Über den Einfluß des Kinetins auf die Aminosäure-Inkorporation in Blattscheiben vom Tabak1)

Flora, Bd. 151, S. 518-534 (1961)

(Aus dem Botanischen Institut der Martin-Luther-Universitat Halle/S.)

Uber den EinHuB des Kinetins auf die Aminosaure-Inkorporation in Blattscheiben vom Tabak!) Von

B. Parthier Mit 6 Abbildungen im Text (Eingegangen am 1. September 1961)

Der Wirkstoff Kinetin hat seit seiner Entdeckung und Isolierung durch MILLER, SKOOG, V. SALTZA und STRONG (1955) haufig Anwendung in pflanzenphysiologischen Untersuchungen gefunden und dabei eine Vielfalt von Reaktionen erkennen lassen, von den en zweifellos ein groJ3er Teil sekundarer Natur ist. Sie finden in den durch Kinetin stimulierten Wachstums-, Entwicklungs-, und Differenzierungsprozessen ihren sichtbaren Ausdruck. (Neuere zusammenfassende Ubersichten der Kinetinwirkungen bei PARTHIER 1960, PEREIRA 1960, REINERT 1960.) Es ist deshalb verstandlich, daJ3 eine Beantwortung der Frage nach der oder den primaren Wirkungen des Kinetins und ihrer Lokalisation mehrfach versucht worden ist. Da der Wirkstoff in den erst en Experimenten mit Tabakmarkgewebe eine ErhOhung der Zellteilungsfrequenz hervorrief (MILLER und Mitarbeiter 1955, SKOOG und MILLER 1957), lag es nahe, tiber eine stimulierte Kernteilung und Chromosomenvermehrung auf eine Beeinflussung des DNS-Stoffwechsels rtickzuschlieJ3en. Dies konnte auch experimentell bestatigt werden (DAS, PATAU und SKOOG 1956 und 1958, DAS und SKOOG 1957, TORREY 1961). SUPNIEWSKA (1958) an Haferkoleoptilen, OLSZEWSKA (1959) an Wurzelspitzen von Allium und MOEWUS (1959) an der Volvocalen Polytoma fan den kinetinverursachte Erhohungen der Mitosezahlen. Es waren jedoch nicht aIle beobachteten Kinetinwirkungen mit dem DNS-Stoffwechsel in Verbindung zu bringen, wie z. B. die Hemmung des EiweiJ3abbaues in isolierten Blattern durch Einstellen der Blatter in KinetinlOsungen (RICHMOND und LANG 1957) oder die Frischgewichts- und Flachenzunahmen isolierter Blattscheiben (KURAISHI und OKUMARA 1956). Einerseits kann man das in jenen Fallen verwendete meristematische Gewebe nicht ohne wei teres mit ausgewachsenem Material ver1) Teil einer Dissertation an der Math.-Nat. Fakultat der Martin-Luther-Universitat Halle/S. Herrn Prof. Dr. K. MOTHES bin ich fiir seine Anregungen und Unterstiitzungen zu gro.6em Dank verpflichtet.

tJber den Einflu.6 des Kinetins auf die Aminosaure-Inkorporation usw.

519

gleichen. Ferner erwies es sich als notwendig, fUr die Induktion von Wachstum und Teilung der jungen Zellen noch Auxin (Indolylessigsaure) zuzusetzen, und oft war dieser Wuchsstoff schon allein wirksam (vgl. SKOOG und MILLER 1957). Andererseits liegen Untersuchungen verschiedener Autoren vor, die eine moglicherweise unmittelbare Beeinflussung des EiweiBstoffwechsels und im Zusammenhang damit der RNS durch Kinetin erkennen lassen: So nehmen GUTTMAN (1957), JENSEN und POLLUCK (1958), OLSZEWSKA (1959 a und b), KENNELL (1960), THIMANN und LALORAYA (1960) als primare Kinetinwirkung eine Aktivierung des RNS-Stoffwechsels und als Folge die gesteigerte Eiwei13synthese ,an. Auch WOLLGIEHN (1961) mochte diese Annahme auf Grund seiner 32P-Inkorporationsversuche in die Nukleinsauren von Tabakblattgewebe nicht vollig ausschlie13en, wenn auch andere Deutungen wahrscheinlicher sind. Dagegen berichtet WEBSTER (1957), in zellfreien Homogenaten von Erbsenkeimlingen keinen Einflu13 des Kinetins auf Aminosaure-Inkorporation und Eiwei13stoffwechsel gefunden zu haben. RICHMOND und LANG (1957), MOTHES, ENGELBRECHT und KULEJAWA (1959)1), MOTHES (1960), ENGELBRECHT undMoTHES (1960), MOTHES undENGELBRECHT(1961), MOTHES, ENGELBRECHT und SCHUTTE (1961) und ENGELBRECHT (1961) haben an isolierten Blattern Versuche unternommen, die Wirkung des Kinetins auf den verhinderten Eiwei13abbau und dariiber hinaus auf den vermehrten EiweiBgehalt zu erklaren. Dabei konnten MOTHES und Mitarb. zeigen, da13 die erhOhte Eiwei13synthese kinetinbehandelter Blatthiilften eine Folge der Akkumulation lOslicher Bausteine ist, die aus den nicht mit Kinetin bespriihten Blatthalften in die Kinetingewebe wandern. Eine solche Akkumulation wird augenscheinlich, wenn markierte Substanzen, lokalisiert aufgetragen, in bestimmter Richtung zum Kinetinort wandern, oder wenn aus altem bzw. irgendwie geschiidigtem Gewebe losliche Stoffe abtransportiert werden. Diese attraktive Kraft ist allen jungen Geweben eigen. Mit ihrer Hilfe ist junges oder kinetinbehandeltes Blattmaterial in der Lage, losliche oder transportierbare Substanzen gegen ein Konzentrationsgefalle zu speichern. Insofern stehen diese Untersuchungen in engem Zusammenhang mit den Erscheinungen des Alterns und der korrelativen Beziehungen der Blatter bzw. der Blatteile untereinander (vgl. MOTHES 1960). Da13 die Wirkung des Kinetins auf die Akkumulation der Stoffe als primar anzunehmen ist und nicht umgekehrt eine aktivierte Synthese die Akkumulation auslOst (vgl. z. B. THIMANN und LALORAYA 1960), konnte unter anderem durch die Wanderung der nicht-proteinogenen Aminosaure a-Amino-Isobuttersaure zum Attraktions- (Kinetin-) Ort gesichert werden (MOTHES, ENGELBRECHT und SCHUTTE 1961). Aus diesem kurzen Dberblick geht hervor, da13 eine eindeutige Antwort auf die Wirkungsweise des Kinetins noch nicht gegeben werden kann. Die Alternative zwischen einem primaren Eingriff des Wirkstoffs in den EiweiBsynthese-Mechanismus, 1) Vgl. auch ENGELBRECHT und UNVERRICHT. Flora 146, S. 250 (1957). 34

