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Composition EN acides gras ET profil DES phospholipides chez DES auxotrophes pour LES acides gras insatures
137
Biochimica et Biophysics Acta, 450 (1976) @ Elsevier/North-Holland Biomedical Press
137-141
BBA 56874
COMPOSITION EN ACIDES GRAS ET PROFIL DES PHOSPHOLIPIDES CHEZ DES AUXOTROPHES POUR LES ACIDES GRAS INSATURES *
A.R. BEAUDOIN Dgpartement de Biologie, Facult.5 des Sciences, Quebec (Canada)
Universitg de Sherbrooke,
Sherbrooke,
(Recu le 4 juin, 1976)
Summary acid composition and phospholipid pattern in auxotrophs for unsaturated fatty acids The relationship between fatty acid composition and phospholipid pattern has been studied in Escherichia coli auxotrophs for unsaturated fatty acids. 1. The presence of a regulatory mechanism which enables the organism to maintain a given fluidity of the lipids has been corroborated using exogenous fatty acids which cause dramatic changes in fatty acid composition. 2. The fatty composition of phosphatidic acid is different from that of the other classes of phospholipids. 3. Changes in fatty acid composition are concomittant with the alteration of the phospholipid pattern. The ratio of phosphatidylglycerol to diphosphatidylglycerol is particularly sensitive to the physical characteristics of the exogenous unsaturated fatty acid. The relative increase in diphosphatidylglycerol is associated with membrane alterations. Fatty
Introduction Certains auxotrophes s’averent un outil de choix pour l’etude des correlations qui existent entre la structure et le fonctionnement des membranes cellulaires. Parmi les nombreux mutants d’Escherichia coli, on a isolk et caractk-ise quelques auxotrophes pour les acides gras insatures [l-4]. En supplementant i lhn de ces mutants des acides gras comportant divers niveaux d’insaturation, Esfahani et al. [2] ont d&e16 la presence d’un mecanisme qui, semble-t-il, contr6le la composition en acides gras des phospholipides. Selon ces m6mes aueurs, le mecanisme serait responsable du maintien d’un certain degre de fluidite des lipides membranaires. Les etudes de Marr et Ingraham [5] ont d’autre part clairement demontre que la bacterie E. coli reagit i un abaissement de temperature en augmentant la proportion d’acides gras insatures dans les lipides. Des * This
work
is supported
by the
N.R.C.
Canada.
138
etudes subsequentes chez un autre auxotrophe pour les acides gras insatures ont mis en correlation directe, les changements de composition en acides gras, les changements d’etat physique des membranes et la cinetique d’une fonction membranaire [ 11. 11 est a se demander si le changement dans la composition en acides gras ne s’accompagne pas d’un changement dans les proportions relatives des diverses classes de phospholipides, ou vice versa. Dans ce cas, il se pourrait que la partie polaire des phospholipides influence l’etat physique des membranes et consequemment certaines fonctions membranaires. On sait d’une part que chez certaines batteries le rapport phosphatidylglyckrol/lysophosphatidylglycerol varie selon les conditions de l’environnement et que la permeabilite cellulaire est reliee a ce rapport [6], et d’autre part, on sait que dans les systemes artificiels, la nature du groupement polaire affecte les transitions de phase observees dans des preparations de phospholipides [ 7 1. Au tours de ce travail, nous avons d’abord determine des conditions qui permettaient de produire, chez un auxotrophe, des changements du degre d’insaturation des phospholipides. Nous avons ensuite determine si ces variations du degre d’insaturation s’accompagnaient de changements dans les proportions des diverses classes de phospholipides de la bacterie. Materiel et Methodes Nous avons utilise les mutants CIV-2-fao-6 * et 0L2 (de la lignee K12) dont les caracteristiques sont bien connues. Les conditions de croissance des mutants, de meme que les methodes d’extraction des lipides, etaient similaires a celles qui ont et& d&rites precedemment [2]. Nous avons separe les classes de phospholipides sur des plaques de silica gel H (Merck) en couches de 0.4 mm d’epaisseur. La separation a ete r&.lisee en chromatographie bi-dimensionnelle selon la technique de Ames [8]. Les lipides ont ete localises en exposant les plaques a des vapeurs d’iode. Le phosphore present dans les ‘spots’ de silica gel a et& mesure selon la procedure de Beaudoin et al. [9]. La composition en acides gras a 6th determince apres methylation par chromatographie en phase gazeuse [2]. Toutes les mesures ont ete faites en triplicata. Resultats
et Discussion
Le Tableau I decrit la composition en acides gras des mutants developpes sur des milieux contenant l’un des acides gras suivants: oleique, elai’dique, myristoleique et linolenique. On y trouve egalement la composition de la bacterie type sauvage developpee sur le meme milieu. Nous observons, dans la fraction des phosphatidylethanolamines, une forte augmentation de la proportion des acides gras satures lorsque nous supplementons des acides gras de caractere “liquide”. Au contraire, dans le cas de l’acide elai’dique la proportion des acides gras satures est considerablement reduite (6% avec CIV--2-Fao--6). Nos resultats obtenus sur des classes de phospholipides corroborent done les resultats obtenus par Esfahani et al. [ 21 sur les phospholipides totaux. * Les ment
mutants of
0L2.
