Citogenética y genética molecular de tumores del sistema nervioso

Citogenética y genética molecular de tumores del sistema nervioso

M.J. Bello, J.M. de Campos*, M.E. Kusak**, J. Vaquero*** y J.A. Rey. Instituto de Investigaciones Biomédicas del CSIC. Servicios de Neurocirugía de *Fundación Jiménez Díaz. ** Hospital de laPrincesa, y ***Clínica Puerta de Hierro. Madrid.

Resumen El análisis citogenético y molecular de los tumores del Sistema Nervioso ha proporcionado en los últimos años una información primordial acerca de los mecanismos responsables de su origen y desarrollo. Así por ejemplo, sabemos que los gliomas muestran un patrón complejo de afectación cromosómica que generalmente implica: ganancia de cromosomas del par 7 y pérdidas proporcionales de los cromosomas o regiones cromosómicas 1p, 9p, 10, 17p, 19q Y 22q. La caracterización molecular de estas anomalías ha demostrado que las mutaciones del gen TP53 junto con la pérdida de alelos a nivel de 17p podrían acontecer en etapas tempranas del desarrollo de estos tumores, mientras que las alteraciones a nivel de los cromosomas 13 y 22, aunque acontecimientos tempranos, sólo caracterizarían determinados subtipos de gliomas, del mismo modo que las alterciones de 1p y 19q contribuyen preferentemente al desarrollo de oligodendrogliomas. La pérdida de secuencias genómicas a nivel de los cromosomas 10 y 9p (es decir de un gen oncosupresor localizado en dichos cromosomas) y la amplificación del gen codificador del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) parecen ser anomalías que, de forma secuencial, contribuyen a la génesis de las formas tumorales de mayor grado de malignidad: Astrocitoma anaplásico y Glioblastoma multiforme. Los datos disponibles en relación a Meningiomas y Neurinomas han demostrado que la pérdida de material genético a nivel del cromosoma 22 representa un factor primordial para su desarrollo. Según esto, un gen o genes de carácter oncosupresor, localizados en este cromosoma, participarían en la génesis de ambas neoplasias, cuya forma de presentación puede ser como tumores esporádicos o asociados a la neurofibromatosis de tipo 2 (NF-2). El análisis molecular de amplias series de meningiomas muestra que la región perdida correspondería a la porción distal del cromosoma, mientras que recientemente se ha aislado un gen responsable del desarrollo de NF-2, cuya localización sería más proximal. Estos datos indican que dos o hasta tres genes diferentes parecen participar de for-

ma activa en la carcinogenesis de los tumores de origen nervioso: a. gen NF-2 localizado a nivel de 22q12, que potencialmente desempeña algún papel en el desarrollo de neurinomas y de ciertos meningiomas; b. locus de meningioma, situado a nivel de 22q12.3-qter, que contribuiría de forma específica en la genesis de meningiomas; c. locus de gliomas, a nivel de 22q13.2-qter, cuya participación parece específica en determinados subgrupos de gliomas. Los trabajos encaminados a la identificación y aislamiento de todos los genes involucrados, así como también el análisis funcional de sus productos proteicos, contribuirán a obtener un mejor y más exacto conocimiento de los factores desencadenantes del desarrollo de los tumores de origen nervioso, con implicaciones clínicas a nivel de diagnóstico, pronóstico, tratamiento, etc. de los pacientes afectos. PALABRAS CLAVE: Citogenética, Genética molecular, Oncogenes, Genes oncosupresores, Tumores del sistema nervioso, Glioma, Meningioma, Neurinoma.

Summary Cytogenetic and molecular genetic analyses of the major histological subtypes of tumors of the Nervous System (neurinomas, meningiomas and gliomas) have provided interesting data on the molecular mechanisms involved in their origin and development. A complex pattern of chromosomal abnormalities has been identified in malignant gliomas, including gains of chromosome 7 and losses of chromosomes 10, 9p, 17p, and 22. The molecular characterization of these abnormalities has demonstrated that anomalies of the TP53 gene, and the loss of alleles at 17p seem to be the earliest abnormalities occurring during the genesis and progression of these neoplasms. The loss of regions on chromosomes 13 and 22 might also represent early events, perhaps characterizing subgroups of low grade tumors. Data available on meningiomas and neurinomas show thatloss of regions on chromosome 22 is the main cytogenetic feature. Thus, tumor suppressor genes located in this chromosome are non-ran183

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domly involved in both neoplasms~ The molecular studies in these tumor types have shown that loci placed at 22q12 or the gene responsible for the d~velopment of neurofibromatosis type 2, also located here, might be the target for the anomalies of chromosome 22, detected in meningiomas or neurinomas. Efforts to identify and isolate the genes involved in these neoplasms will contribute to a better understanding of the mechanisms of oncogenesis in brain tumors and will doubtless have a clinical impact on the diagnosis, treatment and prognosis of the patients. KEY WORDS: Cytogenetics, Molecular genetics, Oncogenes, Tumor suppressor genes, Nervous system tumors, Brain tumors, Glioma, Meningioma, Neurinoma.

