Beeinflussung der enchondralen Ossifikation durch Kohlehydratbelastung

Exp. Path., Bd. 12, S. 137-148 (1976) Pathologisches Institut der Universitat Freiburg i. Br. (Direktor: Prof. Dr. W. SANDRITTER)

BeeinflussuDg der enchondralen Ossifikation durch Kohlehydratbelastu.Dg Von U. N. RIEDEl), H. BARTL, R. ROHRBACH, C. P. ADLER und W. SANDRITTER Mit einer AbbiJdung (Eingegangen am 21. November 1975) Influence of carbohydrate load on enchondral ossification Key-words: enchondral ossification; cartilage tissue; epiphyseal cartilage; carbohydrate load; skeletal growth; chondrocytes; fructose; glucose; X-ray examination; morphometry; rat

Abstract Pro bl em: Several authors reported disturbances in skeletal growth due to disorders in carbohydrate metabolism. In this study changes in enchondral ossification due to fructose and glu~ose load are to be demonstrated and analyzed by X-ray examination and by light microscopic morphometric analysis. Material and methods a.) Test arrangement For the experiments 21-day-old Wistar rats were used (Ivanovas; Kissleg, Allgau) which were kept in individual caging. Always 5 animals received for nutrition only a 60 %-fructose solution ad libitum over a period of 7, 14 and 33 days, respectively. After 33 days of fructose load 5 anima,ls were refed with Altromin®-standa,rd diet for 21 days. 5 rats were fed a 60 %-glucose solution a,d libitum. To outline the changes induced by malnutrition the following tests were performed: Over a period of 14 days 10 animals were fed a 60 %-fructose solution ad libitum. The average fructose uptake was measured daily. From the ca.!oric value of fructose (3.9 Kca.!/g fructose) the daily caloric inta,ke wa,s calculated. Simultaneously 5 other animals were fed Altromin@-standard diet isoca.!oric to the fructose a,nimals and drinking water ad libitum. Calcula,tion of the caloric inta,ke was based on the average caloric value of Altromin@-standard diet (2.8 Kca,l/g). b) X-ray examination The proximal epiphyseal cartilage of the tibia was radiologically exa,mined under ether anesthesia at 3 days intervals. c) Preparation for light microscopy The proximal tibia.! ends of the left and right hind legs were removed immediately after deca,pita,tion and halved in the sagittal plane; fixation in 1.33 % osmium tetroxide solution + s-collidin buffer; twice rinsing for 15 min with s-collidin huffer; dehydration in ascending alcohol grades and embedding in Epikote 812. The specimens were cut in semithin sections (1 ,urn) by means of a "REICHERT Ultramikrotom Om U2" and stained with toluidine blue. d) Morphometric analysis The light microscopic morphometric evaluation was done at WOO-fold magnification with a 1024 point test screen by a.id of a manual optical image analyzer (MOP, Kontron Mtinchen). From each of the 5 rats from one test group alwa,ys 3 tissue sections of the proximal tibial epiphyseal cartilage were morphometrica.lly ana.lyzed. In each tissue section a.lways 10 subsequent test fields along the epiphyseal demarcation of the proliferative zone and 10 test fields in the zone of the hypertrophic cartilage along the metaphyseal demarcation were analyzed. Consequently, from each experimental group 50 test fields in the proliferative zone and 50 test fields in the zone of hypertrophic cartilage were evaluated. 1) Mit freundlicher Untersttitzllng durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (Az Ri 271/1).

137

These 2 zones of the epiphyseal growth plate were characterized by the following morphometrically definable parameters: number of chondrocyte nuclei per unit volume of cartilage tissue (1 mm 3) N vc Vvc percentage of the volume share of chondrocyte cytoplasm in the unit volume of cartilage tissue average individual volume of cartilage cells (11m3) V veiN vc NCeoLuMN number of cartilage cells (prolif./hypertrophic) per cell column Calculation of the number of chondrocytes per unit volume of cartila,ge tissue (sensu strictiore: number of nuclei per unit volume) was done after the formula, given by WEIBEL et aI. (1966).

N VC

aK

=

11'

