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Über das Verhalten der Triosephosphat-Dehydrogenasen in Wurzeln
r Flora, Abt. A, Bd. 157, S. 80-91 (196fi) Aus dem Institut mr Allgemeine Botanik der Universitat Halle
tiber das Verhalten der Triosephosphat-Dehydrogenasen in Wurzeln Von MONICA-PETRA LIEDTKE und ERICH
OHMAN~
Mit 5 Abbildungen im Text (Eingegangen am 26. April 1966)
I. Einleitung Der bei der Triosephosphat-Dehydrogenierullg: 3-Phosphoglyzerillaldehyd
+ PN ox + P a
---*
1,3-Diphosphoglyzerillsaure
+
PN red
dem Substrat elltnommene Wasserstoff kann entweder auf NAD oder auf NADP iibertragen werden. Es existieren ~omit zwei Triosephosphat-Dehydrogenasen, die je nach dem Transportmetaboliten, der durch sie hydriert wird, als NAD- bzw. als NADP-abhangige Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase [systematische N amen: D-Glyzerinaldehyd-3-phosphat: NAD-Oxydoreduktase (phosphorylierend), E. C. 1. 2. 1. 12 und D-Glyzerinaldehyd-3-phosphat: NADP-Oxydoreduktase (phosphorylierend), E. C. 1. 2. 1. 13] bezeichnet werden. Die NAD-abhangige Triosephosphat-Dehydrogenase ist sowohl in farblosen als auch in griinen pflanzlichen Geweben zu finden. Sie steht im Dienste der Glykolyse und wird als vorwiegend im Zytoplasma wirkend angenommen. Die Reduktion der Phosphoglyzerinsaure zum Aldehyd im Proze£ der photosynthetischen CO 2 - Fixierung wird spezifisch bei allen hoheren Pflanzen und Algen, die bisher daraufhin untersucht worden sind, von der NADP-abhangigen Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogellase katalysiert (ARNON 1952, GIBBS 1952). Wie aIle anderen Enzyme des Photosynthesegeschehens ist auch die NADP-abhangige Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase im Chloroplasten lokalisiert (ROSENBERG und ARNOX 1955, WHATLEY et al. 1956, HEBER et al. 1963). Die experimenteIlen Daten von BRA'YER:lIA2'l' und KONIGSBERG (1960), die das Enzym in der lOslichen Zytoplasmafraktion von Eltglena gracilis nachwiesen, sind wohl am besten Verwendete Abklirzungen: P~ox, PN red = oxydiertes bzw. reduziertes Pyridinnukleotid; NAD = Nikotinsaureamid-adenin-dinukleotid; NADP = Nikotinsiiureamid-adenin-dinukleotidphosphat; FDP = Fruktose-1,6-diphosphat; F-6-P = Fruktose-6-phosphat; G-6-P = GlukoseG-phosphat; P a = Orthophosphat; EDTA = Athylendiamintetraessigsaure.
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im Sinne einer Auswaschung des Enzyms aus den Chloroplasten wahrend des Fraktionierungsprozesses zu interpretieren. Es ist bekannt, daf3 bei einer waf3rigen Zellfraktionierung, deren sich die Autoren bedienten, besonders die Chloroplasten einen starken Proteinverlust erleiden (SMILLIE 1963). Zunachst wurde die NADP-abhangige Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase ausschlief3lich in photosynthetisch aktiven pflanzlichen Geweben gefunden, wobei sich die Untersuchungen an hoheren Pflanzen nur auf das Blatt und den Sprof3 beschrankten. Dabei lief3 sich immer wieder feststellen, daf3 bei allen Organism en, die das NADP-Enzym potenziell synthetisieren konnen, das Auftreten der Enzymaktivitat erst unter dem Einfluf3 der Belichtung und zeitlich gekoppelt mit der Chlorophyllsynthese erfolgt. Diese Untersuchungen erweckten den Anschein, daf3 der photosynthetische Apparat immer nur in seiner Gesamtheit von Enzymen und Strukturelementen einschlief3lich der Farbstoffe induziert werden kann. Die Entdeckung, daB einige chlorophyllfreie Albinomutanten einer Gerstensorte die NADP-abhangige Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase in relativ hoher spezifischer Aktivitat enthalten, lief3 hingegen deutlich werden, daf3 der Besitz von Chlorophyll keine unbedingt notwendige Voraussetzung fUr das Enzym ist (FULLER und GIBBS 1959). Wurzeln zeigen gegeniiber den Geweben des Sprosses mancherlei Besonderheiten. So sind sie bevorzugt zu bestimmten Syntheseleistungen befahigt (MoTHEs 1955) und zeigen eine intensive aerobe Garung (RUHLAND und RAMSHORN 1938). In der Regel sind sie farblos und haben fUr die Photosynthese keine Bedeutung. In einer Reihe von Fallen sind sie aber in der Lage, im Licht zu ergriinen. Sie vermogen dann auch photosynthetisch CO 2 zu fixieren (FADEEL 1963). Inwieweit die Induktion der dazu notigen Enzyme konform mit der Chlorophyllsynthese erfolgt, ist nicht naher bekannt. Von der Glykolsaureoxydase weif3 man, daf3 sie in Wurzeln nur im Licht synthetisiert wird (MoTHEs et al. 1956). Es erschien daher von Interesse, das Verhalten der NADP-abhangigen Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase in einigen Wurzeln unter verschiedenen Bedingungen niiher zu untersuchen. II. Experimenteller Teil A. Material Die Versuche wurden durchgefiihrt an isolierten Wurzeln von Pisum sativum "Friihe Harzerin" und Triticum aestivum, sowie am Wurzelteil von Citrus aurantium maxima und Ipomoea rubro coefulea. 1. Pisum sativum "Friihe Harzerin":
Die Erbsen wurden 6 Minuten in 1 % Bromwasser (Gewichtsprozent) sterilisiert, viermal mit keimfreiem, dreifaeh destilliertem Wasser gewasehen und in Petrisehalen auf feuehtem FlieBpapier bei 27°C im Dunkeln zum Keimen ausgelegt. Naeh 3 Tagen trennten wir unter sterilen Bedingungen die Spitzen der entstandenen Keimwurzeln in einer Lange von 0,5 bis 1 em ab und iibertrugen 6 Flora, Aht. A, Bd. 157.
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sie auf eine Nahrliisung nach ROBBINS und SCHMIDT (GA UTIIERET 1942). Dabei ist zu beacht,en, daB die Wurzelspitzen auf dl1f Niihrliisung schwimmen, untergetauchte Wurzeln miissen 'lorn Versuch ausgeschieden werden. Ein Teil der Kulturen wurde bei 25 DC in Dunkelheit gehalten, der Rest bei gleicher Temperatur einer Beleuchtung von 12500 Lux ausgesetzt. 1m Abstand von zwei Tagen entnahmen wir sowohl den Lieht- als aueh Dunkelkulturen Proben und ermittelten Enzymaktivitaten und Chlorophyllgehalt. 2. Triticum aestivum: Die Sterilisation der Weizenkiirner und die Zusammensetzung der fUr die Wurzelkultur beniitigten Nahrliisungen folgte den Angaben von FAD EEL (1963). Wie bei Pisum sativum wurde ein Teil der Kulturen im Licht gezogen, der Rest im Dunkeln. Nach 10 bis 12 Tagen ermittelten wir Enzym- und Chlorophyllgehalt.
