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Beziehungen zwischen Enzymaktivitäten und Krankheitsresistenz von Pflanzen1)
Riochem. Physiol. Pflanzen 168, S. 597 -606 (1975)
Beziehungen zwischen Enzym.aktivitaten und Krankheitsresistenz von Pflanzen l ) H. HOFFEREK
und
H.
W OLFFGANG
Institut fiir Phytopathologie der AdL, Aschersleben
Correlations Between Enzyme Activities and Disease Resistance in Plants I. Activity of Peroxidase in Barley after Yellow-rust Infection
Key Term Index: isoenzymes, peroxidase, rust infection, resistance; Hordeum vulgare, Puccinia striiformis.
Summary Earlier work with 16 barley varieties, differing in resistance against stripe rust had shown striking differences of the activity of a peroxidase isoenzyme (IPO-23) between susceptible and resistant uninfected plants. In this work we were studying the influence of infection on IPO-23 activity. IPO-23 is found in the roots only. In susceptible varieties soon after infection (3. -10. day) of the primary leaves strong, then decreasing changes of activity appear. In resistent varieties activity changed far less. The changes are most pronounced before symptoms appear. All that leads to the conclusion that IPO-23 has important regulatory functions.
Einleitung
Untersuchungen an Gerstensorten unterschiedlicher Resistenz gegen Gelbrost (Puccinia striiformis West.) hatten gezeigt, daB in den Aktivitaten multipler molekularer Formen der Peroxidase starke und im Verlaufe der Pflanzenentwicklung veranderliche prainfektionelle Unterschiede zwischen den Sorten bestehen. Ein Vergleich dieser Unterschiede mit den zuvor ermittelten Unterschieden im Resistenzverhalten der Sorten lieB - wenn auch bis dahin nur bei bestimmten Sortengruppen - einen Zusammenhang erkennen, der auf dem besonderen Aktivitatsverhalten eines in allen gepriiften Sorten vorkommenden Isoenzyms beruht. Abb.1 zeigt einige Densitogramme von Polyacrylamidgel-Disc-Elektropherogrammen von Isoperoxidasen. Daraus geht hervor, daB bei der Isoperoxidase der relativen Position 23 (IPO 23) auffallende Aktivitatsunterschiede zwischen Sorten oder bestimmten Sortengruppen vorkommen. Die von den einzelnen Sorten gezeigten Densitogramme sind nach zunehmender Gelbrostresistenz der Sorten geordnet (R 1-R 9). Die IPO-23Aktivitaten der hochanfalligen Sort en (R 1-R 3) zeigen wesentlich geringere Aktivitaten als die der resistenten Sorten (R 8-R 9). Bei den weniger anfalligen bzw. weniger resistenten Sorten (R 5-R 7) lassen sich derartige Beziehungen nicht eindeutig feststellen: Es treten sowohl hohe als auch niedrige Aktivitaten auf. Die Unterschiede in den Aktivitaten der IPO 23 sind aber auch hier deutlich ausgebildet. Die Aktivitats1) Herrn Prof. Dr. h. c. multo K.
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75. Geburtstage gewidmet.
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Abb.1. Aktivitiit der Peroxidaseisoenzyme in den Wurzeln nichtinfizierter Pflanzen (Hordeum vulgare L.). Densitogramme vom 21. Tag nach der Aussaat, geordnet nach zunehmender Gelbrost-Resistenz (R 1- R 9) der Sorten. Abszisse: Rp = relative Bandenposition im Zymogramm.
anderungen der Isoperoxidasen in den einzelnen Sorten sind unterschiedIich; es konnten steigende, fallen de - dabei in der Zeit auch oszillierende - und nahezu gleichbleibende Tendenzen im Aktivitatsverlauf wahrend der Pflanzenentwicklung beobachtet werden. Die Sortenunterschiede der Aktivitatsanderungen sind bei IPO 23 am deutlichsten ausgepragt. Es ist allgemein bekannt, daB multiple molekulare Enzymformen die gleiche Reaktion katalysieren und auch sonst einander sehr ahnIich sind, sich aber meist in Eigenschaften unterscheiden, die fiir die Regulation ihrer Aktivitat von Bedeutung sind. Wir vermuten, daB das Enzym IPO 23 wichtige Regel- und Kontrollfunktionen im Stoffwechselgeschehen ausiibt. Pathogene Infektionen losen bei Pflanzen tiefgreifende Veranderungen aus, deshalb erschien es angebracht, den EinfluB der Gelbrostinfektion auf Isoenzyme in Gerstenpflanzen verschiedener Resistenz zunachst bei solchen Enzymen naher zu studieren, deren Aktivitaten sich stark veranderten. Die vorIiegende Arbeit ist ein Teilergebnis dieser Untersuchungen.
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Beziehungen zwischen Enzymaktivitiit und Krankheitsresistenz
Material und Methoden Pflanzenmaterial. - Fiir die Untersuchungen wurden folgende Gerstensorten benutzt (geordnet nach zunehmender Gelbrostresistenz): resistente Sorten
anfiillige Sorten Xenia Dornburger Heils Franken Abed Binder 12
(R 1) (R 1) (R 5)
Stotz's Salemer Japan 1 Bigo
(R 6)
(R9) (R 9)
Anzucht der Versuchspflanzen. - Die Anzucht der Pflanzen erfolgte im Klimahaus (WACHE und WOLFFGANG 1966) des Instituts. Das Saatgut wurde in Spezialwannen (60 x 80 cm, 6 cm hoch), die mit Sand gefiillt waren, ausgelegt. Einmal in der Woche wurde mit Niihrlosung (0,5 g Harnstoff, 0,5 g K2 HP04 , 5 Tropfen einer 5%igen FeCIs-Losung je Liter Wasser), sonst mit Leitungswasser gegossen. Um gute Infektionserfolge zu gewiihrleisten, muBten die Pflanzen bei 14°C gehalten werden. Die Bedingungen in den Klimazellen wurden bei der Anzucht und Versuchsdurchfiihrung konstant gehalten, Temperatur 14°C am Tage und nachts; Licht: 16 h Tagesliinge; Beleuchtung ausschlieBlich durch Mischlicht aus Leuchtstofflampen vom Typ Narva LS 65 weiB und LS 65 Lumoflor, die im Verhiiltnis 1: 1 angeordnet waren. Beleuchtungsstiirke war etwa 1800 lx, relative Luftfeuchte 70 %. In jedem Versuch wurden 2 Sorten miteinander verglichen, jeder Vergleich wurde 3fach wiederholt. Infektion der Versuchspflanzen. - Die Infektion der Pflanzen erfolgte mit Sporen der Rasse R 24, die mit Talkum im Verhiiltnis 1: 1 (gIg) gemischt worden waren. Infiziert wurde am 11. Tage nach der Aussaat. Das Infektionsmaterial wurde mit einem Pinsel auf das 1. Blatt (Primiirblatt) aufgetragen, die Wachsschicht der Bliitter war zuvor durch Abstreifen mit warmem Wasser entfernt worden. Dann wurden mit feuchtem FlieBpapier ausgelegte Perfolhauben 3 Tage lang iiber die infizierten Pflanzen gestellt. Die gesunden Kontrollen wurden unter den gleichen Bedingungen gehalten. Bewertung des Infektionsverlaufes. - Die Bewertung erfolgte mit Hilfe eines BoniturSchliissels mit 6 Kennziffern fiir das Symptombild (Standardverfahren): Kennziffer Symptome
1
2
3
4
5
6
Chlorosen Pusteln
keine keine
schwach keine
stark keine
vorhanden schwach
vorhanden stark
keine vorhanden
Die Kennziffern wurden fiir je etwa 100 zufiillig entnommene Pflanzen ermittelt. Aus der Hiiufigkeit der Kennziffer errechnet sich nach Kennziffer x Hiiufigkeit (in % der Pflanzen) der Befallsgrad der Population. Er kann demnach zwischen 100 (alle Pflanzen symptomfrei, hOchste Resistenz) und 600 (aIle Pflanzen mit Symptomen der Kennziffer 6, hOchste Anfiilligkeit) liegen. Die Bewertungszahlen wurden jeweils am Tage der Probenahme ermittelt (Beobachtungszeitraum: 3. - 27. Tag nach der Infektion). Probenahme. - Es wurden am 3.,6.,10.,13.,17.,20.,24. und 27. Tag nach der Infektion jeweils etwa 50 Pflanzen entnommen, gewaschen und zwischen FlieBpapierbogen getrocknet. Die Pflanzen wurden dann in 3 Proben je Sorte geteilt: in Wurzel, Primiirblatt und restlichen SproB. Nach der Frischgewichtsbestimmung durch Wiigung erfolgte die weitere Aufarbeitung der einzelnen Proben.