N AC 3 . hK

T . y Vvc

Calculation of the qua,ntita.tive distribution factor aK was preceded by calculation of the classes of nuclear size according to the method reported by WICKS ELL (1925). The calculation was done after WEIBEL et al. (1966). The shape factor (J of the cartila,ge cell nuclei (proliferative zone and hypertrophic zone) was calculated individually for each test animal by means of the formula given by LINDBERG et al. (1970). The influence of section thickness was corrected by calculation of the HOLMEs-factor h K (HOLMES 1927). The total amount of chondrocytes (that means: transsected chondrocytes) within one cartilage cell column wa,s counted per test group always in 30 random regions. The cells were differentia,ted in proliferating and hypertrophic chondrocytes after the following criteria: Proliferating chondrocytes (PC): Fla,t or spindle-sha,ped cells with dense cytopla.sm in columnar arrangement Hypertrophic chondrocytes (BC): All roundish or vesicular cells with brightened cytoplasm. In each test animal the width of the epiphyseal growth plate was mea.sured at 15 random spots along the cell columns from the osseous epiphyseal plate up to the last hypertrophic cartilage cell yet not eroded by capillaries. d) Statistica.l analysis The statistical analysis comprehended calculation of the mean value (m) as well as calculation of the standard devia,tion (SD) and of standard error (SE). Significance of the results wa,s determined by va,riance analysis (Student's t-test). All calculations were performed by use of a morphometric programme in an OLIVETTI Computer-set P 652, MLU-600 and Editor 4ST. Results Already after 14 days the rats loaded with fructose or glucose had lost 30 % of their body weight After 7 days of fructose load the X-ray picture show, a markedly smaller epiphyseal cartilage as comparerl to the control animals. After 21 days of glucose load the epiphyseal cartilage is scarcely visible. Following 33 days of fructose load the epiphyseal plate starts opening already after 7 days efeeding with Altromin@-standard diet. Light microscopic morphometric findings (tables 1 and 2) In the proliferative zone the percentage of the cytoplasmic volume share in cartilage tissue is decrea,sing due to fructose and glucose load (p < 0.0005). Restoration was observed after 3 weeks of refeeding (p < 0.0025). The loss is yet more noticeable in the zone of hypertrophic cartilage However, also after 3 weeks of refeeding the per cent volume share of cytoplasm in cartilage tissue remains markedly behind the initial value. The n u m eri c al dens i ty of the proliferating chondrocytes is progressively reduced by fructose load and by isocaloric feeding with Altromin@-standard diet, to a lesser degree also by glucose load. After 21 days of refeeding with Altromin@-standa,rd diet the numerical density of the proliferating chondrocytes reaches nearly the values of the normal control animals. In contrast, the numerical density of hypertrophic chondrocytes is increased already after 7 days of fructose load. The increase continues until the 14th day, but afterwards it remains unchanged up to the 33rd day and does not return to normal values also after 21 days of refeeding (p < 0.05). Following 14 days of glucose load the numerical density of the hypertrophic chondrocytes is markedly increased; only in animals fed Altromin@-standard diet it is markedly reduced when compared with the controls. The average individual volume of the proliferating chondrocytes decreases during 33 days of fructose load (p < 0.0025); restoration was observed after ref~edin~ for 21 days (p < 0.05). Also following 24 days of isocaloric Altromin@-standard diet the prohfera,tm~ chondrocytes. are reduced in their individual number. However, they are larger when compa,red WIth those of ammals loaded with fructose or glucose. The individual volume of the hypertrophic chondrocytes is markedly reduced by fructose or glucose load (p < 0.0005). Following isocaloric feeding of standard diet and after

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refeeding the fructose anima,ls with Altromin ®-sta,ndard diet the hypertrophic chondrocytes are reduced in their individua.\ volume when compared with the controls (p < 0.0025), but they are markedly greater than after pure fructose or glucose diet (p < 0.0025). The total number of proliferating chondrocytes within the whole cartilage cell column is a,ugmented in the course of 33 days fructose load (p < 0.0005) and returns to norma.\ following 21 days refeeding (p < 0.01); contrarily, the amount of hypertrophic chondrocytes is decreasing during fructose load (p < 0.0005). This process is reversible by refeeding (p < 0.025). Following isocaloric Altromin®-standa,rd diet the number of chondrocytes is less drastically changed in the proliferative zone and in the zone of hypertrophic cartilage (p < 0.0005). Following glucose load the cha,nges in number are poor. The width of the epiphyseal growth pla,te is reduced during fructose and glucose load. These changes are less pronounced in the anima.\s fed Altromin®-standard diet. Summarizing it can be said that severe disturbances in skeletal growth are induced in juvenile rats when exclusively fed fructose or glucose for severa,1 subsequent days. The quantita,tive histological architecture is markedly changed. Following load with fructose or glucose the individual volume of the chondrocytes is reduced in the proliferative zone. Simultaneous decrease occurred in the cartilage cell column as well as in the unit volume of cartilage tissue. By this a, reduction of these cytoplasm sha,re occurs in the cartilage tissue. Since the X-ray picture demonstrates marked narrowing of the epiphyseal growth plate at the same time as well as retarda,tion of skeletal growth, it can be concluded tha,t the proliferative metabolism of the chondrocytes is inhibited by uniform load with carbohydra,tes (see RIEDE and ADLER 1974). The morphometric parameters of the hypertrophic chondrocytes a,re more dra,3tica.lly changed than the values of the proliferating chondrocytes. By fructose and glucose load the hypertrophic chondrocytes are reduced in size as well as in their amount within the cartila,ge cell column. These changes of the hypertrophic cartilage by fructose and glucose load a,re supposedly due to disturbed transformation of prolifera.ting cells into hypertrophic chondrocytes thus a.\so producing disorders in the functional metabolism of chondrocytes without impairment of cartilage resorption and mineralization.

