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Choix de la concentration en NaCl pour optimiser la détection de la résistance à la méticilline chez Staphylococcus par la méthode de diffusion en gélose
Pathol Biol 2001 ; 49 : 216-21
2001 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés S0369-8114(01)00131-6/FLA
Article original
Choix de la concentration en NaCl pour optimiser la détection de la résistance à la méticilline chez Staphylococcus par la méthode de diffusion en gélose P. Bemer-Melchior ∗ , H.B. Drugeon Laboratoire de bactériologie, hôpital Laënnec, CHU Nantes, boulevard J. Monod, 44093 Saint-Herblain cedex 1, Nantes, France (Reçu le 25 janvier 2000 ; accepté le 12 mai 2000)
Résumé La résistance intrinsèque à l’oxacilline de 374 souches de Staphylococcus sp a été détectée par la méthode de diffusion en milieu gélosé (Mueller-Hinton additionné de 2 et 5 % de NaCl) avec un inoculum de 0.5 McF (108 CFU/mL), à l’aide d’un disque d’oxacilline à 5 µg. Après une incubation de 24 h à 37 ◦ C, les diamètres sont mesurés en tenant compte des squatters colonies. La PCR mecA est réalisée principalement sur les souches résistantes ou présentant des résultats discordants. Les résultats sont concordants pour 246 des 256 souches de S. aureus testées (182 sensibles et 64 résistantes). Parmi 118 souches de S. epidermidis, 105 présentent des résultats concordants (37 souches sensibles et 68 résistantes). Six souches (3 S. aureus et 3 S. epidermidis ) sont faussement résistantes (PCR-mecA négative) sur les deux milieux hypersalés. Dix-sept souches sont discordantes sur 5 % uniquement : sept souches de S. aureus ne possédant pas le gène mecA sont sensibles sur 2 % mais résistantes sur 5 % (3 % de faux positifs), dix souches de S. epidermidis possédant le gène mecA sont résistantes sur 2 % mais sensibles ou à la limite de la sensibilité sur 5 % (5 % de faux négatifs). Ainsi, la détection de la résistance à la méticilline sur milieu MH additionné de 2 % de NaCl pour une incubation de 24 h à 37 ◦ C améliore la spécificité pour l’espèce S. aureus et la sensibilité pour S. epidermidis. 2001 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS concentration de NaCl / diffusion en agar / résistance à la méticilline / staphylococcus
Summary – Determination of the NaC1 concentration in agar diffusion method for improving the detection of oxacillin resistance in Staphylococcus. The detection of oxacillin resistance is evaluated by the disk diffusion method in a collection of 374 Staphylococcus sp strains. The disk diffusion assay is performed with 5-µg oxicillin disk and a 108 CFU/mL inoculum on Mueller-Hinton agar plates supplemented with 2 or 5% NaCl and incubated at 37 ◦ C for 24 h. Strains are considered resistant in accordance to the French recommendations (any growth around the disk is observed). The detection of mecA gene is performed by PCR almost for resistant and discordant strains. Results are concordant for 246 of 256 Staphylococcus aureus strains (182 susceptible and 64 resistant strains) and for 105 of 118 S. epidermidis isolates tested (37 susceptible and 68 resistant strains). Six mecA-negative strains (3 S. aureus and 3 S. epidermidis) give false resistant results on agar with 2 and 5% NaCl. Seventeen isolates are discordant on 5% NaCl: 7 mecA-negative S. aureus strains are susceptible on 2% NaCl agar but resistant at 5% (3% false-positive results), 10 mecA-positive S. epidermidis strains are resistant on 2% NaCl agar but susceptible at 5% NaCl (5% false-negative results). The detection of meticillin resistance is improved on agar supplemented with 2% NaCl. 2001 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS agar diffusion method / meticillinoresistance / NaCl supplementation / staphylococcus
∗ Correspondance et tirés à part.
Adresse e-mail : [email protected] (P. Bemer-Melchior).
Choix de la concentration en NaCl et détection de la résistance à la méticilline
La résistance intrinsèque à la méticilline chez Staphylococcus est la conséquence de la production d’une protéine de liaison aux pénicillines (PLP) additionnelle, la PLP 2a ou PLP 2 codée par le gène mecA. Cette protéine additionnelle présentant une très faible affinité pour les bêtalactamines est capable à elle seule de catalyser la synthèse du peptidoglycane [1]. Cette résistance est rencontrée chez Staphylococcus aureus et dans d’autres espèces de staphylocoques à coagulase négative. En dépit de la présence constante du gène mecA chez tous les staphylocoques résistants à la méticilline, l’expression phénotypique de cette résistance est variable et quatre classes de résistance ont été définies par Tomasz [2] : une classe homogène, classe 4 (toutes les bactéries expriment le même haut niveau de résistance) et trois classes hétérogènes, classes 1, 2, 3 (il existe dans la population bactérienne des subpopulations plus ou moins résistantes). Dans les classes 1 et 2, la fréquence des bactéries résistantes est de 10–8 à 10–4. Ces souches sont difficiles à détecter phénotypiquement. L’expression phénotypique de cette résistance est influencée par la température (30◦ C > 37◦ C > 41◦ C), la concentration en NaCl (2 à 5 %) et par le pH (5,2 < 7,4). C’est pourquoi plusieurs méthodes ont été proposées, faisant varier la température, la durée d’incubation, l’inoculum, l’osmolarité du milieu (concentration en NaCl) [3], sans qu’il y ait de véritable consensus international concernant la détection de la méticillinorésistance par la méthode de diffusion en gélose. Le National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) préconise un disque d’oxacilline chargé à 1 µg sur un milieu de Mueller-Hinton sans adjonction de NaCl ensemencé avec un inoculum de 108 UFC/mL (0,5 MacFarland) et incubé à 33◦ –35◦ C (en favorisant 33◦ C) pendant 24 h [4]. Toutefois, pour la détermination des CMI en milieu solide et en milieu liquide, il préconise l’adjonction de NaCl à 2 % et pour l’« oxacillin screening plates » une concentration à 4 % [5]. Le comité de l’antibiogramme de la Société française de microbiologie (CA-SFM) recommande l’utilisation d’un disque d’oxacilline à 5 µg sur milieu de Mueller-Hinton incubé à 30◦ C ou sur milieu de Mueller-Hinton hypersalé incubé à 37◦ C, avec un inoculum lourd (107 UFC/mL). Pour certaines souches de staphylocoques présentant une croissance faible, une incubation de 48 heures est recommandée. Après avoir été longtemps égale à 5 %, la concentration en NaCl préconisé actuellement par le CA-SFM est comprise entre 2 et 4 % [6]. Parfois, avec l’utilisation de gélose de Mueller-Hinton contenant 5 % de NaCl, certaines souches de Staphylococcus aureus sensibles aux autres familles d’antibiotiques sont interprétées résistantes à la méticilline et certaines souches de S. epidermidis résistantes aux fluoroquinolones, aux aminosides ou aux macrolides sont répondues sensibles à la méticilline. Cette étude a été réalisée afin de déterminer quelle est la meilleure concentration (entre 2 et 5 %) de NaCl permettant la détection
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de la méticillinorésistance chez Staphylococcus aureus et les staphylocoques à coagulase négative dans un délai maximal de 24 heures. La recherche du gène mecA par la technique PCR a été choisie comme méthode de référence pour confirmer les résistances phénotypiques et résoudre les résultats discordants [7, 8].
