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Conditions de culture pour les gamètes et embryons : quels milieux de culture ? et quelle incidence sur le nouveau-né ?
G Model
GOFS-227; No. of Pages 7 Gyne´cologie Obste´trique Fertilite´ & Se´nologie xxx (2018) xxx–xxx
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ScienceDirect www.sciencedirect.com
Mise au point
Conditions de culture pour les game`tes et embryons : quels milieux de culture ? et quelle incidence sur le nouveau-ne´ ?§ Culture conditions for gametes and embryos: Which culture medium? Which impact on newborn? I. Koscinski a,*,b, M. Merten b,c, N. Kazdar d, J.-L. Gue´ant b,c a
Laboratoire de biologie de la reproduction, CHRU de Nancy, 10, rue du Dr-Heydenreich, 54000 Nancy, France Unite´ Inserm 954 N-GERE, 9, avenue de la Foreˆt-de-Hayes, CS 5018, 54505 Vandœuvre-le`s-Nancy, France c Laboratoire de biochimie, CHRU de Nancy, rue du Morvan, 54511 Vandœuvre-le`s-Nancy, France d Laboratoire Eylau-Unilabs, clinique Pierre-Cherest, 5, rue Pierre-Cherest, 92200 Neuilly-sur-Seine, France b
I N F O A R T I C L E
R E´ S U M E´
Historique de l’article : Rec¸u le 6 juin 2017
L’impact des milieux de culture sur la cine´tique de de´veloppement embryonnaire humain a e´te´ largement e´tudie´ en termes d’efficacite´ de la culture, mais peu d’e´tudes s’inte´ressent au suivi au long cours de la sante´ des enfants conc¸us apre`s fe´condation in vitro en fonction du milieu de culture. Pourtant, depuis plusieurs anne´es, des e´tudes animales signalent de possibles effets des techniques de culture embryonnaire in vitro sur la sante´ de la descendance. Dans l’espe`ce humaine, ces effets sont plus difficiles a` e´tablir dans la mesure ou` l’ensemble des conditions de la grossesse ainsi que la ge´ne´tique des ge´niteurs constituent des biais e´vidents. La composition d’un milieu de culture doit eˆtre de´chiffre´e de tre`s pre`s, au-dela` du caracte`re unique ou se´quentiel correspondant au « let embryo choose » ou « back to nature » respectivement. A` partir d’une analyse de la litte´rature portant sur l’expe´rimentation animale et la clinique humaine, les principaux constituants des milieux de culture embryonnaire seront pre´sente´s en pointant les conse´quences me´taboliques et les possibles conse´quences e´pige´ne´tiques. Les me´tabolites e´nerge´tiques sont d’importants re´gulateurs de la machinerie e´pige´ne´tique, ce qui sugge`re que les anomalies me´taboliques lie´es a` des anomalies morphologiques du de´veloppement embryonnaire pourraient constituer la face visible de l’iceberg et les anomalies e´pige´ne´tiques la face cache´e.
C 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits re ´ serve´s.
Mots cle´s : Milieu de culture Me´tabolisme embryonnaire E´pige´ne´tique embryonnaire Suivi des enfants FIV
A B S T R A C T
Keywords: Culture medium Embryo metabolism Embryo epigenetics IVF children follow-up
Many studies have examined the impact of cell/embryo culture media on the development of human embryo during IVF process, but few studies have followed up and compared the effects of these culture media on the developmental outcome of children conceived by IVF. As recurrent experimental evidence from animal studies suggests potential long-term effects of embryo culture media on the health outcome of IVF-conceived children, more studies are needed to clarify the role of the culture media and mechanisms underlying such effects. In human, however, the effects of culture media are difficult to pinpoint due to complications stem from both the influence of maternal nutrition during the gestational period and the parental genetic. Based on a simple review of the literature integrating animal experimentations and human clinic studies, we suggest that the composition of culture medium should be considered beyond the character of unique or sequential medium, corresponding to ‘‘let embryo choose’’ or ‘‘back to nature’’ respectively. Instead, we suggest that the main components of embryo culture media should be considered from the point of view of metabolic consequences and potential epigenetic effects. Given that energetic metabolites can regulate epigenetic machinery, we hypothesize that metabolic abnormalities linked to morphological abnormalities could reveal epigenetic defects in embryos.
C 2018 Elsevier Masson SAS. All rights reserved.