Los grandes avances experimentados por la Biología molecular durante los últimos años han demostrado que el desarrollo neoplásico es el resultado de la acumulación secuencial de diversas alteraciones que principalmente afectan a dos tipos de genes: oncogenes y genes oncosupresores (GOS). Mientras los primeros parecen ser de carácter dominante, los GOS son recesivos a nivel celular y estas diferencias se manifiestan también a nivel de su función biológica: Los oncogenes generalmente codifican proteínas que promueven el crecimiento de las células susceptibles, mientras que los GOS están relacionados con proteínas que impiden dicho crecimiento. Esto significa que la alteración de un único alelo de un oncogén sería suficiente para promover el crecimiento celular, en contraste con los GOS para los que ambos alelos han de inactivarse de tal forma que la ausencia de la función normal de inhibición de crecimiento contribuya al desarrollo tumoral. Existen numerosos ejemplos de oncongenes, muy bien conocidos en la actualidad. En cambio, sólo se han aislado unos pocos GOS, siendo el mejor caracterizado el gen de la susceptibilidad a retinoblastoma RB-1, cuyos dos alelos son inactivados por una variedad de mecanismos durante el desarrollo de retinoblastoma. Las alteraciones moleculares de estos tipos de genes se relacionan frecuentemente con anomalías detectables a nivel cromosómico mediante el análisis citogenético de las células tumorales. Las anomalías citogenéticas se encuadran en tres categorías principales: A) Translocaciones, inserciones, inversiones, etc. que por yuxtaposición a otras secuencias cromosómicas pueden activar un oncogén. El ejemplo más estudiado es la translocación t9;22 característica de la Leucemia Mieloide Crónica que permite la fusión del oncogén abl con el gen BCR, originando una proteína anómala que contribuye al desarrollo neoplásico. 184

B) Deleciones cromosómicas, monosornías, O en generalla pérdida específica de una regióncromosómica en un tipo tumoral concreto sugiere que dicha región contiene un GOS. En algunos retinoblastomas, una delección del cromosoma 13 [del (13) (q14)] contribuye a la pérdida de una copia del GOS RB-1, y permite comprobar la existencia de mutaciones inactivantes en el alelo retenido de este GOS. C) Trisomías, isocromosomas, dobles minutes, etc. que generalmente se relacionan con amplificación génica, que frecuentemente afectan a los oncogenes. A nivel molecular, el análisis de oncogertes encaminado a la detección de reordenamientos o amplificación se realiza mediante la utilización de fragmer¡.tos de ADN (sondas) específicos para el oncogen a som~ter a estudio. Por contra, la estrategia para el estudio de GOS supone un análisis indirecto de pérdidas alélicas de regiones del genoma próximas al GOS en estudio y con posterioridad se podría efectuar su aislamiento y clonación. En este momento, el análisis molecular directo de un GOS es factible del mismo modo que se efectúa para los oncogenes. La utilización conjunta de ambas metodologías (Citogenética y Genética molecular) ha demostrado su utilidad para el esclarecimiento de los mecanismos 1;Jiológicos que participan en el desarrollo y progresión tumoral, con frecuentes implicaciones a nivel diagnóstico, pronóstico e incluso de clasificación neoplásica, proporcionando un abundante acúmulo de datos referentes a multitud de tipos histológicos de tumores, incluyendo también los de origen nervioso. A continuación vamos a resumir los datos de mayor interés referentes a la Citogenética y Genética molecular de los principales subtipos histológicos de tumores neurogénicos: gliomas, meningiomas y neurinomas. Citogenética de gliomas 1. Astrocitoma anaplásico y Glioblastoma multiforme (grado 111-1V de malignidad). Alrededor de 200 muestras de tumores de esta categoría han sido analizados citogenéticamente, 5,12,36.42,50,51,57,58,72 Y la mayoría de ellos presentan líneas celulares de rango diploide (en tomo a 46 cromosomas) mientras un 10-20% de tumores muestran numerosos modales de rango tri-tetraploide (60-90 cromosomas). Las anomalías cromosómicas más frecuentes son de tipo numérico e implican la ganancia de copias del cromosoma 7 (observada en aproximadamente el 70% de las muestras), y las pérdidas de ejemplares del cromosoma 10 (detectada en 50-60% de tumores analizados). Con menor frecuencia (20% de casos) se observan pérdidas del cromosoma 22. Las alteraciones cromosómicas estructurales han sido detectadas en el 60% de las muestras analizadas, observándose que las deleciones o translocaciones que afectan al brazo corto del