3. Citrus aurantium maxima: In diesem Falle wurde auf eine besondere Sterilisation der Samen verzichtet. Wir entfernten unter aseptischen Bedingungen die Testa und brachten die Embryonen in keimfreien Petrisehalen auf feuehtem FlieBpapier bei 27DC im Dunkeln zum Wachstum. Nachdem die Keimlinge eine Lange von 3 bis 4 cm erreicht hatten, lieBen wir ihre Wurzeln in eine Nahrliisung nach ZINZADZE eintauchen, wiihrend der SproBteil einer intensiven Beleuchtung ausgesetzt wurde. Bei einem Teil der Pflanzen wurde auch der sich in der Nahrliisung befindliehe Wurzelteil belichtet, bei dem Rest durch eine schwarze Papiermanschette abgedunkelt. Die Wurzeln wachsen rasch und zeigen im Licht schon naeh wenigen Tagen eine reichliche Chlorophyllbildung. 4. Ipomoea rubro coemlea ; Die Ipomoea-Samen wurden zunachst kurz in 96 % Athanol getaucht, urn die Benetzbarkeit ihrer rauhen Oberflaehe zu erhiihen. Dann sterilisierten wir sie 8 Minuten in 1 % Bromwasser, spiilten viermal mit keimfreien, dreifach destilliertem Wasser und legten die Samen auf feuehtem FlieBpapier bei 27 DC zum Keimen aus. Ais Keimwurzeln und Primarblatter hervorgebrochen waren, wurden die kleinen Pflanzchen in Fernbaeh-Kolben auf die Oberfliiche einer Whitesehen Niihrliisung (WHITE 1943) iibertragen. Wiederum wurde ein Teil im Licht, der Rest im Dunkeln kultiviert. ::\ach 14 Tagen hat sieh ein reich verzweigtes Wurzelsystem gebildet, das d,wn auf Chlorophyllgehalt und Enzymaktivitiit untersucht werden kann.
B. Methodik 1. Aufbereitung des Versuchsmaterials zum zellfreien Extrakt:
Zur Gewinnung des fiir den optischen Test notwendigen zellfreien Extraktes hat sich das Zerreiben des Wurzelmaterials mit Trispuffer als vorteilhaft erwiesen. 1m einzelnen wurde folgendermaBen verfahren: Wir zerrieben das zu untersuchende Objekt im Kiihlraum (+2 DC) mit einer Mischung aus 0,05 M Trispuffer pH 7,8; 0,002 M EDTA und 0,002 ~12-Mereaptoiithanol. Danach wurde 20Minuten bei 20000 x g und + 2 DC zentrifugiert und der Uberstand zu den Enzymmessungen benutzt. 2. Bestimmungen der Enzymaktivitaten: a) Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenasen [D-Glyzerinaldehyd-3-phosphat: NADOxydoreduktase (phosphorylierend), E. C. 1. 2. 1. 12 und D-Glyzerinaldehyd-3-phosphat-NADPOxydoreduktase (phosphorylierend), E. C. 1. 2. 1. 13]:
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Die Aktivitiitsbestimmung der Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenasen erfolgte im optischen Arsenattest nach WARBURG (WARBURG et al. 1935). Die physiologische Reaktion der Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenasen besteht in einer oxydativen Umsetzung von 3-Phosphoglyzerinaldehyd zu 1,3-Diphosphoglyzerinsaure unter Aufnahme von Orthophosphat. Ersetzt man das Orthophosphat durch Arsenat, so wird an Stelle der 1,3-Diphosphoglyzerinsaure mit einer in Position 3 energiereich gebundenen Phosphatgruppe eine sehr instabile Arsenatverbindung gebildet, die spontan zerfallt. Es entstehen 1-Phosphoglyzerinsiiure und Arsenat. Die Rolle des Arsenats besteht also darin, das dehydrierte Reaktionsprodukt stets aus dem Gleichgewicht zu entfernen, so daB der U msatz des Substrates quantitativ erfolgt. Der Phosphoglyzerinaldehyd wurde in einer vorgeschalteten Hilfsreaktion durch Spaltung von Fruktose-1,6-diphosphat mit Aldolase erhalten. Zur Duchfiihrung des Testes werden in der angegebenen Reihenfolge in eine Kiivette, d = 1 cm, folgende Komponenten pipettiert: 2 ml H 20; 0,15 mIl M Tris- HCI pH 8,5; 0,3 m10,11VI Na-arsenat; 0,5 ml zellfreier Extrakt; 0,02 ml einer 0,05 M Lasung von NAD bzw. NADP; 0,01 ml Aldolase (Kristallsuspension); 0,05 ml 0,1 M Na-FDP. Die Reaktion wird gestartet durch Zugabe der FDP-Lasung. Der Anstieg der Extinktion wird im Photometer Eppendorf bei 366 nm und Zimmertemperatur gemessen; er erfolgt iiber mehrere Minuten linear (Abb. 3). Die durch Messung der NADH 2- bzw. NADPH 2-Absorption ermittelten Ergebnisse sind auf der Basis eines Extinktionskoeffizienten fiir die reduzierten Pyridinnukleotide von E 3 • 6 = 3,3· 10 6 (cm2/Mol) errechnct worden (BERGMEYER 19(2). Als Enzymeinheit (E) wurde die Menge Enzym definiert, die in 1 Minute bei 25°C 1 f,tMol Substrat umsetzt. 1 mE = 1 E . 10- 3 • Die spezifische Aktivitat wurde als Enzymeinheit pro mg Protein ausgedriickt (COOPER et al. 1958). b) Alkalische FDP-ase (D-Fruktose-1,6-diphosphat-1-phosphohydrolase, E. C. 3. 1. 3. 11): Die Bestimmung dieses Enzyms erfolgte in Anlehnung an die Methode von SCHROEDER und RACKER (1964) durch Erfassung des aus FDP freigesetzten Orthophosphates. Dabei wurde folgendermaBen verfahren: Wir inkubierten eine geeignete :!Ylenge des zellfreien Extraktes mit folgenden Zusiitzen: 0,1 mIl M Tris-HCI pH 8,5; 0,05 ml 0,1 M FDP; 0,1 m10,02 M Na-ED'l'A; 0,05 mlO,l M Magnesiumchlorid und Wasser bis auf ein Gesamtvolumen von 1 m!. Die Inkubationsdauer betrug 20 Minuten. Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 mIlO % Trichloressigsaure abgestoppt, das ausgeflockte EiweiB abzentrifugiert und im Uberstand Phosphat nach der von SCHLEGEL (1954) modifizierten :Methode von MARTLAND und ROBINSON (1926) bestimmt. c) Hexosephosphat-Isomerase (D-Glukose-6-phosphat-Ketolisomerase, E. C. 5. 3. 1. 9): Nach einer von DELBRUCK et al. (1959) beschriebenen Methode wurde das Enzym im optischen Test bei 366 nm im Photometer Eppendorf in folgendem 2-ml-Ansatz getestet: 50 mM Trispuffer pH 7,4; 5 mM Magnesiumchlorid; 0,25 mM NADP; 0,6 mM F-6-P; 0,02 ml Glukose-6-phosphatDehydrogenase (Boehringer) und zellfreier Extrakt. d) Glukose-G-phosphat-Dehydrogenase (D-Glukose-6-phosphat: N ADP-Oxydore duktase, E. C. 1. 1. 1. 49): Die Bestimmung erfolgte in Anlehnung an die von PFLEIDERER (1964) und von DELBRUCK et al. (1959) beschriebenen Verfahren in einem 2-ml-Ansatz folgender Zusammensetzung: 50 mM Trispuffer pH 7,4; 5 mM EDTA; 5 mM Magnesiumchlorid; 0,25 mlli NADP; 2 mM G-6-P und zellfreier Extrakt. Die Messung erfolgte im Photometer Eppendorf bei 366 nm. 6*