Flora, Bd. 151

520

B. PARTHIER

worunter wir auch den Nukleinsaure-Stoffwechsel rechnen wollen, und einer den Stoffwechsel allgemein aktivierenden Wirkung tiber stimulierte Permeabilitat, Stoffaufnahme und Akkumulation, in deren Folge verstarkt Synthesen stattfinden, kann also erst durch weitere Beobachtungen entschieden werden. Die vorliegenden Untersuchungen sollen dazu einen Beitrag leisten und die in einer kurzen Darstellung (PARTHIER und WOLLGIEHN 1961) mitgeteilten Ergebnisse vervollstandigen (vgl. auch WOLLGIEHN 1961). Material und Methodik In den Versuchen wurden Pflanzen von Nicotinia rustica und Nicotinia tabacum, Sorte "Virgin Gold" verwendet, die unter natiirlichem Tag-Nacht-Rhythmus in einer Vegetationshalle aufgezogen worden waren. In den Wintermonaten erhielten sie zusatzliche Beleuchtung mit 250 W- Quecksilberhochdrucklampen, so daB ihr "Tag" auf die "normale" Lange von 12 h gebracht wurde. Das Versuchsmaterial wurde stets zur gleichen Zeit (meist nachmittags) geerntet. Kinetin wurde auf folgenden Wegen gegeben: Entweder schnitten wir ganze Blatter ab, bespriihten sie halbseitig mit Kinetinliisung und lieBen sie bestimmte Zeiten in feuchten Kammern liegen; dann wurden Blattscheiben: (14 mm 0) ausgestochen und mit radioaktiven Aminosauren gefiittert. Oder wir isolierten die Blattscheiben sofort yom Blatt an der Pflanze, legten sie auf Kinetinliisungen und inkorporierten dann die Aminosauren. In einigen Fallen wurde auch Kinetin auf Blatter an der Pflanze gespriiht, aus den en nach einigen Tagen Scheiben isoliert und gefiittert wurden. Die Blattscheiben wurden je nach Versuchsanstellung mit den radioaktiven Liisungen infiltriert oder mit den Oberflachen auf die Liisungen aufgelegt. fiber die Vor- und Nachteile der Blattscheibenmethodik und der Applikationsweise der radioaktiven Substanzen ist kiirzlich geschrieben worden (PARTHIER 1961). Dort sind auch die weiteren methodischen Einzelh.eiten iiber Extraktion und Analysengang zur Gewinnung der EiweiB- und anderer untersuchter Fraktionen, der l4O-Messung und der Ohlorophyll- und EiweiB-N-Bestimmungen zu ersehen. Folgende l4O-markierte Aminosauren wurden eingesetzt: Glycin-l- 14 0, DL-Methionin-l- 14 0 und D-Leucin-140. Die letztgenannte ist nicht proteinogen. Die verwendeten Konzentrationen sind in den Darstellungen der einzelnen Versuche angegeben.

Ergebnisse 1. Der EinfluB des Kinetins auf die 14C_Verteilung in verschiedenen Fraktionen. Versuche mit Glycin-1- 14C . .

In den folgenden Abbildungen sind Ergebnisse von Versuchen zusammengefaJ3t, die den Einbau von Glycin in kinetinbehandeltes Blattgewebe zeigen. MOTHES, ENGELBRECHT und KULAJEWA (1959) hatten festgestellt, daJ3 radioaktives Glycin yom Applikationsort zum Kinetinort wandert und dort vermehrt in die EiweiJ3fraktion eingebaut wird. Dieser Einbau wurde als Folge vorangegangener Akkumulation der Aminosaure gedeutet, doch wurde die Moglichkeit einer direkten Beeinflussung der EiweiJ3synthese durch Kinetin nicht vollig ausgeschlossen. Ob solcher Vermutung Wert beigemessen werden muJ3 oder nicht, sollte deshalb etwas eingehender untersucht werden. Dabei berticksichtigen wir besonders das Alter des Blattmaterials,

'Ober den EinfluB des Kinetins auf die Aminosaure-Inkorporation usw.

521

wei! wir dem Kinetin aus verschiedenen, oben schon angedeuteten Grunden "verjungend" wirkende Eigenschaften zuschreiben konnen (MOTHES 1960). Junge (noch wachsende), alte hellgrune und alte, durch N-Mangelernahrung weiJj aussehende isolierte Blatter (nur die Schlie.l3zellen der Stomata enthalten noch Chloroplasten) von Nicotiana tabacum werden, wie in der Methodik angegeben, mit KinetinIOsung (30 mg/l = 1,5 . 10- 4 M) halbseitig bespruht. Nach 4 Tagen werden aus den kinetinbehandelten und den Kontrollhalften (mit Wasser bespruht) Scheib en isoliert ~+c-Einbau ,~mfnJlIO'

in die Proteinfraklion

....c - Gesamteinbau

15

10

5

abc

abc

Junge BlaUer

a be

abc

Aile Bllitter

abc

abc

Weioe Blatter

Abb.lB.

Abb.lA.

~

Jmp./min.Jll0J 15

1+C - Einbau in die pes -Fraklion

10

3,0

5 2,0 1.0

0,5 abc

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Junge Bltitter

abc

abc

Alle BliiUer

Abb.10.

abc

abc

Weihe Bltitter

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abc

Junge Bllitler

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abc

Aite Bltitter

abc

abc

Weihe Blalter

Abb.lD.

Abb.l A-D. Nicotiana tabacum. Kinetinwirkung bei Blattern verschiedener Entwicklungsstadien. l4O-Verteilung in den untersuchten Fraktionen 90 min nach Futterung von Glycin-l- 14 0. Den Zahlenangaben liegen gleiche Blattflachen zugrunde. WeiBe Felder = Lichtversuche; schraffierte Felder = Dunkelversuche. a = Scheib en aus Blattern an der Planze ("FrischkontrolIen"). b = Scheiben aus kinetinbehandelten Blattern. c = Scheib en aus wasserbehandelten Blattern. 34*

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B.