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Bestimmung der IPO-23-Aktivitiit. - Das Probenmaterial wurde in der Reibschale mit Quarzsand und Aqua dest. (mljg Frischgewicht, 1: 1) zerrieben, zentrifugiert und der zellfreie Enzymextrakt fUr die Auftrennung der Isoenzyme verwendet. Die Auftrennung der Isoperoxidasen erfolgte in 7,5%igem Polyacrylamidgel nach ORNSTEIN und DAVIS (1962) wie bei MAURER (1971) beschrieben. In allen Versuchen wurden aliquote Anteile (0,1 ml) der Enzymextrakte eingesetzt. Als Elektrolytpuffer diente 1 m Tris-Glycin-Puffer, pH 8,3; es wurden parallel jeweils 2 Disc-Elektropherogramme hergestellt. Der Nachweis der in den Disc-Elektropherogrammen getrennten Isoperoxidasen erfolgte nach SEEVERS et al. (1971). Die Gele wurden in der Substratliisung bei 25 DC (Wasserbadthermostat) 30 min inkubiert. Die so hergestellten Zymogramme wurden durch Behandlung mit 2%iger Essigsiiure fixiert und anschlieBend nach einem von uns bereits friiher beschriebenen Verfahren densitometrisch ausgewertet (HOFFEREK et al. 1973). Die densitometrisch gemessene Bandenintensitiit im Zymogramm entspricht der IPO-23-Aktivitiit. Es wurde jeweils der Mittelwert aus den 2 parallel gewonnenen Zymogrammen benutzt.
Ergebnisse
1. EinfluB der Infektion auf die IPO-23-Aktivitat Gelbrostinfektionen verandern die IPO-23-Aktivitaten der Gerstenpflanzen verschiedenen Resistenzgrades unterschiedlich, bei den anfalligen Sorten starker als bei den resistenten Sorten; diese Unterschiede treten bereits in der erst en Infektionsphase auf. Abb. 2 zeigt, daB die Aktivitaten bei den 3 anfalligen Sorten ("Xenia", "Dornburger Heils Franken", "Abed Binder 12") etwa bis zum 13. Tag nach der Infektion auffallend groB werden. Dabei treten Phasenunterschiede zwischen den Sorten ein. Die Aktivitaten werden mit zunehmendem Infektionsalter allmahlich wieder normalisiert, am 27. Tage nach der Infektion bestehen nur noch geringfiigige Unterschiede gegeniiber gesunden Pflanzen (Abb. 2). Abb. 3 zeigt den EinfluB der Infektion auf die IPO-23-Aktivitaten bei 3 resistenten Sorten ("Stotz's Salemer", "Japan 1", "Bigo"). Die in der friihen Infektionsphase auftretenden Veranderungen betragen maximal urn 60 %. Dabei weisen die infizierten resistenten Pflanzen meistens geringere Aktivitaten auf als die nichtinfizierten Kontrollen. Abb. 3 zeigt auBerdem, daB sich bei der Sorte "J~pan 1" die Enzymaktivitiit mit zunehmendem Alter der Infektion erh6ht, spater aber wieder auf die Kontrollwerte absinkt. Bei den beiden anderen Sorten ("Stotz's Salemer", "Bigo") treten dann kaum noch wesentliche Abweichungen auf. Hier, wie auch bei den anfalligen Sorten, wird die Tendenz Zl,lr Normalisierung der veranderten Isoenzymaktivitat in der spateren Phase des Infektionsablaufes erkennbar; am 27 .. Tage nach der Infektion bestehen kaum noch Unterschiede zwischen resistenten und anfiilligen Sorten (vgl. Abb. 2 und 3).
2. Aktivitiitsanderung und Infektionsverlauf Die von uns in der friihen Infektionsphase beobachteten starken Veranderungen der IPO-23-Aktivitaten (Abb. 2) treten noch vor dem Erscheinen der fUr Gelbrostinfektionen typischen Krankheitssymptome auf. Urn einen Einblick in diese physiologischen Prozesse zu erhalten, werden die pathogeninduzierten Veranderungen der Enzymaktivitat mit dem Verlauf der Infektion verglichen.
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Aus Abb. 4 und 5 geht hervor, daB die ersten Krankheitssymptome etwa 10 Tage nach der Infektion erkennbar werden - also erst dann, wenn die Aktivitatsabweichungen in den anfalligen und resistenten Pflanzen ihre maximalen Werte bereits durchlaufen haben (vgl. Abb. 4, 5; 6 dpi). Das bedeutet, daB diese Aktivitatsveranderungen und die Symptomauspragung zeitlich unterschiedlich einsetzen: Nach der Infektion verandern sich zunachst die Aktivitaten des Isoenzyms, dann erst erfolgt die Ausbildung der Symptome. An dem direkten kausalen Zusammenhang zwischen diesen Ereignissen ist nicht zu zweifeln. Wegen der Komplexitat und Kompliziertheit der stoffwechselphysiologischen Prozesse kann tiber seine Art noch nichts ausgesagt werden. Abb. 4 und 5 zeigen ferner, daB sich die Symptome mit zunehmendem InfektionsaIter verstarken; die Symptomausbildung ist bei der Sorte "Abed Binder 12" - gemessen an den ermitteIten Bewertungszahlen - ungefahr doppeIt so stark als bei der Sorte "Stotz's Salemer". In der gleichen Zeit treten Abweichungen von der normalen Enzym% der Ifunfrolle 500
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3 2 Abb.2. Aktiritiitsiinderung des IPO-23-Enzyms in den Wurzeln nack Gelbrostinfektion der Primiirbliitler anfiilliger Pflanzen. Abszisse: dpi = Tage nach der Infektion. Sorte "Abed Binder 12" ( - - ) ; Sorte "Xenia" (-------); Sorte "Dornburger Heils Franken" (-.-.-.-). Abb.3. Aktivitiitsiinderung des IPO-23-Enzyms in den Wurzeln nack Gelbrostinfektion der Primiirbliitler resistenter Pflanzen. Abszisse: dpi = Tage nach der Infektion. Sorte "Stotz's Salemer" ( - - ) Sorte "Bigo" (--------); Sorte "Japan 1" (-. -' -' -' -).