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cromosoma 9 (9p), que generalmente suponen la pérdida de material genético de la región 9p24-p13, son las anomalías más frecuentes. Por otra parte, deleciones o translocaciones de 1p36-p32, 6q15-q28, 7q22-q34, 8p23-p21, 13q21-q22, 19q13 Y 22q13 aparecen de forma recurrente y son consideradas alteraciones no debidas al azar. Un pequeño número de tumores presenta deleciones parciales del cromosoma 10. Tras un análisis detallado de las porciones perdidas se puede concluir que la región 10q24qter sería una zona crítica donde se situaría un GOS involucrado en gliomas 58 • Por último, un tercio de los tumores analizados presentó marcadores citogenéticos de amplificación génica: dobles minutes (DMs). 2. Astrocitomas de bajo grado (l-U) de malignidad. Se ha analizado un menor número de muestras procedentes de astrocitomas de bajo grado de malignidad 12,31,36, 42,49,54,72. En el 30% de las 65 muestras analizadas sólo se encontraron complementos cromosómicos normales, mientras que los restantes tumores presentaron clones alterados que incluían anomalías cromosómicas similares a las descritas en las formas de mayor grado de malignidad: trisomía 7, monosornía 10 y/o 22 y reordenamientos estructurales de 6q, 9p, etc. 3. Oligodendrogliomas. Una cifra inferior a 65 oligodendrogliomas ha sido analizada citogenéticamente 3\,36,49,50,54,72. Como ocurre con los astrocitomas de grado I-II, la presencia de cariotipos normales o 45,XO es la característica primordial en las muestras de bajo grado. No obstante en oligodendrogliomas anaplásicos se han encontrado alteraciones numéricas implicando pérdidas del cromosoma 22 y alteraciones estructurales de 1p, 7q, llq, 19q Y 22q. 4. Ependimomas. No más de 45 muestras de ependimomas han sido objeto de análisis citogenético 15,19,3\,36.49.54,72. Aunque no se puede establecer un patrón detallado de alteraciones, las deleciones a nivel de 22q13 o las pérdidas de este cromosoma completo aparecen de forma reiterada en varios casos.

Genética molecular de gliomas Los estudios moleculares en gliomas se han orientado sobre dos aspectos principales: 1) Análisis de la expresión y amplificación de oncogenes y, 2) Mapeo de deleción de las regiones cromosómicas involucradas en pérdidas o deleciones con el fin de determinar la sublocalización de GOS implicados en el desarrollo de estas neoplasias. En 1985, Liberman y col 4\ demostraron la existencia de amplificación del gen codificador del receptor del fac-

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tor de crecimiento epidérmico (EGFR) en 4 de 10 glioblastomas, mientras que ninguna muestra derivada de astrocitomas de grado I-II o de oligodendroglioma presentaba esta anomalía. Por otra parte demostraron que subsecuente al reordenamiento intragénico y posterior amplificación del gen EGFR, estos tumores presentaban altos niveles de actividad EGFR quinasa. Recientemente, Wong y cols. 80, utilizando técnicas de hibridación in situ y molecular, encontraron amplificación génica afectando al gen EGFR paralela a altos niveles de RNAm específico que, en algunos tumores, se correlacionaba con síntesis de EGFR de bajo peso molecular. Un EGFR truncado, con pérdida del dominio extracelular caracterizaba al 50% de los glioblastomas analizados. Por tanto, la alteración del gen EGFR sería un factor que contribuiría al crecimiento tumoral de los gliomas. Nuestros resultados al respecto en una serie de 57 gliomas demostraron que 11 tumores presentaban amplificaciones del gen EGFR (Figura 1). Nueve de ellos fueron diagnosticados como glioblastomas multiformes y los dos restantes correspondieron a un astrocitoma de grado II y a un oligodendroglioma (grado II). El análisis detallado de los fragmentos de restricción permitió determinar la presencia de alteraciones estructurales del gen en cuatro glioblastomas. De forma esporádica, se han encontrado otros oncogenes amplificados en gliomas malignos, como por ejemplo: c-mye, c-gli, o e-ros 14,37,73. Su relación con el crecimiento celular en estos tipos tumorales no está todavía bien estudiada. Los estudios para delimitar las regiones genómicair perdidas en gliomas han abarcado todos los cromosomas. Así, Fults y col. 27,28 concluyeron que los cromosomas 10 y 17p deben ser sede de GOS que desempeñan un papel primordial en el desarrollo de gliomas. Las alteraciones de l7p estaban presentes en astrocitomas anaplásicos y glioblastomas, involucrando la región 17pter-p 11.2 24.33. Paralelamente se determinó que estos mismos subtipos histológicos de gliomas presentaban frecuentemente mutaciones del gen TP53 (localizado en 17p), sugiriéndose que éste podría ser el gen diana para las deleciones previamente observadas afectando a 17p 25.26.45,11. Sin embargo, recientemente se han descrito tumores con pérdida de 17p sin alteraciones del gen TP53, sugiriéndose que otro GOS, localizado en la misma región del genoma (l7p), podría participar también en el desarrollo de algunos tipos histológicos de gliomas, principalmente los de tipo astrocítico 25, 26, 69, 76. Cuando se efectuaron estudios similares en tumores no astrocíticos se comprobó una menor frecuencia de alteraciones de TP53: 12% de oligodendrogliomas, pero no en ependimomas 47. Un posible significado de las alteraciones de TP53 fUe propuesto por Sidranski y col. 69 tras demostrar que las subpoblaciones de células presentes en 185