MATÉRIEL ET MÉTHODES Souches bactériennes Trois cent soixante-quatorze souches de staphylocoques consécutives non redondantes ont été isolées de tous types de prélèvements et de l’ensemble des services de l’hôpital Laënnec de Nantes, du mois de décembre 1997 au mois de septembre 1998. Elles ont été identifiées à Staphylococcus aureus pour 256 souches et à Staphylococcus epidermidis pour 118 souches par la recherche de la coagulase liée et la galerie d’identification API 32 Staph (bioMérieux, La Balme-les-Grottes, France).
Étude de la sensibilité à la méticilline La résistance à la méticilline a été recherchée à l’aide d’un disque d’oxacilline 5 µg sur deux géloses Mueller Hinton hypersalées, aux concentrations de 5 g/100 mL (0,85 mol/L) et 2 g/100mL (0,34 mol/L), incubées à 37◦ C pendant 24 heures. L’inoculum choisi correspond à un inoculum lourd de 0,5 MacFarland soit 1,5 108 bactéries/mL environ. La lecture s’effectue après 24 heures d’incubation à 37◦ C. La souche de staphylocoque est considérée comme résistante à la méticilline si la zone d’inhibition autour de l’oxacilline est < 20 mm ou s’il existe des colonies isolées à l’intérieur de la zone.
Réalisation de la PCR mecA Indication de la PCR mecA La recherche du gène mecA a été réalisée sur une partie des souches sensibles et concordantes (16 souches de S. aureus, 18 souches de S. epidermidis), sur toutes les souches résistantes concordantes, ainsi que sur l’ensemble des 23 souches présentant des résultats discordants entre les deux concentrations de NaCl (dix souches de S. aureus et 13 souches de S. epidermidis).
Extraction d’ADN À partir d’une culture de 24 heures sur gélose au sang, une extraction par la résine (kit Nucleon BACC2, Amersham Pharmacia) est réalisée après traitement des colonies par le lysozyme (Appligène Oncor), la lysostaphine (Sigma) et la protéinase K (Merk). L’extraction est réalisée conformément aux recommandations du fabriquant.
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P. Bemer-Melchior, H.B. Drugeon
Oligonucléotides Les amorces (Genosys Biotechnologies (Europe) Ltd.) ont été décrites par Vannufel et al. [8]. M1 (5 -TGGCTATCGTGTCACAATCG-3 ) correspond aux nucléotides 4355 à 4375 et M2 (5 -CTGGAACTTGTTGAGCAGAG3 ) est complémentaire des nucléotides 4640 à 4659 du gène mecA (numéro d’accession emb Y14051). L’amplification donne un produit de PCR de 310 paires de base.
Tableau I. Résultats obtenus avec la PCR mecA selon les phénotypes de résistance à l’oxacilline.
S. aureus
La réaction PCR est réalisée avec une concentration de MgCl2 de 3 mM. Le programme d’amplification inclue 40 cycles d’amplification (dénaturation à 95◦ C pendant 15 secondes, hybridation des amorces à 60◦ C pendant 30 secondes, et extension d’amorces à 72◦ C pendant 30 secondes). Les produits de PCR sont visualisés par une électrophorèse sur gel d’agarose.
Performances comparées de la détection sur milieu hypersalé La sensibilité et la spécificité de la détection ont été calculées pour les souches de S. aureus et de S. epidermidis, à partir des résultats obtenus sur les géloses contenant 2 ou 5 % de NaCl.
RÉSULTATS Résultats obtenus avec la PCR mecA Parmi les 256 souches de S. aureus, 182 sont retrouvées sensibles quelque soit la concentration en NaCl et parmi ces souches, la PCR mecA est négative pour les 26 souches testées. Soixante-quatre souches sont résistantes en présence des deux concentrations de NaCl ; elles possèdent toutes le gène mecA. Dix souches sont négatives en PCR mecA mais sont répondues résistantes : trois sur la gélose 2 % et dix sur la gélose 5 % (tableau I). Sur les 118 souches de S. epidermidis, 37 sont sensibles à la méticilline quelque soit la concentration de NaCl ; les résultats de la PCR sont négatifs sur les 18 souches testées. Soixante-huit souches possèdent le gène mecA et sont résistantes avec les deux concentrations. Treize souches présentent des résultats discordants : trois souches négatives en PCR sont résistantes sur deux et 5 %, six souches positives en PCR mecA sont sensibles sur 5 %, quatre souches PCR-mecA positive sont résistantes sur 2 % et 5 % mais présentent des diamètres proches de la sensibilité sur 5 %.
Diamètres obtenus pour les souches non discordantes de Staphylococcus aureus et epidermidis Parmi les 256 souches de S. aureus, 182 sont sensibles à la méticilline et présentent un diamètre moyen de 25,8
S. epidermidis
NaCl 5 %
S
S
256 182 S (16 mecA−)
Amplification
NaCl 2 %
64 mecA+
R
R
7 mecA−
S
R
3 mecA−
R
R
S
S
68 mecA+
R
R
6 mecA+
R
S
4 mecA+
R
R*
3 mecA−
R
R
118 37 S (18 mecA−)
* Diamètres observés à la limite du seuil de sensibilité, cf. tableau IV.