Biochemistry,
CIV-fao--6 Baylor
et
CRT-257
College
of
one Medicine,
ete
obtenus
Houston,
du Texas.
Professeur
S.J.
Wakil.
du
Depart-
ACIDES
GRAS
DEX AUXOTROPHES
I
AJOUTES
AU
MILIEU
DE
CROISSANCE
14 : 0 14 : 1 16 : 0 16 : 1 18 : 0 18 : 1 18 : 3
14 : 14 : 16 : 16 : 18 : 18 : 18 : N.D.
Phosphatidyldthanolamine
Phosphatidyl&c&ol Diphosphatidylglyckol
33.2 7.6 4.0 38.0
1.8
51.4 3.2 3.4 39.9
0
1 0 1 0 1 3
48.4 9.6 1.4 37.8
2.8
6.2
11.1
1 0 1 0 1 3
14 : 14 : 16 : 16 : 18 : 18 : 18 : N.D.
Acides phosphatidiques
Oleate
12.3
14.0 6.4 1.3 77.3
1.0
72.6
2.1 1.0 12.2 12.0
26.1 9.0 12.9 45.9
5.9
Elaidate
OL2 Acide gras suppl&nent@.
0
Acide gras mesure
Phospholipides
non
COMPOSITION
3.8 6.7 77.2
3.8 19.8 76.2
19.3 1.3 77.8
1.9 48.0
1.6
49.0
1.1
93.9
5.6
47.7
50.0
0.5
2.3
8.5 54.9
17.0 14.7
21.4
12.8
30.8
5.8
Elaidate
61.0
7.3
Oleate
GRAS
3.1
4.7
3.9 30.3 58.0
1.6
4.0 28.9 65.5
7.1
11.8
9.0 2.0 70.0
22.8 3.3
7.3
64.4
2.2
54.1 19.9 2.4 22.3
1.2
55.0 24.0 1.6 18.0
72.2
54.0 13.6 12.8 12.8
6.8
L&n&z K12
3.3
25.3
DE PHOSPHO-
Type sauvage
CLASSES
2.5
25.6 25.8
11.1
35.3
2.2
Linolenate
DES DIVERSES
Myristoleate
EN ACIDES
CiV--2-Fao--6 Acide gras supplbmentb
52.2
3.4
LA
d6termin8.