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aktivitat nur bei der anfalligeren der beiden Sorten deutlicher auf. Ein Vergleich dieser Aktivitatsveranderungen mit dem Infektionsverlauf tiber den Zeitraum yom 10. bis zum 27. Tag nach der Infektion laBt aber keinen allgemeinen Zusammenhang erkennen. Bei der Sorte "Abed Binder 12" besteht nur vortibergehend (10. -13. Tag) eine zeitliche Parallelitat zwischen dem erneuten Anstieg der Enzymaktivitat und dem in der gleichen Zeitspanne beobachteten Verlauf der Infektion (Abb. 4). Hier ist also eine unmittelbare Beziehung zwischen Aktivitiitsveranderung und Symptombildung nicht auszuschlieBen. 3. Beziehung zwischen IPO-23-Aktivitat und Infektionserfolg Am Beispiel der beiden Sort en "Abed Binder 12" und "Stotz's Salemer" soll nun gezeigt werden, daB sich Veranderungen des Infektionserfolges und Unterschiede in den Aktivitatsveranderungen entsprechen (vgl. dazu auch Abb. 4, 5). Diese Beziehungen sind in Abb. 6 dargestellt. Die im Diagramm eingetragenen Werte entsprechen den MeBergebnissen aus 3 gleichartigen Versuchsserien mit unterschiedlichen Infektionserfolgen. Die Anlage der einzelnen Versuche entspricht den in der Abb. 4 und 5 enthaltenen Angaben (Beobachtungszeitraum: 3.-27. Tag nach der Infektion). In jedem Versuch wurden die beiden Sort en miteinander verglichen. In der Abb. 6 ist die Summe der Differenzen ("Abed Binder 12" - "Stotz's Salemer") der Aktivitaten zwischen den beiden Sorten aufgetragen gegen die Summe der Differenzen der Befallsgrade. Es werden also die Sortenunterschiede der Enzymaktivitaten den Unterschieden der Befallsgrade gegentibergestellt. Die 3 Versuchsserien ergeben so
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Abb.4. Aktivitiitsiinderung des IPO-23-Enzyms in der Wurzel und Infektionsverlauf nach Gelbrostinfektion des Primiirblattes. Abszisse: dpi = Tage nach der Infektion. Aktivitatsanderung, bezogen auf die gesunde Kontrolle (Wurzel, -------); Infektionserfolg (Primarblatt, - - ) Sorte "Abed Binder 12". Abb.5. Aktivitatsiinderung des IPO-23-Enzyms in der Wurzel und Infektionsverlauf nach Gelbrostinfektion des Primiirblattes. Erklarungen wie Abb. 4. Sorte "Stotz's Salemer".
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3 "MeJ3werte" im Diagramm (Abb. 6). Dieses zeigt, daJ3 eine direkte Abhangigkeit der Enzymaktivitat yom BefaIlsgrad besteht. Diskussion
Die Aktivitaten der in der Wurzel vorkommenden Peroxidase IPO-23 (Abb. 2 und 3) legen die Vermutung nahe; daJ3 pathogene Faktoren yom infizierten Primarblatt aus die normalen physiologischen Prozesse des Wurzelsystems storen: Die Isoperoxidaseaktivitat verandert sich auf Grund der in die Wurzel translocierten Storungseinwirkung der Gelbrostinfektion gegentiber dem Sollwert (Wert der entsprechenden gesunden KontroIle). Als Reaktion auf die Starung treten ausgepragte, stark gedampfte Schwingungen der Aktivitat auf, die in ihrem AusmaJ3 u. a. yom BefaIlsgrad bzw. der Infektionsphase abhangen. Da die biologische Funktion des IPO-23-Enzyms unbekannt ist, lassen sich keine Aussagen dartiber machen, welche Stoffwechselvorgange so heftig auf diese Starung reagieren. Es soIl in diesem Zusammenhang auf die Moglichkeit hingewiesen werden, daJ3 rhythmische Anderungen in der Konzentration von Metaboliten unmittelbar oder tiber Zwischenwirkungen entsprechende Veranderungen in der Aktivitat von Enzymen bewirken konnen. Betrachtet man den Wirt-Erreger-Komplex als ein stoffwechselphysiologisches System, so ist vorstellbar, daJ3 sich diese Beziehungen auch in Konzentrationsanderungen der beteiligten Metabolite manifestieren; im wechselseitigen Austausch beeinflussen beide Partner einander. Dazu gehOrt die Aufnahme von Intermediarprodukten der Pflanze, die Abgabe von toxischen Substanzen oder vielleicht anderer Wirkstoffe durch den Pilz. Diese Wechselwirkungen spielen sich primar aber an den Infektionsorten ab, also im vorliegenden FaIle im befallenen Gewebe des 1. Blattes - hier konnen die verschiedenen Mechanismen der Regulation des Zellstoffwechsels zunachst wirksam werden.
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Abb.6. Beziehung zwischen Sortenunterschieden im Infektionserfolg und Sortenunterschieden in der Aktivitiitsiinderung des IPO-23-Enzyms. "Abed Binder 12" und "Stotz's Salemer". Nahere Erlauterungen siehe Text.