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Cet article a fait l’objet d’une communication orale lors des Journe´es de la Fe´de´ration franc¸aise d’e´tude de la fertilite´ (Tours, 13–15 septembre 2017). * Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (I. Koscinski).
https://doi.org/10.1016/j.gofs.2018.03.010 C 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits re ´ serve´s. 2468-7189/
Pour citer cet article : Koscinski I, et al. Conditions de culture pour les game`tes et embryons : quels milieux de culture ? et quelle incidence sur le nouveau-ne´ ? Gyne´cologie Obste´trique Fertilite´ & Se´nologie (2018), https://doi.org/10.1016/j.gofs.2018.03.010
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1. Introduction Un milieu de culture s’inte`gre dans un syste`me de culture embryonnaire incluant un me´lange gazeux permettant de maintenir un pH correct. A` toutes les e´tapes, la culture cellulaire peut eˆtre alte´re´e par des conditions de culture de´grade´es ou par des composants organiques volatiles (COV) e´mis par les consommables ou l’environnement plus ge´ne´ral du laboratoire de culture cellulaire, en premie`re ligne les produits de bionettoyage. Durant ces 40 dernie`res anne´es, la composition des milieux de culture embryonnaire a conside´rablement e´volue´, passant de simples solutions salines supple´mente´es en glucose et en phosphate jusqu’a`, plus re´cemment, des formules complexes contenant des acides amine´s essentiels et non essentiels, des che´lateurs comme l’EDTA, des vitamines, des macro-et oligoe´le´ments, des antibiotiques et des facteurs de croissance [1,2]. La composition des premiers milieux de culture a e´te´ e´labore´e a` partir des connaissances sur les milieux de culture cellulaires classiques et des e´tudes portant sur les fluides tubaires dans diverses espe`ces mammife`res. Dans un deuxie`me temps, une simplification des proce´dures a e´te´ propose´e. Actuellement, deux « philosophies » de culture cellulaire s’opposent : les milieux se´quentiels « back to nature » qui proposent de mimer les conditions naturelles dans les voies ge´nitales fe´minines ; les milieux uniques qui re´sultent du « let embryo choose » et pre´sentent une composition permettant la culture cellulaire de J1 au stade blastocyte avec ou sans renouvellement du milieu au troisie`me jour. Si les premiers se´duisent car plus proches de la physiologie, suivant les besoins variables de l’embryon au cours de son de´veloppement [2], ils imposent aussi des manipulations d’embryons pour changer le milieu, ce qui peut entraıˆner une de´gradation temporaire des conditions de culture (variations de tempe´rature, pH, . . .), a` l’origine de stress cellulaire. En revanche, dans les seconds, l’embryon trouve tout ce dont il a besoin tout au long de son de´veloppement pre´implantatoire ; mais ne trouve-t-il pas e´galement des substances inapproprie´es ? Le Tableau 1 pre´sente la majorite´ des milieux de culture disponibles sur le marche´ en 2017. Leur caracte`re se´quentiel ou unique y est pre´cise´. L’impact des milieux de culture sur la cine´tique de de´veloppement embryonnaire a e´te´ largement e´tudie´, principalement en termes d’efficacite´ de la culture (c’est-a`-dire, en termes de taux de blastulation, d’implantation, de naissance, obtenus avec tel ou tel milieu) [3], mais peu d’e´tudes rapportent le suivi au long cours de la sante´ des enfants conc¸us apre`s fe´condation in vitro [4] en fonction du milieu de culture. Pourtant, depuis plusieurs anne´es, des e´tudes animales signalent de possibles effets incontroˆle´s des techniques de fe´condation in vitro sur la sante´ des enfants [5–8]. Certes, ces e´tudes ne prennent souvent pas en conside´ration l’ensemble des conditions de culture mais l’alte´ration de l’expression de certains ge`nes soumis a` empreinte comme Igf2 et H19 ainsi que des modifications du poids des petits issus de fe´condation in vitro doit e´veiller l’attention [6], meˆme si l’e´tude de Hemkemeyer, plus re´cente, peut paraıˆtre rassurante concernant l’impact des milieux de culture sur le de´veloppement des fœtus post-implantation ; notons que cette e´tude purement morphohistologique rapporte toutefois que les fœtus issus d’un milieu de culture supple´mente´ en acides amine´s e´taient globalement plus grands que ceux issus d’embryons cultive´s dans un milieu pauvre ou conc¸us in vivo et que les fœtus issus de culture en milieux ISM1/ISM2 avaient des jambes (tibia et fibula) plus longues que les souriceaux conc¸us in