± 3,8 mm (20–42 mm) sur 5 % et de 26,3 ± 3,5 mm (20–40 mm) sur 2 %. Soixante-quatre souches, résistantes à la méticilline, présentent un diamètre moyen de 6,2 ± 0,8 mm (6–10 mm) sur 5 % et de 6,3 ± 1,3 mm (6–16 mm) sur 2 %. Une souche résistante présente un diamètre de 16 mm sur 2 % contre 6 mm sur 5 % (tableau II). Parmi les 118 souches de S. epidermidis, 37 souches sensibles à la méticilline et présentent un diamètre moyen de 32,0 ± 3,0 mm (23–38 mm) sur 5 %, et de 32,1 ± 3,6 mm (24–40 mm) sur 2 % respectivement. Pour soixante-huit souches résistantes, le diamètre moyen est de 7,3 ± 3 mm (6–16 mm) sur 5 % et de 6,7 ± 2,2 (6– 19 mm) sur 2 %. Une souche présente a un diamètre de 19 mm sur 2 % contre 16 mm sur 5 %.
Résultats discordants chez S. aureus Sur les dix souches de S. aureus ne possèdant pas le gène mecA, trois présentent des résultats discordants aux deux concentrations (diamètre < 20 mm). Sept souches présentent des discordances à la concentration de 5 % : le diamètre moyen est de 15,3 mm sur 5 % et de 23,7 mm sur 2 % ; la diminution des diamètres ne s’accompagne pas de la présence de microcolonies dans la zone d’inhibition de l’oxacilline (tableau III).
Résultats discordants chez S. epidermidis Trois souches de S. epidermidis sont négatives en PCR mecA et présentent des diamètres < 20 mm sur les milieux à 2 et 5 %, sans colonies isolées à l’intérieur de la zone d’inhibition de l’oxacilline. Dix souches possèdent le gène mecA et présentent un diamètre moyen de 22,0 ± 4,0 mm sur 5 %, contre 9,0 ± 4,2 sur 2 %. Sur 5 %, quatre souches (deux avec
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Choix de la concentration en NaCl et détection de la résistance à la méticilline
Tableau II. Diamètres obtenus pour les souches concordantes sur milieu hypersalé. Souches
Nombre
S. aureus
Gélose NaCl 2 %
Gélose NaCl 5 %
moyenne mm
écart mm
moyenne mm
écart mm
246
sensibles
182
26,3 ± 3,5
20−40
25,8 ± 3,8
20−42
résistants
64
6,3 ± 1,3
6−16
6,2 ± 0,8
6−10
S. epidermidis
105
sensibles
37
32,1 ± 3,6
24−40
32,0 ± 3
23−38
résistants
68
6,7 ± 2,2
6−19
7,3 ± 3
6−16
Tableau III. Résultats discordants pour 10 souches de Staphylococcus aureus. Discordances sur 2 et 5 % Souches
Discordances sur 5 %
Diamètre sur NaCl 2 % (mm)
Diamètre sur NaCl 5 % (mm)
PCR mecA
Souches
Diamètre sur NaCl 2 % (mm)
Diamètre sur NaCl 5 % (mm)
PCR mecA
1
15
15
NEG
3
25
15
NEG
2
15
15
NEG
5
25
16
NEG
3
19
15
NEG
6
29
13
NEG
7
23
15
NEG
8
23
17
NEG
9
21
16
NEG
10
20
15
NEG
Tableau IV. Résultats discordants pour 13 souches de Staphylococcus epidermidis. Discordances sur 2 et 5 % Souches
Discordances sur 5 %
Diamètre sur NaCl 2 % (mm)
Diamètre sur NaCl 5 % (mm)
PCR mecA
Souches
Diamètre sur NaCl 2 % (mm)
Diamètre sur NaCl 5 % (mm)
PCR mecA
1
13
6
NEG
4
6
22
POS
2
15
15
NEG
5
6
25
POS
3
16
19
NEG
6
10
24
POS
7
13
26
POS
8
15
23
POS
9
16
28
POS
10
6
19
POS
11
6
19
POS
12
6
18
POS
13
6
18
POS
un diamètre de 18 mm et deux avec un diamètre de 19 mm), ont été considérées comme discordantes car très proches du diamètre critique de 20 mm alors qu’elles ne présentent aucun diamètre d’inhibition sur la gélose à 2 % (tableau IV).
Calculs des sensibilités et spécificité Chez S. aureus, la sensibilité est de 100 %, quelle que soit la concentration de NaCl utilisée. La spécificité
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P. Bemer-Melchior, H.B. Drugeon
Tableau V. Performances de la détection de la résistance à la méticilline sur milieux hypersalés. Germes
NaCl 2 %
NaCl 5 %
SE
SP
SE
SP
S. aureus
100 %
98,4 %
100%
94,8 %
S. epidermidis
100 %
92,5 %
93%
92,5 %
est supérieure sur 2 % : 98,4 % versus 94,8 % sur 5 % (tableau V). Pour les souches de S. epidermidis, la spécificité est identique (92,5 %) sur les milieux contenant 2 ou 5 %. En revanche, la sensibilité est améliorée par la diminution de la concentration en NaCl (100 % sur 2 % versus 93 % sur 5 %).