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Fig. 1.- Análisis por southern blot del gen EGFR en un blastoma multifonne. Diez microgramos de ADN tumoral linfocitario (N) fueron digeridos con los enzimas de restri indicados (Taql, Hind/lI, Mspl). Posteriormente, los fragm de restricción obtenidos fueron resueltos mediante electrofi en gel de agarosa y transferidos a una membrana de nyl, continuación se efectuó la hibridación molecular con la ~ paw/O (correspondiente a un clon cDNA derivado de, EGFR), y posterior exposición autorradiográfica a _70 0 du 3 días. En los tres ensayos, se observó un considerable i mento de la señal autorradiográfica en los carriles T, ce pondientes al ADN tumoral, utilizando como referencia 1, rrespondiente señal de los carriles que contienen ADN ¡¡nfi rio normal.

un astrocitoma de bajo grado contenían las mismas al ciones de TP53 que las células que componían la reci de aquel astrocitoma. Según este dato, la progresión di gliomas astrocíticos podría estar asociada a la expan clonal de células que previamente adquieren mutaci, inactivantes de TP53. Esta mutación probablemente, fiere ventaja selectiva para el crecimiento celular in vi 186

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cadores del interferon A y B (IFN-A, IFN-B) (Figura 2), participaría en la genesis de formas agresivas de glioblastomas 9,34,48. En base a todos estos hallazgos, se puede sugerir que las alteraciones de 17p representarían uno de los primeros acontecimientos durante el desarrollo de gliomas, mientras que las pérdidas de secuencias a nivel de 9p, 10 Y la amplificación del gen EGFR serían alteraciones relacionadas con la progresión tumoral. Como ya hemos indicado en el apartado de citogenética, al análisis cromosómico de las células tumorales permitió detectar, en algunos astrocitomas de grado 1-11 y en unos pocos oligodendrogliomas, que había poblaciones celulares minoritarias caracterizadas por monosoITÚa o deleción del cromosoma 10 y, con menor frecuencia, deleciones de 9p. Estos hallazgos indicarían que dichas alteraciones no están limitadas a tumores de alto grado, pudiendo ya estar presentes en células aisladas de las formas de menor grado de malignidad. En este sentido, Leenstra y col. 39 han confirmado, a nivel molecular, los hallazgos citogenéticos previos, tras analizar las regiones 9p, 10 Y 17p en las zonas con diferente grado de malignidad (1-11 y III-IV) e incluso en las áreas de satelitosis en cuatro tumores astrocíticos. Estos autores comprobaron que las alteraciones presentes en las áreas de mayor grado de malignidad también lo estaban en las regiones de grado 1-11 de los mismos tumores, o en las áreas de satelitosis. Estos resultados no son contradictorios con el papel propuesto previamente para las alteraciones de 9p y del cromosoma 10, ya que se puede aceptar la posibilidad de que, en los astrocitomas de grado 11, aquellos pequeños clones celulares que contienen dichas alteraciones son los que proliferarán originando un tumor de mayor grado de malignidad. Recientemente, Godbout y col. 30 analizaron la expresión de varios genes con potencial capacidad oncosupresora (RB-l, TP-53, INF-A, INF-B, MGMT) en líneas celulares derivadas de gliomas malignos y concluyeron que dichos GaS se inactivan de forma independiente. Unicamente se presentó en relativa asociación la inactivación de RB-l y MGMT, es decir alteraciones a nivel de los cromosomas 13 y 10 donde se localizan dichos genes. Bello y col. 11 han analizado las alteraciones de loci situados en el cromosoma 1 en una serie de gliomas, detectando que las deleciones que afectan al brazo corto (l p) son frecuentes en oligodendrogliomas (13 de 15 tumores estudiados), mientras se presentan de forma esporádica en glioblastomas y raramente en tumores astrocíticos. Según estos hallazgos un GaS localizado en 1p estaría preferentemente involucrado en la tumorogénesis de oligodendrogliomas. La última región del genoma con potencial interés en este tipo tumoral viene representada por el cromosoma 22. La deleción de regiones de este cromosoma caracteriza