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Die vorliegenden Untesruchungen zeigen, daB es bei der Auseinandersetzung mit dem Pathogen in anfalligen Pflanzen zu auffallend starken Veranderungen in der Aktivitat eines Isoenzyms - des Enzyms IPO-23 - kommt, wahrend in resistenten Pflanzeu nur geringfUgige Aktivitatsveranderungen auftreten. Nach vorlaufigen Befunden liegen ahnliche Verhaltnisse bei 2 weiteren Gerstensorten vor, die z. Z. unter den gleichen Bedingungen untersucht werden. In diesen Beispielen waren also die Unterschiede im Aktivitatsverhalten der Isoperoxidase zumindest formal mit den Befallsunterschieden in Beziehung zu bringen. Bei Spekulationen iiber die Interpretation der beobachteten Effekte muB das normale Aktivitatsniveau beriicksichtigt werden: In den nichtinfizierten anfiilligen Pflanzen liegen die Werte fUr die IPO-23-Aktivitat meistens niedriger als die der resistenten Sorten. Die Sortenunterschiede im Aktivitatverlauf des Enzyms IPO-23 zeigen eine so groBe MannigfaItigkeit, daB eine kooperative Wirkung verschiedenartiger Mechanismen nicht auszuschlieBen ist. Das ist angesichts der Vermaschung und Interferenz biologischer Regelsysteme auch nicht anders zu erwarten; das Resistenzgeschehen muB deshalb als komplexer ProzeB aufgefaBt werden, dabei konnen u. U. verschiedene Prinzipien wirksam werden, die die Entwicklung des Gelbrostes in der befallenen Pflanze beeinflussen (WOLFFGANG 1975). Auch ohne die Bedeutung der pathogeninduzierten Aktivitatsveranderungen der IPO-23 fUr das Resistenzverhalten der einzelnen Sort en vorerst genau zu kennen, ist fUr die Resistenzphysiologie von besonderem Interesse, daB diese Veranderungen bereits in der friihen Infektionsphase, d. h. noch vor der Ausbildung der Krankheitssymptome, auftreten (Abb. 4 und 5). Der beobachtete Effekt kann deshalb nicht eine Folge der Symptombildung sein - zumindest nicht bis zum etwa 10. Tag nach der Infektion (spater in Erscheinung tretende Aktivitatsveranderungen konnten dagegen mit den Prozessen der Symptomauspriigung in einem Zusammenhang gebracht werden). Da es sich hier urn ein wurzelspezifisches Isoenzym handeIt, das in den oberirdischen Pflanzenteilen nicht vorkommt, und seine Aktivitiit bei den anfiilligen Sorten wesentlich verandert werden kann, darf angenommen werden, daB stoffwechselphysiologische Korrelationen zwischen Wurzel und SproB einen EinfluB auf die Manifestation der Gelbrostinfektion im 1. Blatt ausiiben. AusmaB und Richtung der induzierten Abweichungen von den normalen Wurzel-SproB- Korrelationen konnten demnach evtl. entscheidend fUr die Befallsstarke sein. Es ist vorstellbar, daB Wirkstoffe - vielleicht wuchsstoffoder kinctinahnliche Verbindungen des Pilzes - wahrend der Infektion das IPO-23Enzymsystem in den anfalligen Pflanzen stark beeinflussen; das so angeregte Enzymsystem konnte dann weitere stoffwechselphysiologische Prozesse auslOsen, die die Entwicklung des Gelbrostes fordern oder vielleicht sogar erst ermoglichen. Da die beobachtete Aktivitatsveranderung des Isoenzyms voriibergehend ist, konnte dies bedeuten, daB das Enzym eine Schaltfunktion im intermediiiren Stoffwechsel ausiibt. Es ist bekannt, daB Phytohormone (Auxine, Gibberelline, Cytokinine, Athylen) die Aktivitat der Peroxidase (EC 1.11.1. 7) in Pflanzen kontrollieren konnen (GALSTON et al. 1967, GALSTON und DAVIES 1969, STUBER und LEVINGS 1969). Die Aktivitatsanderungen erfolgen hier durch Regulation der Genaktivitat, d. h. durch Induktion bzw. Repression der Peroxidasesynthese (HESS 1968).
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Auf der metabolischen Ebene fungieren phenolische Stoffe entweder als Stimulatoren oder als Inhibitoren der Peroxidasen (PAUL 1963). Die Peroxidaseaktivitat ist mithin eine Funktion des koordinierten Zusammenwirkens des genetischen Apparates, der Phytohormone und der einwirkenden endogenen und exogenen Faktoren. Es ist noch umstritten, welche Rolle dieses Enzymsystem im Stoffwechsel spielt. Ftir die Peroxidase in der Pflanze wird eine Funktion als IESabbauendes Enzym (PSENAKOVA und KOLEK 1972), bei Respirationsvorgangen (BURRIS 1960), bei Hydroxylierungen (PAUL 1963), bei der Polymerisation des Lignins (FREUDENBERG 1965; YOUNG und STEELINK 1973) und bei der Oxidation biologisch aktiver Proteine (SIZER 1953) diskutiert. Soweit bisher an verschiedenen Wirt-Pathogen-Kombinationen untersucht, ist eine Veranderung der Peroxidaseaktivitat in der infizierten Pflanze bei diesem Enzymsystem im Prinzip der einzige Effekt, der in einen Zusammenhang mit der Pathogenese gebracht werden kann. Die tatsachlich in der WirtspfIanze ablaufenden Prozes~e und die Bedeutung der multiplen Enzymformen der Peroxidase im komplexen Resistenzgeschehen sind nicht bekannt; vielfach werden aber Zusammenhange mit dem StoffwechseI einfacher phenolischer Verbindungen vermutet, einige dieser Verbindungen wirken als spezifische Resistenzfaktoren (GOODMAN et aI. 1967, STAHMANN und DEMOREST 1973). Das von uns aufgefundene Isoenzym IPO-23 konnte also in der gesunden und in der kranken Pflanze an Regulationsvorgangen beteiligt sein, die Prozesse steuern, die zu einer Veranderung des Resistenzverhaltens der Pflanze ftihren. So ist bekann t, daB die Temperaturbedingungen auf Anfalligkeit bzw. Resistenz und die Pathogenese von Pflanzen tiefgreifende Einfltisse austiben konnen. Spezielle Experimente haben aber gezeigt, daB die Aktivitat dieses Isoenzyms auffallend temperaturempfindlich ist; die Untersuchungen werden deshalb zunachst in dieser Richtung weitergeftihrt. Literatur BURRIS, R. H., Hydroperoxidases (peroxidase and catalase). In: Handbuch der Pflanzenphysiologie, Bd. 12, S. 365-400.1960. Berlin-Giittingen-Heidelberg 1960. FREUDENBERG, K., Lignin: its constitution and formation from p-hydroxy-cinnamoyl alcohols. Science 148, 595-600 (1965). GALSTON, A. W., and DAVIES, P. J., Hormonal regulation in higher plants. Science 163, 1288-1297 (1969). L:\VEE, S., and SIEGEL, B. Z., The induction and repression of peroxidase isoenzymes by 3indolacetic acid. Proc. 6th Int. Conf. Plant Growth Substances, Ottawa 1967, S.455-472 (1967). GOOD)UN, R. N., KIRALY, Z., and ZAITLIN, M., The Biochemistry and Physiology of Infectious Plant Disease. D. van Nostrand, Princeton-Toronto-London-Melbourne 1967. HESS, D., Biochemische Genetik. Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1968. HOFFEREK, H., SPOHN, H.-J., und PROLL, E., Densitometrie von Protein-Disc-Elektropherogrammen. Jenaer Rundschau 18, 140-147 (1973). MAURER, H. R., Disc Electrophoresis and Related Techniques of Polyacrylamide Gel Electrophoresis. W. de Gruyter, Berlin-New York 1971. ORNSTEIN, L., and DAVIS, B. J., Disc Electrophoresis. Distillation Products Division, Eastman Kodak Co., 1962.