Tableau 1 Synthe`se des milieux de culture existant sur le marche´ en 2017. Milieu de culture
Companie
Type de milieu
BlastAssist BlastGenTM Complete Early Cleavage Medium1 (ECM1) Complete MultiBlast Medium1 EmbryoGen1 Ferticult IVF medium G-1TM G-2TM G-1TM PLUS G-2TM PLUS Gems ISM1TM IVF medium IVF-50 IVC K-SICM K-SIBM K-SIFM Multiblast P-11 Medium Quinn’s AdvantageTM Protein Plus Cleavage Quinn’s AdvantageTM Protein Plus Blastocyst Global1 GM501 G-TLTM Ham’s F-10 HTF SAGE 1-StepTM–with HSA SAGE 1-StepTM–with SPS Single Step MediumTM
Origio Origio Irvine scientific
Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel
Irvine scientific Origio Fertipro Vitrolife Vitrolife Vitrolife Vitrolife Merck Origio Vitrolife Scandinavian IVF In Vitro Care Cook Cook Cook Irvine scientific Irvine scientific Origio
Se´quentie Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel
Origio
Se´quentiel
Life Global Gynemed Vitrolife Gibco Irvine scientific Origio Origio Irvine scientific
Unique Unique Unique Unique Unique Unique Unique Unique
vivo. Enfin, on peut reprocher a` cette e´tude de ne comporter aucun e´le´ment de biologie mole´culaire potentiellement plus sensible que la microscopie optique [9]. En outre, in vivo, les effets de la nutrition maternelle sur le poids de naissance et les risques de maladies me´taboliques et cardiovasculaires ont e´te´ mis en e´vidence dans diffe´rentes espe`ces. Dans l’espe`ce humaine, ces effets sont plus difficiles a` e´tablir dans la mesure ou` l’ensemble des conditions de la grossesse constitue des biais e´vidents. La corre´lation entre poids de naissance des nouveaux-ne´s et milieu de culture employe´ pour re´aliser la culture embryonnaire in vitro n’est pas claire. Certaines e´tudes sont en faveur d’un impact du milieu de culture sur le poids de naissance des nouveau-ne´s [10,11]. D’autres e´tudes concluent le contraire [6,8,12]. La revue de la litte´rature propose´e par Mantikou insiste sur les difficulte´s a` mettre en e´vidence le lien entre composition du milieu de culture embryonnaire et sante´ des enfants issus de ces cultures, meˆme s’il est bien e´tabli que des modifications de la composition des milieux de culture ont un impact sur le de´veloppement embryonnaire, notamment la concentration en glucose, lactate et pyruvate, en acides amine´s essentiels et non essentiels. Mais il ne faut pas sous-estimer l’importance des autres facteurs de culture (stabilite´ de la tempe´rature, du pH, de l’osmolarite´, . . .). Ce concept de culture embryonnaire globale de´ja` assez ancien [13] a e´te´ de´veloppe´ toujours par Gardner et repris par d’autres [4,6,14,15]. Tout re´cemment, Morbeck et al. [16] ont compare´ la culture embryonnaire murine jusqu’au stade blastocyte avec 4 milieux de culture uniques, dont les compositions en pyruvate, lactate et acides amine´s e´taient tre`s variables : ils concluent a` une sensibilite´ des embryons vis-a`-vis du milieu de culture, renforce´e par l’interaction entre le milieu de culture et la concentration en oxyge`ne qui est une condition propre a` chaque laboratoire.
Pour citer cet article : Koscinski I, et al. Conditions de culture pour les game`tes et embryons : quels milieux de culture ? et quelle incidence sur le nouveau-ne´ ? Gyne´cologie Obste´trique Fertilite´ & Se´nologie (2018), https://doi.org/10.1016/j.gofs.2018.03.010
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Nous proposons ici une analyse critique de la composition des milieux de culture avec une attention particulie`re porte´e sur les e´le´ments pouvant perturber les e´ve`nements e´pige´ne´tiques ayant lieu pendant le de´veloppement embryonnaire pre´-implantatoire. Enfin, nous ferons une synthe`se des e´tudes publie´es portant sur la sante´ des nouveaux-ne´s conc¸us par FIV, notamment leur poids de naissance. Nous ne traiterons pas ici des effets potentiels de certains produits ajoute´s aux milieux de culture comme le GMCSF, la PVP, la pentoxiphiline, les cryoprotecteurs. . . utilise´s plus ou moins en routine dans les laboratoires de fe´condation in vitro ; ils me´riteraient une e´tude bibliographique a` part entie`re. Seul l’acide hyaluronique sera discute´ car pre´sent dans plusieurs milieux commercialise´s.