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3. Proteinbestimmung: Der fiir die Ennittlung der spezifisehen Aktivitat erforderliche Proteingehalt des zellfreien Extraktes wurde nach der Methode von LOWRY et al. (1951) bestimmt. Krist. Rinderserumalbumin diente als Standard. Urn eine Kontrolle iiber den GesamteiweiBgehalt wahrend verschiedener Entwicklungsstadien der Wurzeln zu haben, wurde in Abstanden von 2 Tagen jeweils eine Licht- und Dunkelprobe der Stickstoffbestimmung nach KJELDAITL unterworfen. 4. Chlorophyllbestimmung: Parallel zu den EiweiBbestimmungen wurde der Chlorophyllgehalt der Wurzeln ermittelt. Dazu wurden die Kulturen geteilt. Der eine Anteil wurde wie beschrieben zu den enzymatischen Bestimmungen aufgearbeitet; mit dem anderen Anteil bestimmten wir den Chlorophyllgehalt nach folgender Methode: Die Proben wurden mit Azeton (Endkonzentration 80 %) im Morser zerrieben, quantitativ durch einen Biichner-Trichter abgesaugt, der ein getrocknetes, ausgewogenes Filter enthielt. Es wurde mehrfach nachgewaschen und der gesamte Durchlauf mit 80% Azeton auf ein passendes Volumen aufgefiillt und sofort im Spektralphotometer VS U 1 (Zeiss, J en a) bei den beiden Wellenlangen 663 nm und 645 nm die Extinktion gemessen. Die Berechnung der Chlorophyllmenge erfolgte nach der von ARNON angegebenen Formel (ARNON 1949). Der Riickstand wurde zusammen mit dem Filter bis zur Gewichtskonstanz getrocknet und zur Ermittlung des Trockengewichtes erneut gewogen. Tabelle 1 Aktivitaten der NAD-abhangigen und NADP-abhangigen GlyzerinaldehydphosphatDehydrogenase bei verschiedenen Wurzeln
Objekt
Pisum satit·um Triticum aestirum Citrus aurantium maxima Ipomoea rubro coerulea
Lichtkultur Dunkelkultur Lichtkultur Dunkelkultur Lichtkultur Dunkelkultur Lichtkultur Dunkelkultur
Chlorophyll mgjgjTrockengewicht
Spezifische Aktivitat NAD-Enzym
NADP-Enzym
0,59
164 mE 192 mE 185 mE 195 mE 150 mE 172 mE 128 mE 132 mE
18 mE
0,19 0,51 0,48
16 mE 29 mE lmE 31 mE
III. Ergebnisse und Diskussion
Da die Bezugsgro13e fUr die Ermittlung der spezifischen Aktivitaten der Enzyme jeweils der Proteingehalt ist, war die Frage zu klaren, ob dieser Proteingehalt wahrend der Lichtinduktion bemerkenswerten Veranderungen unterworfen ist. Ein Aus-
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Abb.1. Proteingehalt isolierter Wurzeln von Pisum sativum bei Anzucht im Licht 0 - - 0 und im Dunkeln . - -•.
druck dafiir ist das Verhaltnis Protein/Frischgewicht. Dieses Verhaltnis nimmt von Beginn der fibertragung der jungen Wurzelspitzen auf die Nahrlosung laufend ab (Abb. 1). Dabei verhalten sich die im Licht und im Dunkeln angezogenen Kulturen im Prinzip gleich, nur liegt der auf das Frischgewicht (auch auf das Trockengewicht) bezogene Proteingehalt zu allen Zeiten bei der Lichtkultur deutlich hOher als bei der im Dunkeln angezogenen Kultur. Obwohl gerichtete Untersuchungen dazu nicht unternommen wurden, geht man wohl nicht fehl in der Annahme, daB es sich auch in Wurzeln bei der vermehrten Proteinbildung im wesentlichen um Chloroplast en protein handelt, wenngleich es gewisse Anzeichen gibt, daB Licht, in besonderem MaBe Blaulicht, auch zu einer spezifischen Proteinsynthese im extraplastidaren Plasma AnlaB geben kann (BERGFELD 1965, KASEMIR und MOHR 1965). Neben biochemischen Arbeiten lassen auch solche mit iiberwiegend entwicklungsphysiologischer Zielsetzung an verschiedenen Objekten Evidenzen erkennen, daB ein erhohter Proteingehalt im Licht vor allen Dingen auf vermehrte Bildung von Plastidenprotein zuriickzufiihren ist (BERGFELD 1963, OHLENROTH und MOHR 1963, KASEMIR und MOHR 1965). In der Wachstumsgeschwindigkeit ergeben sich bei isolierten Wurzeln von Pisum sativum bei Kultur im Licht und im Dunkeln keine merklichen Unterschiede. Bei dem hier angewandten Test auf die Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenasen wird das Triosephosphat in einer vorgeschalteten Hilfsreaktion durch Spaltung von FDP mit Aldolase entwickelt. Bei dieser Durchfiihrung des Testes besteht die Moglichkeit, daB im zellfreien Rohextrakt iiber eine dreistufige Reaktionskette unter Beteiligung der FDP-ase, Hexosephosphat-Isomerase und Glukose-6-phosphatDehydrogenase eine Reduktion von NADP auf einem Seitenweg bewirkt wird:
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MmncA-l'ETRA LIEDTKE und ERlen
FDP-ase FDP - - -
F-6-P
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F-6-P + P a
Hexosephosphat- Isomerase -
G-6-P + NADP
OHMANN
+
0-6-P
Glukose-6-phosphat- Dehydrogenase ->-
6-Phosphoglukonsaure + NADPH 2
Der so entstehende Extinktionsanstieg bei 366 nm kann im Test eine Aktivitat vortauschen, die nicht - oder nur zu einem gewissen Prozentsatz - auf die NADPabhangige Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase zuruckzufuhren ist. DaB aIle drei erwahnten Enzyme im zellfreien Extrakt isoliert kuItivierter WurzeIn vorkommen, haben wir nachweisen k6nnen. Verschiedentlich ist berichtet worden, daB die Aktivitat der alkalischen FDP-ase in grunen pflanzlichen Geweben urn ein Mehrfaches h6her ist als in etiolierten. An isolierten Wurzeln konnten wir diese Befunde nicht bestiitigen. Die spezifische Aktivitiit des Enzymes zeigte in den im Dunkeln und im Licht angezogenen Kulturen keine Unterschiede und betrug im Durchschnitt 25 mE. Inkubiert man vor Beginn des optischen Testes, der zur Ermittlung der Aktivitiiten der Triosephosphat-Dehydrogenasen dienen solI, den zellfreien Extrakt 5 Minuten mit 0,01 M Monojodazetat, so werden die beiden Triosephosphat-Dehydrogenasen v6Ilig inaktiviert, wahrend die FDP-ase, die Hexosephosphat-Isomerase und die Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase davon nicht beeinfluBt werden. 0)6
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Abb.2. Der EinfluB von Monojodazetat (JA) auf die NADP-abhangige GlyzerinaldehydphosphatDehydrogenase. Die Kiivette, d c= 1 em, enthielt im Gesamtvolumen von 3 ml 150,uMole TrisHel, pH 8,5; 30,uMole N a-arsenat; l,uMol N ADP; 100,ug krist. Aldolase; zellfreien Extrakt mit 1,0 mg Protein, in einem Fall mit Monojodazetat vorinkubiert (+JA). Naeh 1 :YIin. Start der Reaktion durch Zugabe von 5,uMolen Na-FDP.
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Minuten Abb.3. Abhangigkeit der Geschwindigkeit der ~ADP-Reduktion von der Enzymkonzentration. Die Kiivette, d = 1 cm, enthielt im Gesamtvolumen von 3 ml 150,uMole Tris-HCl, pH 8,5; 30,uMole Na-arsenat; 1 ,uMol NADP; 100,ug krist. Aldolase; zellfreien Extrakt; die Zahlen an den Kurven geben mg eingesetztes Protein an. Start der Reaktion nach 1 Min. durch Zugabe von 5,uMolen Na-FDP.
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Abb.4. Chlorophyllgehalt und Aktivitat der :'{ADP-abhangigen GlyzerinaldehydphosphatDehydrogenase in isolierten Wurzeln von Pisum sativum. Chlorophyllgehalt 6 - - - 6 und Enzymaktivitat 0 - - - 0 bei Kulturen im Licht. •- - - . Chlorophyllgehalt und Enzymaktivitat bei Kulturen im Dunkeln.
