bevorzugen daher die zweite Interpretation. Damit stellt sich natiirlich sofort die Frage nach der Quelle des markierten Kohlenstoffs, der neben dem 12C in den RibulosediphosphatUmsatz einbezogen wird. Wenige Verbindungen bieten sich dafUr an: Sie miissen mar-

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kiert sein, mtissen ein gentigend groBes Reservoir darstellen und mtissen in den Photosynthesestoffwechsel einbeziehbar sein. Das Reservoir sollte sich dadurch identifizieren lassen, daB es mit der Zeit kleiner wird. Eine Betrachtung der Abb. 3 und 5 zeigt, daB diese Forderungen flir Dihydroxyacetonphosphat zutreffen. Dihydroxyacetonphosphat wird wahrend der Photosynthese groBtenteils exportiert und liegt dann auBerhalb der Chloroplasten vor. Da der 14C-Gehalt von Dihydroxyacetonphosphat wiihrend der Photosynthese in Gegenwart von 12C02 abnimmt, wird Dihydroxyacetonphosphat offenbar weiter umgesetzt. AuBerhalb der Chloroplasten ist eine Umwandlung nennenswerten AusmaBes lediglich in Fructose-1,6-diphosphat moglich, da Triosephosphatisomerase und Aldolase auch in Suspensionen gewaschener Chloroplasten noch in merklicher Aktivitiit im Medium gefunden werden. In der Tat zeigt eine Gleichgewichtsbetrachtung (Tabelle 1), daB die wiihrend der Assimilation von 12C02 beobachtete Zunahme der 14C-Markierung von Fructose-1,6-diphosphat (Abb. 3 und 5) auf die Kondensation markierten Triosephosphats zu Fructose-1,6-diphosphat zurtickgeftihrt werden kann. Der schnellere Anstieg von markiertem Fructose-1,6-diphosphat im 3-Phosphoglycerat-Experiment mag sich aus dem hiiheren Spiegel an Triosephosphat erkliiren. Fructosediphosphat vermag die Chloroplastenhtille nicht ohne wei teres zu passieren (HELDT and RAPLEY 1970). Tabelle 1. Konzentrationen an markiertem Dihydroxyacetonphosphat und Fructose-1,6-diphosphat im Medium 1) zum Ende deT 14C-Markierung nach Photoreduktion von 14C02 oder 14C-Phosphoglycerat. 1m Vergleich dazu Konzentration an Fructose-1,6-diphosphat, die der Gleichgewichtslage der Aldolase- Reaktion entsprechen wiirde [Gleichgewichtskonstanten der Aldolase- und Triosephosphatsomerase- Reaktion - vgl. HESS 1 Konzentrationen im Medium CuM)1) Dihydroxy-aceton- Glycerinphosphat aldehydphosphat2) (gemessen)

3-Phosphoglycerat200 Experiment 19 CO 2-Experiment

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Fructose-1,6-diphosphat (gemessen)

Fructose-1,6-diphosphat im Gleichgewicht mit Dihydroxyacetonphosphat und Glycerinaldehydphosphat

18 1

30 3

1) Errechnet unter der Annahme, daB die Chloroplastenkonzentrationen vernachliissigt werden kiinnen, da die Chloroplasten nur 0,3 % des Ansatzvolumens einnehmen. 2) Errechnet unter der Annahme, daB Dihydroxyacetonphosphat und Glycerinaldehydphosphat im Gleichgewicht stehen.