Das Skelettwachstum wird durch anabole und katabole Stoffe, sowie durch Mangelernahrung beeinfluBt (Literatur s. RIEDE 1974). So wirken sich auch Eingriffe in den Kohlehydratstoffwechsel auf das Skelettwachstum aus (HIGGINSON 1974, JONES und DEAN 1959, ENWONWU 1973, RIEDE et al. 1973, ROSENBERG und CAPLAN 1974). In der vorliegenden Arbeit wurden juvenile Ratten mit Fruktose und Glukose belastet. Fruktose ruft im Gegensatz zur Glukose eine Verarmung der Zellen an ATP hervor und fiihrt, wenn sie Ratten als einzige Nahrungsquelle wahrend mehreren Tagen angeboten wird, zu einer Glykogenspeicherleber (RIEDE et al. 1975). Die dabei beobachteten Zytoplasmaverauderungen der Leberparenchymzellen gleichen denjenigen bei der Glykogenose Typ I und cerebro-hepatorenalen Syndrom (SPYCHER und GITZELMANN 1969, RIEDE et aI. 1975, GOLDFISCHER et al. 1973, RIEDE et al. 1975). Es war deshalb das Ziel der vorliegenden Arbeit, den EinfluB auf die enchondrale Ossifikation in Fruktose- und Glukosebelastung sowohl rontgenologisch als auch lichtmikroskopisch-morphometrisch zu untersuchen. Dabei zeigte es sich, daB als Folge der Fruktose- und Glukosebelastung ein Minderwuchs resultiert, bei dem der Chondrocytenproliferations- und Funktionsstoffwechsel gestort ist.

Material und Methodik a) Versuchsanordnung Fur die Experimente wurde 21 Tage alte mannliche Wistarratten (Ivanovas; KiBlegg, Allgau) verwendet, die in Einzelkafigen gehalten wurden. Je 5 Tiere erhielten uber einen Zeitraum von 7, 14 und 33 Tagen eine 60%ige FruktoselOsung ad libitum als einzige Nahrung. Nach der 33tagigen Fruktosebelastung wurden 5 Versuchstiere wahrend 21 Tagen mit einer Altromin®-Standa,rddiat wiederaufgefuttert. 5 Ratten erhielten wanrend 14 Tagen eine 60%ige Glukoseliisung ad libitum. Zur Abgrenzung der Veranderungen, die durch Ma,ngelernahrung hervorgerufen werden, wurde folgender Versllch durchgefuhrt: 10 Tiere erhielten wah rend 14 Tagen eine 60%ige Fruktoseliisung ad libitum, wobei taglich die durchschnittliche Fruktoseaufnahme gemessen wurde. Aus dem Kalorienwert von Fruktose (3,9 Kcaljg Fruktose) ergab sich die ta~liche Kalorienaufnahme. Parallel zu diesem Versuch erhielten 5 Tiere taglich, isocalorisch zu den Fruktosetieren, eine Altromin®Standarddiat und Trinkwasser ad libitum. Fur die calorische Umrl:>chnung wurde der durchschnittliche Kaloriengehalt der Altromin®-Standarddiat von 2,8 Kcaljg zugrunde gelegt. Die restlichen 5 Wistarratten dienten a.\s Kontrollen. Sie erhielten wahrend 33 Tagen eine Altromin®-Standarddiii.t und Trinkwa,sser ad libitum.

139

b) Rontgenologische Untersuchung Die proximalen Tibiaepiphysenfugen wurden unter Atherinhalationsnarkose in 3tagigen Abstanden rontgenologisch untersucht. c) Lichtmikroskopische Praparation Entnahme der proximalen Tibiaenden des linken und rechten Beines unmittelbar nach der Dekapitation; Halbierung derselben in der Sagittalebene; Fixation in 1,33%iger OsmiumtetroxidlOsung + s-Collidinpuffer; 2 x 15 Min. Waschen mit s-Collidinpuffer; Entwasserung in aufsteigender Alkoholreihe; anschlieBend Einbettung in Epikote 812. Von den Proben wurden Semidunnschnitte (l.um) mit Hilfe eines "REICHERT- Ultra.mikrotom Omu 2" angefertigt und mit Toluidinblau angefarbt. d) Morphometrische Auswertung Die lichtmikroskopisch-morphometrische Auswertung erfolgte bei 1000facher VergroBerung mit einem 1024-Punkte-Testra.ster unter Zuhilfenahme eines manuell-optischen Bildanalysengerates (MOP, Kontron, Munchen). Von den jeweils 5 Ratten einer Versuchsgruppe wurden pro Tier je 3 Gewebsschnitte der proximalen Tibia,epiphysenfugen morphometrisch analysiert, wobei pro Gewebsschnitt je 10 a.ufeinanderfolgende Testfelder entlang der epiphysaren Begrenzung der Proliferationszone und 10 Testfelder im Blasenknorpel entlang der metaphysaren Begrenzung herangezogen wurden. Pro Versuchsgruppe wurden folglich je 50 Testfelder in der Proliferationszone und 50 Testfelder in der Bla.senknorpelzone analysiert. Diese beiden Zonen der Epiphysenfuge wurden durch folgende morphometrisch bestimmbaren Parameter charakterisiert: Anzahl der Chondrozytenkerne pro Einheitsvolumen Knorpelgewebe (1 mm 3 ) Prozentualer Volumenanteil des Zytoplasmas der Chondrozyten am Einheitsvolumen Knorpelgewebe VvcjN vc Durchschnittliches Einzelvolumen der Chondrozyten (.um3) NCCOLUMN Anzahl der Chondrozyten (prolif.jhypertroph.) pro Knorpelzellsaule Die Berechnung der Chondrozytenza,hl pro Einheitsvolumen Knorpelgewebe (sensu strictiore: Kernanzahl pro Einheitsvolumen) erfolgte nach der von WEIBEL et aI. (1966) angegebenen Formel: Nvc Vvc