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MONICA-PETRA LIEDTKE
und
ERICH OHMANN
Die mit einem in dieser Weise mit Monojodazetat vorbehandelten Extrakt erhaltenen Extinktionsanderungen geben das Ausma13 der durch Nebenreaktionen bedingten NADP-Reduktion an (Abb. 2). Dieser Wert ist bei allen Probeentnahmen aus den Kulturansatzen ermittelt worden, und die flir die NADP-abhangige Triosephosphat-Dehydrogenase gemessenen Aktivitaten sind danach korrigiert worden. Der Test verlauft liber mehrere Minuten linear und die gemessenen Extinktionsanderungen sind der eingesetzten Enzymkonzentration proportional (Abb. 3). Die im Dunkeln kultivierten Erbsenwurzeln sind voIIig frei von NADP-abhangiger Triosephosphat-Dehydrogenase. Erst nach Einbringen der Kultur ins Licht wird das Enzym induziert. Es hat unter diesen Bedingungen nach 6 bis 7 Tagen das Maximum seiner spezifischen Aktivitat erreicht und bleibt dann etwa auf dieser Hohe (Abb. 4). Zum selben Zeitpunkt hat auch der Chlorophyllgehalt seine maximalen Werte erreicht. Doch hat es den Anschein, da13 die Enzymsynthese der Chlorophyllbildung geringfligig vorauseiIt, die erst nach einer langeren Verzogerungsphase in Gang kommt. Es ware vorsteIIbar, daB bei der durch Licht bewirkten Induktion des photosynthetischen Apparates in den Wurzeln zuerst die lamellaren Strukturen einschlie13lich der mit ihnen verbundenen Enzyme angelegt werden, ehe die Belegung mit den Pigment en erfolgt. Bei Lemna minor geIingt es, durch kurzfristige Gabe von rot em Licht (655 nm), den Proze13 der Enzymbildung voIIig von der Chlorophyllsynthese zu trennen und unabhangig verlaufen zu lassen (OHMANN und LIEDTKE 1966). Ahnlich wie hier bei der Erbse im Detail dargestelIt, verhielten sich die isolierten Wurzeln von Triticum aestivum sowie der Wurzelteil kleiner Pflanzen von Citrus aurantium maxima und Ipomoea rubro coerulea. Die bei diesen Objekten nach maximaIer Induktion erhaltenen Werte sind in der Tabelle I dargestellt. 1st die aus den Proteinbestimmungen hergeleitete Mutma13ung, da13 es sich bei dem vermehrten Proteingehalt der im Licht aufgezogenen Wurzeln um Chloroplastenprotein handelt, sehr indirekt, so erhiilt sie durch die Enzymuntersuchungen doch eine Stlitzung. 1m Blatt kann auf die Chloroplasten 50 % und mehr vom Gesamtprotein der Zellen entfallen (MENKE 1939, ZUCKER und STINSON 1962). Die NADP-abhangige Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase bildet natlirlich nur einen sehr geringen Anteil des Chloroplastenproteins. Es ist aber wahrscheinlich, da13 sich die anderen flir die Photosynthese spezifischen Enzyme im Prinzip in ahnlicher Weise verhalten, wenngleich die flir die Regulation wichtige Frage der koordinierten Synthese der am Photosynthesegeschehen beteiligten Enzyme noch nicht untersucht ist. An einem in vieler Hinsicht autonomen Status des Chloroplast en in der Zelle konnen aber angesichts vieler Arbeiten liber seine Fahigkeit zur Nukleinsaure- und Proteinsynthese kaum noch Zweifel bestehen (z. B. HEBER 1962, SMILLIE 1963, KIRK 1963, SAGER und ISHIDA 1963, PARTHIER 1964, WOLLGIEHN und MOTHES 1964,
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BRAWERMAN und EISENSTADT 1964, EISENSTADT und BRAWERMAN 1964, EDELMAN pt al. 1964, GOFFEAU und BRACHET 1965, SISSAKIAN ct al. 1965, SPENCER 1965, RUPPEL und VAN WYK 1965). Gleichzeitig mit der in den Chloroplasten lokalisierten NADP-abhangigen Triosephosphat-Dehydrogenase haben wir die NAD-abhangige Form der Glyzerinaldehyd3-phosphat-Dehydrogenase untersucht. Kennzeichnend fur das NAD-Enzym ist, daB es in den Wurzeln immer in einer wesentlich hOheren spezifischen Aktivitiit vorkommt als das NADP-Enzym. Es kommt in ergrunten und farblosen Geweben vor, und bei aHen untersuchten Objekten ist die spezifische Aktivitiit in den im Dunkeln gewachsenen Wurzeln signifikant hoher als in den belichteten Proben (Tabelle 1 und Abb. 5). Wahrend der Dauer der Kultur ist auch die Aktivitiit der NAD-abhiingigen Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase einer charakteristischen Anderung unterworfen; sie ist unabhangig von der Belichtung und verliiuft bei den im Licht und im Dunkeln gezogenen Wurzeln etwa gleichsinnig. Fur isolierte Erbsenwurzeln sind cliese Verhiiltnisse in cler Abbilclung 5 dargestellt. Die Aktivitiit steigt zuniichst an, erreicht am 6. bis 8. Tag nach der Dbertragung cler jungen, etwa 1 cm langen Wurzelspitzen auf die Niihrlosung ein Maximum und falIt dann wieder abo
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Abb. j. Das Verhalten der NAD-abhangigen Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase wahrend der Kultur isolierter Wurzeln von Pisum sativum. 0 - - 0 Enzymaktivitiit bei Kultur im Licht. •- - . Enzymaktivitat bei Kultur im Dunkeln.
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Ein ahnliehes Bild erhalt man, wenn die Enzymaktivitaten nieht gegen die Zeitaehse, sondern gegen die Wurzellange aufgetragen werden. Von del' Wurzelspitze ausgehend, steigt die Aktiyitat aneh erst an, urn dann naeh etwa der Halfte del' Wurzellange steil abzufallen. Ganz offensiehtlieh entspreehen den versehiedenen Wurzelzonen versehiedene physiologisehe Leistungszustande, die unter anderem aueh dureh eine versehiedene Aktivitat des NAD-Enzyms gekennzeiehnet sind. Bekannt ist, daB del' RQ als komplexe .AuBerung eines physiologisehen Status sieh je naeh Abstand von der Spitze andert (RUHLAND und RAMS HORN 1938, BETZ 1955, RAMSHORN 1957).
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Summary
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The occurence and the behaviour of NAD and NADP requiring glyceraldehyde-3-phosphate : dehydrogenase in roots of Pisum sativum, Triticum aestivum, Citrus aurantium maxima and, . Ipomoea rubro coerulea has been studied. In dark grown, pale roots the NADP requiring enzyme does not occur. Transfering the cultures into the light, the enzyme is formed. The kinetic of photo- ' induction was studied in detail with excised roots of Pisum sativum. The NADP linked glyreralde- ' hyde-3-phosphate dehydrogenase is under a photocontrol similar to that regulating chlorophyll synthesis. The induction of chlorophyll synthesis in etiolated roots generally parallels dosly that of N ADPlinked glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, but with a somewhat longer lag phase. The NAD linked glyceraldehyde phosphate dehydrogenase is present in extracts of both etiolated and green roots. During culture of excised roots of Pisum sativum its amount changes in a characteristic manner, which is independent of light. N AD linked glyceraldehyde phosphate dehydrogenase in roots is not under photocontrol.
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R
Unser Dank gilt Herrn Prof. Dr. K. MOTHES und Herrn Prof. Dr. F. J.\COIl filr die vielseitige Fiirderung der Arbeit.