DISCUSSION La technique de diffusion en milieu gélosé est la première à avoir été utilisée pour détecter les souches de staphylocoques résistants à la méticilline. Certaines conditions optimales d’expression de la résistance à la méticilline ont été décrites [3] : une température d’incubation à 30◦ C, un milieu hypersalé, un inoculum lourd ou encore une durée d’incubation de 48 h. Lorsque la température d’incubation est étudiée, les différences sont souvent non significatives ; la détection à 30◦ C nécessitant le plus souvent 48 heures [9, 10]. La plupart des auteurs s’accordent pour préconiser l’utilisation d’un inoculum lourd de 108 CFU/mL. Cet inoculum est identique à celui préconisé par le NCCLS mais supérieur à celui recommandé pour l’antibiogramme en milieu gélosé par le CA-SFM (106 CFU/mL). Les souches hétérogènes appartenant à la classe 1 de Tomasz [2] présentent une résistance de haut niveau à la méticilline (CMI > 25 mg/L) pour une subpopulation dont la fréquence de résistance est égale à 10–8 à 10–7 . Un inoculum lourd augmente les chances de détection. La concentration en NaCl est le troisième paramètre déterminant pour la détection de la résistance à la méticilline chez Staphylococcus. L’utilisation de NaCl a été recommandée dès la détection de cette nouvelle résistance pour stimuler la croissance des souches hétérorésistantes [11, 12]. Une concentration de NaCl 5 % a amélioré historiquement les performances du disque de céfalotine qui présentait alors 40 % de discordances avec les souches résistantes [13]. Le mode d’action du NaCl est mal connu. Pour Chambers [14], il n’augmente pas la production de PLP2a. Pour Murty [15], il stimule la production de PLP2a à 30 et 37◦ C, mais n’augmente la résistance qu’à 37◦ C. Il augmenterait la pression osmotique et limiterait l’effet des systèmes autolytiques déclenchés par l’action de l’antibiotique (oxacilline, méticilline) sur les PLP normales. Les recommandations du CA-SFM préconisent d’utiliser
un milieu hypersalé jusqu’en 1998 (les géloses disponibles commercialement étaient dosées à 5 %), et depuis 1999 la concentration en NaCl est précisée devant être comprise entre 2 et 4 % [6]. La concentration idéale de chlorure de sodium est difficile à déterminer, car elle dépend des espèces comparées, de l’inoculum, de la température et du temps d’incubation. Ainsi, Law et al. [16] proposent d’utiliser un milieu à 5 % de NaCl, alors que Mulder et al. [17] et Zambardi et al. [18] concluent à une meilleure détection de la résistance à la méticilline sur des milieux contenant 2 % de chlorure de sodium. Notre étude est en accord avec ces derniers résultats. Avec une méthode utilisant un disque d’oxacilline à 5 µg, un Mueller-Hinton sans adjonction de NaCl, un inoculum lourd (0,5 McF) et une incubation de 48 heures à 30◦ C, Barbier-Frebourg et al. [9] détecte toutes les souches de S. aureus mais ne parvient pas à détecter sept souches de staphylocoques à coagulase négative résistantes. En utilisant une incubation de 24 heures à 37◦ C et une concentration de NaCl à 5 %, nous observons des résultats similaires : six souches de S. épidermidis ne sont pas détectés ; la concentration de 2 % fait disparaître cette discordance. Nous avons choisi d’optimiser le milieu hypersalé plutôt que d’utiliser la température d’incubation à 30◦ C (aucune étude ne met en évidence de différence significative entre ces deux paramètres) car l’incubation à 30◦ C nécessite souvent une incubation de 48 heures pour les staphylocoques à coagulase négative [9, 10]. Parfois certaines souches ne se développent pas à cette température. Ces particularités entraînent un délai dans la réponse de l’antibiogramme alors que la résistance à la méticilline est un examen urgent car il oriente vers une thérapeutique spécifique. Six souches (3 S. aureus et 3 S. epidermidis) sont faussement résistantes aux deux concentrations de NaCl testées (diamètre < 20 mm et recherche du gène mecA négative). Ces six souches peuvent correspondre à des souches dites MODSA, présentant une affinité diminuée pour les protéines de liaison aux pénicillines (PLP) [19], ou à des souches dites borderline, définies par une hyperproduction de bêtalactamase. Petersson et al. montrent que le niveau de production de la bêtalactamase de certaines souches de S. aureus sensibles à la méticilline (PCR-mecA négative) est proportionnelle à la concentration en sel [20]. L’inoculum lourd utilisé dans notre étude pourrait être responsable de ces résultats faussement positifs sur gélose hypersalée. Dix-sept souches (7 S. aureus et 10 S. epidermidis) présentent des résultats discordants uniquement sur 5 %. Sept souches de S. aureus ne possédant pas le gène mecA, sont résistantes sur 5 %, soit 3 % de résultats faussement positifs (sept sur 256 souches de S. aureus), mais sont sensibles sur 2 %. Il peut s’agir dans ce cas d’une hyperproduction de bêtalactamase stimulée par la concentration en NaCl.
Choix de la concentration en NaCl et détection de la résistance à la méticilline
Dix souches de S. epidermidis discordantes possèdent le gène mecA. Six souches sont résistantes stricto sensu sur milieu à 2 % mais sensibles sur 5 %, soit 5 % (six sur 118) de résultats faussement négatifs. Quatre souches de S. epidermidis présentent une résistance contact (6 mm) sur 2 %, alors que les diamètres observés sur 5 % sont à la limite du seuil de sensibilité de 20 mm. La variabilité de la lecture des diamètres pourrait tout à fait faire considérer ces quatre souches comme sensibles par différents examinateurs. Les résultats obtenus dans cette étude permettent trois observations principales. Les diamètres des souches non discordantes de staphylocoques sont tout-à-fait comparables sur 2 et 5 %. Parmi les 13 souches de staphylocoques sensibles à la méticilline (dix souches de S. aureus et trois de S. epidermidis), trois seulement présentent des résultats discordants sur le milieu à 2 % contre 13 sur la gélose à 5 %. Les performances de la détection sont meilleures sur le milieu contenant 2 % de chlorure de sodium, quelque soit l’espèce considérée. Pour S. aureus, si la sensibilité est de 100 % aux deux concentrations testées, la spécificité est supérieure sur NaCl 2 %, 98,4 % versus 94,8 % sur NaCl 5 %. En revanche, pour S. epidermidis, c’est la sensibilité qui est améliorée sur la gélose à 2 % (100 % versus 92 % sur NaCl 5 %), alors que la spécificité de 92,5 % est identique aux deux concentrations de chlorure de sodium testées. Ainsi, le milieu de MuellerHinton additionné de 2 % de NaCl avec une incubation de 24 heures à 37 ◦ C permet une meilleure détection de la résistance à la méticilline chez S. epidermidis et évite quelques faux positifs chez S. aureus. L’inoculum de 108 CFU /mL induit probablement de rares fausses résistances à la méticilline sur la gélose additionnée de 2 % de NaCl.