N VC

aK

=

1/

N Ac3 . hK

T . VVvc

Der Berechnung des GroBenverteilungsfa.ktors aK ging die Berechnung der KerngroBenklassen na,ch der von WICKS ELL angegebenen Methode (WICKSELL 1925) voraus, und die Berechnung von a K erfolgte na,ch WEIBEL et al. (1966). Der Formfaktor {J der KnorpelzeIlkerne (Proliferationszone und Blasenknorpelzone) wurde na,ch der von LINDBERG et aI. (1970) angegebenen Formel fur jedes Versuchstier getrennt berechnet. Der EinfluB der Schnittdicke wurde durch Berechnung des HOLMESFa,ktors h K korrigiert (HOLMES 1927).' Die totale Anza,hl der Chondrozyten (d. h. Chondrozytenanschnitte) in einer Knorpelzellsaule wurde pro Versuchsgruppe jeweils an 30 zufalligen Stellen ausgezahlt. Die Differenzierung in proliferierende Knorpelzellen und Blasenknorpelzellen erfolgte nach folgenden Kriterien: Proliferierende Knorpelzellen (PC): Platte oder spindelformige zu Saulen angeordnete Zellen mit dichtem Zytoplasma Blasenknorpelzellen (BC): AIle rundlichen und blasenformigen Zellen mit aufgehelltem Zytoplasma. Die Messung der Epiphysenfugenbreite erfolgte pro Versuchsgruppe an 15 zufalligen Stellen entlang der Zellsaulen von der ossaren Epiphysenplatte bis zur letzten intakten, d. h. noch nicht von Kapillaren a.rrodierten Bla,senknorpelzelle. e) Statistische Analyse Die statistische Analyse umfaBte die Mittelwertberechnung (iii) sowie die Berechnung der Standardabweichung (SD) und des Sta.ndardfehlers (SE). Die Signifikanz der Resultate wurde mit einer Varianzana.Iyse (Student-t-Test) ermittelt. AIle Berechnungen erfolgen mit Hilfe eines Morphometrieprogra.mms auf einem OLIVETTI-Mikrocomputer P 652.

Ergebnisse a) Makroskopische Befunde Wahrend normale juvenile Ratten mit einem anfanglichen Korpergewicht von 60 g im Verlaufe von 33 Tagen ihr Korpergewicht etwa verdreifachen, nimmt das Korpergewicht