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subgrupos de gliomas que, generalmente presentan pérdida del cromosoma completo 27,32,52,59. No obstante, en unas pocas muestras, las pérdidas a nivel molecular se restringen a la región 22q13, confirmando el hallazgo citogenético similar en algunos oligodendrogliomas y ependimomas, o incluso en el 10-20% de los glioblastomas multiformes 52,59. Por tanto, la inactivación de un GaS localizado en 22q13 representaría una factor importante en el desarrollo de algunos subtipos de gliomas. La existencia de un GOS de glioma en el cromosoma 22 es de especial interés, dado que, como veremos más adelante, existe una afectación preferencial del cromosoma 22 en meningiomas y neurinomas. ¿Sería factible establecer un patrón para la secuencia de alteraciones génicas que participan en la génesis y evolución de los tumores gliales? Dado que este es uno de los objetivos fundamentales de los estudios moleculares y citogenéticos en gliomas, varios grupos de investigación han propuesto sendos patrones que, como veremos a continuación, no son capaces de explicar los hallazgos en todas las muestras tumorales. Según Bigner y Vogelstein 13, la pérdida de 17 p, así como también las deleciones de los cromosomas 13 y 22 se presentarían en determinados subgrupos de gliomas, y tal vez ocurran en tumores de bajo grado y en tumores avanzados. No obstante, estas alteraciones no se observan en todos los astrocitomas anaplásicos, por lo que se puede suponer que en gliomas podrían actuar otros mecanismos genéticos. Según estos autores, las alteraciones del gen TP53 serían relativamente tempranas y se relacionarían con la evolución hacia astrocitomas III-IV. Las alteraciones a nivel de 9p y del cromosoma 10 representarían aspectos similares a las que afectan a TP53, si bien las primeras se producirían con posterioridad. Por último, la amplificación de EGFR y, en ocasiones, la deleción de 9p podrían ser alteraciones conducentes a la génesis de formas más agresivas de gliomas de alto grado. Scrable y col. 65 propusieron un modelo, posteriormente ratificado por Ransom y col. 49,50, según el cual las alteraciones ocurrirían sin un orden preestablecido, con la única excepción de aquellas anomalías que afectan al cromosoma 10 y a 17p. Estos autores proponen que la pérdida de genes localizados en el cromosoma lOse relaciona con la progresión hacia tumores de grado IV, mientras que las pérdidas a nivel de 17 p estarían ya presentes en los tumores de bajo grado de malignidad, que posteriormente evolucionarían hacia formas de grado IV, perdiendo el cromosoma 10. Sin embargo, algunos gliomas se presentan como grado IV, con pérdida del 10 y sin alteraciones aparentes de loci localizados en 17p, representando excepciones a este modelo. En este sentido, los hallazgos de Bello y col. 7 demuestran también que las alteraciones de 17p y cromosoma 10 no son necesariamente acontecimientos secuenciales en la evolución de gliomas astrocíticos y, por 187

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otra parte, constatan la presencia de alteraciones de 9p en algunos gliomas de bajo grado.

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presencia de ambas copias del cromosoma 22 es una característica de los tumores no hipodiploides, cuyo posible significado molecular se discutirá más adelante.

Citogenética de meningiomas Genética molecular de meningiomas

El meningioma puede considerarse como el primer tumor sólido en el que se detectó una anomalía cromosómica específica. Al inicio de la década de los años 70, Mark y col. 44 y Zank1 y Zang 82 demostraron que la monosomía o deleción del cromosoma 22 es la principal característica citogenética de los meningiomas. Estudios más recientes, llevados a cabo en varios laboratorios 3, ]6,43.56, 81, han proporcionado información sobre las características cromosómicas de alrededor de unas 300 muestras derivadas de meningiomas, confirmando que aproximadamente el 70% de tumores presenta alteraciones del cromosoma 22. Desde un punto de vista citogenético se pueden diferenciar varios subgrupos de meningiomas: l. Meningiomas en los que únicamente se han descrito cariotipos normales. Este grupo representa el 18-20% del total. 2. Meningiomas sin alteraciones del cromosoma 22, pero que muestran anomalías numéricas y/o estructurales, de carácter clonal, que afectan a otros cromosomas. Entre el 5-7% de los meningiomas se incluyen en este grupo. 3.a. Tumores en los que las alteraciones del cromosoma 22 son las únicas detectadas (representa 50-60% del total de meningiomas)y, 3.b. Tumores con alteraciones que afectan a otros cromosomas además de las propias del cromosoma 22 (en este grupo se incluyen 10-20% del total de los casos). Actualmente se acepta que las alteraciones afectando a otros cromosomas representan cambios secundarios a las anomalías del 22, y desempeñarían un papel relacionado con la progresión tumoral de los meningiomas, que producen formas atípicas e incluso anaplásicas. Este hecho explicaría por sí mismo el interés en conocer cuales son estas alteraciones cromosómicas secundarias a la monosomía o deleción del par 22. Sin embargo, la baja frecuencia de este subgrupo de meningiomas dificulta la obtención de datos, al carecer de series amplias. No obstante, la información disponible en aproximadamente 50 muestras incluibIes en este grupo citogenético demuestra que las únicas anomalías de carácter recurrente serían: deleciones del brazo corto del cromosoma 1 (Ip), pérdidas de los cromosomas 8 y 14 y, más raramente, pérdidas de 11p 3, 16,43,56,81. Generamente, los meningiomas se caracterizan por números cromosómicos modales de rango hipodiploide (45 cromosomas o menos), principalmente como resultado de la pérdida del cromosoma 22. Con menor frecuencia, encontramos meningiomas diploides normales o pseudodiploides y tan sólo en el 2-3% de los casos se detectan números modales hiperdiploides (47 cromosomas o má~). La 188