RÉFÉRENCES 1 Vandenesch F, Bland S, Etienne J. Résistances par modification de cible et leur support génétique : la résistance à la méticilline chez les staphylocoques. In : IXe séminaire fondamental de microbiologie clinique. MSD ; 1994, p. 117-33. 2 Tomasz A, Nachman S, Leaf H. Stable classes of phenotypic expression in methicillin resistant clinical isolates of Staphylococci. Antimicrob Agents Chemother 1991 ; 35 : 124-9. 3 Gutman L, Goldstein F. Staphylocoques et bêta-lactamines. L’antibiogramme (Courvalin, Goldstein, Philippon et Sirot) 23-28. 4 National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2000. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, vol. 20, no 1. Approved standard M2-A7. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Wayne, Pa. 5 National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2000. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard, vol. 20, no 2. Approved
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2001 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés S0369-8114(01)00131-6/FLA
Article original
Choix de la concentration en NaCl pour optimiser la détection de la résistance à la méticilline chez Staphylococcus par la méthode de diffusion en gélose P. Bemer-Melchior ∗ , H.B. Drugeon Laboratoire de bactériologie, hôpital Laënnec, CHU Nantes, boulevard J. Monod, 44093 Saint-Herblain cedex 1, Nantes, France (Reçu le 25 janvier 2000 ; accepté le 12 mai 2000)
Résumé La résistance intrinsèque à l’oxacilline de 374 souches de Staphylococcus sp a été détectée par la méthode de diffusion en milieu gélosé (Mueller-Hinton additionné de 2 et 5 % de NaCl) avec un inoculum de 0.5 McF (108 CFU/mL), à l’aide d’un disque d’oxacilline à 5 µg. Après une incubation de 24 h à 37 ◦ C, les diamètres sont mesurés en tenant compte des squatters colonies. La PCR mecA est réalisée principalement sur les souches résistantes ou présentant des résultats discordants. Les résultats sont concordants pour 246 des 256 souches de S. aureus testées (182 sensibles et 64 résistantes). Parmi 118 souches de S. epidermidis, 105 présentent des résultats concordants (37 souches sensibles et 68 résistantes). Six souches (3 S. aureus et 3 S. epidermidis ) sont faussement résistantes (PCR-mecA négative) sur les deux milieux hypersalés. Dix-sept souches sont discordantes sur 5 % uniquement : sept souches de S. aureus ne possédant pas le gène mecA sont sensibles sur 2 % mais résistantes sur 5 % (3 % de faux positifs), dix souches de S. epidermidis possédant le gène mecA sont résistantes sur 2 % mais sensibles ou à la limite de la sensibilité sur 5 % (5 % de faux négatifs). Ainsi, la détection de la résistance à la méticilline sur milieu MH additionné de 2 % de NaCl pour une incubation de 24 h à 37 ◦ C améliore la spécificité pour l’espèce S. aureus et la sensibilité pour S. epidermidis. 2001 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS concentration de NaCl / diffusion en agar / résistance à la méticilline / staphylococcus
Summary – Determination of the NaC1 concentration in agar diffusion method for improving the detection of oxacillin resistance in Staphylococcus. The detection of oxacillin resistance is evaluated by the disk diffusion method in a collection of 374 Staphylococcus sp strains. The disk diffusion assay is performed with 5-µg oxicillin disk and a 108 CFU/mL inoculum on Mueller-Hinton agar plates supplemented with 2 or 5% NaCl and incubated at 37 ◦ C for 24 h. Strains are considered resistant in accordance to the French recommendations (any growth around the disk is observed). The detection of mecA gene is performed by PCR almost for resistant and discordant strains. Results are concordant for 246 of 256 Staphylococcus aureus strains (182 susceptible and 64 resistant strains) and for 105 of 118 S. epidermidis isolates tested (37 susceptible and 68 resistant strains). Six mecA-negative strains (3 S. aureus and 3 S. epidermidis) give false resistant results on agar with 2 and 5% NaCl. Seventeen isolates are discordant on 5% NaCl: 7 mecA-negative S. aureus strains are susceptible on 2% NaCl agar but resistant at 5% (3% false-positive results), 10 mecA-positive S. epidermidis strains are resistant on 2% NaCl agar but susceptible at 5% NaCl (5% false-negative results). The detection of meticillin resistance is improved on agar supplemented with 2% NaCl. 2001 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS agar diffusion method / meticillinoresistance / NaCl supplementation / staphylococcus
∗ Correspondance et tirés à part.
Adresse e-mail : [email protected] (P. Bemer-Melchior).
Choix de la concentration en NaCl et détection de la résistance à la méticilline
La résistance intrinsèque à la méticilline chez Staphylococcus est la conséquence de la production d’une protéine de liaison aux pénicillines (PLP) additionnelle, la PLP 2a ou PLP 2 codée par le gène mecA. Cette protéine additionnelle présentant une très faible affinité pour les bêtalactamines est capable à elle seule de catalyser la synthèse du peptidoglycane [1]. Cette résistance est rencontrée chez Staphylococcus aureus et dans d’autres espèces de staphylocoques à coagulase négative. En dépit de la présence constante du gène mecA chez tous les staphylocoques résistants à la méticilline, l’expression phénotypique de cette résistance est variable et quatre classes de résistance ont été définies par Tomasz [2] : une classe homogène, classe 4 (toutes les bactéries expriment le même haut niveau de résistance) et trois classes hétérogènes, classes 1, 2, 3 (il existe dans la population bactérienne des subpopulations plus ou moins résistantes). Dans les classes 1 et 2, la fréquence des bactéries résistantes est de 10–8 à 10–4. Ces souches sont difficiles à détecter phénotypiquement. L’expression phénotypique de cette résistance est influencée par la température (30◦ C > 37◦ C > 41◦ C), la concentration en NaCl (2 à 5 %) et par le pH (5,2 < 7,4). C’est pourquoi plusieurs méthodes ont été proposées, faisant varier la température, la durée d’incubation, l’inoculum, l’osmolarité du milieu (concentration en NaCl) [3], sans qu’il y ait de véritable consensus international concernant la détection de la méticillinorésistance par la méthode de diffusion en gélose. Le National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) préconise un disque d’oxacilline chargé à 1 µg sur un milieu de Mueller-Hinton sans adjonction de NaCl ensemencé avec un inoculum de 108 UFC/mL (0,5 MacFarland) et incubé à 33◦ –35◦ C (en favorisant 33◦ C) pendant 24 h [4]. Toutefois, pour la détermination des CMI en milieu solide et en milieu liquide, il préconise l’adjonction de NaCl à 2 % et pour l’« oxacillin screening plates » une concentration à 4 % [5]. Le comité de l’antibiogramme de la Société française de microbiologie (CA-SFM) recommande l’utilisation d’un disque d’oxacilline à 5 µg sur milieu de Mueller-Hinton incubé à 30◦ C ou sur milieu de Mueller-Hinton hypersalé incubé à 37◦ C, avec un inoculum lourd (107 UFC/mL). Pour certaines souches de staphylocoques présentant une croissance faible, une incubation de 48 heures est recommandée. Après avoir été longtemps égale à 5 %, la concentration en NaCl préconisé actuellement par le CA-SFM est comprise entre 2 et 4 % [6]. Parfois, avec l’utilisation de gélose de Mueller-Hinton contenant 5 % de NaCl, certaines souches de Staphylococcus aureus sensibles aux autres familles d’antibiotiques sont interprétées résistantes à la méticilline et certaines souches de S. epidermidis résistantes aux fluoroquinolones, aux aminosides ou aux macrolides sont répondues sensibles à la méticilline. Cette étude a été réalisée afin de déterminer quelle est la meilleure concentration (entre 2 et 5 %) de NaCl permettant la détection
217
de la méticillinorésistance chez Staphylococcus aureus et les staphylocoques à coagulase négative dans un délai maximal de 24 heures. La recherche du gène mecA par la technique PCR a été choisie comme méthode de référence pour confirmer les résistances phénotypiques et résoudre les résultats discordants [7, 8].