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L
tiber das Verhalten der Triosephosphat-Dehydrogenasen in Wurzeln Von MONICA-PETRA LIEDTKE und ERICH
OHMAN~
Mit 5 Abbildungen im Text (Eingegangen am 26. April 1966)
I. Einleitung Der bei der Triosephosphat-Dehydrogenierullg: 3-Phosphoglyzerillaldehyd
+ PN ox + P a
---*
1,3-Diphosphoglyzerillsaure
+
PN red
dem Substrat elltnommene Wasserstoff kann entweder auf NAD oder auf NADP iibertragen werden. Es existieren ~omit zwei Triosephosphat-Dehydrogenasen, die je nach dem Transportmetaboliten, der durch sie hydriert wird, als NAD- bzw. als NADP-abhangige Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase [systematische N amen: D-Glyzerinaldehyd-3-phosphat: NAD-Oxydoreduktase (phosphorylierend), E. C. 1. 2. 1. 12 und D-Glyzerinaldehyd-3-phosphat: NADP-Oxydoreduktase (phosphorylierend), E. C. 1. 2. 1. 13] bezeichnet werden. Die NAD-abhangige Triosephosphat-Dehydrogenase ist sowohl in farblosen als auch in griinen pflanzlichen Geweben zu finden. Sie steht im Dienste der Glykolyse und wird als vorwiegend im Zytoplasma wirkend angenommen. Die Reduktion der Phosphoglyzerinsaure zum Aldehyd im Proze£ der photosynthetischen CO 2 - Fixierung wird spezifisch bei allen hoheren Pflanzen und Algen, die bisher daraufhin untersucht worden sind, von der NADP-abhangigen Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogellase katalysiert (ARNON 1952, GIBBS 1952). Wie aIle anderen Enzyme des Photosynthesegeschehens ist auch die NADP-abhangige Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase im Chloroplasten lokalisiert (ROSENBERG und ARNOX 1955, WHATLEY et al. 1956, HEBER et al. 1963). Die experimenteIlen Daten von BRA'YER:lIA2'l' und KONIGSBERG (1960), die das Enzym in der lOslichen Zytoplasmafraktion von Eltglena gracilis nachwiesen, sind wohl am besten Verwendete Abklirzungen: P~ox, PN red = oxydiertes bzw. reduziertes Pyridinnukleotid; NAD = Nikotinsaureamid-adenin-dinukleotid; NADP = Nikotinsiiureamid-adenin-dinukleotidphosphat; FDP = Fruktose-1,6-diphosphat; F-6-P = Fruktose-6-phosphat; G-6-P = GlukoseG-phosphat; P a = Orthophosphat; EDTA = Athylendiamintetraessigsaure.
r
Uber das Verhalten der Triosephosphat-Dehydrogenasen in Wurzeln
81
im Sinne einer Auswaschung des Enzyms aus den Chloroplasten wahrend des Fraktionierungsprozesses zu interpretieren. Es ist bekannt, daf3 bei einer waf3rigen Zellfraktionierung, deren sich die Autoren bedienten, besonders die Chloroplasten einen starken Proteinverlust erleiden (SMILLIE 1963). Zunachst wurde die NADP-abhangige Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase ausschlief3lich in photosynthetisch aktiven pflanzlichen Geweben gefunden, wobei sich die Untersuchungen an hoheren Pflanzen nur auf das Blatt und den Sprof3 beschrankten. Dabei lief3 sich immer wieder feststellen, daf3 bei allen Organism en, die das NADP-Enzym potenziell synthetisieren konnen, das Auftreten der Enzymaktivitat erst unter dem Einfluf3 der Belichtung und zeitlich gekoppelt mit der Chlorophyllsynthese erfolgt. Diese Untersuchungen erweckten den Anschein, daf3 der photosynthetische Apparat immer nur in seiner Gesamtheit von Enzymen und Strukturelementen einschlief3lich der Farbstoffe induziert werden kann. Die Entdeckung, daB einige chlorophyllfreie Albinomutanten einer Gerstensorte die NADP-abhangige Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase in relativ hoher spezifischer Aktivitat enthalten, lief3 hingegen deutlich werden, daf3 der Besitz von Chlorophyll keine unbedingt notwendige Voraussetzung fUr das Enzym ist (FULLER und GIBBS 1959). Wurzeln zeigen gegeniiber den Geweben des Sprosses mancherlei Besonderheiten. So sind sie bevorzugt zu bestimmten Syntheseleistungen befahigt (MoTHEs 1955) und zeigen eine intensive aerobe Garung (RUHLAND und RAMSHORN 1938). In der Regel sind sie farblos und haben fUr die Photosynthese keine Bedeutung. In einer Reihe von Fallen sind sie aber in der Lage, im Licht zu ergriinen. Sie vermogen dann auch photosynthetisch CO 2 zu fixieren (FADEEL 1963). Inwieweit die Induktion der dazu notigen Enzyme konform mit der Chlorophyllsynthese erfolgt, ist nicht naher bekannt. Von der Glykolsaureoxydase weif3 man, daf3 sie in Wurzeln nur im Licht synthetisiert wird (MoTHEs et al. 1956). Es erschien daher von Interesse, das Verhalten der NADP-abhangigen Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase in einigen Wurzeln unter verschiedenen Bedingungen niiher zu untersuchen. II. Experimenteller Teil A. Material Die Versuche wurden durchgefiihrt an isolierten Wurzeln von Pisum sativum "Friihe Harzerin" und Triticum aestivum, sowie am Wurzelteil von Citrus aurantium maxima und Ipomoea rubro coefulea. 1. Pisum sativum "Friihe Harzerin":
Die Erbsen wurden 6 Minuten in 1 % Bromwasser (Gewichtsprozent) sterilisiert, viermal mit keimfreiem, dreifaeh destilliertem Wasser gewasehen und in Petrisehalen auf feuehtem FlieBpapier bei 27°C im Dunkeln zum Keimen ausgelegt. Naeh 3 Tagen trennten wir unter sterilen Bedingungen die Spitzen der entstandenen Keimwurzeln in einer Lange von 0,5 bis 1 em ab und iibertrugen 6 Flora, Aht. A, Bd. 157.
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:\[O"IC .\- PETR.\ LIEDTKE und ERIrl! OIlMANX
sie auf eine Nahrliisung nach ROBBINS und SCHMIDT (GA UTIIERET 1942). Dabei ist zu beacht,en, daB die Wurzelspitzen auf dl1f Niihrliisung schwimmen, untergetauchte Wurzeln miissen 'lorn Versuch ausgeschieden werden. Ein Teil der Kulturen wurde bei 25 DC in Dunkelheit gehalten, der Rest bei gleicher Temperatur einer Beleuchtung von 12500 Lux ausgesetzt. 1m Abstand von zwei Tagen entnahmen wir sowohl den Lieht- als aueh Dunkelkulturen Proben und ermittelten Enzymaktivitaten und Chlorophyllgehalt. 2. Triticum aestivum: Die Sterilisation der Weizenkiirner und die Zusammensetzung der fUr die Wurzelkultur beniitigten Nahrliisungen folgte den Angaben von FAD EEL (1963). Wie bei Pisum sativum wurde ein Teil der Kulturen im Licht gezogen, der Rest im Dunkeln. Nach 10 bis 12 Tagen ermittelten wir Enzym- und Chlorophyllgehalt.