SUR
Myristoleate
Les cekdes ant et& r&xlt&es au milieu de la phase exponentieIIe. N.D.,
LIPIDES
DES
TABLEAU
EFFET
140
La composition en acides gras de la fraction des acides phosphatidiques differe de facon marquee des autres fractions de phospholipides bien qu’elle en soit le precurseur. Ce qui montre bien que la composition en acides gras des phospholipides n’est pas determinee exclusivement au moment de la formation des acides phosphatidiques. Ceci est d’ailleurs confirm6 par la difference de composition que l’on peut remarquer entre la fraction phosphatidylethanolamine et la fraction phosphatidylglyckrol-diphosphatidylglycerol. On sait que ces deux fractions sont synthetises i partir de CDP-diacylglycerols [lo]. On peut voir au Tableau II l’influence des acides gras supplement& aux mutants sur leur profil phospholipidique. Dans le cas ou l’on supplemente des acides gras de caractere “liquide”, on observe un rapport phosphatidylglycerol/ diphosphatidylglycerol tres eleve. Au contraire, dans le cas de l’acide elai’dique, la proportion des diphosphatidylglycerols est grandement augmentee, en particulier chez CIV-2-Fao--6. Nous avons aussi examine l’effet de l’augmentation de temperature sur un autre mutant, CRT257, et l’on y observe egalement une augmentation diphosphatidylglycerols. Dans ces deux situations, on trouve des anomalies dans la structure membranaire de ces mutants (ref. 11, et Crowfoot, P., et Wakil, S.J., communication personnelle). Ces resultats ddmontrent que les changements de composition en acides gras observes chez les mutants s’accompagnent de changements dans le profil phospholipidique. Un travail de Cronan sur la meme espece montre qu’au moment ou les cellules passent de la phase exponentielle a la phase stationnaire, il se produit une augmentation des acides gras de type cyclopropane et parallele-
TABLEAU EFFET DES
II DES
CONDITIONS
AUXOTROPHES
DE POUR
CROISSANCE LES
SUR
ACIDES
GRAS
LA
DISTRIBUTION
INSATURES
DES
ET
CHEZ
PHOSPHOLIPIDES UN
CHEZ
MUTANT
THERMO-
SENSIBLE Les
cellules
ont
BtB rkoltdes
phosphatidylglycCro1.
Car,
au
milieu
de
la phase
exponentielle.
PE,
phosphatidylCthanolamine.
diphosphatidylglyckrol. _ Acide
Mutant
gras
SupplCmente
Civ--P-fao--6
Pourcentage
phospholipidique
Elaidate
79.6
12.1
6.5
Linolenate
82.6
9.7
4.7
Myristoleate
76.5
16.5
1.0
Oleate
77.6
12.4
4.6
1.87 2.06 16.50 2.70
Elaidate
80.4
10.1
9.3
Linolenate
84.2
14.0
1.4
10.00
Myristoleate
87.0
20.0
1.5
13.30
Oleate
83.6
10.0
4.7
2.14
78.7
11.0
6.1
1.81
11.0
7.3
1.51
CRT
257
dr%eloppk
B 27°C
80.5
CRT
257
developpe
B 27OC
77.6
I41”C
Car
PG
type
augmentb
PG/Car
total
PE
Wild
puis
Rapport
du
4.4
18.1
1.09
0.245
PG.
141
ment une augmentation de la proportion des diphosphatidylglycdrols [ 121. Comme il a et6 mentionne par d’autres auteurs, l’influence des groupements polaires de phospholipides charges sur leur rble physiologique dans les membranes est mal connue [ 131. Ces observations ddmontrent qu’il existe des interrelations prkcises entre la composition en acides gras et le profil phospholipidique. En consequence, toute etude mettant en relation la composition en acides gras, des transitions en phase et certaines fonctions membranaires devrait comporter une analyse du profil phospholipidique. References 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Overath, P., Pauh, G. et Schrairer, H.U. (1969) Eur. J. Biochem. 