MATÉRIEL ET MÉTHODES Souches bactériennes Trois cent soixante-quatorze souches de staphylocoques consécutives non redondantes ont été isolées de tous types de prélèvements et de l’ensemble des services de l’hôpital Laënnec de Nantes, du mois de décembre 1997 au mois de septembre 1998. Elles ont été identifiées à Staphylococcus aureus pour 256 souches et à Staphylococcus epidermidis pour 118 souches par la recherche de la coagulase liée et la galerie d’identification API 32 Staph (bioMérieux, La Balme-les-Grottes, France).
Étude de la sensibilité à la méticilline La résistance à la méticilline a été recherchée à l’aide d’un disque d’oxacilline 5 µg sur deux géloses Mueller Hinton hypersalées, aux concentrations de 5 g/100 mL (0,85 mol/L) et 2 g/100mL (0,34 mol/L), incubées à 37◦ C pendant 24 heures. L’inoculum choisi correspond à un inoculum lourd de 0,5 MacFarland soit 1,5 108 bactéries/mL environ. La lecture s’effectue après 24 heures d’incubation à 37◦ C. La souche de staphylocoque est considérée comme résistante à la méticilline si la zone d’inhibition autour de l’oxacilline est < 20 mm ou s’il existe des colonies isolées à l’intérieur de la zone.
Réalisation de la PCR mecA Indication de la PCR mecA La recherche du gène mecA a été réalisée sur une partie des souches sensibles et concordantes (16 souches de S. aureus, 18 souches de S. epidermidis), sur toutes les souches résistantes concordantes, ainsi que sur l’ensemble des 23 souches présentant des résultats discordants entre les deux concentrations de NaCl (dix souches de S. aureus et 13 souches de S. epidermidis).
Extraction d’ADN À partir d’une culture de 24 heures sur gélose au sang, une extraction par la résine (kit Nucleon BACC2, Amersham Pharmacia) est réalisée après traitement des colonies par le lysozyme (Appligène Oncor), la lysostaphine (Sigma) et la protéinase K (Merk). L’extraction est réalisée conformément aux recommandations du fabriquant.
218
P. Bemer-Melchior, H.B. Drugeon
Oligonucléotides Les amorces (Genosys Biotechnologies (Europe) Ltd.) ont été décrites par Vannufel et al. [8]. M1 (5 -TGGCTATCGTGTCACAATCG-3 ) correspond aux nucléotides 4355 à 4375 et M2 (5 -CTGGAACTTGTTGAGCAGAG3 ) est complémentaire des nucléotides 4640 à 4659 du gène mecA (numéro d’accession emb Y14051). L’amplification donne un produit de PCR de 310 paires de base.
Tableau I. Résultats obtenus avec la PCR mecA selon les phénotypes de résistance à l’oxacilline.
S. aureus
La réaction PCR est réalisée avec une concentration de MgCl2 de 3 mM. Le programme d’amplification inclue 40 cycles d’amplification (dénaturation à 95◦ C pendant 15 secondes, hybridation des amorces à 60◦ C pendant 30 secondes, et extension d’amorces à 72◦ C pendant 30 secondes). Les produits de PCR sont visualisés par une électrophorèse sur gel d’agarose.
Performances comparées de la détection sur milieu hypersalé La sensibilité et la spécificité de la détection ont été calculées pour les souches de S. aureus et de S. epidermidis, à partir des résultats obtenus sur les géloses contenant 2 ou 5 % de NaCl.
RÉSULTATS Résultats obtenus avec la PCR mecA Parmi les 256 souches de S. aureus, 182 sont retrouvées sensibles quelque soit la concentration en NaCl et parmi ces souches, la PCR mecA est négative pour les 26 souches testées. Soixante-quatre souches sont résistantes en présence des deux concentrations de NaCl ; elles possèdent toutes le gène mecA. Dix souches sont négatives en PCR mecA mais sont répondues résistantes : trois sur la gélose 2 % et dix sur la gélose 5 % (tableau I). Sur les 118 souches de S. epidermidis, 37 sont sensibles à la méticilline quelque soit la concentration de NaCl ; les résultats de la PCR sont négatifs sur les 18 souches testées. Soixante-huit souches possèdent le gène mecA et sont résistantes avec les deux concentrations. Treize souches présentent des résultats discordants : trois souches négatives en PCR sont résistantes sur deux et 5 %, six souches positives en PCR mecA sont sensibles sur 5 %, quatre souches PCR-mecA positive sont résistantes sur 2 % et 5 % mais présentent des diamètres proches de la sensibilité sur 5 %.