2. Quels parame`tres et constituants d’un milieu de culture sont susceptibles d’induire une diffe´rence de de´veloppement embryonnaire et du taux de blastulation ? 2.1. La me´thionine Des e´tudes animales soulignent l’importance du me´tabolisme de la me´thionine au stade morula tardif, en accord avec les tre`s importants e´ve`nements de me´thylation spe´cifique a` ce stade de de´veloppement embryonnaire : dans un mode`le bovin, Ikeda et al. ont montre´ que la me´thionine contribue a` la me´thylation de l’ADN via sa conversion en S-ade´nosylme´thionine, le donneur de me´thyle universel utilise´ par la DNA me´thyltransfe´rase (DNMTs). Tout dysfonctionnement du me´tabolisme de la me´thionine peut entraıˆner une hypome´thylation de l’ADN et mener a` l’alte´ration de l’expression de ge`nes importants dans la diffe´renciation cellulaire et finalement, une diminution du taux de blastulation a` partir du stade morula [17]. Cette e´tude confirmait celle de Kwong’s [18] qui avanc¸ait la ne´cessite´ de folate dans les milieux de culture pour embryons bovins, non seulement pour la synthe`se de thymidine (comme de´montre´ pre´ce´demment dans un mode`le murin) [19] mais aussi pour des raisons e´pige´ne´tiques. Ne´anmoins, des blastocystes bovins e´taient e´galement obtenus, certes en plus faibles proportions avec des concentrations non approprie´es en folates. Ces observations animales sugge`rent deux re´flexions : meˆme en dehors de concentrations optimales en donneurs de me´thyle, des embryons mammife`res e´voluent jusqu’au stade blastocyste, qui ne peut donc eˆtre conside´re´ comme le reflet de conditions optimales de culture embryonnaire, garantissant par la meˆme occasion un de´veloppement normal et la mise en œuvre physiologique d’e´ve`nements e´pige´ne´tiques tels que la me´thylation de l’ADN. Ceci sugge`re que le taux de blastulation dans l’espe`ce murine, utilise´ comme indicateur de performance par les fabricants de milieux de culture ne garantit pas du tout que le milieu teste´ soit adapte´ au de´veloppement physiologique embryonnaire et l’importance de ce test dans les certificats de qualite´ des milieux devrait eˆtre tempe´re´e ; les fournisseurs de milieu de culture commercialisent leurs produits sans en donner la composition, ce qui est scientifiquement et e´thiquement tre`s discutable. Dans leur revue de la litte´rature commandite´e par la Socie´te´ europe´enne d’embryologie et de reproduction humaine (ESHRE), Sunde et al. soulignent l’importance pour les utilisateurs finaux de connaıˆtre la composition exacte des milieux commercialise´s puisqu’ils sont responsables des effets de la culture sur les enfants, c’est-a`-dire responsables des effets des composants pre´sents dans les milieux de culture [20]. Cette situation tre`s de´licate pour l’embryologiste a pousse´ certains a` controˆler les substances
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contenues dans les milieux de culture commercialise´s [21,22]. Ainsi, Morbeck et al. ont-ils analyse´ par spectrome´trie de masse la composition en acides amine´s, acides organiques, ions et ions me´talliques contenus dans 7 milieux de culture commercialise´s : leur composition varie largement avec de grandes diffe´rences en pyruvate, lactate et diffe´rents acides amine´s. En utilisant le test de blastulation murine, les auteurs mettent en e´vidence la de´pendance en certains acides amine´s et montrent une interaction avec la concentration en oxyge`ne et la pre´sence de prote´ines [22]. 2.2. La question du glucose dans les milieux de culture au stade zygote Le glucose est connu pour eˆtre ne´faste a` la fe´condation et au de´veloppement tre`s pre´coce de l’embryon (notamment au stade 2 cellules). Cependant, la plupart des milieux de culture commercialise´s contiennent du glucose meˆme pour les milieux de culture se´quentiels pre´tendant imiter le fluide tubaire proche de l’ampoule tubaire fe´minine qui ne contient quasiment pas de glucose. La strate´gie adopte´e par les fournisseurs principalement de milieu unique, mais aussi dans une bien moindre importance par les fournisseurs de milieux se´quentiels, consiste a` ajouter dans le milieu comple´mente´ en glucose de l’acide e´thyle`nediamine te´traace´tique, plus connu sous l’acronyme EDTA. Cette substance bloque les enzymes