PARTHIER

und mit radioaktivem Glycin-1- 14C vakuuminfiltriert. Danach liegen die infiltrierten Scheiben in kleinen feuchten Kammern im dargestellten FaIle 90 min, sonst auch langer (3-6 h). Dunkel- und Lichtversuche (5000 Lux, Philips HPL 1000) werden parallel angesetzt. Aus den Darstellungen der Versuche ist ersichtlich (Abb. lA-D), daB die viertagige Einwirkung des Kinetins eine erhohte Fahigkeit zur Glycin-Inkorporation bewirkt hat (Saulen b), verglichen mit den Wasserkontrollen (c) und den unbehandelten Scheib en ("Frischkontrollen") aus vergleichbaren Blattern an der Pflanze (a). Wir konnen feststellen, daB sich die Wirkung des Kinetins nicht allein auf den Eiweil3stoffwechsel erstreckt, d. h., daB allein die Inkorp-oration des Glycins in die Proteinfraktion erhoht wird, sondern auch die anderen untersuchten Fraktionen wie die perchlorsaurelOsliche (= Starke und Nukleinsauren) und die alkoholatherlosliche ( = Pigmente und Lipide) werden in gleichem MaBe beeinfluBt. Analoge Ergebnisse hat WOLLGIEHN (1961) flir den Glycineinbau in die RNS- und DNS-Fraktionen kinetinbehandelter Blatter gefunden. Auf die Unspezifitat der Kinetinwirkung flir den EiweiBstoffwechsel deutet ferner ein Vergleich des prozentualen 14C-Einbaus in die Proteinfraktion kinetinbehanTabelle 1 auf den l4O-Einbau in die Proteinfraktion von Kinetins des EinfluB Der tabacum. Nicotiana Blattern verschiedener physiologischer Entwicklungsstadien nach Fiitterung von Glycin-l- 14 0 (0,5 mM, spez. Akt. 12 mc/mM). Kinetin bzw. Wasser halbseitig auf isolierte Blatter gespriiht, nach 4 Tagen Scheiben ausgestochen, mit markiertem Glycin vakuuminfiltriert und 90 min in Licht oder Dunkelheit exponiert. Angegeben sind der absolute l4O-Einbau (Imp./min x 10 3 /12 Blattscheiben) und der prozentuale l4O-Einbau in die Proteinfraktion vom Gesamteinbau ( = 100%).

Frisch

I

Licht 4d Kinetin

Dunkelheit

I

4d Wasser

Frisch

I Ki!e~in I Wasser 4d

Junge Blatter: l4O-Einbau in die Proteinfraktion (Imp/min x 10 3 ) % vom Gesamteinbau

2,7 23,5

3,8 20,0

2,5 18,0

9,7 73,5

11,3 70,5

5,7 71,0

Alte, hellgriine Blatter: 14 0Einbau in die Proteinfraktion (Imp/min x 103 ) % vom Gesamteinbau

1,7 26,0

2,6 22,5

1,4 23,5

5,7 65,0

7,8 66,0

4,5 67,0

Alte, weiBe Blatter (N -Mangel) : l4O-Einbau in die Proteinfraktion (Imp/min x 10 3 ) % vom Gesamteinbau

5,5 65,0

5,3 66,0

3,2 66,0

5,0 69,5

5,1 72,5

2,3 70,0

I

I

I

-aber den Einflul3 des Kinetins auf die Aminosaure-Inkorporation usw.

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delter und Kontrollblattscheiben hin. Die Zahlen sind in allen Fallen ungefahr gleich. Bei einer Beeinflussung der EiweiBsynthese durch den Wirkstoff sollten die Werte zugunsten der kinetinbespriihten Gewebe verschoben sein (Tabelle 1). In diesen Versuchen ist die Verwendung von carboxylmarkiertem Glycin von Vorteil, obwohl es sich bei Eiweillsyntheseuntersuchungen an Tabakblattern als ungeeignet erwiesen hat (PARTHIER 1961; 60-80% der markierten Oarboxylgruppen werden abgespalten), weil gerade die Moglichkeit der abgespaltenen Gruppen, auch an weiteren Reaktionen teilzunehmen, tiber eine einseitige Betrachtung der Proteinfraktion hinausweist. Kinetin ist also nicht nur in der Lage, den Eiweillschwund in isolierten Blattgeweben aufzuhalten (RICHMOND und LANG 1957) oder, allgemeiner ausgedrtickt, die Aktivitat abbauender Blattgewebe zu bewahren, sondern es erhoht dartiber hinaus die synthetischen Fahigkeiten, indem 140 vermehrt in aIle (untersuchten) Fraktionen eingebaut wird. Seine Wirkung ist in jungen Blattern ebenso eindeutig wie in alten chlorophyllhaltigen. Sie kommt bei jungem Gewebe urn so starker zum Vorschein, je langer das Blatt isoliert gehalten wird. Der Unterschied gegeniiber altern Gewebe liegt allein in der Lange der Zeit, die vergeht, bis die Wirkungen sichtbar werden. Alte Blatter reagieren meist schneller auf Kinetinbesprtihung als junge. Vielleicht mtissen diese erst einen durch die Isolation ausgelOsten "Alterszustand" erreicht haben. - Lediglich bei den weiBen N-Mangelblattern konnte bisher noch kein Kinetineffekt im Sinne erhohter Einbauaktivitat beobachtet werden, obwohl der den Stoffwechsel aufrechterhaltende EinfluB des Wirkstoffs vorhanden ist: Die kinetinbehandelten Blatteile bauen nur etwa die gleichen Mengen an 140 ein wie die "Frischkontrollen", jedoch deutlich mehr als die "Wasserkontrollen". DaB der l4O-Einbau in die Proteinfraktion (Abb. 1B) im Licht geringer ist als in Dunkelheit, kann auf die schon erwahnte Abspaltung der Oarboxylgruppe zuriickgeftihrt werden, die als 14002 im Licht bevorzugt in die Photosyntheseprodukte (Starkefraktion, Abb. 10) eingebaut wird. Die Kinetinwirkungen sind jedoch in allen Fallen ersichtlich. Wir haben bisher nur die l4O-Inkorporation bei sukzedaner Verabreichung von Kinetin und Glycin betrachtet, also nachdem der Wirkstoff schon 4 Tage oder langer auf das Blattgewebe einwirken konnte. Es ware nun aufschluBreich, etwas tiber die Zeit zu erfahren, die das Kinetin benotigt, um an den Reaktionsorten wirksam zu werden, womit zugleich Hinweise auf die primaren Einfltisse erhalten wtirden. Wir isolierten deshalb Scheib en aus frischgeernteten Blattern von Nicotiana rustica und infiltrierten Kinetin und Glycin-l- 140 gleichzeitig. Nach 8 h Exposition in Licht oder Dunkelheit wurden die Fraktionen analysiert. Die Ergebnisse, von denen einige in Tabelle 2 niedergelegt sind, lassen erkennen, daB unter diesen Bedingungen keine signifikanten Unterschiede zwischen kinetin-

.

524

B.