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PAUL, K. G., Peroxidase. In: P. D. Boyer, H. LARDY and K. MYRBACK, The enzymes, vol. 8, p. 227 to 274. Academic Press, New York and London 1963. P!lENAKovA, T., und KOLEK, J., Studium der Enzymdegradation der Indolyl-3-essigsaure in der Wurzel von Getreidemais (Zea mays L.). Biochem. Physiol. Pflanzen 163, 536-544 (1972). SEEVERS, P. M., DALY, J. M., and CATEDRAL, F. F., The role of peroxidase isozymes in resistance to wheat stem rust disease. Plant Physiol. 48, 353-360 (1971). SIZER, I. W., Oxidation of proteins by tyrosinase and peroxidase. Advanc. Enzymol. 14, 129-161 (1953). STAHMANN, M. A., and DEMOREST, D. M., Changes in enzymes of host and pathogen with special reference to peroxidase interaction. In: R. J. W. BYRDE and C. V. CUTTING, Fungal Pathogenicity and the Plants Response. Third Long Ashton Symposium 1971, pp. 405-420 (1971). STUBER, C. W., and LEVINGS, C. S., Auxin induction and repression of peroxidase isoenzymes in oats (Avena sativa L.). Crop Sc. 9, 415-416 (1969). WACHE, H.-W., und WOLFF GANG, H., Das Klimahaus des Institutes fur Phytopathologie Aschersleben. Arch. Gartenbau 14, 583-596 (1966). W OLFFGANG, H., Krankheitsresistenz von Pflanzen, ein komplexer Proze!!. Acta Phytopathologica Acad. Sci. Hungaricae - im Druck (1975). YOUNG, M., and STEELINK, C., Peroxidase catalyzed oxidation of naturally-occurring phenols and hardwood lignins. Phytochemistry 12, 2851- 2861 (1973). Eingegangen 8. Marz 1975. Anschrift der Verfasser: Dr. H. HOFFEREK und Dr. H. WOLFF GANG, Institut fiir Phytopathologie der AdL, 432 Aschersleben, Theodor-Roemer-Weg 3.
Beziehungen zwischen Enzym.aktivitaten und Krankheitsresistenz von Pflanzen l ) H. HOFFEREK
und
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W OLFFGANG
Institut fiir Phytopathologie der AdL, Aschersleben
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Key Term Index: isoenzymes, peroxidase, rust infection, resistance; Hordeum vulgare, Puccinia striiformis.
Summary Earlier work with 16 barley varieties, differing in resistance against stripe rust had shown striking differences of the activity of a peroxidase isoenzyme (IPO-23) between susceptible and resistant uninfected plants. In this work we were studying the influence of infection on IPO-23 activity. IPO-23 is found in the roots only. In susceptible varieties soon after infection (3. -10. day) of the primary leaves strong, then decreasing changes of activity appear. In resistent varieties activity changed far less. The changes are most pronounced before symptoms appear. All that leads to the conclusion that IPO-23 has important regulatory functions.
Einleitung
Untersuchungen an Gerstensorten unterschiedlicher Resistenz gegen Gelbrost (Puccinia striiformis West.) hatten gezeigt, daB in den Aktivitaten multipler molekularer Formen der Peroxidase starke und im Verlaufe der Pflanzenentwicklung veranderliche prainfektionelle Unterschiede zwischen den Sorten bestehen. Ein Vergleich dieser Unterschiede mit den zuvor ermittelten Unterschieden im Resistenzverhalten der Sorten lieB - wenn auch bis dahin nur bei bestimmten Sortengruppen - einen Zusammenhang erkennen, der auf dem besonderen Aktivitatsverhalten eines in allen gepriiften Sorten vorkommenden Isoenzyms beruht. Abb.1 zeigt einige Densitogramme von Polyacrylamidgel-Disc-Elektropherogrammen von Isoperoxidasen. Daraus geht hervor, daB bei der Isoperoxidase der relativen Position 23 (IPO 23) auffallende Aktivitatsunterschiede zwischen Sorten oder bestimmten Sortengruppen vorkommen. Die von den einzelnen Sorten gezeigten Densitogramme sind nach zunehmender Gelbrostresistenz der Sorten geordnet (R 1-R 9). Die IPO-23Aktivitaten der hochanfalligen Sort en (R 1-R 3) zeigen wesentlich geringere Aktivitaten als die der resistenten Sorten (R 8-R 9). Bei den weniger anfalligen bzw. weniger resistenten Sorten (R 5-R 7) lassen sich derartige Beziehungen nicht eindeutig feststellen: Es treten sowohl hohe als auch niedrige Aktivitaten auf. Die Unterschiede in den Aktivitaten der IPO 23 sind aber auch hier deutlich ausgebildet. Die Aktivitats1) Herrn Prof. Dr. h. c. multo K.
I
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75. Geburtstage gewidmet.
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H. WOLFFGANG JP023
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Abb.1. Aktivitiit der Peroxidaseisoenzyme in den Wurzeln nichtinfizierter Pflanzen (Hordeum vulgare L.). Densitogramme vom 21. Tag nach der Aussaat, geordnet nach zunehmender Gelbrost-Resistenz (R 1- R 9) der Sorten. Abszisse: Rp = relative Bandenposition im Zymogramm.
anderungen der Isoperoxidasen in den einzelnen Sorten sind unterschiedIich; es konnten steigende, fallen de - dabei in der Zeit auch oszillierende - und nahezu gleichbleibende Tendenzen im Aktivitatsverlauf wahrend der Pflanzenentwicklung beobachtet werden. Die Sortenunterschiede der Aktivitatsanderungen sind bei IPO 23 am deutlichsten ausgepragt. Es ist allgemein bekannt, daB multiple molekulare Enzymformen die gleiche Reaktion katalysieren und auch sonst einander sehr ahnIich sind, sich aber meist in Eigenschaften unterscheiden, die fiir die Regulation ihrer Aktivitat von Bedeutung sind. Wir vermuten, daB das Enzym IPO 23 wichtige Regel- und Kontrollfunktionen im Stoffwechselgeschehen ausiibt. Pathogene Infektionen losen bei Pflanzen tiefgreifende Veranderungen aus, deshalb erschien es angebracht, den EinfluB der Gelbrostinfektion auf Isoenzyme in Gerstenpflanzen verschiedener Resistenz zunachst bei solchen Enzymen naher zu studieren, deren Aktivitaten sich stark veranderten. Die vorIiegende Arbeit ist ein Teilergebnis dieser Untersuchungen.