Los estudios de los meningiomas a nivel molecular se han dirigido casi exclusivamente al análisis del cromosoma 22, con el fin de efectuar una mapa de deleción de dicho cromosoma que permitiese localizar el GaS involucrado en el desanollo de este tipo de tumor 23,56,66. Utilizando un panel de sondas polimórficas derivadas del cromosoma 22, se comprobó que el 50-60% de muestras presentaban pérdidas de alelas localizados en este cromosoma. Se incluirían casos con resultados compatibles con la pérdida total del cromosoma y tumores cuyos resultados demostraban la existencia de deleciones terminales, es decir, retención del genotipo constitucional en los marcadores centroméricos, con pérdidas para los marcadores situados en regiones distales. Los estudios en este aspecto demuestran que la región del cromosoma 22, cuya pérdida se detecta con frecuencia sería aquella localizada distalmente al gen MB, lo cual sugiere que el GaS involucrado en meningiomas, se puede situar en la región 22q12.3qter. No obstante, hay datos que sugieren que otro GOS localizado más proximalmente en el cromosoma 22 estaría también involucrado en algunos meningiomas. Según Lekanne-Deprez y col. 40, este GaS se situaría a nivel de 22q11-q12, y podría relacionarse con el gen responsable del desanollo de Neurofibromatosis tipo 2 (NF-2) Yde los neurinomas. De acuerdo con los hallazgos moleculares, la pérdida de secuencias del cromosoma 22 acontecería en todos los subtipos histopatológicos de meningiomas. La principal excepción viene representada por el hemangiopericitoma meníngeo. Hasta el momento se han analizado a nivel molecular 7 muestras y todas ellas retenían el genotipo constitucional, es decir, no presentan pérdidas de alelas del cromosoma 22. Este dato está de acuerdo con los resultados citogenéticos que demuestran que esta neoplasia retiene ambas copias del par 22 10,23,64. Recientemente, este tipo tumoral ha sido separado del grupo de meningiomas, pasando a constituir una entidad independiente. Tal vez, los hallazgos citogenéticos y moleculares están conoboranelo que meningiomas y hemangiopericitomas ele localización meníngea representan tipos tumorales diferentes. Como ya hemos indicado más arriba, la retención de ambas copias del cromosoma 22 es también característica de los meningiomas pseudodiploides e hiperdiploides, con la consiguiente retención de alelas demostrada en los estudios moleculares 8. En estos tumores no hipodiploides cabe la posibilidad de que mutaciones puntuales, o microdeleciones, afecten al GaS de meningioma, no siendo detec-

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tables dichas alteraciones mediante las técnicas utilizadas. Tal vez el análisis directo del gen, cuando éste haya sido clonado, permitirá determinar esta posibilidad. Obviamente, este argumento es también aplicable a los hemangiopericitomas y, del mismo modo un análisis detallado del GOS de meningiomas permitirá en su momento obtener datos de gran interés respecto a su implicación o no en dicho tipo tumoral, contribuyendo así a su correcta clasificación histológica. Los estudios moleculares más recientes efectuados en meningiomas han demostrado la asociación entre determinadas alteraciones y la progresión tumoral hacia formas atípicas o anaplásicas: pérdida de secuencias localizadas en el cromosoma 10 y en el brazo corto del cromosoma 1, en concreto en 1pter-1p32. Estas anomalías aparecen raramente en los meningiomas típicos, en más del 50% de los atípicos y en casi el 100% de los clasificados como anaplásicos. Estos hallazgos sugieren que la progresión hacia formas agresivas de meningiomas supone, al menos, la inactivación de GOS localizados en estas regiones del genoma 6. Citogenétíca de neurinomas

Apenas un centenar de muestras derivadas de neurinomas han sido objeto de estudio citogenético, incluyendo tanto tumores esporádicos como asociados a NF-2 4,18,55,62, 71,79. En la mayoría de los casos se han descrito complementos cromosómicos normales,' y un 30% de tumores presentan monosomía 22 o, raramente, delección de 22q. Como ocurre en los meningiomas, estos datos citogenéticos sugieren que un GOS localizado en el cromosoma 22 está involucrado en el desarrollo de neurinomas. En un pequeño número de muestras se han identificado alteraciones clonales (numéricas y/o estructurales) que afectan a otros cromosomas distintos del 22. En varios tumores se ha descrito afectacion de los pares 6 y 9 4. Genética molecular de neurinomas