Jedoch zeigt ein Blick auf die Abb. 3 und 5, daB die Zunahme der Markierung von Fructose-1,6-diphosphat die Abnahme des 14C-Gehaltes von Dihydroxyacetonphosphat nur zum Teil erkliirt. Ein wesentlicher Teil der Abnahme kommt offenbar dadurch zustande, daB bereits exportiertes Dihydroxyacetonphosphat entgegen dem Strom von Photosyntheseprodukten (vgl. Abb. 1) wieder in die Chloroplasten aufgcnommen und

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dort metabolisiert wird. Die Einbeziehung in den Chloroplastenstoifwechsel bedingt die langsame Zunahme der Markierung von Glycolat, das ausgeschieden und nicht weiter metabolisiert wird, ebenso wie die erstaunlich rasche Weitermarkierung der Starke, die in den Chloroplasten verbleibt. Sie bedingt weiter die Aufrechterhaltung eines Grundpegels an 14C in Ribulosediphosphat wahrend der 12C02-Assimilation. Abb. 4 zeigt nun, daI3 die Markierung von Sedoheptulosediphosphat weniger stark wahrend der 12C02-Assimilation abnimmt als die Markierung von Ribulosediphosphat. Das gleiche ergibt sich ftir Fructose-6-phosphat sowie Glucose-6-phosphat und Seduheptulose-7-phosphat im CO2-Experiment der Abb. 3. Im analog en 3-Phosphoglycerat-Experiment ist nicht einmal eine deutliche Abnahme des 14C-Gehaltes der Zuckermonophosphate festzustellen. Die Pentosemonophosphate sind Intermediarprodukte des Calvinzyklus. Sie lassen jedoch sowohl im CO 2- als auch im 3-Phosphoglycerat-Experiment selbst wahrend der 12C02-Assimilation noch eine Zunahme der Markierung erkenneu. Die Diskrepanz zur Abnahme des 14C-Gehaltes in Ribulosediphosphat deutet in all diesen Fallen auf die Existenz inhomogener Pools hin. Verschiedene Pools ein- und desselben Photosynthesemetaboliten sind innerhalb der Chloroplasten nicht ohne weiteres vorstellbar. Es ist jedoch leicht denkbar, daI3 aus den Chloroplasten exportiertes Zukkerphosphat einen stoffwechseltragen Pool darstellt, wahrend intraplastidisches Zukkerphosphat stoffwechselaktiv ist. Von den Pentosemonophosphaten ist bekannt, daI3 sie die Chloroplastenhtille langsam passieren konnen. Die standige Zunahme der Markierung dieser Phosphat ester auch wahrend der 12C02-Assimilation bedeutet offenbar, daI3 der Chloroplasten-Pool, der ja eine Abnahme der Markierung erfahren muI3, klein ist gegentiber dem extraplastidischen Pool, in den durch Export stan dig 14C hineinflieI3t. Dieses stammt letztIich, wie schon besprochen, aus extraplastidischem Dihydroxyacttonphosphat, das in die Chloroplast en "zurtickgerufen" wird. Wie die Abnahme der Markierung in den Hexosemonophosphaten und in Sedoheptulosediphosphat beim "Sptilen" mit 12C im Vergleich zur Abnahme der Markierung im Ribulosediphosphat erkennen laI3t, konnen bei diesen Zuckerphosphaten die extraplastidischen Pools nicht sehr groI3 im Vergleich zu den plastidischen Pools sein. Das heiI3t, daI3 wahrend der Photosynthese der Export dieser Zuckerphosphate aus den Chloroplast en geringer war als der der Pentosemonophosphate (vgl. HEBER 1974, WALKER 1974). In diesem Zusammenhang mag eine vergleichende Betrachtung von PoolgroI3en zweckmaI3ig sein. Tabelle 2 zeigt PoolgroI3en einiger Phosphatester in Praparationen isolierter Chloroplast en und in Chloroplasten in vivo wahrend der Photosynthese von Blattern. A.hnliche PoolgroI3enwurden flir Chloroplasten von LATZKO und GIBBS (1969) gemessen. Die flir die isolierten Chloroplasten angegebenen Werte wurden am Ende der Markierungsphase (Abb. 3 und 5) unter der Annahme berechnet, daI3 die gesamte mar·· kierte Verbindung in den Chloroplasten vorliegt. Das ist offen bar nicht immer eine realistische Annahme, da es sich zeigt, daI3 nur die Ribulosediphosphat-PoolgroI3en in isolierten Chloroplast en und in Chloroplasten in vivo vergleichbar sind. Haufig haben wir sogar wesentlich kleinere Pools an Ribulosediphosphat in isolierten Chloroplasten, wahrend rascher Photosynthese gefunden, was wir als Anzeichen daflir interpretieren, daI3