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Beziehungen zwischen Enzymaktivitiit und Krankheitsresistenz
Material und Methoden Pflanzenmaterial. - Fiir die Untersuchungen wurden folgende Gerstensorten benutzt (geordnet nach zunehmender Gelbrostresistenz): resistente Sorten
anfiillige Sorten Xenia Dornburger Heils Franken Abed Binder 12
(R 1) (R 1) (R 5)
Stotz's Salemer Japan 1 Bigo
(R 6)
(R9) (R 9)
Anzucht der Versuchspflanzen. - Die Anzucht der Pflanzen erfolgte im Klimahaus (WACHE und WOLFFGANG 1966) des Instituts. Das Saatgut wurde in Spezialwannen (60 x 80 cm, 6 cm hoch), die mit Sand gefiillt waren, ausgelegt. Einmal in der Woche wurde mit Niihrlosung (0,5 g Harnstoff, 0,5 g K2 HP04 , 5 Tropfen einer 5%igen FeCIs-Losung je Liter Wasser), sonst mit Leitungswasser gegossen. Um gute Infektionserfolge zu gewiihrleisten, muBten die Pflanzen bei 14°C gehalten werden. Die Bedingungen in den Klimazellen wurden bei der Anzucht und Versuchsdurchfiihrung konstant gehalten, Temperatur 14°C am Tage und nachts; Licht: 16 h Tagesliinge; Beleuchtung ausschlieBlich durch Mischlicht aus Leuchtstofflampen vom Typ Narva LS 65 weiB und LS 65 Lumoflor, die im Verhiiltnis 1: 1 angeordnet waren. Beleuchtungsstiirke war etwa 1800 lx, relative Luftfeuchte 70 %. In jedem Versuch wurden 2 Sorten miteinander verglichen, jeder Vergleich wurde 3fach wiederholt. Infektion der Versuchspflanzen. - Die Infektion der Pflanzen erfolgte mit Sporen der Rasse R 24, die mit Talkum im Verhiiltnis 1: 1 (gIg) gemischt worden waren. Infiziert wurde am 11. Tage nach der Aussaat. Das Infektionsmaterial wurde mit einem Pinsel auf das 1. Blatt (Primiirblatt) aufgetragen, die Wachsschicht der Bliitter war zuvor durch Abstreifen mit warmem Wasser entfernt worden. Dann wurden mit feuchtem FlieBpapier ausgelegte Perfolhauben 3 Tage lang iiber die infizierten Pflanzen gestellt. Die gesunden Kontrollen wurden unter den gleichen Bedingungen gehalten. Bewertung des Infektionsverlaufes. - Die Bewertung erfolgte mit Hilfe eines BoniturSchliissels mit 6 Kennziffern fiir das Symptombild (Standardverfahren): Kennziffer Symptome
1
2
3
4
5
6
Chlorosen Pusteln
keine keine
schwach keine
stark keine
vorhanden schwach
vorhanden stark
keine vorhanden
Die Kennziffern wurden fiir je etwa 100 zufiillig entnommene Pflanzen ermittelt. Aus der Hiiufigkeit der Kennziffer errechnet sich nach Kennziffer x Hiiufigkeit (in % der Pflanzen) der Befallsgrad der Population. Er kann demnach zwischen 100 (alle Pflanzen symptomfrei, hOchste Resistenz) und 600 (aIle Pflanzen mit Symptomen der Kennziffer 6, hOchste Anfiilligkeit) liegen. Die Bewertungszahlen wurden jeweils am Tage der Probenahme ermittelt (Beobachtungszeitraum: 3. - 27. Tag nach der Infektion). Probenahme. - Es wurden am 3.,6.,10.,13.,17.,20.,24. und 27. Tag nach der Infektion jeweils etwa 50 Pflanzen entnommen, gewaschen und zwischen FlieBpapierbogen getrocknet. Die Pflanzen wurden dann in 3 Proben je Sorte geteilt: in Wurzel, Primiirblatt und restlichen SproB. Nach der Frischgewichtsbestimmung durch Wiigung erfolgte die weitere Aufarbeitung der einzelnen Proben.
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Bestimmung der IPO-23-Aktivitiit. - Das Probenmaterial wurde in der Reibschale mit Quarzsand und Aqua dest. (mljg Frischgewicht, 1: 1) zerrieben, zentrifugiert und der zellfreie Enzymextrakt fUr die Auftrennung der Isoenzyme verwendet. Die Auftrennung der Isoperoxidasen erfolgte in 7,5%igem Polyacrylamidgel nach ORNSTEIN und DAVIS (1962) wie bei MAURER (1971) beschrieben. In allen Versuchen wurden aliquote Anteile (0,1 ml) der Enzymextrakte eingesetzt. Als Elektrolytpuffer diente 1 m Tris-Glycin-Puffer, pH 8,3; es wurden parallel jeweils 2 Disc-Elektropherogramme hergestellt. Der Nachweis der in den Disc-Elektropherogrammen getrennten Isoperoxidasen erfolgte nach SEEVERS et al. (1971). Die Gele wurden in der Substratliisung bei 25 DC (Wasserbadthermostat) 30 min inkubiert. Die so hergestellten Zymogramme wurden durch Behandlung mit 2%iger Essigsiiure fixiert und anschlieBend nach einem von uns bereits friiher beschriebenen Verfahren densitometrisch ausgewertet (HOFFEREK et al. 1973). Die densitometrisch gemessene Bandenintensitiit im Zymogramm entspricht der IPO-23-Aktivitiit. Es wurde jeweils der Mittelwert aus den 2 parallel gewonnenen Zymogrammen benutzt.
Ergebnisse
1. EinfluB der Infektion auf die IPO-23-Aktivitat Gelbrostinfektionen verandern die IPO-23-Aktivitaten der Gerstenpflanzen verschiedenen Resistenzgrades unterschiedlich, bei den anfalligen Sorten starker als bei den resistenten Sorten; diese Unterschiede treten bereits in der erst en Infektionsphase auf. Abb. 2 zeigt, daB die Aktivitaten bei den 3 anfalligen Sorten ("Xenia", "Dornburger Heils Franken", "Abed Binder 12") etwa bis zum 13. Tag nach der Infektion auffallend groB werden. Dabei treten Phasenunterschiede zwischen den Sorten ein. Die Aktivitaten werden mit zunehmendem Infektionsalter allmahlich wieder normalisiert, am 27. Tage nach der Infektion bestehen nur noch geringfiigige Unterschiede gegeniiber gesunden Pflanzen (Abb. 2). Abb. 3 zeigt den EinfluB der Infektion auf die IPO-23-Aktivitaten bei 3 resistenten Sorten ("Stotz's Salemer", "Japan 1", "Bigo"). Die in der friihen Infektionsphase auftretenden Veranderungen betragen maximal urn 60 %. Dabei weisen die infizierten resistenten Pflanzen meistens geringere Aktivitaten auf als die nichtinfizierten Kontrollen. Abb. 3 zeigt auBerdem, daB sich bei der Sorte "J~pan 1" die Enzymaktivitiit mit zunehmendem Alter der Infektion erh6ht, spater aber wieder auf die Kontrollwerte absinkt. Bei den beiden anderen Sorten ("Stotz's Salemer", "Bigo") treten dann kaum noch wesentliche Abweichungen auf. Hier, wie auch bei den anfalligen Sorten, wird die Tendenz Zl,lr Normalisierung der veranderten Isoenzymaktivitat in der spateren Phase des Infektionsablaufes erkennbar; am 27 .. Tage nach der Infektion bestehen kaum noch Unterschiede zwischen resistenten und anfiilligen Sorten (vgl. Abb. 2 und 3).
2. Aktivitiitsanderung und Infektionsverlauf Die von uns in der friihen Infektionsphase beobachteten starken Veranderungen der IPO-23-Aktivitaten (Abb. 2) treten noch vor dem Erscheinen der fUr Gelbrostinfektionen typischen Krankheitssymptome auf. Urn einen Einblick in diese physiologischen Prozesse zu erhalten, werden die pathogeninduzierten Veranderungen der Enzymaktivitat mit dem Verlauf der Infektion verglichen.