Al igual que en los meningiomas, los estudios moleculares de los neurinomas se han dirigido casi exclusivamente hacia el cromosoma 22, tratando de localizar e identificar el hipotético GOS involucrado 18,52,67. Aunque se han efectuado estudios al respecto en varias series de tumores, en la mayoría de los casos que presentaban alteración, ésta suponía la ausencia del cromosoma 22 completo. Dicha anomalía se presentaba con independencia de la localización (acústico, dorsal, etc.) y de la forma clínica de presentación (esporádicos o asociados a NF-2). En los pocos casos en los que se ha identificado una deleción parcial, se ha podido determinar que el GOS implicado se situaría a nivel de 22q11.3-12.1, siendo ésta también la 10-

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calización del gen que predispone a la NF-2. Por esta razón cobra verosimilitud la hipótesis de que el GOS involucrado en los neurinomas sea el mismo afectado en NF-2, que incluso podría propiciar el inicio de algunos meningiomas. Tumores del sistema nervioso y neurofibromatosis.

La neurofibromatosis (NF) es una facomatosis que predispone al desarrollo de tumores del sistema nervioso. Existen dos variantes clínicas fundamentales: - NF periférica, NF de van Recklinghausen, o NF-1. Esta entidad representa una de las enfermedades autosómico dominantes más comunes en humanos y se caracteriza por neurofibromas periféricos, pigmentación patológica de la piel, etc. La NF-1 representa el 80-90% de todas las NF. El gen causante de esta enfermedad ha sido identificado, habiéndose clonado segmentos de ADN procedentes de dicho gen, cuya localización es 17q11.2 17,76,78. - El segundo tipo de NF, NF-2, NF-central, o NFacústico-bilateral, se caracteriza por desarrollo de neurinoma de acústico bilateral, meningiomas, schwannomas, etc. Esta entidad se hereda con un patrón autosómico dominante, y el gen responsable, asignado a la región 22q12 ha sido recientemente identificado y clonado 63.74. Ambos genes NF parecen mostrar características de GOS. En la actualidad se procede a la identificación de las funciones biológicas de los correspondientes productos proteicos. Se han efectuado pocos estudios citogenéticos en tumores asociados a la NF-1, Ygeneralmente se restringen a neurofibromas, y a casos aislados de gliomas (22,29,53,60,61). En estos tumores se han detectado múltiples alteraciones cromosómicas, sin una particular afectación de la región del cromosoma 17 donde se localiza el gen NF-l. La única excepción a este hecho es un caso analizado por Decker y col. 22 caracterizado por una translocación de los cromosomas 17 y 22. No obstante, sí se han detectado unos pocos pacientes con anomalías constitucionales del cromosoma 17, que han resultado de fundamental importancia para la identificación y clonado del gen 17,76, 78. Por otra parte, el análisis molecular de tumores asociados a NF-1 ha demostrado la pérdida de secuencias en 17p, así como alteraciones del gen TP53. En el 50% de los casos se observaron pérdidas que afectan regiones adyacentes y al propio gen NF-l, y se especula con la posibilidad de que otros mecanismos, tales como mutaciones puntuales contribuyan a inactivar el gen en aquellos casos en los que ambos alelas son detectables 29,46,60,68,70. Basándose en el tumor con afectación de los cromosomas 17 y 22 a que anteriormente hacíamos referencia, Decker y col. 22 propusieron que, además de la inactivación del gen NF-l localizado en el cromosoma 17, algu189

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Citogenética y genética molecular de tumores del sistema nervioso

nos tumores asociados a NF-1 se desarrollarían a través de una afectación posterior de un gen localizado en el cromosoma 22, tal vez NF-2, o un pseudogen de NF-l. En este sentido, recientemente se ha detectado tanto a nivel citogenético como molecular una deleción de la región 22q12 en un neurofibrosarcoma de un paciente afecto de NF-1 60, lo cual parece fundamentar la hipótesis de Decker y col. 22. El análisis citogenético y molecular de tumores asociados a NF-2 (principalmente meningiomas y neurinomas) ha demostrado monosomía 22 y la pérdida de alelos localizados en este cromosoma, confirmando que el gen de esta entidad se localiza en 22q 12 4,52,68,71. Tras la reciente identificación y clonado del gen responsable de esta entidad se abren unas importantes expectativas que requieren el análisis directo de dicho gen en los tumores asociados, con el fin de determinar qué alteraciones y en qué tipos de tumores se presentan, con objeto de identificar los mecanismos moleculares que contribuyen al desarrollo de estas neoplasias.

mientras que los dos sin anomalías permanecían libres de recidivas tras períodos de seguimiento superiores a los 60 meses. Estos mismos autores 20 efectuaron un estudio similar sobre una serie de 32 meningiomas concluyendo que la mayoría de los meningiomas con características de agresividad tumoral, (posterior recurrencia, características histológicas atípicas, etc.) presentaban complementos cromosómicos complejos, es decir alteraciones añadidas a la pérdida del cromosoma 22, Este último dato estaría de acuerdo con los recientes hallazgos de Bello y col. que demuestran, a nivel molecular, la asociación entre pérdidas de alelas del cromosoma 1p Y la progresión tumoral en meningiomas. Obviamente, todos estos datos preliminares necesitan confirmarse mediante estudios en series amplias, pero, por el momento, sugieren una interesante relación entre los datos citogenéticos de los tumores del Sistema Nervioso y su conducta biológica.