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Tabelle 2. Apparente PoolgrofJen einiger Phosphatester in Chloroplasten in vivo!) und bei der PhotosYlithese isolierter Chloroplasten

Ribulosediphosphat Seduheptulosediphosphat Frnctosediphosphat Frnctose-6-Phosphat

isolierte Chloroplasten PGS-Experiment CO.-Experiment

in Chloroplasten im Spinatblatt (13)

70·10- 5 M 170·10-6 M 1600·10-5 M 12·10- 4 M

25·10- 5 M 7.5·10- 6 M 8·10-5 M 1· 10-4 M

8·10- 5 M 60·10- 6 M 80·10-5 M 5·10- 4 M

1) Errechnet aus Angaben von HEBER et al. (1967 a) unter der Annahme, daB in intatken Chloroplasten einem :\filligramm Chlorophyll ein Stromavolumen von 30,ul entspricht.

Ullter Bikarbonatsattigung die Carboxylierung von Ribulosediphosphat kein limitierender Schritt der Photosynthese isolierter Chloroplasten ist. Die fiir Seduheptulosediphosphat und die Fruktosephosphate errechneten PoolgroBen sind in isolierten Chloroplasten zum Teil sehr erheblich groBer als in vivo. In Obereinstimmung mit dem Markierungsverhalten bei der 12C02-Assimilation interpretieren wir das dahingehend, daB ein Teil der in Tabelle 2 den isolierten Chloroplasten zugeschriebenen Phosphat ester dort gar nicht vorkommt, sondern vielmehr im ChloroplastenauBenraum zu finden ist. Diese Interpretation ist in Obereinstimmung mit Befunden von BASSHAM, KIRK und JENSEX (1968). Von Interesse ist das Markierungsverhalten der Starke. In allen Experimenten war nach Umstellen der Photosynthese auf die Reduktion von 12C02 zunachst einmallangsamere Zunahme der Starkemarkierung festzustellen, die sich dann wieder beschleunigte. Aus der Markierung von Ribulosediphosphat (Abb. 4) ist abzulesen, daB der 14C-Anteil in neusYllthetisierten Starkevorstufen, die wahrend der 12C0 2-Assimilation bereitgestellt wurden, wesentlich absank. Der Anstieg des 14C-Gehaltes in der Starke vor allem wiihrend der spateren Phase der 12C02-Assimilation zeigt daher eine gegentiber der vorhergehenden Photosyntheseperiode erhohte StarkesYllthese an. Wahrend im CO2-Experiment der Abb. 3 noch eine langsame Abnahme der Markierung von Phosphoglycerat wahrend der 12C02 - Reduktion beobachtet wurde, fand im 3-Phosphoglycerat-Experiment der Abb. 5 wahrend der Tracer-Chase-Phase sogar ein Anstieg des 14C-Gehaltes von Phosphoglycerat statt. Diese Befunde beleuchten die relative Stoffwechseltragheit von extraplastidischem Phosphoglycerat im Vergleich zum Dihydroxyacetonphosphat wahrend der Assimilation von CO2. In Abwesenheit von Bikarbonat wird Phosphoglycerat dagegen rasch aufgenommen und umgesetzt, wie sich aus dem schnellen Umsatz zu Dihydroxyacetonphosphat wahrend der erst en 7 min Beiichtung im Experiment der Abb. 5 deutlich ergibt. Der langsame Umsatz von externem Phosphoglycerat wahrend der CO2-Assimilation ist von Bedeutung in bezug auf heute gangige Denkmodelle tiber die Photosynthese sog. C4- Pflanzen (HATCH 1971 b). In diesen Pflanzen werden Dikarboxylsauren als primare Photosyntheseprodukte betrachtet. Diese Auffassung grtindet sich auf Markierungs- und Tracer-Chase-Experimente. Bei der l\Iarkierung wird Tracer in Malat oder Aspartat gefunden, bevor Phosphoglycerat