140

der fruktosebelasteten Tiere urn tiber die HaUte des Ausgangswerts abo Schon nach 14 Tagen betragt der Gewichtsveriust der fruktosebelasteten Tiere etwa 30 %. Dasselbe gilt ftir die mit Glukose belasteten Tiere. Bei den isocalorisch mit Altromin®-Standarddiat ernahrten Tieren sinkt das Korpergewicht innerhalb der ersten Woche um etwa 10 % abo Sie weisen danach einen stetigen Gewichtsanstieg auf und erreichen nach 14 Tagen wieder ihr Anfangsgewicht. Zu diesem Zeitpunkt betragt das Durchschnittsgewicht der mit Fruktose ernahrten Tiere nur noch 75 % des Ausgangswerts. Nach 2ltagiger Wiederaufftitterung mit Altromin®Standarddiat hat sich das Ausgangsgewicht wieder vervierfacht. b) Rontgenologische Befunde (Abb. 1) Die Epiphysenfuge ist im Rontgenbild schon nach 7tagiger Fruktosebelastung wesentlich schmaler als bei den Kontrolltieren. Nach 21 Tagen Fruktosebelastung ist die Epiphysenfuge rontgenologisch kaum noch zu erkennen und scheint geschlossen zu sein. Bei den zu den Fruktosetieren isocalorisch mit Altromin®-Standarddiat geftitterten Tieren ergibt sich nach 14 Tagen keine rontgenologisch faJ3bare Verschmalerung der Epiphysenfuge. Nach 33tagiger Fruktosebelastung beginnt sich bereits nach 7 Tagen Wiederaufftitterung mit Altromin®Standarddiat die Epiphysenfuge zu Offnen. Dieser ProzeJ3 wird im weiteren Verlauf des Versuchs noch deutlicher. c) Lichtmikroskopisch-morphometrische Befunde (Tabelle 1 und 2) Der prozentuale Volumenanteil des Zytoplasmas am Knorpelgewebe sinkt in der Proliferationszone im VerIauf der Fruktose- und Glukosebelastung ab (p < 0,0005) und erholt sich nach 3wochiger Wiederauffii.tterung (p < 0,025). Dieser Volumenzytoplasmaverlust ist bei den isocalorisch mit Altromin®-Standarddiat gehaltenen Tieren nur geringer vorhanden (p < 0,0025). 1m Bereich des Blasenknorpels ist er unter Fruktose- und Glukosebelastung noch deutlicher (p < 0,0005). Der prozentuale Volumenanteil des Zytoplasmas am Knorpelgewebe erreicht auch nach 3wochiger Wiederaufftitterung nicht annahernd den Ausgangswert (p < 0,0005). Die numerische Dichte der proliferierenden Knorpelzellen nimmt im Veriauf der Fruktosebelastung progredient ab (p < 0,0025). Dasselbe gilt fUr die isocalorisch mit Altromin®-Standarddiat geftitterten Tiere (p < 0,025) und im geringeren AusmaJ3 auch ftir die glukosebelasteten Versuchstiere. Nach 21 Tagen Wiederauffiitterung mit Altromin®Standarddiat erreichen die Werte fUr die numerische Dichte der proliferierenden Knorpelzellen nahezu diejenigen der normalen Kontrolltiere. In der Blasenknorpelzone hingegen nimmt die numerische Dichte der Knorpelzellen bereits nach 7 Tagen Fruktosebelastung zu. Nach 14 Tagen ist diese Zunahme noch deutlicher (p < 0,01). Auffalligerweise verandert sich dann die numerische Dichte der Blasenknorpelzellen bis zum 33. Tag nicht mehr und normalisiert sich auch nach 21 Tagen Wiederaufftitterung nicht (p < 0,05). Auch nach 14 Tagen Glukosebelastung ist die numerische Dichte der Blasenknorpelzellen deutlich erhoht (p < 0,0025). Lediglich bei den isocalorisch mit Altromin®-Standarddiat gefiitterten Tieren ist sie im Vergleich zu den Kontrolltieren erniedrigt (p < 0,0005). Das durchschnittliche Einzelvolumen der proliferierenden Knorpelzelle nimmt im VerIauf einer 33tagigen Fruktosebelastung ab (p < 0,025) und erholt sich nach 21 Tagen Wiederaufftitterung (p < 0,05). Auch nach 14tagiger isocalorischer Ernahrung mit Altromin®-Standarddiat sind die proliferierenden Knorpelzellen kleiner als die der Kontrolltiere, jedoch deutlich groJ3er als nach Fruktose- oder Glukosebelll.stung (p < 0,05). Das Einzelvolumen der Blasenknorpelzellen sinkt im VerIauf der Fruktose- (p < 0,0005) und Glukosebelastung (p < 0,0005) drastisch abo Nach isocalorischer Ftitterung mit dem Standardfutter sowie nach Wiederaufftitterung der Fruktose belasteten Tiere mit Altromin®-Standarddiat sind die Blasenknorpelzellen kleiner als die der normalen Kontrolltiere (p < 0,0025), jedoch wesentlich groJ3er als nach reiner Fruktose- und Glukosebelastung (p < 0,0025). Der zahl e n maJ3i g e An teil der proliferierenden Knorpelzellen an der gesamten Knorpelzellsaule wird im VerIauf der 33tagigen Fruktosebelastung groJ3er (p < 0,0005) und normalisiert sich nach 21 Tagen Wiederaufftitterung (p < 0,01). Dagegen fallt der zahlenmaJ3ige

141

a

b

c

d

e

f

9

h

Abb. 1a,. Epiphysenfuge einer 5 Woehen alten unbehandelten mannlichen Wistarra.tte, gefiittert mit Altromin®-Standardfutter ad libitum. Abb.1b. Epiphysenfuge einer unbehandelten 6 Woehen alten mannliehen Wistarra.tte (dasselhe Tier wie in Abb. la). Abb.1e. Epiphysenfuge einer 9 Woehen alten unbehandelten Wistarratte (dasselbe Tier wie in Abb.l a). Abb. 1 d. Epiphysenfuge einer 6 Wochen alten Wistarratte naeh 7tagiger Fruktosebelastung.

142

Tabelle 1. l\forphometrische Daten Table 1. Morphometric Data (for explanation of words see below) Altromin isocal. 14d

Kontrollen SD

J\Iittelwert

SD

1,12

0,117

0,20

0,020

28,13 9,60

1,535 0,273

13,21 4,13

2,249 1,008

Mittelwert Epiphysenfugenbreite (mm) Chondrozytenza,hl pro Zellsaule: prolif. Chondrozyten Blasenknorpelzellen

FruktQse 14d

Glukose 14d Epiphysenfugenbreite (mm) Chondrozytenzahl pro Zellsaule: prolif. Chondrozyten Bla,senknorpelzellen

0,14

0,020

0,12

0,017

13,63 3,57

2,684 0,935

8,53 0,87

2,300 0,793

Fruktose 7d Epiphysenfugenbreite (mm) Chondrozytenzahl pro Zellsaule: prolif. Chondrozyten Blasenknorpelzellen

Fruktose 33d

0,18

0,013

0,082

0,013

13,23 3,13

2,58 0,899

7,67 0,58

2,72 0,523

Fruktose 33d + Wiederauffiitterung Epiphysenfugenbreite (mm) Chondrozytenza,hl pro Zellsau Ie: prolif. Chondrozyten Blasen knorpelzellen

0,42

0,035

19,20 7,65

2,067 1,039

Explanation of words: Mittelwert = mean value; Kontrollen = controls; Epiphysenfugenbreite = width of the epiphyseal cartila,ge; Chondrozytenzahl pro Zellsaule = number of chondrocytes per cell eolumn; prolif. Chondrozyten = proliferating ehondrocytes; Blasenknorpelzellen = hypertrophic chondrocytes; Wiederauffiitterung = refeeding; l\forphometrische Symbole = morphometric symbols.