Implicaciones clínicas de los hallazgos citogenéticos

En los apartados que preceden hemos expuesto las principales características citogenéticas y moleculares de los tumores del Sistema Nervioso. Los datos disponibles demuestran la existencia de patrones de alteraciones cromosómicas no aleatorias y de carácter recurrente, sugiriendo la existencia de subgrupos de gliomas, probablemente caracterizados por alteraciones específicas y, por tanto, con implicaciones moleculares diferentes. La progresión tumoral de los astrocitomas supone la inactivación aparentemente progresiva de vaúos genes de carácter oncosupresor (GOS), localizados en diferentes regiones del genoma: 17p, 10, 9p, 22q, Y en fases avanzadas se produce una afectación de diversos oncongenes, principalmente amplificación del gen EGFR. Los datos sobre la vía de iniciacian y evolución de los oligodendrogliomas sugieren un patrón algo diferente: inactivación de GOS localizados en 1p y 19q, con posterior amplificación del gen EGFR o alteración de 9p en casos aislados. Los meningiomas y neurinomas muestran una alteración citogenética común: pérdida del cromosoma 22, que indicaría la localización en este cromosoma de uno o varios GOS involucrados en el origen y desarrollo de estas neoplasias. En meningiomas se ha podido determinar que la ulterior inactivación de un GOS en 1p contribuye a la evolución hacia meningiomas atípicos o incluso anaplásicos, mientras que en los neurinomas no se descarta la existencia de procesos similares, aún no determinados, en la génesis de formas agresivas, No cabe duda de que los esfuerzos encaminados hacia la identificación, clonaje y caracterización de los genes involucrados en la génesis de los tumores del Sistema Nervioso permitirán un mejor conocimiento de multitud de sus características biológicas, tal vez con incidencia en el desarrollo de terapias más eficaces. Por otra parte, los estudios

De la misma forma que la citogenética se ha revelado como una metodología de utilidad para el diagnóstico, clasificación y pronóstico de pacientes afectados de procesos hematológicos malignos, los estudios similares en otras neoplasias podrían incidir en estos aspectos de interés clínico. El principal problema para el establecimiento de correlaciones entre los datos clínico-patológicos y los aspectos citogenéticos o moleculares reside en la obtención de resultados en un número suficientemente elevado de muestras, lo cual permita, con posterioridad, efectuar unos estudios estadísticos fiables para el establecimiento de conclusiones firmes. Obviamente, el limitado número de muestras de tumores del Sistema Nervioso analizadas hasta ahora dificulta el desarrollo de estos importantes trabajos. No obstante se han comenzado a efectuar las primeras correlaciones que, sin olvidar las limitaciones inherentes al tamaño de las series, han mostrasio resultados de gran interés. Al Saadi y Latimer 2 observaron mayores períodos de supervivencia en los pacientes afectos de gliomas con cariotipos normales o desviaciones cromosómicas mínimas (ej. pérdida del cromosoma Y), Kusak y col. 38 realizaron un análisis para correlacionar el cariotipo tumoral y el pronóstico (en términos de supervivencia libre de recidiva) en 41 glioblastomas. Se encontró una asociación entre cariotipos complejos y tumores con mayor agresividad biológica. En este sentido, de Campos y col. 21 realizaron un estudio similar en 13 oligodendrogliomas y se comprobó que todos los tumores de alto grado y cinco de siete tumores de bajo grado presentaban alteraciones cromosómicaso Todos los tumores con alteraciones cromosómicas recurrieron, con posterior fallecimiento de los pacientes, 190

Conclusiones y perspectivas futuras

Citogenética y genética molecular de tumores del sistema nervioso

de correlación entre los datos citogenético-moleculares y las características clínico-patológicas de los tumores nos proporcionará información de gran interés sobre el pronóstico y evolución de los pacientes, etc. Sin embargo, todos estos estudios deben considerar que multitud de factores adicionales como la localización del tumor, extensión de la resección, programas de tratamiento, etc. influyen considerablemente en el pronóstico. Por tanto, se requiere un análisis multidisciplinario que permita obtener la mayor información posible en cada caso con el fin de determinar cuáles son los factores biológicos que muestran un significado clínico para su posterior aplicación. Agradecimientos Deseamos expresar nuestro agradecimiento a los organismos oficiales (CAICYT, CICYT, Consejería de Educación de la Comunidad Autónoma de Madrid) y fundaciones privadas (Fundación Jiménez Díaz, Fundación Científica de la Asociación Española contra el Cáncer) que, con su valioso apoyo durante la última década, nos han permitido efectuar diversas aportaciones científicas en el área de conocimiento del tema que nos ocupa.

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