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U. HEBER und M. R. KIRK

radioaktiv wird (HATCH 1971 a). Bemerkenswerterweise werden die Dikarboxylate im Zytoplasma synthetisiert (GIBBS et al. 1970, HATCH and KAGAWA 1973), wahrend Phosphoglycerat in den Chloroplasten markiert wird. 1m Tracer-Chase-Experiment verlieren die Dikarboxylate Radioaktivitat, bevor diese aus Phosphoglycerat verschwindet (HATCH 1971 a). Wahrend aus diesen Experimenten ein schneller Umsatz der Dikarboxylate deutlich wird, ist es doch fraglich, ob der SchluB gezogen werden kann, daB im KohlenstofffluB Phosphoglycerat den Dikarboxylaten nachgeordnet ist. Es ist klar, daB in Tracer-Chase-Experimenten die relative Stoffwechseltragheit von zytoplasmatischem Phosphoglycerat den Verlust von 14C aus dieser Verbindung verzogern muB, so daB das auBere Bild eines rascheren Verschwindens von 14C aus den Dikarboxylaten entsteht. Dieses Bild kann triigen. Es sagt auf jeden Fall wenig iiber den KohlenstofffluB in aktiven Pools aus. Die Untersuchungen wurden durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft gefordert. Wir danken der Fa. Boehringer, Mannheim, fur die Uberlassung von 14C-markierter Phosphoglycerinsaure.

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Aufnahme von Photosyntheseprodukten durch Chloroplasten

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Korrekturnotiz Herr Dr. H. W. Heldt, 1Iiinchen, machte uns freundlicherweise darauf aufmerksam, daB man den Anstieg in cer 14C-1IarkiEfllng von 3-Phosphoglycerat im Experiment der Abb. 0 aueh anders als geschehen interpretieren kiinne. Das Verhiiltnis von Dihydroxyacetonphosphat zu Phosphoglycerat kiinne bei Zugabe von Bikarbonat sinken und damit den beobachteten Anstieg an 14C-markiertclll Phosphoglycerat bedingen. Wir haben daraufhin Chloroplasten im Licht 14C0 2 rc('uzicren lassen und die 1Iarkierung der Photosyntheseprodukte verfolgt. Nach 8 Minuten langsalllH Photosynthese in limitierendem Rotlicht (8 W 111-2) wurde 2 mM inaktives Phosphoglycerat zugegeben und damit das in zwischen gebildete markierte Phosphoglycerat urn den Faktor 100 verdiinnt. Da Phosphoglycerat ein Zwischenprodukt der Photosynthese ist, sollte ein schneller nnd ungehincerter Austausch iiber die Chloroplastenhiille hinweg zu einer entsprechenden Isotopenverclmnung cu Folgeprodukte der Photosynthese fiihren. Tatsiichlich stieg jedoch die :\;Iarkierung c1er Ptntosemonophosphate, von Dihyclroxyacetonphosphat und von Glycolat, das im wesentliehen aus der oxydativen Spaltung von Ribulosediphosphat stamillt (HEBER et al. 1970), weiter an, wenngleich mit verringerter Rate. Lediglich die Hexosemonophosphate zeigten auf Grund der Isotopenverdiinnung einen AbfaH der 1Iarkierung, doch auch hier wesentlich weniger als bei schnellem Austausch von Phosphoglycnat zu erwarten wiire. Aus clem AusmaB des AbfaJls der Hexosephosphatmarkierung im Vergleich zur Yerdiinnung des "heiBen" Phosphoglycerats durch die unmarkierte Verbindung liiBt sich abschiitzen, daB unter den Photosynthesebedingungen des Experimentes internes Phosphoglyeerat gegeniiber externem Phosphoglycerat bei der Recluktion um den Faktor 20 begiinstigt war. Der Begiinstigungsfaktor steigt natiirlich noch bei hiiheren Photosyntheseraten. Die Ergebnisse des Experimentes sind also im Einklang mit den in der vorliegenden Arbeit gezogenen Schliissen.