Abb.le. Epiphysenfuge einer 6 Wochen alten Wistarratte nach 14tagiger Fruktosebelastung (da,sselbe Tier wie in Abb. Id). Abb. If. Epiphysenfuge einer 7 Wochen alten Wistarra.tte nach 33tagiger Fruktosebelastung (dasselbe Tier wie in Abb. Id). Abb.lg. Epiphysenfuge einer 6 Wochen alten Wistarmtte nach 14tii.giger Glukosebelastung. Abb.lh. Epiphysenfuge einer 6 Worhen alten Wista.rra,tte nach Verfiitterung der Altromin@Standarddiat isocalorisch zur durchschnittlich auf~enommenen Fruktosemenge. Abb. Ii. Epiphysenfuge einer 12 Wochen alten Wistarratte nach 33tii.giger Fruktosebelastung und anschlieLlend 3wochiger Wiederauffiitterung mit Altrominl!>-Standardfutter ad libitum (dasselbe Tier wie in Abb. If). Beachte, wie sich die Epiphysenfuge in Abb. If, naeh 33tagiger Fruktosebelastung beinahe geschlossen, wieder uffnet. Fig. 1 a. Epiphysea.! cartilage of a 5-week-old untreated ma.!e Wistar mt fed with Altromin@ standard diet ad libitum. Fig. 1 b. Epiphyseal cartilage of an untreated G-week-old male wistar rat (the same animal as in fig. la). Fig. 1 r. Epiphyseal cartilage of an untreated 9-week-old Wistar rat (the same animal as in fig. 1 a). Fig. 1 d. Epiphyseal cartilage of a 6-week-old Wistar rat after 7 days of fructose load. Fig. 1 e. Epiphyseal cartilage of a 6-week-old Wistar rat after 14 days of fructose load (the same anima.! as in fig. 1 d). Fig. If. Epiphysea.! cartilage of a 6-week-old Wistar rat after 33 days of glucose load. Fig. 1g. Epiphyseal cartilage of a 6-week-old Wistar rat after 14 da,ys of glucose load. Fig. 1 h. Epiphyseal cartilage of a 6-week-old Wistar rat after feeding with Altromin® sta,ndard diet isoea.!oric to the average fructose uptake. Fig. Ii. Epiphyseal cartilage of a 12-week-old Wista,r mt after 33 days of fructose load and afterwards 3 weeks of refeeding with Altrominl!> standard diet ad libitum (the same animal as in fig. If). Note opening of the epiphysea.l ca,rtilage which was nearly closed after 33 days of fructose load.

143

Tabelle 2 a. Morphometrische Daten Table 2 a. Morphometric Data (for explanation of words see table 1) Morphometrische Symbole

Kontrollen

Altromin isocal. 14d

Mittelwert

SD

Mittelwert

SD

Nvpc Vvpc (%) VvpcjN VPC (Iim 3) NVBC VVBC (%) VvBcjN VBC (Iim 3)

275'200 25,2 915 76'850 91,7 11'930

10'200 0,5 20,5 350 0,2 70

217'350 17,4 805 54'800 48,5 8'850

16'450 0,2 105 3050

N vpc VVPC (%) VvpcjN VPC (Iim 3) NVBC VVBC (%) VvBcjN VBC (Iim 3)

253'650 14,1 600 154'550 19,1 1'250

42'450 0,4 120 23'200 1,4 220

212'950 15,1 712 118'020 21,0 1'840

24'150 0,6 80 25'250 6,1 850

Fruktose 33d 160'020 26'950 9,5 1,6 595 60 115'100 21'125 15,2 2,1 1'330 75

Glukose 14d

217'400 16,5 765 91'150 39,0 4'450

680

Fruktose 14d

Fruktose 7d Nvpc Vvpc (%) VvpcjN VPC (pm3 ) N VBC VVBC (%) VvBcjN VBC (Iim 3)

a,3

23'400 1,3 80 22'500 4,7 595

Tabelle 2b. Morphometrische Daten Table 2b. Morphometric Data (for explana,tion of words see table 1) Morphometrische Symbole

Fruktose 33d + Wiederauffiitterung Mittelwert SD

N vpc Vvpc (%) VvpcjN VPC (Iim 3) N VBC VVBC (%) VvBcjN VBC (Iim 3)

270'150 21,5 795 111'350 45,3 4'550

Nvpc

NVBC

VVBC

VvpcjN vpc VVBcjNvBC

144

7'700 1,5 80 21'950 31

h75

Anzahl der proliferierenden Chondrozytenkerne pro Einheitsvolumen Knorpelgewebe (1Iim3) Number of nuclei of proliferating chondrocytes per unit volume of cartilage tissue (1Ii m3 ) Anzahl der Blasenknorpelzellkerne pro Einheitsvolumen Knorpelgewebe (1Iim3) Number of nuclei of hypertrophic chondrocytes per unit volume of cartilage tissue (1Iim3) Prozentua.ler Volumenanteil des Zytoplasmas der proliferierenden Chondrozyten am Einheitsvolumen Knorpelgewebe Per cent volume of the cytoplasm of proliferating chondrocytes within the unit volume of cartilage tissue Prozentua.ler Volumenanteil des Zytoplasmas der Blasenknorpelzellen am Einheitsvolumen Knorpelgewebe Per cent volume of the cytoplasm of hypertrophic chondrocytes within the unit volume of cartilage tissue Durchschnittliches Einzelvolumen der proliferierenden Chondrozyten (Iim 3) Average individual volume of proliferating chondrocytes (Iim 3) Durchschnittliches Einzelvolumen der Blasenknorpelzellen (Iim 3) Average individual volume of hypertrophic chondrocytes (Iim 3)