PARTHIER

Tabelle 2 Nicotiana rustica. Der 14C-Einbau in verschiedene Fraktionen nach gleichzeitiger Infiltration von Kinetin (30 mg/l) und Glycin-I-14C (0,5 mM, spez. Akt. = 12 mc/mM) in Blattscheiben. Die Zahlenangaben fiir die Reihen (1)-(4) sind Imp./min x 103 pro 12 Scheiben, fiir die Reihen (5)-(7) der prozentuale Einbau der einzelnen Fraktionen vom Gesamteinbau ( = 100%). Licht Wasser Kinetin (a) (b)

I

(1) (2) (3) (4)

14C-Gesamteinbau 14C-Einbau in die Proteinfraktion 14C-Einbau in die perchlorsaureliisliche Fraktion 14C-Einbau in die alkoholatherliisliche Fraktion

(5) Proteinfraktion (6) Perchlorsaureliisliche Fraktion (7) Alkoholatherliisliche Fraktion

Dunkelheit Kinetin Wasser (c) (d)

I

34,0 11,0 18,0 5,0

30,2 11,8 14,2 4,2

23,7 19,5 3,2 1,0

24,4 20,5 3,0 0,9

32,5 53,0 14,5

38,5 46,5 15,0

82,0 13,5 4,5

84,0 12,5 3,5

und wasserbehandelten Scheiben bestehen. Der geringen Forderung der perchlorsaureloslichen Fraktion im Licht (Starke!) wollen wir keine besondere Bedeutung zumessen. Die Zeit von 8 h ist offensichtlich zu kurz,' als daB Kinetin bereits an die Reaktionsorte gewandert ist und schon Wirkungen zeigen konnte. Aus Griinden einer einsetzenden mangelnden Sauerstoffversorgung der Zellen diirfen wir aber solche Infiltrationsversuche nicht beliebig lange ausdehnen. Wir haben deshalb die Versuche abgeandert, indem wir Blattscheiben (20 mm 0) isolierten, einen Teil davon mit Kinetin, einen anderen mit Wasser und einen dritten mit Indolylessigsaure (5 mg/l) bespriihten und in feuchten Kammern in einem Nordgewachshaus auslegten. AIle Scheiben werden taglich neu mit Wasser bespriiht. In Tagesabstanden wurden kleinere Scheiben ausgeschnitten und mit Glycin-1-14C infiltriert. Die Expositionszeit betrug 3h. Die Versuche wurden nur in Dunkelheit durchgefiihrt, weil Licht bei dem unterschiedlich vergilbenden Material sehr verschieden wirksam wiirde, so daB ein Vergleich der Scheiben ausgeschlossen ware. Nach einer Latenzzeit von 1-2 Tagen macht sich der EinfluB des Wirkstoffs in einer gesteigerten Inkorporationsfahigkeit der kinetinbehandeltenScheiben bemerkbar( Abb. 2 a und b). Sie ist nicht nur fiir die hier dargestellte Inkorporation in die Gesamtund Eiweil3fraktion zu beobachten, sondern ist auch bei den anderen Fraktionen vorhanden, wenn auch nicht so ausgepragt. Die Kinetinwirkung bleibt tagelang erhalten, und noch nach 30 Tagen ist die Glycin-Inkorporation solcher kinetinbehandelter Scheib en groBer als bei vergleichbarem Material von frischen Blattern, wenn auch die EinbaugroBe gegeniiber dem Maximum deutlich abgenommen hat. Es muB betont werden, daB der stimulierende EinfluB des Kinetins hier an Blattgewebe demonstriert wird, bei dem eine Stoffakkumulation auf Kosten abbauender Blattbezirke ausgeschlossen ist.

Uber den EinfluB des Kinetins auf die Aminosaure-Inkorporation usw.

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525

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Zeit nach Kinetin -SprfllJ (d)

Abb. 2a und b. Nicotiana rustica. Einbau von Glycin-1- e in Blattscheiben, die verschieden lange Zeiten mit Kinetin (30 mg/I) behandelt worden sind. Vakuuminfiltration, Expositionsdauer 3 h in Dunkelheit. Zahlenangaben beziehen sich auf je 12 Blattscheiben. Glycinkonzentration 0,5 mM, spez. Akt. 12 mc/mM. H

Am Rande sei bemerkt, daB den kinetinbehandelten Blattscheiben mit zuneh· mender Dauer der Wirkstoffeinwirkung weniger Radioaktivitat in die Interzellularen infiltriert werden kann als am Anfang~ Das spricht fUr die Ausdehnung des Blattparenchyms auf Kosten des Interzellularsystems. AuBerdem dehnen sich die Blattscheib en aus, der Durchmesser vergroBert sich. Diese Wirkung des Kinetins auf die Ausdehnung der Blattzellen ist mehrfach beschrieben worden (MILLER 1956, RuRAISHI und OKUMURA 1956, SCOTT und LIVERMAN 1956, HUMPHRIES und WHEELER 1960, POWELL und GRIFFITH 1960) und ist zur quantitativen Auswertung herangezogen worden (KURAISHI 1959) . Die wasserbehandelten Blattscheiben bauen erwartungsgemaB bald nach der Isolation ihre EiweiBe ab und vergilben. Dabei sinkt langsam die Fahigkeit, Glycin in die EiweiBe einzubauen. Sehr ahnlich verhalten sich die zu Vergleichszwecken mit IES besprtihten Scheiben. Hier muB die Frage offenbleiben, ob das Auxin tiberhaupt bis zu den Wirkungsorten vorgedrungen ist 1). Andererseits berichtet SACHER (1959) von einer Hemmung des EiweiBabbaues und der Alterserscheinungen an auxinbehandelten Blattschnitten von Rhoeo discolor und Mesenbryanthem~tm. 2. EinfluB der Kinetinkonzentration. Versuche mit 14C-markiertem DL-Methionin und D·Leucin

Neben dem Zeitfaktor spielt die Konzentration eine wichtige Rolle bei der Kinetinwirkung. So zeigt Abb. 3 die Abhiingigkeit des Methionineinbaues in die Pro1) Diesen orientierenden IES-Versuchen entbehrt natiirlich die Beweiskraft flir eine solche Annahme; dazu miiBten zunachst Versuche mit Auxinkonzentrationsreihen durchgefiihrt werden.

526

B.