de la glycolyse en che´latant les ions Ca++ et Mg++. Mais ces meˆmes ions sont essentiels pour les enzymes de la synthe`se de l’ADN, e´tape cruciale de la division cellulaire. Les fournisseurs utilisent les proprie´te´s me´taboliques suivantes de l’embryon : les besoins en glucose de l’embryon sont proportionnels a` son expression des enzymes de la glycolyse : ainsi, un embryon de moins de 2 jours produira peu d’enzymes de glycolyse et donc ne sera pas en mesure d’utiliser le glucose contenu dans le milieu de culture si cette faible quantite´ d’enzymes glycolytiques est bloque´e par exemple par de l’EDTA ajoute´ au milieu ; par la suite, les besoins croissants de l’embryon en glucose seront associe´s a` une production croissante d’enzymes glycolytiques ˆ a` l’EDTA pre´sent dans le permettant de de´passer le blocage du milieu. La plupart des milieux se´quentiels proposent des concentrations en glucose tre`s variables entre le milieu de segmentation (aux alentours de 0,2–0,3 mM) et le milieu de blastulation (3 mM), alors que les milieux uniques proposent la meˆme concentration en glucose (0,2–0,3 mM) tout le long de la culture. Dans une revue re´cente de la litte´rature, Chronopoulou et Harper [23] concluent que seules les concentrations importantes en glucose seraient ne´fastes pour le de´veloppement embryonnaire aux stades pre´coces de clivage [24], mais pas les concentrations mode´re´es physiologiques. De ce fait, l’addition d’EDTA pour bloquer la glycolyse dans les premiers stades de de´veloppement embryonnaire n’apparaıˆt plus essentielle. 2.3. Lien entre composition du milieu de culture et variation de cine´tique de de´veloppement embryonnaire Absalon-Medina et al. proposent une lecture du me´tabolisme embryonnaire a` la lumie`re de l’expe´rimentation animale et d’e´tudes cliniques humaines [25]. Gardner et Harvey [26] re´sument ainsi certaines explications de la variation de cine´tique de de´veloppement embryonnaire : le de´veloppement embryonnaire est de´pendant des acides amine´s, du glucose et de certaines conditions de culture comme la concentration en oxyge`ne : une concentration e´leve´e en oxyge`ne (21 %) ralentit la cine´tique de de´veloppement pendant la phase de segmentation et aussi lors de la compaction de la morula. Lors de l’emploi de milieux se´quentiels, il est possible que les manipulations embryonnaires qu’ils imposent (changement de goutte de milieu) soient a` l’origine d’une plus lente cine´tique de de´veloppement embryonnaire que
Pour citer cet article : Koscinski I, et al. Conditions de culture pour les game`tes et embryons : quels milieux de culture ? et quelle incidence sur le nouveau-ne´ ? Gyne´cologie Obste´trique Fertilite´ & Se´nologie (2018), https://doi.org/10.1016/j.gofs.2018.03.010
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celle observe´e pour des embryons cultive´s dans un milieu unique. C’est e´galement ce que sugge`rent Hardarson et al. qui comparent la culture dans un incubateur de type time-lapse avec un milieu unique et avec un milieu se´quentiel : les deux moitie´s de cohortes ovocytaires me`nent a` une meˆme proportion de blastocystes de bonne qualite´, meˆme si quantitativement, le milieu se´quentiel permet l’obtention d’un nombre significativement plus important d’embryons au troisie`me jour. Enfin, la production d’ions ammonium, conse´quence du me´tabolisme des composants du milieu embryonnaire par l’embryon en de´veloppement et associe´e a` un moindre de´veloppement embryonnaire, est augmente´e dans le milieu se´quentiel par rapport au milieu unique [27].
chef d’orchestre du me´tabolisme e´nerge´tique cellulaire et la cible de la rapamycin (mTOR) qui semblent eˆtre implique´s dans la cine´tique de de´veloppement embryonnaire aux stades de segmentation comme au stade plus tardif de de´veloppement du trophectoderme du blastocyste. L’importance du glucose et des acides amine´s pendant le de´veloppement embryonnaire est illustre´e par le lien observe´ entre obe´site´ maternelle, restriction de croissance fœtale et re´duction de l’activite´ mTOR placentaire. Ceci sugge`re que toute perturbation de l’activite´ de mTOR au niveau embryonnaire, trophectodermique et placentaire se traduit par une diminution de la vitalite´ embryonnaire, blastocystique et fœtale [26,28,29].