Anteil der B1asenknorpelzellen an der gesamten Knorpelzellsaule im Verlauf der Fruktosebelastung ab (p < 0,0005). Dieser Vorgang erweist sich nach Wiederauffiitterung als reversibel (p < 0,025). Der zahlenmaBige Anteil der Knorpelzellen in der Proliferations- und B1asenknorpelzone verandert sich bei den isocalorisch mit Altromin®-Standarddiat ernahrten Tieren weniger drastisch (p < 0,0005) und ist nach Glukosebelastung nur geringfUgig ausgebildet (p < 0,0005). Die Epiphysenfugenbreite nimmt im VerI auf der Fruktose- (p < 0,0005) und Glukosebelastung (p < 0,0005) ab und erholt sich nach Wiederauffiitterung (p < 0,0025). Bei den isocalorisch mit Altromin®-Standarddiat gehaltenen Tieren ist die Verschmalerung der Epiphysenfuge weniger stark ausgepragt (p < 0,0005).

Diskussion Fruktose und Glukose, als alleinige Nahrungsquelle iiber mehrere Tage angeboten, rufen bei juvenilen Ratten eine schwere Storung des Skelettwachstums hervor, wobei die quantitative Histoarchitektur in der Epiphysenfuge tiefgreifend umgestaltet wird. Die ChondrozytengroBe wird im Verlaufe der Fruktose- und Glukosebelastung in der Proliferationszone reduziert. Gleichzeitig nimmt die Zahl der proliferierenden Knorpelzellen, sowohl bezogen auf die Knorpelzellsaule als auch im Einheitsvolumen Knorpelgewebe, abo Dadurch wird auch der Zytoplasmaanteil am Knorpelgewebe verringert. Da gleichzeitig im Rontgenbild die Epiphysenfugen augenfallig verschmalert sind und das Skelettwachstum sistiert, ist der SchluB berechtigt, durch eine einseitige Kohlehydratbelastung werde der chondrozytare Proliferationsstoffwechsel gedrosselt (vgl. RIEDE und ADLER 1974). Die morphometrischen Parameter der Blasenknorpelzellen verandern sich drastischer als die Werte der proliferierenden Knorpelzellen. Die Blasenknorpelzellen werden durch die Fruktose- und Glukosebelastung kleiner, und ihre Anzahl nimmt pro Knorpelzellsaule abo Diese Umgliederung des Blasenknorpels durch die Fruktose- und Glukosebelastung beruht vermutlich auf einer gestorten Umwandlung der proliferierenden Zellen in B1asenknorpelzellen, so daB auch der Funktionsstoffwechsel der Chondrozyten ohne Beeintrachtigung der Knorpelresorption und Knorpelmineralisation gestort ist. Diese SchluBfolgerung wird durch folgende Tatsachen unterstiitzt:

1. Die Blasenknorpelzellen verringern ihr Volumen nach Fruktose- und Glukosebelastung wesentlich starker als die proliferierenden Knorpelzellen. 2. Die Anzahl der Blasenknorpelzellen nimmt innerhalb einer Knorpelzellsaule wahrend der Fruktosebelastung progredient starker ab als die Anzahl der proliferierenden Chondrozyten. 3. In der Leber ist nach einer 3wochigen Fruktosebelastung das gesamte Ergastoplasma in den drastisch verkleinerten Leberparenchymzeilen urn iiber zwei Drittel reduziert (RIEDE et al. 1975, RIEDE, unpubliziert). Dasselbe gilt fUr die Leberzelle nach Orotsaureverabreichung (RIEDE et al. 1971). Auch bei einer Vitamin-C-Hypovitaminose wird in den Knorpelzellen das Ergastoplasma reduziert, und die Epiphysenfugen sind bei gleichzeitiger Reduktion der proliferierenden Chondrozyten auffallig verschmalert (GEILER und STRAUCH 1962, THYBERG et al. 1971). Die beobachteten Veranderungen der Epiphysenfugen stehen mit einem gestOrten Proliferations- und Funktionsstoffwechsel und folglich auch einer gestOrten Kollagen- und Proteoglykansynthese in Zusammenhang. Dafur spricht auch die Tatsache, daB die juxtametaphysare Knorpelmatrix verdichtet ist und in atypischer Weise native Kollagenfibrillen enthalt (RIEDE und ADLER 1974). Als formale Pathogenese (vgl. RIEDE 1974) sind folgende Prozesse in Betracht zu ziehen:

1. Reduzierte Proliferationsrate der Chondrozyten bei gestorter Umwandlung von proliferierenden Knorpelzellen in Blasenknorpelzellen bei normaler Knorpelresorption. Dies trifft fur die ersten Tage der Fruktose- und G1ukosebelastung zu und geht spater iiber in eine 2. blockierte Knorpelzellreifung bei reduzierter Knorpelresorption. 10 Exp. Path. Bd. 12