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Aus Abb. 4 und 5 geht hervor, daB die ersten Krankheitssymptome etwa 10 Tage nach der Infektion erkennbar werden - also erst dann, wenn die Aktivitatsabweichungen in den anfalligen und resistenten Pflanzen ihre maximalen Werte bereits durchlaufen haben (vgl. Abb. 4, 5; 6 dpi). Das bedeutet, daB diese Aktivitatsveranderungen und die Symptomauspragung zeitlich unterschiedlich einsetzen: Nach der Infektion verandern sich zunachst die Aktivitaten des Isoenzyms, dann erst erfolgt die Ausbildung der Symptome. An dem direkten kausalen Zusammenhang zwischen diesen Ereignissen ist nicht zu zweifeln. Wegen der Komplexitat und Kompliziertheit der stoffwechselphysiologischen Prozesse kann tiber seine Art noch nichts ausgesagt werden. Abb. 4 und 5 zeigen ferner, daB sich die Symptome mit zunehmendem InfektionsaIter verstarken; die Symptomausbildung ist bei der Sorte "Abed Binder 12" - gemessen an den ermitteIten Bewertungszahlen - ungefahr doppeIt so stark als bei der Sorte "Stotz's Salemer". In der gleichen Zeit treten Abweichungen von der normalen Enzym% der Ifunfrolle 500
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3 2 Abb.2. Aktiritiitsiinderung des IPO-23-Enzyms in den Wurzeln nack Gelbrostinfektion der Primiirbliitler anfiilliger Pflanzen. Abszisse: dpi = Tage nach der Infektion. Sorte "Abed Binder 12" ( - - ) ; Sorte "Xenia" (-------); Sorte "Dornburger Heils Franken" (-.-.-.-). Abb.3. Aktivitiitsiinderung des IPO-23-Enzyms in den Wurzeln nack Gelbrostinfektion der Primiirbliitler resistenter Pflanzen. Abszisse: dpi = Tage nach der Infektion. Sorte "Stotz's Salemer" ( - - ) Sorte "Bigo" (--------); Sorte "Japan 1" (-. -' -' -' -).
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aktivitat nur bei der anfalligeren der beiden Sorten deutlicher auf. Ein Vergleich dieser Aktivitatsveranderungen mit dem Infektionsverlauf tiber den Zeitraum yom 10. bis zum 27. Tag nach der Infektion laBt aber keinen allgemeinen Zusammenhang erkennen. Bei der Sorte "Abed Binder 12" besteht nur vortibergehend (10. -13. Tag) eine zeitliche Parallelitat zwischen dem erneuten Anstieg der Enzymaktivitat und dem in der gleichen Zeitspanne beobachteten Verlauf der Infektion (Abb. 4). Hier ist also eine unmittelbare Beziehung zwischen Aktivitiitsveranderung und Symptombildung nicht auszuschlieBen. 3. Beziehung zwischen IPO-23-Aktivitat und Infektionserfolg Am Beispiel der beiden Sort en "Abed Binder 12" und "Stotz's Salemer" soll nun gezeigt werden, daB sich Veranderungen des Infektionserfolges und Unterschiede in den Aktivitatsveranderungen entsprechen (vgl. dazu auch Abb. 4, 5). Diese Beziehungen sind in Abb. 6 dargestellt. Die im Diagramm eingetragenen Werte entsprechen den MeBergebnissen aus 3 gleichartigen Versuchsserien mit unterschiedlichen Infektionserfolgen. Die Anlage der einzelnen Versuche entspricht den in der Abb. 4 und 5 enthaltenen Angaben (Beobachtungszeitraum: 3.-27. Tag nach der Infektion). In jedem Versuch wurden die beiden Sort en miteinander verglichen. In der Abb. 6 ist die Summe der Differenzen ("Abed Binder 12" - "Stotz's Salemer") der Aktivitaten zwischen den beiden Sorten aufgetragen gegen die Summe der Differenzen der Befallsgrade. Es werden also die Sortenunterschiede der Enzymaktivitaten den Unterschieden der Befallsgrade gegentibergestellt. Die 3 Versuchsserien ergeben so
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Abb.4. Aktivitiitsiinderung des IPO-23-Enzyms in der Wurzel und Infektionsverlauf nach Gelbrostinfektion des Primiirblattes. Abszisse: dpi = Tage nach der Infektion. Aktivitatsanderung, bezogen auf die gesunde Kontrolle (Wurzel, -------); Infektionserfolg (Primarblatt, - - ) Sorte "Abed Binder 12". Abb.5. Aktivitatsiinderung des IPO-23-Enzyms in der Wurzel und Infektionsverlauf nach Gelbrostinfektion des Primiirblattes. Erklarungen wie Abb. 4. Sorte "Stotz's Salemer".
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3 "MeJ3werte" im Diagramm (Abb. 6). Dieses zeigt, daJ3 eine direkte Abhangigkeit der Enzymaktivitat yom BefaIlsgrad besteht. Diskussion
Die Aktivitaten der in der Wurzel vorkommenden Peroxidase IPO-23 (Abb. 2 und 3) legen die Vermutung nahe; daJ3 pathogene Faktoren yom infizierten Primarblatt aus die normalen physiologischen Prozesse des Wurzelsystems storen: Die Isoperoxidaseaktivitat verandert sich auf Grund der in die Wurzel translocierten Storungseinwirkung der Gelbrostinfektion gegentiber dem Sollwert (Wert der entsprechenden gesunden KontroIle). Als Reaktion auf die Starung treten ausgepragte, stark gedampfte Schwingungen der Aktivitat auf, die in ihrem AusmaJ3 u. a. yom BefaIlsgrad bzw. der Infektionsphase abhangen. Da die biologische Funktion des IPO-23-Enzyms unbekannt ist, lassen sich keine Aussagen dartiber machen, welche Stoffwechselvorgange so heftig auf diese Starung reagieren. Es soIl in diesem Zusammenhang auf die Moglichkeit hingewiesen werden, daJ3 rhythmische Anderungen in der Konzentration von Metaboliten unmittelbar oder tiber Zwischenwirkungen entsprechende Veranderungen in der Aktivitat von Enzymen bewirken konnen. Betrachtet man den Wirt-Erreger-Komplex als ein stoffwechselphysiologisches System, so ist vorstellbar, daJ3 sich diese Beziehungen auch in Konzentrationsanderungen der beteiligten Metabolite manifestieren; im wechselseitigen Austausch beeinflussen beide Partner einander. Dazu gehOrt die Aufnahme von Intermediarprodukten der Pflanze, die Abgabe von toxischen Substanzen oder vielleicht anderer Wirkstoffe durch den Pilz. Diese Wechselwirkungen spielen sich primar aber an den Infektionsorten ab, also im vorliegenden FaIle im befallenen Gewebe des 1. Blattes - hier konnen die verschiedenen Mechanismen der Regulation des Zellstoffwechsels zunachst wirksam werden.
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Abb.6. Beziehung zwischen Sortenunterschieden im Infektionserfolg und Sortenunterschieden in der Aktivitiitsiinderung des IPO-23-Enzyms. "Abed Binder 12" und "Stotz's Salemer". Nahere Erlauterungen siehe Text.