2.4. Lien entre composition en acides amine´s du milieu de culture et variation du taux d’implantation embryonnaire
2.6. Interactions entre me´tabolisme e´nerge´tique et me´canismes e´pige´ne´tiques dans l’espe`ce humaine
Physiologiquement, l’implantation du blastocyste dans l’endome`tre est facilite´e par le lactate produit par le blastocyste luimeˆme. Ce lactate est synthe´tise´ par l’embryon a` partir du stock ovocytaire de glycoge`ne. Ainsi, in vitro, tout ce qui pourrait perturber cette production de lactate pourrait e´galement avoir un impact ne´gatif sur l’implantation. Tout de´ficit du milieu de culture en acides amine´s du stade de segmentation au stade blastocyste force l’embryon et plus particulie`rement le blastocyste a` utiliser le glucose pre´sent dans le milieu de culture ou, si cela n’est pas suffisant, a` utiliser son stock de glycoge`ne, exposant plus tard le blastocyste a` ne plus pouvoir produire des quantite´s suffisantes de lactate pour permettre l’implantation. Les milieux de culture riches en acides amine´s, notamment en alanine, en glycine, se´rine, pre´curseurs du pyruvate et donc du lactate prote`geraient ainsi l’embryon d’une glycolyse pre´coce excessive. Les milieux commercialise´s contiennent des quantite´s de ces acides amine´s variant du simple au double [22].
Le lien entre me´tabolisme e´nerge´tique et me´canismes e´pige´nomiques, dont la me´thylation de l’ADN et la me´thylation et l’ace´tylation des histones, a e´te´ largement expose´ par Gardner et Harvey [26] : il re´sulte du fait que plusieurs me´tabolites e´nerge´tiques comme la S-ade´nosylme´thionine (SAM), l’ace´tylCoA et le NAD modulent l’activite´ de la machinerie e´pige´ne´tique [30], graˆce a` SIRT 1 de la famille des Sirtuines (SIRTs), une famille d’histones de´pendantes du NAD et des prote´ines de´ace´tylases. Cette de´pendance au NAD des SIRTs les relie a` la re´gulation a` la fois de l’AMPK [31] et de mTOR [32]. L’impact des me´tabolites e´nerge´tiques sur l’e´pige´ne´tique du nouveau-ne´ est donc ine´vitable. Me´tabolisme e´nerge´tique et me´canismes e´pige´nomiques se trouvent a` des points cle´s de re´gulation dans des situations cruciales tout au long de la vie, comme par exemple la re´ponse a` la restriction e´nerge´tique, la longe´vite´, la te´ratogene`se ou encore la cance´rogene`se. . . le suivi des enfants issus de l’AMP et plus pre´cise´ment de FIV est indispensable pour e´valuer leur poids de naissance, mais aussi leur susceptibilite´ a` de´velopper plus tard une pathologie en lien avec un syndrome me´tabolique ou une pathologie de´ge´ne´rative ou oncologique.
2.5. Concentrations en lactate/pyruvate et cine´tique de de´veloppement embryonnaire Une des grandes diffe´rences entre la composition des milieux se´quentiels et des milieux uniques consiste en une concentration en lactate (et surtout le rapport lactate/pyruvate) supe´rieure dans les milieux uniques par rapport aux milieux se´quentiels correspondant au stade de segmentation embryonnaire. Ainsi, l’embryon en segmentation qui utilise le lactate comme source d’e´nergie premie`re peut-il trouver imme´diatement re´ponse a` tous ses besoins dans le milieu de culture unique. En revanche, cultive´ dans un milieu de culture se´quentiel pauvre en lactate dans les stades de clivage/ segmentation, l’embryon doit synthe´tiser lui-meˆme le lactate qu’il utilise dans un deuxie`me temps comme source d’e´nergie. Cette variation de composition explique la variation de cine´tique de de´veloppement pendant les stades de segmentation lorsque les embryons sont cultive´s dans un milieu unique (nombre de cellules plus important obtenu plus vite, notamment premier clivage plus rapide) ou dans un milieu se´quentiel (nombre de cellules moins important, premier clivage plus tardif). La plupart des milieux commercialise´s sont faiblement supple´mente´s en pyruvate, sugge´rant que ce sont davantage les proprie´te´s antioxydantes de ce dernier qui sont recherche´es plutoˆt que son utilisation par l’embryon comme substrat e´nerge´tique a` la place du glucose [22,26]. De plus, le ratio de concentrations pyruvate/lactate du milieu de culture peut re´guler le me´tabolisme embryonnaire ainsi que le potentiel redox intracellulaire [26]. Certains milieux se´quentiels sont tre`s fortement supple´mente´s en lactate tant pour les stades de segmentation que pour la blastulation [22]. Le me´tabolisme embryonnaire comporte encore des incompre´hensions, notamment concernant les interactions entre la se´rine-thre´onine kinase 11, l’AMP-activated protein kinase (AMPK),