7, 559-574 Esfahani. M.. Barnes, Jr.. E.M. et Wahil. S.J. (1969) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. 64, 1057-1064 SiIbert, D.F. et Vagelos, P.R. (1967) Proc. NatI. Acad. Sci. U.S. 58. 1579-1586 Wilson, G., Rose, S.P. et Fox. C.F. (1970) Biochem. Biophys. Res. Commun. 38. 617-623 Marr, A.G. et Ingraham, J.L. (1962) J. Bacterial. 84. 1260-1267 Tocanne, J.F., Ververgaert, P.H.J.Th.. VerMeii. A.J. et Van Deenen. L.L.M. (1974) Chem. Phys. Lipid 12, 220-231 Vaughan, D.J. and Keough, K.M. (1974) FEBS Lett. 47.158-163 Ames, G.F. (1968) J. Bacterial. 95, 833-843 Beaudoin. A.R.. Villeneuve, J.L. et Lemonde, A. (1967) J. Insect. Physiol. 14, 831-840 Chang. Y.Y. et Kennedy, E.P. (1967) J. Biol. Chem. 242. 516 Hirota, Y.. WahiI, S., Shapiro, B.. Ryter. A., Hurwitz, G. et Jacob, F. (1969) C.R. Acad. Sci. Paris 269.1346-1348 Cronan, J.E. (1968) J. Bacterial 95. 2054 Tocanne. J.E., Ververgaert. P.H.J.Th., VerkIeij. A.J. et Van Deenen. L.L.M. (1974) Chem. Phys. Lipid 12.220-231
Biochimica et Biophysics Acta, 450 (1976) @ Elsevier/North-Holland Biomedical Press
137-141
BBA 56874
COMPOSITION EN ACIDES GRAS ET PROFIL DES PHOSPHOLIPIDES CHEZ DES AUXOTROPHES POUR LES ACIDES GRAS INSATURES *
A.R. BEAUDOIN Dgpartement de Biologie, Facult.5 des Sciences, Quebec (Canada)
Universitg de Sherbrooke,
Sherbrooke,
(Recu le 4 juin, 1976)
Summary acid composition and phospholipid pattern in auxotrophs for unsaturated fatty acids The relationship between fatty acid composition and phospholipid pattern has been studied in Escherichia coli auxotrophs for unsaturated fatty acids. 1. The presence of a regulatory mechanism which enables the organism to maintain a given fluidity of the lipids has been corroborated using exogenous fatty acids which cause dramatic changes in fatty acid composition. 2. The fatty composition of phosphatidic acid is different from that of the other classes of phospholipids. 3. Changes in fatty acid composition are concomittant with the alteration of the phospholipid pattern. The ratio of phosphatidylglycerol to diphosphatidylglycerol is particularly sensitive to the physical characteristics of the exogenous unsaturated fatty acid. The relative increase in diphosphatidylglycerol is associated with membrane alterations. Fatty
Introduction Certains auxotrophes s’averent un outil de choix pour l’etude des correlations qui existent entre la structure et le fonctionnement des membranes cellulaires. Parmi les nombreux mutants d’Escherichia coli, on a isolk et caractk-ise quelques auxotrophes pour les acides gras insatures [l-4]. En supplementant i lhn de ces mutants des acides gras comportant divers niveaux d’insaturation, Esfahani et al. [2] ont d&e16 la presence d’un mecanisme qui, semble-t-il, contr6le la composition en acides gras des phospholipides. Selon ces m6mes aueurs, le mecanisme serait responsable du maintien d’un certain degre de fluidite des lipides membranaires. Les etudes de Marr et Ingraham [5] ont d’autre part clairement demontre que la bacterie E. coli reagit i un abaissement de temperature en augmentant la proportion d’acides gras insatures dans les lipides. Des * This
work
is supported
by the
N.R.C.
Canada.