PARTHIER

teinfraktion von der Konzentration des Wirkstoffs. Urn eine bessere Kontrolle tiber die Menge des applizierten Kinetins zu bekommen, wurde von der Aufsprtihmethode Abstand genommen und die Blattscheiben bei Dunkelheit auf die einzelnen Wirkstoffkonzentrationen aufgelegt. Nach bestimmter Zeit (meist 24 h) wurden sie grtindlich abgewaschen, leicht abgetrocknet und mit der Aminosaureliisung infiltriert oder auf diese gelegt. Wir zogen fUr diese Zwecke Methionin dem Glycin vor, da aus den oben schon erwahnten Grtinden carboxylmarkiertes Glycin stark verandert, Methionin aber zu einem hohen Prozentsatz in die Proteinfraktion eingebaut wird und somit eindeutigere Resultate liefert. Aus Abb. 3 ist zu entnehmen, daB der Methionineinbau in kinetinvorbehandelte Scheib en ein Optimum bei 10- 6 bis 10- 6 M Kinetin besitzt. Hohere Konzentrationen wirken hemmend, verglichen mit den Wasserkontrollen, und schwachere Konzentrationen tiben kaum einen EinfluB aus. Diese deutliche Abhangigkeit der 14C-Inkorporation von der Konzentration des Wirkstoffs ist in Licht- und Dunkelversuchen gleichermaBen vorhanden, obwohl sie im Licht ausgepragter erscheint. Hier handelt es sich urn die Licht- oder Dunkelbedingungen ftir die Expositionszeit mit der markierten Aminosaure. Das ist nicht zu verwechseln mit den Beleuchtungsbedingungen Zeit der KinetJneinwirkunf/

Methionin -Einbau in die ProteinfraJction

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Abb.3. Nicotiana tabacum. EinfluB der Kinetinkonzentration auf den Einbau von Methionin1-14C (0,7 mM, spez. Akt. 4,2 mcJmM) in die Proteinfraktion bei Licht und Dunkelheit. Scheiben 24 h mit Kinetin vorbehandelt in Dunkelheit. Vakuuminfiltration, Expositionsdauer 5 h.

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Abb.4. Nicotiana tabacum. Der zeit- und konzentrationsabhangige Einbau von Methionin-l-14C (0,7 mM, spez. Akt. 4,2 mcJmM) in die Proteinfraktion von BlIittscheiben. Scheiben verschieden lange Zeiten durch Auflegen auf die Kinetinlosungen in Licht oder Dunkelheit vorbehandelt. Methioninfiitterung 4 h in Dunkelheit.

tJber den Einflu.B des Kinetins auf die Aminosaure-Inkorporation usw.

!

·1

527

bei der 24sttindigen Vorbehandlungszeit auf den Kinetinltisungen. Dort erweisen sich ini Dunkeln gehaltene Scheiben wesentlich empfindlicher als beleuchtete, d. h., das Optimum der Kinetinwirkung ist deutlicher, hOhere Werte fUr den 14C-Einbau treten in den optimalen Konzentrationen auf, und die hohen Konzentrationen hemmen die Inkorporation starker als bei lichtvorbehandeIten Scheiben. Das wird z. B. auch in Abb. 4 deutlich, in der Ergebnisse mit den genannten Versuchsbedingungen (Licht- und Dunkelvorbehandlung) aufgezeichnet sind. Aus dieser Abbildung ist ferner eine Abhiingigkeit der Kinetinkonzentration von der Zeit der Einwirkung zu ersehen. Das ist nattirlich ein Ausdruck fUr die Menge des aufgenommenen wirksamen Kinetins. Die Glycinversuche haben einerseits schon wahrscheinlich gemacht, daB die Wirkung des Kinetins kaum auf einer primaren Stimulation bestimmter Synthesen beruhen kann, sondern in allgemeineren Prozessen zu suchen ist, welche den Synthesen vorangehen wie Aufnahme und Akkumulation von Stoffen (vgl. auch die schon genannten Arbeiten von MOTHES und Mitarbeitern). Dieser Gedanke wird nun durch die charakteristische Abhangigkeit des Aminosaureeinbaues von der Wirkstoffkonzentration untersttitzt. In diesen Fallen kommt das Kinetin Wirkstoffen mit "permeabilitatssteigernden" Eigenschaften nahe, Substanzen also, deren Wirkungsgrad entscheidend von der verwendeten Konzentration abhiingt, wie z. B. bei Auxinen. Es war notwendig, diese Annahme durch Bestimmung der Aminosaureaufnahme experimentell zu prtifen. Die Infiltrationsmethodik wurde hierbei durch Auflegen der Scheib en auf die Losungen ersetzt und die Radioaktivitat der aufgenommenen Aminosaure in der trichloressigsaureltislichen Fraktion bestimmt. Mit Methionin-1- 14C lieBen sich keine eindeutigen Resultate erzielen auBer einer starken Herabsetzung der Aufnahme nach Vorbehandlung der Scheib en mit 10- 4 M Kinetin. Wir bezogen daher eine Aminosaure in die Versuche ein, die nicht in die Blattproteine eingebaut wird, mit der also die reine Aufnahme bzw. Akkumulation gem essen werden kann: D-Leucin-14C. D-Formen von Aminosauren sind mehrfach schon zu Stoffaufnahmeversuchen benutzt worden. Bei einem Vergleich mit den L-Formen konnten hinsichtlich des Aufnahmeprozesses grundsatzlich die gleichen Verhiiltnisse festgestellt werden. Lediglich die Aufnahmegeschwindigkeit ist bei DAminosauren verringert CDbersicht bei CHRISTENSEN 1955). Aus Abb. 5 konnen wir entnehmen, daB die D-Leucinaufnahme in gleichem MaBe von der Konzentration des zugefUgten Kinetins abhangig ist, wie wir es fUr den Methionineinbau gefunden haben. Die optimale Wirkung liegt bei 10- 5 bis 10- 6 M Kinetin, die Konzentration von 10- 4 M hemmt. DaB die konzentrationsabhangige erhohte Aminosaureaufnahme nicht auf einem ebenfalls durch den Wirkstoff stimulierten Wassereinstrom (KURAISHI und OKUMURA 1956, KURAISHI 1959) zurtickzuftihren ist, konnten wir durch Parallelbestimmungen von 14C- und Wasseraufnahme ausschlieBen.

528

B.

PARTHIER

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0.11."'.

Abb.6

Abb. 5. Nicotiana tabacum. EinfluB der Kinetinkonzentration auf die Aufnahme von n-Leucin14C (0,85 mM, spez. Akt. 3,9 mc/mM). Scheiben 24 h in Dunkelheit auf die Kinetinliisungen aufgelegt, danach 5 h in Licht oder Dunkelheit auf bestimmte Leucinkonzentration aufgelegt. Abb.6. Nicotiana rustica. Vergleich der Kinetinwirkung an isolierten Blattern und Blattern an der Pflanze. Einbau von Methionin-l- 14C (0,8 mM, spez. Akt. 4,2 mcJmM) in die Proteinfraktionen. Vakuuminfiltration der Aminosaure, Expositionsdauer 3 h in Licht oder Dunkelheit. Zahlenangaben pro Flacheneinheiten. 0 = Unbehandelte Blatter an der Pflanze ("Frischkontrollen"). a = Kinetinbehandelte Blatthalften. b = .Wasserbehandelte Blatthalften. (Daraus jeweils Scheib en ausgestochen.) WeiBe Saulen = Lichtversuche, schraffierte Siiul~n = DunkeIversuche. c = Wasserbehandelte ganze Bliitter.