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Die vorliegenden Untesruchungen zeigen, daB es bei der Auseinandersetzung mit dem Pathogen in anfalligen Pflanzen zu auffallend starken Veranderungen in der Aktivitat eines Isoenzyms - des Enzyms IPO-23 - kommt, wahrend in resistenten Pflanzeu nur geringfUgige Aktivitatsveranderungen auftreten. Nach vorlaufigen Befunden liegen ahnliche Verhaltnisse bei 2 weiteren Gerstensorten vor, die z. Z. unter den gleichen Bedingungen untersucht werden. In diesen Beispielen waren also die Unterschiede im Aktivitatsverhalten der Isoperoxidase zumindest formal mit den Befallsunterschieden in Beziehung zu bringen. Bei Spekulationen iiber die Interpretation der beobachteten Effekte muB das normale Aktivitatsniveau beriicksichtigt werden: In den nichtinfizierten anfiilligen Pflanzen liegen die Werte fUr die IPO-23-Aktivitat meistens niedriger als die der resistenten Sorten. Die Sortenunterschiede im Aktivitatverlauf des Enzyms IPO-23 zeigen eine so groBe MannigfaItigkeit, daB eine kooperative Wirkung verschiedenartiger Mechanismen nicht auszuschlieBen ist. Das ist angesichts der Vermaschung und Interferenz biologischer Regelsysteme auch nicht anders zu erwarten; das Resistenzgeschehen muB deshalb als komplexer ProzeB aufgefaBt werden, dabei konnen u. U. verschiedene Prinzipien wirksam werden, die die Entwicklung des Gelbrostes in der befallenen Pflanze beeinflussen (WOLFFGANG 1975). Auch ohne die Bedeutung der pathogeninduzierten Aktivitatsveranderungen der IPO-23 fUr das Resistenzverhalten der einzelnen Sort en vorerst genau zu kennen, ist fUr die Resistenzphysiologie von besonderem Interesse, daB diese Veranderungen bereits in der friihen Infektionsphase, d. h. noch vor der Ausbildung der Krankheitssymptome, auftreten (Abb. 4 und 5). Der beobachtete Effekt kann deshalb nicht eine Folge der Symptombildung sein - zumindest nicht bis zum etwa 10. Tag nach der Infektion (spater in Erscheinung tretende Aktivitatsveranderungen konnten dagegen mit den Prozessen der Symptomauspriigung in einem Zusammenhang gebracht werden). Da es sich hier urn ein wurzelspezifisches Isoenzym handeIt, das in den oberirdischen Pflanzenteilen nicht vorkommt, und seine Aktivitiit bei den anfiilligen Sorten wesentlich verandert werden kann, darf angenommen werden, daB stoffwechselphysiologische Korrelationen zwischen Wurzel und SproB einen EinfluB auf die Manifestation der Gelbrostinfektion im 1. Blatt ausiiben. AusmaB und Richtung der induzierten Abweichungen von den normalen Wurzel-SproB- Korrelationen konnten demnach evtl. entscheidend fUr die Befallsstarke sein. Es ist vorstellbar, daB Wirkstoffe - vielleicht wuchsstoffoder kinctinahnliche Verbindungen des Pilzes - wahrend der Infektion das IPO-23Enzymsystem in den anfalligen Pflanzen stark beeinflussen; das so angeregte Enzymsystem konnte dann weitere stoffwechselphysiologische Prozesse auslOsen, die die Entwicklung des Gelbrostes fordern oder vielleicht sogar erst ermoglichen. Da die beobachtete Aktivitatsveranderung des Isoenzyms voriibergehend ist, konnte dies bedeuten, daB das Enzym eine Schaltfunktion im intermediiiren Stoffwechsel ausiibt. Es ist bekannt, daB Phytohormone (Auxine, Gibberelline, Cytokinine, Athylen) die Aktivitat der Peroxidase (EC 1.11.1. 7) in Pflanzen kontrollieren konnen (GALSTON et al. 1967, GALSTON und DAVIES 1969, STUBER und LEVINGS 1969). Die Aktivitatsanderungen erfolgen hier durch Regulation der Genaktivitat, d. h. durch Induktion bzw. Repression der Peroxidasesynthese (HESS 1968).
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Auf der metabolischen Ebene fungieren phenolische Stoffe entweder als Stimulatoren oder als Inhibitoren der Peroxidasen (PAUL 1963). Die Peroxidaseaktivitat ist mithin eine Funktion des koordinierten Zusammenwirkens des genetischen Apparates, der Phytohormone und der einwirkenden endogenen und exogenen Faktoren. Es ist noch umstritten, welche Rolle dieses Enzymsystem im Stoffwechsel spielt. Ftir die Peroxidase in der Pflanze wird eine Funktion als IESabbauendes Enzym (PSENAKOVA und KOLEK 1972), bei Respirationsvorgangen (BURRIS 1960), bei Hydroxylierungen (PAUL 1963), bei der Polymerisation des Lignins (FREUDENBERG 1965; YOUNG und STEELINK 1973) und bei der Oxidation biologisch aktiver Proteine (SIZER 1953) diskutiert. Soweit bisher an verschiedenen Wirt-Pathogen-Kombinationen untersucht, ist eine Veranderung der Peroxidaseaktivitat in der infizierten Pflanze bei diesem Enzymsystem im Prinzip der einzige Effekt, der in einen Zusammenhang mit der Pathogenese gebracht werden kann. Die tatsachlich in der WirtspfIanze ablaufenden Prozes~e und die Bedeutung der multiplen Enzymformen der Peroxidase im komplexen Resistenzgeschehen sind nicht bekannt; vielfach werden aber Zusammenhange mit dem StoffwechseI einfacher phenolischer Verbindungen vermutet, einige dieser Verbindungen wirken als spezifische Resistenzfaktoren (GOODMAN et aI. 1967, STAHMANN und DEMOREST 1973). Das von uns aufgefundene Isoenzym IPO-23 konnte also in der gesunden und in der kranken Pflanze an Regulationsvorgangen beteiligt sein, die Prozesse steuern, die zu einer Veranderung des Resistenzverhaltens der Pflanze ftihren. So ist bekann t, daB die Temperaturbedingungen auf Anfalligkeit bzw. Resistenz und die Pathogenese von Pflanzen tiefgreifende Einfltisse austiben konnen. Spezielle Experimente haben aber gezeigt, daB die Aktivitat dieses Isoenzyms auffallend temperaturempfindlich ist; die Untersuchungen werden deshalb zunachst in dieser Richtung weitergeftihrt. Literatur BURRIS, R. H., Hydroperoxidases (peroxidase and catalase). In: Handbuch der Pflanzenphysiologie, Bd. 12, S. 365-400.1960. Berlin-Giittingen-Heidelberg 1960. FREUDENBERG, K., Lignin: its constitution and formation from p-hydroxy-cinnamoyl alcohols. Science 148, 595-600 (1965). GALSTON, A. W., and DAVIES, P. J., Hormonal regulation in higher plants. Science 163, 1288-1297 (1969). L:\VEE, S., and SIEGEL, B. Z., The induction and repression of peroxidase isoenzymes by 3indolacetic acid. Proc. 6th Int. Conf. Plant Growth Substances, Ottawa 1967, S.455-472 (1967). GOOD)UN, R. N., KIRALY, Z., and ZAITLIN, M., The Biochemistry and Physiology of Infectious Plant Disease. D. van Nostrand, Princeton-Toronto-London-Melbourne 1967. HESS, D., Biochemische Genetik. Springer, Berlin-Heidelberg-New York 1968. HOFFEREK, H., SPOHN, H.-J., und PROLL, E., Densitometrie von Protein-Disc-Elektropherogrammen. Jenaer Rundschau 18, 140-147 (1973). MAURER, H. R., Disc Electrophoresis and Related Techniques of Polyacrylamide Gel Electrophoresis. W. de Gruyter, Berlin-New York 1971. ORNSTEIN, L., and DAVIS, B. J., Disc Electrophoresis. Distillation Products Division, Eastman Kodak Co., 1962.
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