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Eine ahnliche formale Pathogenese ist auch fiir die folgenden experimentellen Stoffwechseleingriffe typisch: Proteinmangel (HERRMANN 1965, IRA et al. 1968). Proteinsynthesehemmung (ENGFELDT 1968, HULTR und LINDBERG 1968). Rontgenbestrahlung (KLEIN-SZANTO und CABRINI 1974, SIMMONS et al. 1971). Dextransulfatbelastung (ELLIS 1965). Hypophysektomie (THORNGREN et aJ. 1973, THORNGREN und HANNSON 1973, TOURTELLOTTE und DZIEWIATKOWSKI 1965). 6. Uramische Epiphyseopathie (KREMPIEN et al. 1974). 7. Experimentelle Epiphyseolyse (RIEDE et aJ. 1975).

1. 2. 3. 4. 5.

Klinisch charakterisiert dieses histologische Bild der durch Kohlehydratbelastung induzierten Epiphysenfugenveranderung die Achondroplasie (PONSETI 1970, MEYNHARD et al. 1974) und die Chondrodystrophie (FORD et al. 1968, COOPER und PONSETI 1971, HUNT et al. 1967, ZIEGLER und CONTER 1973). Die kausale Pathogenese des durch die Fruktose- und Glukosebelastung hervorgerufenen Zwergwuchses laJ3t sich aus diesen quantitativen morphologischen Untersuchungen nicht vollstandig abklaren. Unterernahrung reduziert die ZellgroBe und die Zellpopulation durch Blockierung der Zellteilungsvorgange. Gehauft auftretende Zellnekrosen und eine Veranderung des Zellstoffwechsels sind dabei typische Begleiterscheinungen (DEARDEN und MOSIER 1974). Auch in der Epiphyse lassen sich diese Prozesse verfolgen. Das lineare Wachstum der Tibia sistiert und die Epiphysenfuge wird schmaler (DEARDEN und MOSIER 1974). Da im Vergleich zu einer 5tagigen absoluten Hungerperiode (= maximale Hungerzeit bei juvenilen Ratten) die Fruktose- und Glukosebelastung eine tiefgreifendere Umstellung der quantitativen Histoarchitektur der Epiphysenfuge bewirken, scheint die Unterernahrung allein (BOTH und SCHMALZ 1970, PLIESS 1974, DEARDEN und MOSIER 1974) nicht fiir die beobachteten Skelettwachstumsstorung verantwortlich zu sein. Dies wird auch durch die morphometrischen Befunde der isocalorisch mit Altromin®-Standardfutter ernahrten Tiere im Vergleich zu den Fruktosetieren bestatigt. Der durch Fruktose und Glukose induzierte Zwergwuchs ist am ehesten mit Skelettwachstumsstorungen zu vergleichen, wie sie in der Humanpathologie beim Kwashiorkor (HIGGINSON 1974, JONES und DEA 1959) und beim hepatischen Zwergwuchs (PLIESS 1974) beschrieben werden. Bei der Ratte sind aber 6-7 Wochen notwendig (ENWONWU 1973), urn mit einer Proteinmangeldiat vergleichbare Veranderungen hervorzurufen, wie sie durch die Fruktose- und Glukosebelastung bereits nach 2 Wochen auftreten. Zusammen mit der Tatsache, daB bei der Ratte durch die Fruktose- und Glukosebelastung eine massive Glykogenspeicherleber erzeugt wird (RIEDE et al. 1975), ist die Uberlegung zulassig, die vorliegende fruktose- und glukoseinduzierte Skelettwachstumsstorung beruhe auf einem hepatischen Minderwuchs (vgl. PLIESS 1974). Der hepatische Minderwuchs begleitet llamlich Speicherlebern, die bei Glykogenosen, Galaktosamie, Morbus Gaucher und bei der sekundaren Glykogenose im Verlaufe des friihkindlichen Diabetes mellitus beobachtet werden (PLIESS 1974). Moglicherweise wirkt sich der Verlust an energiereichen Substraten, wie er durch die Fruktosebelastung hervorgerufen wird (GOLDBLATT et al. 1970) auf den chondrozytaren Stoffwechsel aus (vgl. ROSENBERG und CAPLAN 1974), so daB das Skelettwachstum verlangsamt wird. Hervorzuheben ist auBerdem die Tatsache, daB sich die quantitative Zytoarchitektur der Leberzelle nach 2tagiger Wiederauffiitterung mit Altromin®-Standarddiat beinahe wieder normalisiert hat (AUGUSTIN 1975). Fur die Wiederherstellung der Histoarchitektur des Wachstumsknorpels sind dagegen mehr als 3 Wochen notig. Die vorliegenden Untersuchungen zeigen, daB sich die Storungen im Intermediarstoffwechsel auch an der Morphologie der Epiphysenfuge widerspiegeln und daB. diese Veranderungen noch lange nach Erholung der Stoffwechselsituation zu erkennen sind (KITANO 1971, LITTLE 1973, GRESSMANN 1974, MILGRAN und SALYER 1974). 146

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