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etudes subsequentes chez un autre auxotrophe pour les acides gras insatures ont mis en correlation directe, les changements de composition en acides gras, les changements d’etat physique des membranes et la cinetique d’une fonction membranaire [ 11. 11 est a se demander si le changement dans la composition en acides gras ne s’accompagne pas d’un changement dans les proportions relatives des diverses classes de phospholipides, ou vice versa. Dans ce cas, il se pourrait que la partie polaire des phospholipides influence l’etat physique des membranes et consequemment certaines fonctions membranaires. On sait d’une part que chez certaines batteries le rapport phosphatidylglyckrol/lysophosphatidylglycerol varie selon les conditions de l’environnement et que la permeabilite cellulaire est reliee a ce rapport [6], et d’autre part, on sait que dans les systemes artificiels, la nature du groupement polaire affecte les transitions de phase observees dans des preparations de phospholipides [ 7 1. Au tours de ce travail, nous avons d’abord determine des conditions qui permettaient de produire, chez un auxotrophe, des changements du degre d’insaturation des phospholipides. Nous avons ensuite determine si ces variations du degre d’insaturation s’accompagnaient de changements dans les proportions des diverses classes de phospholipides de la bacterie. Materiel et Methodes Nous avons utilise les mutants CIV-2-fao-6 * et 0L2 (de la lignee K12) dont les caracteristiques sont bien connues. Les conditions de croissance des mutants, de meme que les methodes d’extraction des lipides, etaient similaires a celles qui ont et& d&rites precedemment [2]. Nous avons separe les classes de phospholipides sur des plaques de silica gel H (Merck) en couches de 0.4 mm d’epaisseur. La separation a ete r&.lisee en chromatographie bi-dimensionnelle selon la technique de Ames [8]. Les lipides ont ete localises en exposant les plaques a des vapeurs d’iode. Le phosphore present dans les ‘spots’ de silica gel a et& mesure selon la procedure de Beaudoin et al. [9]. La composition en acides gras a 6th determince apres methylation par chromatographie en phase gazeuse [2]. Toutes les mesures ont ete faites en triplicata. Resultats
et Discussion
Le Tableau I decrit la composition en acides gras des mutants developpes sur des milieux contenant l’un des acides gras suivants: oleique, elai’dique, myristoleique et linolenique. On y trouve egalement la composition de la bacterie type sauvage developpee sur le meme milieu. Nous observons, dans la fraction des phosphatidylethanolamines, une forte augmentation de la proportion des acides gras satures lorsque nous supplementons des acides gras de caractere “liquide”. Au contraire, dans le cas de l’acide elai’dique la proportion des acides gras satures est considerablement reduite (6% avec CIV--2-Fao--6). Nos resultats obtenus sur des classes de phospholipides corroborent done les resultats obtenus par Esfahani et al. [ 21 sur les phospholipides totaux. * Les ment
mutants of
0L2.
Biochemistry,
CIV-fao--6 Baylor
et
CRT-257
College
of
one Medicine,
ete
obtenus
Houston,
du Texas.
Professeur
S.J.
Wakil.
du
Depart-
ACIDES
GRAS
DEX AUXOTROPHES
I
AJOUTES
AU
MILIEU
DE
CROISSANCE
14 : 0 14 : 1 16 : 0 16 : 1 18 : 0 18 : 1 18 : 3
14 : 14 : 16 : 16 : 18 : 18 : 18 : N.D.
Phosphatidyldthanolamine
Phosphatidyl&c&ol Diphosphatidylglyckol
33.2 7.6 4.0 38.0
1.8
51.4 3.2 3.4 39.9
0
1 0 1 0 1 3
48.4 9.6 1.4 37.8
2.8
6.2
11.1
1 0 1 0 1 3
14 : 14 : 16 : 16 : 18 : 18 : 18 : N.D.
Acides phosphatidiques
Oleate
12.3
14.0 6.4 1.3 77.3
1.0
72.6
2.1 1.0 12.2 12.0
26.1 9.0 12.9 45.9
5.9
Elaidate
OL2 Acide gras suppl&nent@.
0
Acide gras mesure
Phospholipides
non
COMPOSITION
3.8 6.7 77.2
3.8 19.8 76.2
19.3 1.3 77.8
1.9 48.0
1.6
49.0
1.1
93.9
5.6
47.7
50.0
0.5
2.3
8.5 54.9
17.0 14.7
21.4
12.8
30.8
5.8
Elaidate
61.0
7.3
Oleate
GRAS
3.1
4.7
3.9 30.3 58.0
1.6
4.0 28.9 65.5
7.1
11.8
9.0 2.0 70.0
22.8 3.3
7.3
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54.1 19.9 2.4 22.3
1.2
55.0 24.0 1.6 18.0
72.2
54.0 13.6 12.8 12.8
6.8
L&n&z K12
3.3
25.3
DE PHOSPHO-
Type sauvage
CLASSES
2.5
25.6 25.8
11.1
35.3
2.2
Linolenate
DES DIVERSES
Myristoleate
EN ACIDES
CiV--2-Fao--6 Acide gras supplbmentb
52.2
3.4
LA
d6termin8.