2.7. Effet de l’acide hyaluronique (AH) Meˆme si l’acide hyaluronique (AH) sort le´ge`rement du cadre de cet article, il nous a paru inte´ressant de le mentionner du fait qu’il entre dans la composition de plusieurs milieux de culture commercialise´s [23]. L’AH est une macromole´cule naturellement pre´sente autour de l’ovocyte au moment de l’ovulation. On en trouve e´galement des quantite´s importantes se´cre´te´es par l’endome`tre. On en trouve de grandes quantite´s dans la circulation fœtale et dans le liquide amniotique. Au moment de l’implantation, il est conside´re´ comme facilitant l’implantation embryonnaire du fait de ses proprie´te´s antiinflammatoires et immunosuppressives. Des re´cepteurs a` l’AH sont pre´sents sur les cellules endome´triales, sur l’embryo et meˆme le spermatozoı¨de, ce qui lui a valu d’eˆtre propose´ comme moyen de se´lection des spermatozoı¨des a` injecter. Concernant les milieux de culture embryonnaire, une revue re´cente de la Cochrane [33] conclut, a` partir de 16 e´tudes randomise´es, a` l’innocuite´ de l’AH et a` son efficacite´ a` ame´liorer l’implantation et donc les taux de grossesse et de naissance (a` partir de 6 e´tudes seulement). Il serait ne´anmoins ne´cessaire de disposer de davantage d’e´tudes randomise´es confirmant cet inte´reˆt d’autant qu’une re´cente e´tude de Nishigara comparant des transferts de blastocystes congele´s dans un milieu de transfert comportant une concentration variable en AH ne retrouve pas de diffe´rence ni dans les taux d’implantation, ni dans les taux de fausses couches ou d’accouchement [34]. On ne retrouve pas d’e´tude exposant un quelconque effet inde´sirable de l’acide hyaluronique.
Pour citer cet article : Koscinski I, et al. Conditions de culture pour les game`tes et embryons : quels milieux de culture ? et quelle incidence sur le nouveau-ne´ ? Gyne´cologie Obste´trique Fertilite´ & Se´nologie (2018), https://doi.org/10.1016/j.gofs.2018.03.010
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Son introduction dans les milieux de culture en remplacement d’autres macromole´cules comme l’HSA a e´te´ salue´e comme un avantage dans la mesure ou` l’HSA n’e´tait pas pure et l’effet des autres mole´cules pre´sentes dans le se´rum humain employe´ n’est pas maıˆtrise´ notamment au niveau e´pige´ne´tique. On en trouve ainsi en quantite´ variable selon les milieux, mais c’est principalement dans les milieux utilise´s pour transfe´rer les embryons que sa spe´cificite´ est exploite´e.
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conclusion de cette expe´rimentation doit eˆtre prise avec re´serve dans la mesure ou` le milieu de Whitten est un milieu trop pauvre en acides amine´s pour assurer une me´thylation de l’ADN correcte pendant le de´veloppement pre´-implantatoire [36]. L’e´tude purement morphohistologique de Hemkemeyer comparant e´galement le de´veloppement embryonnaire en fonction de diffe´rents milieux de culture dont les milieux Whitten, KSOMaa, mais e´galement ISM1 et 2 et HTF/Multiblast montre que les fœtus issus d’embryons cultive´s en KSOMaa e´taient globalement plus grands que ceux issus d’embryons cultive´s en milieu Whitten ou in vivo [9].
3. E´pige´ne´tique et milieu de culture Ce que nous apportent les expe´rimentations animales : les expe´rimentations animales ont mis en e´vidence que les embryons de souris obtenus par FIV pre´sentaient une expression aberrante de ge`nes a` empreinte parentale [35]. La perturbation de l’empreinte e´tait la plus marque´e lorsque c’e´tait le milieu de Whitten (milieu tre`s pauvre) qui e´tait employe´ et moins marque´e lorsque c’e´tait le milieu KSOM, milieu supple´mente´ en acides amine´s. La majorite´ des ge`nes en question e´taient d’expression mono-alle´lique, exprime´s dans le placenta et implique´s dans la re´gulation de la croissance et du de´veloppement placentaires (par exemple : Igf2, Igf2r, Ascl2, Peg3, Peg1/Mest, Phlda2/Ipl, Cdkn1, Grb10) et ses fonctions (par exemple : Igf2, Slc22a1, Slc22a2, Slc22a3). En 2010, Market-Velker et al. ont compare´, en fe´condation in vitro murine, deux par deux, cinq milieux de culture embryonnaire humains commercialise´s (KSOMaa, Global, Human Tubal Fluid, Preimplantation 1/Multiblast et G1v5PLUS/G2v5PLUS) avec le milieu de culture embryonnaire le plus