3. Kinetinwirkungen und Vergilbungserscheinungen

Bisher ist ein auBerlich sichtbarer EinfluB des Wirkstoffs nur dann beobachtet worden, wenn Blatter oder deren Teile von der Pflanze isoliert und mit Kinetin bespriiht vorliegen. Das legt den Gedanken nahe, vielleicht einen hormonalen EinfluB des Wurzelsystems auf physiologischen Zustand und Proteingehalt des Blattes (CHIBNALI, 1939), der mit der Isolation verlorengegangen ist, durch Kinetin ersetzen zu konnen (MOTHES 1960, MOTHES, ENGELBRECHT und SCHUTTE 1961). Die Verhaltnisse liegen jedoch nicht so einfach, wie Abb. 6 zeigt. Rier ist ein Vergleich des Methionin-l- 14C-Einbaues in kinetinbehandelte Blatter, isoliert und an der Pflanze, dargestellt. Das Blattmaterial, d. h. sowohl die isolierten Blatter als auch die ganzen Pflanzen, wurde in feuchten Kammern 7 Tage lang bei Schwachlicht (500 Lux, Leuchtstofflampen) gehalten. Dann isolierten wir mit dem Korkbohrer Blattscheiben, die mit Methionin-l- 14C infiltriert und 3 h in kleinen feuchten Kammern bei Licht (5000 Lux) oder Dunkelheit exponiert wurden.

tiber den Einflu.6 des Kinetins auf die Aminosaure-Inkorporation usw.

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I

529

Wir wahlten die Schwachlichtbedingungen, weil wir tatsachlich keine Wirkung des Kinetins auf die Aminosaure-Inkorporation erhalten haben, wenn wir Pflanzenmaterial der Sommermonate benutzten oder wenn den Pflanzen so viel Licht geboten worden war, daB eine gute Photosynthese stattfinden konnte. Kinetineffekte als Verzogerung des Vergilbens sind jedoch stets zu bekommen, wenn die Blatter an der Pflanze ganz oder halbseitig tagelang verdunkelt werden. Die Spreitenhalften isolierter und an der Pflanze befindlicher Blatter reagieren auf die Kinetinbehandlung gleichartig: Die Blattscheiben aus den "Kinetinhalften" bauen im isolierten Zustande ebensoviel 14e in ihre Proteiilfraktion ein wie an der intakten Pflanze. Der Betrag liegt hOher als bei den "Frischkontrollen" (unbehandelt). Das ist ein weiterer Beweis fUr eine tiber die Hemmung des EiweiBabbaues hinausgehende, aktivierende Wirkung des Kinetins. Es scheint uns wichtig darauf hinzuweisen, daB kinetinbehandeltes Blattgewebe unabhangig davon, ob es einem "Wurzelfaktor" ausgesetzt ist oder nicht, d. h. sich an der Pflanze befindet oder isoliert ist, in allen durchgefUhrten Versuchen einen gleich hohen Methionineinbau aufweist (Abb. 6, Saulen a). Die wasserbesprtihten isolierten, vergilbten Blatter inkorporieren im Vergleich zu den gleichbehandelten an den intakten Pflanzen wesentlich weniger Radioaktivitat. Beide unterscheiden sich zwar durch Besitz bzw. Abwesenheit des Wurzelsystems, doch erhebt sich die Frage, ob diese Gewebe tiberhaupt noch verglichen werden dtirfen. Die Annahme, daB mit dem Wurzelsystem verbundene Blatter ihren Eiweillhaushalt im Gleichgewicht halten konnen, wahrend bei isolierten Blattern der Abbau stark tiberwiegt, trifft fUr den ersten Teil nicht ganz zu; denn auch an der Pflanze kommt es zum Aufhellen der grtinen Farbe und zum EiweiBabbau bei den wasserbehandelten Spreitenhalften, wenn die Ernahrungs- (Licht-) Bedingungen suboptimal wie in unseren Fallen gehalten werden. Wir dtirfen deshalb wohl eine wichTabelle 3 Nicotiana rustica. Die Wirkung des Kinetins auf den Eiwei.6- und Chlorophyllgehalt isolierter Blatter. Naheres im Text. AusgangsI wert

nach 3 d Kinetin I Wasser

I

nach 6 d Wasser Kinetin

I

I

Eiwei.6-N-Gehalt (mg N/dm2 ) Differenz gegeniiber dem Ausgangswert (%)

8,37

Chlorophyllgehalt (mg a + b/dm2 ) Differenz gegeniiber dem Ausgangswert (%)

2,56

-

I

-

8,88

I I

+ 6,1 2,28 -11,1

7,00 -16,2 1,49 -42,5

8,70

+ 4,7 2,03 -20,8

4,78 -42,8 0,63 -75,4

530

B.

PARTHIER

tige Voraussetzung fUr die Kinetinwirkung im Ernahrungszus tand des Blattes, speziell im Kohlenhydratspiegel, suchen (vgl. auch MOTHES, ENGELBRECHT und KULAJEWA 1959). In Tabelle 3 ist die Beeinflussung des Chlorophyll- und Eiweil3gehaltes isolierter Blatter nach Kinetinbesprtihung dargestellt. 3 bzw. 6 Tage nach halbseitiger Kinetinbehandlung (30 mgjl) und Lagerung in feuchten Kammern bei Schwachlicht (1000 Lux) werden die Halften analysiert. Wahrend aIle mit Wasser besprtihten Gewebe (Kontrollen) erheblich Eiwei13 abbauen, haben die kinetinbehandelten ihren Eiweil3gehalt vermehrt (Akkulumation). Del' Chlorophyllgehalt fallt unter allen Versuchsbedingungen ab (es wurden auch Versuche mit starkerem Licht bzw. Dauerlicht durchgeftihrt). Del' Verlust ist allel'dings bei den Kinetinhalften ganz wesentlich geringer als bei den Kontrollen. In keinem FaIle kann eine Vermehrung des Chlorophyllgehaltes festgestellt werden. Das wtirde also nicht nul' bedeuten, daB EiweiBe und Chlorophylle in .isolierten, kinetinbehandelten Blattern nicht in einem bestimmten Verhaltnis vorliegen mtissen, sondern daB auch Synthese des einen und Abbau des anderen bilanzmaBig unabhangig nebeneinander ablaufen konnten.