SUR
Myristoleate
Les cekdes ant et& r&xlt&es au milieu de la phase exponentieIIe. N.D.,
LIPIDES
DES
TABLEAU
EFFET
140
La composition en acides gras de la fraction des acides phosphatidiques differe de facon marquee des autres fractions de phospholipides bien qu’elle en soit le precurseur. Ce qui montre bien que la composition en acides gras des phospholipides n’est pas determinee exclusivement au moment de la formation des acides phosphatidiques. Ceci est d’ailleurs confirm6 par la difference de composition que l’on peut remarquer entre la fraction phosphatidylethanolamine et la fraction phosphatidylglyckrol-diphosphatidylglycerol. On sait que ces deux fractions sont synthetises i partir de CDP-diacylglycerols [lo]. On peut voir au Tableau II l’influence des acides gras supplement& aux mutants sur leur profil phospholipidique. Dans le cas ou l’on supplemente des acides gras de caractere “liquide”, on observe un rapport phosphatidylglycerol/ diphosphatidylglycerol tres eleve. Au contraire, dans le cas de l’acide elai’dique, la proportion des diphosphatidylglycerols est grandement augmentee, en particulier chez CIV-2-Fao--6. Nous avons aussi examine l’effet de l’augmentation de temperature sur un autre mutant, CRT257, et l’on y observe egalement une augmentation diphosphatidylglycerols. Dans ces deux situations, on trouve des anomalies dans la structure membranaire de ces mutants (ref. 11, et Crowfoot, P., et Wakil, S.J., communication personnelle). Ces resultats ddmontrent que les changements de composition en acides gras observes chez les mutants s’accompagnent de changements dans le profil phospholipidique. Un travail de Cronan sur la meme espece montre qu’au moment ou les cellules passent de la phase exponentielle a la phase stationnaire, il se produit une augmentation des acides gras de type cyclopropane et parallele-
TABLEAU EFFET DES
II DES
CONDITIONS
AUXOTROPHES
DE POUR
CROISSANCE LES
SUR
ACIDES
GRAS
LA
DISTRIBUTION
INSATURES
DES
ET
CHEZ
PHOSPHOLIPIDES UN
CHEZ
MUTANT
THERMO-
SENSIBLE Les
cellules
ont
BtB rkoltdes
phosphatidylglycCro1.
Car,
au
milieu
de
la phase
exponentielle.
PE,
phosphatidylCthanolamine.
diphosphatidylglyckrol. _ Acide
Mutant
gras
SupplCmente
Civ--P-fao--6
Pourcentage
phospholipidique
Elaidate
79.6
12.1
6.5
Linolenate
82.6
9.7
4.7
Myristoleate
76.5
16.5
1.0
Oleate
77.6
12.4
4.6
1.87 2.06 16.50 2.70
Elaidate
80.4
10.1
9.3
Linolenate
84.2
14.0
1.4
10.00
Myristoleate
87.0
20.0
1.5
13.30
Oleate
83.6
10.0
4.7
2.14
78.7
11.0
6.1
1.81
11.0
7.3
1.51
CRT
257
dr%eloppk
B 27°C
80.5
CRT
257
developpe
B 27OC
77.6
I41”C
Car
PG
type
augmentb
PG/Car
total
PE
Wild
puis
Rapport
du
4.4
18.1
1.09
0.245
PG.
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ment une augmentation de la proportion des diphosphatidylglycdrols [ 121. Comme il a et6 mentionne par d’autres auteurs, l’influence des groupements polaires de phospholipides charges sur leur rble physiologique dans les membranes est mal connue [ 131. Ces observations ddmontrent qu’il existe des interrelations prkcises entre la composition en acides gras et le profil phospholipidique. En consequence, toute etude mettant en relation la composition en acides gras, des transitions en phase et certaines fonctions membranaires devrait comporter une analyse du profil phospholipidique. References 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
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