3. Citrus aurantium maxima: In diesem Falle wurde auf eine besondere Sterilisation der Samen verzichtet. Wir entfernten unter aseptischen Bedingungen die Testa und brachten die Embryonen in keimfreien Petrisehalen auf feuehtem FlieBpapier bei 27DC im Dunkeln zum Wachstum. Nachdem die Keimlinge eine Lange von 3 bis 4 cm erreicht hatten, lieBen wir ihre Wurzeln in eine Nahrliisung nach ZINZADZE eintauchen, wiihrend der SproBteil einer intensiven Beleuchtung ausgesetzt wurde. Bei einem Teil der Pflanzen wurde auch der sich in der Nahrliisung befindliehe Wurzelteil belichtet, bei dem Rest durch eine schwarze Papiermanschette abgedunkelt. Die Wurzeln wachsen rasch und zeigen im Licht schon naeh wenigen Tagen eine reichliche Chlorophyllbildung. 4. Ipomoea rubro coemlea ; Die Ipomoea-Samen wurden zunachst kurz in 96 % Athanol getaucht, urn die Benetzbarkeit ihrer rauhen Oberflaehe zu erhiihen. Dann sterilisierten wir sie 8 Minuten in 1 % Bromwasser, spiilten viermal mit keimfreien, dreifach destilliertem Wasser und legten die Samen auf feuehtem FlieBpapier bei 27 DC zum Keimen aus. Ais Keimwurzeln und Primarblatter hervorgebrochen waren, wurden die kleinen Pflanzchen in Fernbaeh-Kolben auf die Oberfliiche einer Whitesehen Niihrliisung (WHITE 1943) iibertragen. Wiederum wurde ein Teil im Licht, der Rest im Dunkeln kultiviert. ::\ach 14 Tagen hat sieh ein reich verzweigtes Wurzelsystem gebildet, das d,wn auf Chlorophyllgehalt und Enzymaktivitiit untersucht werden kann.
B. Methodik 1. Aufbereitung des Versuchsmaterials zum zellfreien Extrakt:
Zur Gewinnung des fiir den optischen Test notwendigen zellfreien Extraktes hat sich das Zerreiben des Wurzelmaterials mit Trispuffer als vorteilhaft erwiesen. 1m einzelnen wurde folgendermaBen verfahren: Wir zerrieben das zu untersuchende Objekt im Kiihlraum (+2 DC) mit einer Mischung aus 0,05 M Trispuffer pH 7,8; 0,002 M EDTA und 0,002 ~12-Mereaptoiithanol. Danach wurde 20Minuten bei 20000 x g und + 2 DC zentrifugiert und der Uberstand zu den Enzymmessungen benutzt. 2. Bestimmungen der Enzymaktivitaten: a) Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenasen [D-Glyzerinaldehyd-3-phosphat: NADOxydoreduktase (phosphorylierend), E. C. 1. 2. 1. 12 und D-Glyzerinaldehyd-3-phosphat-NADPOxydoreduktase (phosphorylierend), E. C. 1. 2. 1. 13]:
Uber das Verhalten der 'l'riosephosphat-Dehydrogenasen in Wurzeln
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Die Aktivitiitsbestimmung der Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenasen erfolgte im optischen Arsenattest nach WARBURG (WARBURG et al. 1935). Die physiologische Reaktion der Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenasen besteht in einer oxydativen Umsetzung von 3-Phosphoglyzerinaldehyd zu 1,3-Diphosphoglyzerinsaure unter Aufnahme von Orthophosphat. Ersetzt man das Orthophosphat durch Arsenat, so wird an Stelle der 1,3-Diphosphoglyzerinsaure mit einer in Position 3 energiereich gebundenen Phosphatgruppe eine sehr instabile Arsenatverbindung gebildet, die spontan zerfallt. Es entstehen 1-Phosphoglyzerinsiiure und Arsenat. Die Rolle des Arsenats besteht also darin, das dehydrierte Reaktionsprodukt stets aus dem Gleichgewicht zu entfernen, so daB der U msatz des Substrates quantitativ erfolgt. Der Phosphoglyzerinaldehyd wurde in einer vorgeschalteten Hilfsreaktion durch Spaltung von Fruktose-1,6-diphosphat mit Aldolase erhalten. Zur Duchfiihrung des Testes werden in der angegebenen Reihenfolge in eine Kiivette, d = 1 cm, folgende Komponenten pipettiert: 2 ml H 20; 0,15 mIl M Tris- HCI pH 8,5; 0,3 m10,11VI Na-arsenat; 0,5 ml zellfreier Extrakt; 0,02 ml einer 0,05 M Lasung von NAD bzw. NADP; 0,01 ml Aldolase (Kristallsuspension); 0,05 ml 0,1 M Na-FDP. Die Reaktion wird gestartet durch Zugabe der FDP-Lasung. Der Anstieg der Extinktion wird im Photometer Eppendorf bei 366 nm und Zimmertemperatur gemessen; er erfolgt iiber mehrere Minuten linear (Abb. 3). Die durch Messung der NADH 2- bzw. NADPH 2-Absorption ermittelten Ergebnisse sind auf der Basis eines Extinktionskoeffizienten fiir die reduzierten Pyridinnukleotide von E 3 • 6 = 3,3· 10 6 (cm2/Mol) errechnct worden (BERGMEYER 19(2). Als Enzymeinheit (E) wurde die Menge Enzym definiert, die in 1 Minute bei 25°C 1 f,tMol Substrat umsetzt. 1 mE = 1 E . 10- 3 • Die spezifische Aktivitat wurde als Enzymeinheit pro mg Protein ausgedriickt (COOPER et al. 1958). b) Alkalische FDP-ase (D-Fruktose-1,6-diphosphat-1-phosphohydrolase, E. C. 3. 1. 3. 11): Die Bestimmung dieses Enzyms erfolgte in Anlehnung an die Methode von SCHROEDER und RACKER (1964) durch Erfassung des aus FDP freigesetzten Orthophosphates. Dabei wurde folgendermaBen verfahren: Wir inkubierten eine geeignete :!Ylenge des zellfreien Extraktes mit folgenden Zusiitzen: 0,1 mIl M Tris-HCI pH 8,5; 0,05 ml 0,1 M FDP; 0,1 m10,02 M Na-ED'l'A; 0,05 mlO,l M Magnesiumchlorid und Wasser bis auf ein Gesamtvolumen von 1 m!. Die Inkubationsdauer betrug 20 Minuten. Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von 1 mIlO % Trichloressigsaure abgestoppt, das ausgeflockte EiweiB abzentrifugiert und im Uberstand Phosphat nach der von SCHLEGEL (1954) modifizierten :Methode von MARTLAND und ROBINSON (1926) bestimmt. c) Hexosephosphat-Isomerase (D-Glukose-6-phosphat-Ketolisomerase, E. C. 5. 3. 1. 9): Nach einer von DELBRUCK et al. (1959) beschriebenen Methode wurde das Enzym im optischen Test bei 366 nm im Photometer Eppendorf in folgendem 2-ml-Ansatz getestet: 50 mM Trispuffer pH 7,4; 5 mM Magnesiumchlorid; 0,25 mM NADP; 0,6 mM F-6-P; 0,02 ml Glukose-6-phosphatDehydrogenase (Boehringer) und zellfreier Extrakt. d) Glukose-G-phosphat-Dehydrogenase (D-Glukose-6-phosphat: N ADP-Oxydore duktase, E. C. 1. 1. 1. 49): Die Bestimmung erfolgte in Anlehnung an die von PFLEIDERER (1964) und von DELBRUCK et al. (1959) beschriebenen Verfahren in einem 2-ml-Ansatz folgender Zusammensetzung: 50 mM Trispuffer pH 7,4; 5 mM EDTA; 5 mM Magnesiumchlorid; 0,25 mlli NADP; 2 mM G-6-P und zellfreier Extrakt. Die Messung erfolgte im Photometer Eppendorf bei 366 nm. 6*
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MONll'A-PE'I'R.\ LlEDTKE
lind
ERICH OIDL\NN