Diskussion

Die vorliegenden Ergebnisse bestatigen erneut, daB Kinetin in isolierten Blattern nicht nul' deren grtine Farbe und Jugendlichkeit erhalt odeI' den Eiweil3abbau verhindert, sondern dartiber hinaus in del' Lage ist, Tabakblattgewebe in einen stimulierten Zustand zu versetzen, in dem es tiber den Ausgangszustand hinaus vermehrt Aminosauren inkorporiert (Abb. 1, 2, 3, 6). Es ist nun denkbar, daB bei del' Fiitterung von Aminosauren die EiweiBsynthese, d. h. die Aminosaure-In korporation gesteigert wird (Abb. 1B, 6). Die Beeinflussung dieses Prozesses durch den Wirkstoff nimmt jedoch keinen Vorrang ein, denn nicht nul' die perchlorsaureliisliche Fraktion (Starke, Abb. 1C) und die alkoholatherlosliche Fraktion (Pigmente, Lipoide, Abb. 1D), sondern auch die RNS- und DNS-Fraktion en (WOLLGIEHN 1961) werden davon gleichermaBen betroffen. In diesen Fallen hat sich das fUr Zwecke del' Untersuchung des Eiweil3stoffwechsels als ungeeignet gefupdene carboxylmarkierte Glycin (PA RTHIER 1961) vorteilhaft erwiesen. Somit dtirfte eine unmittelbare Wirkung des Kinetins auf die Massensynthese von EiweiBen auszuschlieBen sein. Es ist vielmehr leichter, die beobachteten Nettosynthesen odeI' Inkorporationserhohungen als Folgen kinetinbeeinfluBter Prozesse zu sehen, die den Synthesen vorausgehen. Die Stimulierung eines solchen Prozesses, die Akkumulation von loslichen Substanzen, ist von MOTHES und Mitarbeitern (s. Einlei tung) sehr wahrscheinlich gemacht worden. Auch die Aufnahme del' Aminosauren scheint del' Wirkung des Kinetins zu unterliegen, wie die· Versuche mit D-Leucin-14C

•

tJber den EinfluJ3 des Kinetins auf dieAminosaure-Inkorporation usw.

531

zeigen (Abb. 5). Wir konnen jedoch mit un serer Methodik Aufnahme und Akkumulation nicht eiildeutig trennen, so da13 auch hier eine Akkumulation von n-Leucin in den Zellen der Blattscheiben vorliegen konnte. Diese Ergebnisse bilden eine Parallele zu den Befunden von MOTHES, ENGELBRECHT und SCHUTTE (1961), die mit der ebenfalls nichtproteinogenen Aminosaure a-Aminoisobuttersaure eine Akkumulation am Kinetinort erhielten. Eine ahnliche Akkumulation dieser Aminosaure haben RIGGS und WALKER (1960) in tierischem Gewebe mit Wachstumshormon erreichen konnen. Wir dUrfen also mit Recht beobachtete Neusynthesen als Folgen von erhOhten Akkumulations- oder Aufnahmeprozessen auffassen, wobei Kinetin in einer noch nicht geklarten Weise aktivierend eingreift. Eine solche Aktivierung kinetinbehandelter Blatteile ist nicht von einem in korrelativer Beziehung dazu stehenden, abbauenden Blattgewebe abhangig, welches dem Kinetingewebe die lOslichen Substanzen zur Akkumulation und vermehrter Synthese liefert. Kinetinbespriihte Blattscheiben flir sich steigern auch ihren Aminosaureeinbau. Die Stimulation setzt 1-2 Tage nach der Wirkstoffgabe ein und bleibt langere Zeit erhalten, wird aber erst augenscheinlich, wenn dem Gewebe die Moglichkeit zur Akkumulation gegeben wird, was wir mit der Zugabe radioaktiv markierter Substanzen erreichen und messen konnen (Abb. 2). Nach dieser Feststellung, da13 der Wirkstoff auch isolierten BlattstUcken attraktive Fahigkeiten verleihen kann, erhebt sich die Frage, inwieweit auf Zellorganellen das gleiche zutrifft, so da13 auch innerhalb einer Zelle von akkumulierenden Zentren und Stofftransport gesprochen werden kann. Wir mUssen die Beantwortung dieser Fragen zukUnftigen Untersuchungen Uberlassen. Die Zeit bis zur Auslosung der Kinetinwirkungen betragt unter unseren Versuchsbedingungen meist 20-40 Stun den. Sic ist selbstverstandlich davon abhangig, wie schnell der Wirkstoff an die Reaktionsorte vordringen kann. Aus dies en GrUnden blieben wohl auch die kUrzere Zeiten dauernden Versuche erfolglos (Tabelle 2). Die Gro13e der Wirkung ist eine Konzentrationsfrage und auch damit ein Ausdruck flir die Schnelligkeit des Eindringens des Kinetins. Auf der anderen Seite kann die Moglichkeit des Wirkstoffabbaues nicht vollig au13er acht gelassen werden, da die .Stimulationsfahigkeit langsam nachla13t. In unseren Versuchen haben wir eine deutliche Abhangigkeit der AminosaureInkorporation von der Kinetinkonzentration gefunden. Werden Blattscheiben 24 h auf verschiedene Wirkstoffkonzentrationen aufgelegt und anschlie13end mit radioaktiven Aminosauren geflittert, liegt der hochste Einbau bei 10- 5 bis 10- 6 M Kinetin. Hohere Konzentrationen hemmen die Inkorporation, verglichen mit den Wasserkontrollen, und niedrigere Uben nur einen geringen stimulierenden Einflu13 aus (Abb. 3, 4). Das gleiche Verhalten wird flir die Aufnahme von n-Leucin-14C beobachtet (Abb. 5). Auch die Wasseraufnahme ist konzentrationsabhangig; das ist bereits beschrieben worden (z. B. KURAISHI und OKUMURA 1956, KURAISHI 1959).

532

B.