Diamètres obtenus pour les souches non discordantes de Staphylococcus aureus et epidermidis Parmi les 256 souches de S. aureus, 182 sont sensibles à la méticilline et présentent un diamètre moyen de 25,8
S. epidermidis
NaCl 5 %
S
S
256 182 S (16 mecA−)
Amplification
NaCl 2 %
64 mecA+
R
R
7 mecA−
S
R
3 mecA−
R
R
S
S
68 mecA+
R
R
6 mecA+
R
S
4 mecA+
R
R*
3 mecA−
R
R
118 37 S (18 mecA−)
* Diamètres observés à la limite du seuil de sensibilité, cf. tableau IV.
± 3,8 mm (20–42 mm) sur 5 % et de 26,3 ± 3,5 mm (20–40 mm) sur 2 %. Soixante-quatre souches, résistantes à la méticilline, présentent un diamètre moyen de 6,2 ± 0,8 mm (6–10 mm) sur 5 % et de 6,3 ± 1,3 mm (6–16 mm) sur 2 %. Une souche résistante présente un diamètre de 16 mm sur 2 % contre 6 mm sur 5 % (tableau II). Parmi les 118 souches de S. epidermidis, 37 souches sensibles à la méticilline et présentent un diamètre moyen de 32,0 ± 3,0 mm (23–38 mm) sur 5 %, et de 32,1 ± 3,6 mm (24–40 mm) sur 2 % respectivement. Pour soixante-huit souches résistantes, le diamètre moyen est de 7,3 ± 3 mm (6–16 mm) sur 5 % et de 6,7 ± 2,2 (6– 19 mm) sur 2 %. Une souche présente a un diamètre de 19 mm sur 2 % contre 16 mm sur 5 %.
Résultats discordants chez S. aureus Sur les dix souches de S. aureus ne possèdant pas le gène mecA, trois présentent des résultats discordants aux deux concentrations (diamètre < 20 mm). Sept souches présentent des discordances à la concentration de 5 % : le diamètre moyen est de 15,3 mm sur 5 % et de 23,7 mm sur 2 % ; la diminution des diamètres ne s’accompagne pas de la présence de microcolonies dans la zone d’inhibition de l’oxacilline (tableau III).
Résultats discordants chez S. epidermidis Trois souches de S. epidermidis sont négatives en PCR mecA et présentent des diamètres < 20 mm sur les milieux à 2 et 5 %, sans colonies isolées à l’intérieur de la zone d’inhibition de l’oxacilline. Dix souches possèdent le gène mecA et présentent un diamètre moyen de 22,0 ± 4,0 mm sur 5 %, contre 9,0 ± 4,2 sur 2 %. Sur 5 %, quatre souches (deux avec
219
Choix de la concentration en NaCl et détection de la résistance à la méticilline
Tableau II. Diamètres obtenus pour les souches concordantes sur milieu hypersalé. Souches
Nombre
S. aureus
Gélose NaCl 2 %
Gélose NaCl 5 %
moyenne mm
écart mm
moyenne mm
écart mm
246
sensibles
182
26,3 ± 3,5
20−40
25,8 ± 3,8
20−42
résistants
64
6,3 ± 1,3
6−16
6,2 ± 0,8
6−10
S. epidermidis
105
sensibles
37
32,1 ± 3,6
24−40
32,0 ± 3
23−38
résistants
68
6,7 ± 2,2
6−19
7,3 ± 3
6−16
Tableau III. Résultats discordants pour 10 souches de Staphylococcus aureus. Discordances sur 2 et 5 % Souches
Discordances sur 5 %
Diamètre sur NaCl 2 % (mm)
Diamètre sur NaCl 5 % (mm)
PCR mecA
Souches
Diamètre sur NaCl 2 % (mm)
Diamètre sur NaCl 5 % (mm)
PCR mecA
1
15
15
NEG
3
25
15
NEG
2
15
15
NEG
5
25
16
NEG
3
19
15
NEG
6
29
13
NEG
7
23
15
NEG
8
23
17
NEG
9
21
16
NEG
10
20
15
NEG
Tableau IV. Résultats discordants pour 13 souches de Staphylococcus epidermidis. Discordances sur 2 et 5 % Souches
Discordances sur 5 %
Diamètre sur NaCl 2 % (mm)
Diamètre sur NaCl 5 % (mm)
PCR mecA
Souches
Diamètre sur NaCl 2 % (mm)
Diamètre sur NaCl 5 % (mm)
PCR mecA
1
13
6
NEG
4
6
22
POS
2
15
15
NEG
5
6
25
POS
3
16
19
NEG
6
10
24
POS
7
13
26
POS
8
15
23
POS
9
16
28
POS
10
6
19
POS
11
6
19
POS
12
6
18
POS
13
6
18
POS
un diamètre de 18 mm et deux avec un diamètre de 19 mm), ont été considérées comme discordantes car très proches du diamètre critique de 20 mm alors qu’elles ne présentent aucun diamètre d’inhibition sur la gélose à 2 % (tableau IV).
Calculs des sensibilités et spécificité Chez S. aureus, la sensibilité est de 100 %, quelle que soit la concentration de NaCl utilisée. La spécificité
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P. Bemer-Melchior, H.B. Drugeon
Tableau V. Performances de la détection de la résistance à la méticilline sur milieux hypersalés. Germes
NaCl 2 %
NaCl 5 %
SE
SP
SE
SP
S. aureus
100 %
98,4 %
100%
94,8 %
S. epidermidis
100 %
92,5 %
93%
92,5 %
est supérieure sur 2 % : 98,4 % versus 94,8 % sur 5 % (tableau V). Pour les souches de S. epidermidis, la spécificité est identique (92,5 %) sur les milieux contenant 2 ou 5 %. En revanche, la sensibilité est améliorée par la diminution de la concentration en NaCl (100 % sur 2 % versus 93 % sur 5 %).