3. Proteinbestimmung: Der fiir die Ennittlung der spezifisehen Aktivitat erforderliche Proteingehalt des zellfreien Extraktes wurde nach der Methode von LOWRY et al. (1951) bestimmt. Krist. Rinderserumalbumin diente als Standard. Urn eine Kontrolle iiber den GesamteiweiBgehalt wahrend verschiedener Entwicklungsstadien der Wurzeln zu haben, wurde in Abstanden von 2 Tagen jeweils eine Licht- und Dunkelprobe der Stickstoffbestimmung nach KJELDAITL unterworfen. 4. Chlorophyllbestimmung: Parallel zu den EiweiBbestimmungen wurde der Chlorophyllgehalt der Wurzeln ermittelt. Dazu wurden die Kulturen geteilt. Der eine Anteil wurde wie beschrieben zu den enzymatischen Bestimmungen aufgearbeitet; mit dem anderen Anteil bestimmten wir den Chlorophyllgehalt nach folgender Methode: Die Proben wurden mit Azeton (Endkonzentration 80 %) im Morser zerrieben, quantitativ durch einen Biichner-Trichter abgesaugt, der ein getrocknetes, ausgewogenes Filter enthielt. Es wurde mehrfach nachgewaschen und der gesamte Durchlauf mit 80% Azeton auf ein passendes Volumen aufgefiillt und sofort im Spektralphotometer VS U 1 (Zeiss, J en a) bei den beiden Wellenlangen 663 nm und 645 nm die Extinktion gemessen. Die Berechnung der Chlorophyllmenge erfolgte nach der von ARNON angegebenen Formel (ARNON 1949). Der Riickstand wurde zusammen mit dem Filter bis zur Gewichtskonstanz getrocknet und zur Ermittlung des Trockengewichtes erneut gewogen. Tabelle 1 Aktivitaten der NAD-abhangigen und NADP-abhangigen GlyzerinaldehydphosphatDehydrogenase bei verschiedenen Wurzeln
Objekt
Pisum satit·um Triticum aestirum Citrus aurantium maxima Ipomoea rubro coerulea
Lichtkultur Dunkelkultur Lichtkultur Dunkelkultur Lichtkultur Dunkelkultur Lichtkultur Dunkelkultur
Chlorophyll mgjgjTrockengewicht
Spezifische Aktivitat NAD-Enzym
NADP-Enzym
0,59
164 mE 192 mE 185 mE 195 mE 150 mE 172 mE 128 mE 132 mE
18 mE
0,19 0,51 0,48
16 mE 29 mE lmE 31 mE
III. Ergebnisse und Diskussion
Da die Bezugsgro13e fUr die Ermittlung der spezifischen Aktivitaten der Enzyme jeweils der Proteingehalt ist, war die Frage zu klaren, ob dieser Proteingehalt wahrend der Lichtinduktion bemerkenswerten Veranderungen unterworfen ist. Ein Aus-
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Abb.1. Proteingehalt isolierter Wurzeln von Pisum sativum bei Anzucht im Licht 0 - - 0 und im Dunkeln . - -•.
druck dafiir ist das Verhaltnis Protein/Frischgewicht. Dieses Verhaltnis nimmt von Beginn der fibertragung der jungen Wurzelspitzen auf die Nahrlosung laufend ab (Abb. 1). Dabei verhalten sich die im Licht und im Dunkeln angezogenen Kulturen im Prinzip gleich, nur liegt der auf das Frischgewicht (auch auf das Trockengewicht) bezogene Proteingehalt zu allen Zeiten bei der Lichtkultur deutlich hOher als bei der im Dunkeln angezogenen Kultur. Obwohl gerichtete Untersuchungen dazu nicht unternommen wurden, geht man wohl nicht fehl in der Annahme, daB es sich auch in Wurzeln bei der vermehrten Proteinbildung im wesentlichen um Chloroplast en protein handelt, wenngleich es gewisse Anzeichen gibt, daB Licht, in besonderem MaBe Blaulicht, auch zu einer spezifischen Proteinsynthese im extraplastidaren Plasma AnlaB geben kann (BERGFELD 1965, KASEMIR und MOHR 1965). Neben biochemischen Arbeiten lassen auch solche mit iiberwiegend entwicklungsphysiologischer Zielsetzung an verschiedenen Objekten Evidenzen erkennen, daB ein erhohter Proteingehalt im Licht vor allen Dingen auf vermehrte Bildung von Plastidenprotein zuriickzufiihren ist (BERGFELD 1963, OHLENROTH und MOHR 1963, KASEMIR und MOHR 1965). In der Wachstumsgeschwindigkeit ergeben sich bei isolierten Wurzeln von Pisum sativum bei Kultur im Licht und im Dunkeln keine merklichen Unterschiede. Bei dem hier angewandten Test auf die Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenasen wird das Triosephosphat in einer vorgeschalteten Hilfsreaktion durch Spaltung von FDP mit Aldolase entwickelt. Bei dieser Durchfiihrung des Testes besteht die Moglichkeit, daB im zellfreien Rohextrakt iiber eine dreistufige Reaktionskette unter Beteiligung der FDP-ase, Hexosephosphat-Isomerase und Glukose-6-phosphatDehydrogenase eine Reduktion von NADP auf einem Seitenweg bewirkt wird:
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MmncA-l'ETRA LIEDTKE und ERlen
FDP-ase FDP - - -
F-6-P
4-
F-6-P + P a
Hexosephosphat- Isomerase -
G-6-P + NADP
OHMANN
+
0-6-P
Glukose-6-phosphat- Dehydrogenase ->-
6-Phosphoglukonsaure + NADPH 2
Der so entstehende Extinktionsanstieg bei 366 nm kann im Test eine Aktivitat vortauschen, die nicht - oder nur zu einem gewissen Prozentsatz - auf die NADPabhangige Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase zuruckzufuhren ist. DaB aIle drei erwahnten Enzyme im zellfreien Extrakt isoliert kuItivierter WurzeIn vorkommen, haben wir nachweisen k6nnen. Verschiedentlich ist berichtet worden, daB die Aktivitat der alkalischen FDP-ase in grunen pflanzlichen Geweben urn ein Mehrfaches h6her ist als in etiolierten. An isolierten Wurzeln konnten wir diese Befunde nicht bestiitigen. Die spezifische Aktivitiit des Enzymes zeigte in den im Dunkeln und im Licht angezogenen Kulturen keine Unterschiede und betrug im Durchschnitt 25 mE. Inkubiert man vor Beginn des optischen Testes, der zur Ermittlung der Aktivitiiten der Triosephosphat-Dehydrogenasen dienen solI, den zellfreien Extrakt 5 Minuten mit 0,01 M Monojodazetat, so werden die beiden Triosephosphat-Dehydrogenasen v6Ilig inaktiviert, wahrend die FDP-ase, die Hexosephosphat-Isomerase und die Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase davon nicht beeinfluBt werden. 0)6
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Abb.2. Der EinfluB von Monojodazetat (JA) auf die NADP-abhangige GlyzerinaldehydphosphatDehydrogenase. Die Kiivette, d c= 1 em, enthielt im Gesamtvolumen von 3 ml 150,uMole TrisHel, pH 8,5; 30,uMole N a-arsenat; l,uMol N ADP; 100,ug krist. Aldolase; zellfreien Extrakt mit 1,0 mg Protein, in einem Fall mit Monojodazetat vorinkubiert (+JA). Naeh 1 :YIin. Start der Reaktion durch Zugabe von 5,uMolen Na-FDP.
Uber das Verhalten der Triosephosphat-Dehydrogenasen in Wurzeln
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2
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Minuten Abb.3. Abhangigkeit der Geschwindigkeit der ~ADP-Reduktion von der Enzymkonzentration. Die Kiivette, d = 1 cm, enthielt im Gesamtvolumen von 3 ml 150,uMole Tris-HCl, pH 8,5; 30,uMole Na-arsenat; 1 ,uMol NADP; 100,ug krist. Aldolase; zellfreien Extrakt; die Zahlen an den Kurven geben mg eingesetztes Protein an. Start der Reaktion nach 1 Min. durch Zugabe von 5,uMolen Na-FDP.
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Abb.4. Chlorophyllgehalt und Aktivitat der :'{ADP-abhangigen GlyzerinaldehydphosphatDehydrogenase in isolierten Wurzeln von Pisum sativum. Chlorophyllgehalt 6 - - - 6 und Enzymaktivitat 0 - - - 0 bei Kulturen im Licht. •- - - . Chlorophyllgehalt und Enzymaktivitat bei Kulturen im Dunkeln.