PARTHIER

Diese Wirkbilder des Kinetins lassen sich an ahnliche der Auxine ankntipfen, ohne da13 hier in extenso die vorhandenen Parallelen zwischen den beiden Wirkstoffen erortert werden sollen. Es darf nur darauf hingewiesen werden, da13 mehrfach eine durch Auxine (IKS) stimulierte Aminosaureaufnahme beschrieben worden ist (z. B. CHRISTENSEN, RIGGS und COYNE 1954, REINHOLD und POWELL 1958). Auch Wirkungen auf den RNS-Stoffwechselliegen vor (z. B. PATAU , DAS und SKOOG 1957, VANDERHAEGHE-HoUGARDY 1957, weitere Literatur bei GALSTON und PURVES 1960), wahrend BOROUGHS 1md BONNER (1953) allerdings keinen Einflu13 auf die Glycininkorporation in die Eiwei13e der Haferkoleoptile gefunden haben. Unsere Befunde tiber die konzentrationsabhangige Wirkung des Kinetins besonders auf die D-Leucinaufnahme sowie dieunspezifischen, allgemeinen Stimulierungen des Stoffwechsels lassen die Annahme nicht abwegig erscheinen, einen primaren Einflu13 des Wirkstoffs auf Zell- bzw. Plasmagrenzschichten oder solcher anderer Zellorganellen zu sehen. Auch GLASZIOU (1957) verlegt den primaren Ort der Kinetinreaktion in die Zellwand. Licht allein wirkt schon erhohend auf die Aminosaure-Inkorporation (STEPHENSON, THIMANN und ZAMECNIK 1956, PARTHIER 1961). Licht undKinetin beeinflussen additiv die Ausdehnung von Blattscheiben (MILLER 1956, SCOTT und LIVERMAN 1956, HUMPHRIES und WHEELER 1960, POWELL und GRIFFITH 1960). In dieser Richtung konnen wir auch unsere Feststellung einordnen, da13 kinetinbehandeltes Tabakblattgewebe im Licht mehr l4C einbaut :und auch aufnimmt als in Dunkelheit (Abb. lA, 3, 5, 6, vgl. auch WOLLGIEHN 1961). Andererseits reagiert das im Dunkeln mit Kinetin vorbehandelte Blattmaterial empfindlicher auf den Wirkstoff als Lichtmaterial (Abb. 4), und verdunkelte oder unter Schwachlicht gehaltene Blatter zeigen sogar Kinetinwirkungen an der intakten Pflanze (Abb. 6). Wintermaterial spricht leichter an als Sommermaterial. In diesem Sinne hat KURAISHI (1959) einen jahreszeitlichen Rhythmus ftir die Kinetinempfindlichkeit beschrieben. Offenbar hangt die Ansprechbarkeit des Gewebes auf den Wirkstoff mit der Kohlenhydratversorgung und damit dem Energiehaushalt zusammen. Vielleicht spielt ATP dabei eine wichtige Rolle (MOTHES und ENGELBRECHT 1961). In dieser Richtung ist auch die hohere Empfindlichkeit alter Blatter gegentiber jungen zu sehen (hier nicht dargestellte Versuche) und ist vielleicht auch die etwas abweichende Kinetinwirkung auf chlorophyllfreie Gewebe zu verstehen (Abb. 1). Ob der hier diskutierte primare EinfluB des Wirkstoffs im Sinne einer Aktivierung von Aufnahme- und Akkumulationsprozessen nur eine Wirkungsweise des Kinetins ist, neben der noch andere, spezifische Einwirkungen auf bestimmte Stoffgruppen angenommen werden mtissen (z. B. Nukleinsauren oder Nukleotide, GUTTMAN 1957, JENSEN und POLLUCK 1958, OLSZEWSKA 1959, KENNELL 1960, THIMANN und LALORAYA 1960, CHWOIKA, WERESCH und KOSEL 1961, TORREY 1961), sei dahingestellt.

-ober den Einflu.B des Kinetins auf die Aminosaure-Inkorporation usw.

533

Zusammenfassung Der Einflu.B des Kinetins auf die Aminosaure-Inkorporation wurde an Blattscheiben von Nicotiana rustica und Nicotiana tabacum studiert. Dabei wurden Glycin-l-14C, DL-Methioninl_14C und D-Leucin- 14 C eingesetzt. Kinetin hemmt in isolierten Blattgeweben nicht nur den Eiwei.Babbau und erhiilt den urspriinglichen Zustand aufrecht, sondern vermag dariiber hinaus das Gewebe anzuregen, vermehrt Aminosauren einzubauen. Auf Grund der Glycinversuche und der 14C-Verteilung in verschiedenen Fraktionen kann geschlossen werden, da.B der Wirkstoff seinen Einflu.B nicht auf spezifische Synthesen ausiibt, sondern Prozesse beeinflu.Bt, die den Synthesen vorausgehen, wie Aufnahme und Akkumulation von Hislichen Substanzen. Die beobachteten erhiihten Synthesen sind lediglich die Folgen solcher durch Kinetin stimulierter Prozesse, wobei der Ort und die Art und Weise des Eingriffs noch ungeklart sind. Versuche mit der nichtproteinogenen Aminosaure D-Leucin- 14 C unterstiitzen diese Annahme. Die Wirkungsart des Kinetins ist von seiner Konzentration abhiingig. Blattscheiben zeigen die hachsten Werte fiir 14C-Einbau oder 14C-Aufnahme, wenn sie 24 h mit Konzentrationen von 10- 5 bis 10- 6 M Kinetin behandelt worden sind. Hahere Wirkstoffkonzentrationen wirken hemmend, verglichen mit den Kontrollen. Es gibt mehrere Hinweise dafiir, da.B die Kinetinwirkungen nach Vorbehandlung des Untersuchungsmaterials in Dunkelheit ausgepragter sind als nach Lichtvorbehandlung. Auch weitere Versuche weisen auf eine Abhangigkeit der Kinetinwirkung vom Vorleben des Blattes hin, wobei dem Ernahrungszustand eine bedeutende Rolle zugeschrieben werden kann. Sowohl junges wie altes Blattgewebe spricht auf Kinetin an, wobei die Zeitdauer der Isolation die Empfindlichkeit der verschiedenen Gewebe beeinflu.Bt.

Summary . The influence of kinetin on the incorporation of amino acids has been studied with leafdisks of Nicotiana rustica and Nicotiana tabacum. Glycine-l-14C, DL-methionine-l- 14 C, and Dleucine- 14 C have been employed for the investigations. Kinetin inhibits not only the degradation of protein in isolated leaf tissue but is able to stimulate the incorporation of amino acids. Based on the investigations with glycine and the following distribution of 14C in different fractions we may conclude that a primary effect of kinetin is not due to specific reactions of synthesis. Therefore, we suggest a stimulatory influence of kinetin on processes preceding synthesis, like uptake or accumulation of soluble substances, and the observation of increased synthesis is merely the consequence of such kinetin-stimulated processes. Investigations carried out :with the non-proteinogenous amino acid D-Ieucine-14C will support this assumption. Evidence is presented that the effect of kinetin is dependent on its concentration. Leafdisks show the highest rate of incorporation or uptake of 14C, if they have been treated with 10- 5 to 10- 6 M kinetin for 24 hours. Higher concentrations give rise to an inhibiting effect, compared with the controls. There are some indications that the influence of kinetin appears more clearly after pretreatment in darkness than in light. Further obtained investigations also suggest the dependence of the influence of kinetin on the former 'life of the leaf tissue, i. e. of its nutrition stage. Both young and old tissues are affected by kinetin, their sensitivity for this substance depends upon the duration of their isolation.

534

B. PARTHIER, Uber den EinfluB des Kinetins auf die Aminosaure-Inkorporation usw.

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