DISCUSSION La technique de diffusion en milieu gélosé est la première à avoir été utilisée pour détecter les souches de staphylocoques résistants à la méticilline. Certaines conditions optimales d’expression de la résistance à la méticilline ont été décrites [3] : une température d’incubation à 30◦ C, un milieu hypersalé, un inoculum lourd ou encore une durée d’incubation de 48 h. Lorsque la température d’incubation est étudiée, les différences sont souvent non significatives ; la détection à 30◦ C nécessitant le plus souvent 48 heures [9, 10]. La plupart des auteurs s’accordent pour préconiser l’utilisation d’un inoculum lourd de 108 CFU/mL. Cet inoculum est identique à celui préconisé par le NCCLS mais supérieur à celui recommandé pour l’antibiogramme en milieu gélosé par le CA-SFM (106 CFU/mL). Les souches hétérogènes appartenant à la classe 1 de Tomasz [2] présentent une résistance de haut niveau à la méticilline (CMI > 25 mg/L) pour une subpopulation dont la fréquence de résistance est égale à 10–8 à 10–7 . Un inoculum lourd augmente les chances de détection. La concentration en NaCl est le troisième paramètre déterminant pour la détection de la résistance à la méticilline chez Staphylococcus. L’utilisation de NaCl a été recommandée dès la détection de cette nouvelle résistance pour stimuler la croissance des souches hétérorésistantes [11, 12]. Une concentration de NaCl 5 % a amélioré historiquement les performances du disque de céfalotine qui présentait alors 40 % de discordances avec les souches résistantes [13]. Le mode d’action du NaCl est mal connu. Pour Chambers [14], il n’augmente pas la production de PLP2a. Pour Murty [15], il stimule la production de PLP2a à 30 et 37◦ C, mais n’augmente la résistance qu’à 37◦ C. Il augmenterait la pression osmotique et limiterait l’effet des systèmes autolytiques déclenchés par l’action de l’antibiotique (oxacilline, méticilline) sur les PLP normales. Les recommandations du CA-SFM préconisent d’utiliser
un milieu hypersalé jusqu’en 1998 (les géloses disponibles commercialement étaient dosées à 5 %), et depuis 1999 la concentration en NaCl est précisée devant être comprise entre 2 et 4 % [6]. La concentration idéale de chlorure de sodium est difficile à déterminer, car elle dépend des espèces comparées, de l’inoculum, de la température et du temps d’incubation. Ainsi, Law et al. [16] proposent d’utiliser un milieu à 5 % de NaCl, alors que Mulder et al. [17] et Zambardi et al. [18] concluent à une meilleure détection de la résistance à la méticilline sur des milieux contenant 2 % de chlorure de sodium. Notre étude est en accord avec ces derniers résultats. Avec une méthode utilisant un disque d’oxacilline à 5 µg, un Mueller-Hinton sans adjonction de NaCl, un inoculum lourd (0,5 McF) et une incubation de 48 heures à 30◦ C, Barbier-Frebourg et al. [9] détecte toutes les souches de S. aureus mais ne parvient pas à détecter sept souches de staphylocoques à coagulase négative résistantes. En utilisant une incubation de 24 heures à 37◦ C et une concentration de NaCl à 5 %, nous observons des résultats similaires : six souches de S. épidermidis ne sont pas détectés ; la concentration de 2 % fait disparaître cette discordance. Nous avons choisi d’optimiser le milieu hypersalé plutôt que d’utiliser la température d’incubation à 30◦ C (aucune étude ne met en évidence de différence significative entre ces deux paramètres) car l’incubation à 30◦ C nécessite souvent une incubation de 48 heures pour les staphylocoques à coagulase négative [9, 10]. Parfois certaines souches ne se développent pas à cette température. Ces particularités entraînent un délai dans la réponse de l’antibiogramme alors que la résistance à la méticilline est un examen urgent car il oriente vers une thérapeutique spécifique. Six souches (3 S. aureus et 3 S. epidermidis) sont faussement résistantes aux deux concentrations de NaCl testées (diamètre < 20 mm et recherche du gène mecA négative). Ces six souches peuvent correspondre à des souches dites MODSA, présentant une affinité diminuée pour les protéines de liaison aux pénicillines (PLP) [19], ou à des souches dites borderline, définies par une hyperproduction de bêtalactamase. Petersson et al. montrent que le niveau de production de la bêtalactamase de certaines souches de S. aureus sensibles à la méticilline (PCR-mecA négative) est proportionnelle à la concentration en sel [20]. L’inoculum lourd utilisé dans notre étude pourrait être responsable de ces résultats faussement positifs sur gélose hypersalée. Dix-sept souches (7 S. aureus et 10 S. epidermidis) présentent des résultats discordants uniquement sur 5 %. Sept souches de S. aureus ne possédant pas le gène mecA, sont résistantes sur 5 %, soit 3 % de résultats faussement positifs (sept sur 256 souches de S. aureus), mais sont sensibles sur 2 %. Il peut s’agir dans ce cas d’une hyperproduction de bêtalactamase stimulée par la concentration en NaCl.
Choix de la concentration en NaCl et détection de la résistance à la méticilline
Dix souches de S. epidermidis discordantes possèdent le gène mecA. Six souches sont résistantes stricto sensu sur milieu à 2 % mais sensibles sur 5 %, soit 5 % (six sur 118) de résultats faussement négatifs. Quatre souches de S. epidermidis présentent une résistance contact (6 mm) sur 2 %, alors que les diamètres observés sur 5 % sont à la limite du seuil de sensibilité de 20 mm. La variabilité de la lecture des diamètres pourrait tout à fait faire considérer ces quatre souches comme sensibles par différents examinateurs. Les résultats obtenus dans cette étude permettent trois observations principales. Les diamètres des souches non discordantes de staphylocoques sont tout-à-fait comparables sur 2 et 5 %. Parmi les 13 souches de staphylocoques sensibles à la méticilline (dix souches de S. aureus et trois de S. epidermidis), trois seulement présentent des résultats discordants sur le milieu à 2 % contre 13 sur la gélose à 5 %. Les performances de la détection sont meilleures sur le milieu contenant 2 % de chlorure de sodium, quelque soit l’espèce considérée. Pour S. aureus, si la sensibilité est de 100 % aux deux concentrations testées, la spécificité est supérieure sur NaCl 2 %, 98,4 % versus 94,8 % sur NaCl 5 %. En revanche, pour S. epidermidis, c’est la sensibilité qui est améliorée sur la gélose à 2 % (100 % versus 92 % sur NaCl 5 %), alors que la spécificité de 92,5 % est identique aux deux concentrations de chlorure de sodium testées. Ainsi, le milieu de MuellerHinton additionné de 2 % de NaCl avec une incubation de 24 heures à 37 ◦ C permet une meilleure détection de la résistance à la méticilline chez S. epidermidis et évite quelques faux positifs chez S. aureus. L’inoculum de 108 CFU /mL induit probablement de rares fausses résistances à la méticilline sur la gélose additionnée de 2 % de NaCl.
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