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MONICA-PETRA LIEDTKE
und
ERICH OHMANN
Die mit einem in dieser Weise mit Monojodazetat vorbehandelten Extrakt erhaltenen Extinktionsanderungen geben das Ausma13 der durch Nebenreaktionen bedingten NADP-Reduktion an (Abb. 2). Dieser Wert ist bei allen Probeentnahmen aus den Kulturansatzen ermittelt worden, und die flir die NADP-abhangige Triosephosphat-Dehydrogenase gemessenen Aktivitaten sind danach korrigiert worden. Der Test verlauft liber mehrere Minuten linear und die gemessenen Extinktionsanderungen sind der eingesetzten Enzymkonzentration proportional (Abb. 3). Die im Dunkeln kultivierten Erbsenwurzeln sind voIIig frei von NADP-abhangiger Triosephosphat-Dehydrogenase. Erst nach Einbringen der Kultur ins Licht wird das Enzym induziert. Es hat unter diesen Bedingungen nach 6 bis 7 Tagen das Maximum seiner spezifischen Aktivitat erreicht und bleibt dann etwa auf dieser Hohe (Abb. 4). Zum selben Zeitpunkt hat auch der Chlorophyllgehalt seine maximalen Werte erreicht. Doch hat es den Anschein, da13 die Enzymsynthese der Chlorophyllbildung geringfligig vorauseiIt, die erst nach einer langeren Verzogerungsphase in Gang kommt. Es ware vorsteIIbar, daB bei der durch Licht bewirkten Induktion des photosynthetischen Apparates in den Wurzeln zuerst die lamellaren Strukturen einschlie13lich der mit ihnen verbundenen Enzyme angelegt werden, ehe die Belegung mit den Pigment en erfolgt. Bei Lemna minor geIingt es, durch kurzfristige Gabe von rot em Licht (655 nm), den Proze13 der Enzymbildung voIIig von der Chlorophyllsynthese zu trennen und unabhangig verlaufen zu lassen (OHMANN und LIEDTKE 1966). Ahnlich wie hier bei der Erbse im Detail dargestelIt, verhielten sich die isolierten Wurzeln von Triticum aestivum sowie der Wurzelteil kleiner Pflanzen von Citrus aurantium maxima und Ipomoea rubro coerulea. Die bei diesen Objekten nach maximaIer Induktion erhaltenen Werte sind in der Tabelle I dargestellt. 1st die aus den Proteinbestimmungen hergeleitete Mutma13ung, da13 es sich bei dem vermehrten Proteingehalt der im Licht aufgezogenen Wurzeln um Chloroplastenprotein handelt, sehr indirekt, so erhiilt sie durch die Enzymuntersuchungen doch eine Stlitzung. 1m Blatt kann auf die Chloroplasten 50 % und mehr vom Gesamtprotein der Zellen entfallen (MENKE 1939, ZUCKER und STINSON 1962). Die NADP-abhangige Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase bildet natlirlich nur einen sehr geringen Anteil des Chloroplastenproteins. Es ist aber wahrscheinlich, da13 sich die anderen flir die Photosynthese spezifischen Enzyme im Prinzip in ahnlicher Weise verhalten, wenngleich die flir die Regulation wichtige Frage der koordinierten Synthese der am Photosynthesegeschehen beteiligten Enzyme noch nicht untersucht ist. An einem in vieler Hinsicht autonomen Status des Chloroplast en in der Zelle konnen aber angesichts vieler Arbeiten liber seine Fahigkeit zur Nukleinsaure- und Proteinsynthese kaum noch Zweifel bestehen (z. B. HEBER 1962, SMILLIE 1963, KIRK 1963, SAGER und ISHIDA 1963, PARTHIER 1964, WOLLGIEHN und MOTHES 1964,
Uber das Verhalten der Triosephosphat-Dehydrogenasen in Wurzeln
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BRAWERMAN und EISENSTADT 1964, EISENSTADT und BRAWERMAN 1964, EDELMAN pt al. 1964, GOFFEAU und BRACHET 1965, SISSAKIAN ct al. 1965, SPENCER 1965, RUPPEL und VAN WYK 1965). Gleichzeitig mit der in den Chloroplasten lokalisierten NADP-abhangigen Triosephosphat-Dehydrogenase haben wir die NAD-abhangige Form der Glyzerinaldehyd3-phosphat-Dehydrogenase untersucht. Kennzeichnend fur das NAD-Enzym ist, daB es in den Wurzeln immer in einer wesentlich hOheren spezifischen Aktivitiit vorkommt als das NADP-Enzym. Es kommt in ergrunten und farblosen Geweben vor, und bei aHen untersuchten Objekten ist die spezifische Aktivitiit in den im Dunkeln gewachsenen Wurzeln signifikant hoher als in den belichteten Proben (Tabelle 1 und Abb. 5). Wahrend der Dauer der Kultur ist auch die Aktivitiit der NAD-abhiingigen Glyzerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase einer charakteristischen Anderung unterworfen; sie ist unabhangig von der Belichtung und verliiuft bei den im Licht und im Dunkeln gezogenen Wurzeln etwa gleichsinnig. Fur isolierte Erbsenwurzeln sind cliese Verhiiltnisse in cler Abbilclung 5 dargestellt. Die Aktivitiit steigt zuniichst an, erreicht am 6. bis 8. Tag nach der Dbertragung cler jungen, etwa 1 cm langen Wurzelspitzen auf die Niihrlosung ein Maximum und falIt dann wieder abo
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Abb. j. Das Verhalten der NAD-abhangigen Glyzerinaldehydphosphat-Dehydrogenase wahrend der Kultur isolierter Wurzeln von Pisum sativum. 0 - - 0 Enzymaktivitiit bei Kultur im Licht. •- - . Enzymaktivitat bei Kultur im Dunkeln.
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Ein ahnliehes Bild erhalt man, wenn die Enzymaktivitaten nieht gegen die Zeitaehse, sondern gegen die Wurzellange aufgetragen werden. Von del' Wurzelspitze ausgehend, steigt die Aktiyitat aneh erst an, urn dann naeh etwa der Halfte del' Wurzellange steil abzufallen. Ganz offensiehtlieh entspreehen den versehiedenen Wurzelzonen versehiedene physiologisehe Leistungszustande, die unter anderem aueh dureh eine versehiedene Aktivitat des NAD-Enzyms gekennzeiehnet sind. Bekannt ist, daB del' RQ als komplexe .AuBerung eines physiologisehen Status sieh je naeh Abstand von der Spitze andert (RUHLAND und RAMS HORN 1938, BETZ 1955, RAMSHORN 1957).
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Summary
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The occurence and the behaviour of NAD and NADP requiring glyceraldehyde-3-phosphate : dehydrogenase in roots of Pisum sativum, Triticum aestivum, Citrus aurantium maxima and, . Ipomoea rubro coerulea has been studied. In dark grown, pale roots the NADP requiring enzyme does not occur. Transfering the cultures into the light, the enzyme is formed. The kinetic of photo- ' induction was studied in detail with excised roots of Pisum sativum. The NADP linked glyreralde- ' hyde-3-phosphate dehydrogenase is under a photocontrol similar to that regulating chlorophyll synthesis. The induction of chlorophyll synthesis in etiolated roots generally parallels dosly that of N ADPlinked glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, but with a somewhat longer lag phase. The NAD linked glyceraldehyde phosphate dehydrogenase is present in extracts of both etiolated and green roots. During culture of excised roots of Pisum sativum its amount changes in a characteristic manner, which is independent of light. N AD linked glyceraldehyde phosphate dehydrogenase in roots is not under photocontrol.
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Unser Dank gilt Herrn Prof. Dr. K. MOTHES und Herrn Prof. Dr. F. J.\COIl filr die vielseitige Fiirderung der Arbeit.
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