pauvre, le milieu de Whitten [36]. Ils ont compare´ les embryons obtenus en fe´condation in vitro et cultive´s du stade 2 cellules au stade blastocyste, avec des embryons de souris conc¸us in vivo (puis re´cupe´re´s par flushing ute´rin). La me´thylation de l’ADN e´tait e´tudie´e a` des loci connus pour eˆtre soumis a` empreinte, dans les ge`nes H19, Peg3, et Snrpn. Les auteurs ont montre´ que les embryons cultive´s dans les cinq milieux pre´sentaient une perte de me´thylation aux zones d’empreinte, en comparaison aux embryons issus de fe´condation spontane´e. En outre, cette perte de me´thylation variait conside´rablement d’un milieu a` un autre, parfois de fac¸on tre`s proche de ce qui e´tait observe´ avec le milieu pauvre de Whitten. Les auteurs en ont de´duit que le traitement de l’ovulation et la culture embryonnaire par elle-meˆme pouvaient augmenter les perturbations de la mise en place de l’empreinte ge´ne´tique. Ils ont conclu par une re´serve concernant toutes les manipulations embryonnaires et ont propose´ que les proce´dures d’AMP soient les plus restreintes possible pour rester le plus proche possible du de´veloppement pre´-implantatoire physiologique, comportant la mise en place de l’empreinte ge´ne´tique. Deux ans plus tard, conside´rant que la lenteur de de´veloppement embryonnaire murin in vitro e´tait une anomalie (un jour de plus par rapport au de´veloppement in vivo) Market-Velker et al. ont fait l’hypothe`se que les embryons ayant la cine´tique de de´veloppement la plus lente e´taient probablement ceux pre´sentant les plus importants de´ficits de me´thylation de l’ADN [37]. Contrairement a` leur hypothe`se, ils ont observe´ que les embryons se de´veloppant le plus rapidement dans le milieu de Whitten, avec le plus grand nombre de cellules au stade de segmentation puis les plus expanse´s au stade blastocyste pre´sentaient en fait les plus importantes perturbations de leur me´thylation de l’ADN et de l’expression de leurs marqueurs me´taboliques. Les embryons avec une cine´tique de de´veloppent pre´-implantatoire plus lente avaient un profil de me´thylation plus proche des embryons de´veloppe´s in vivo (meˆme nombre de cellules, meˆme volume blastocystique, semblable me´thylation de Snrpn et H19, semblable expression de H19, Atp1a1 et Slc2a1). La
4. Effet des milieux de culture sur la sante´ des enfants Le concept de fœto-programming de´veloppe´ par Barker [38] relie un grand nombre de pathologies de l’adulte a` des de´sordres e´pige´ne´tiques pre´nataux. Plusieurs e´tudes ont mis en e´vidence que l’expression de ge`nes soumis a` empreinte, comme IGF2, H19 et DMR2, pouvait eˆtre modifie´e selon le milieu de culture employe´ [35,37,39] rendant crucial le suivi des enfants conc¸us par FIV. Quarante ans apre`s la naissance de Louise Brown, a` travers le monde, plus de 5 millions d’enfants ont e´te´ conc¸us par FIV. Des observations rapportent chez ces enfants un risque accru de petit poids de naissance, de pre´maturite´, de retard de croissance in utero, de mort pe´rinatale [40,41] ainsi que des malformations conge´nitales [42,43]. D’autres e´tudes pointent une e´le´vation de la glyce´mie [44], une dyslipide´mie, voire meˆme un risque accru de cancer [23,45]. Ceci sugge`re que les proce´dures de FIV, particulie`rement des conditions de culture suboptimales puissent eˆtre a` l’origine d’alte´rations e´pige´ne´tiques exposant au de´veloppement de syndrome me´tabolique [46]. En faveur de cet impact sur l’e´pige´ne´tique embryonnaire, une enqueˆte mene´e en 2003 par Maher et al. retrouvait une incidence du syndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS) de 4 % parmi les enfants conc¸us par fe´condation in vitro (classique ou ICSI) contre 1,2 % dans la population ge´ne´rale (p = 0,009) [47]. Cette alerte e´tait confirme´e 6 ans plus tard par Manipalviratn et al., qui publiaient que 90 % des enfants BWS conc¸us par AMP pre´sentent des de´fauts d’empreinte ge´ne´tique contre 40–50 % des enfants BWS issus de grossesses spontane´es [48]. Dans le meˆme sens que cette observation, la revue de la litte´rature de Hiura et al. pointe des diffe´rences en termes de de´fauts de me´thylation associe´s aux anomalies d’empreinte chez les enfants conc¸us par FIV par rapport a` ceux conc¸us spontane´ment [49]. Toutes ces e´tudes humaines sont e´galement en accord avec les expe´rimentations animales : ainsi, des embryons de souris conc¸us spontane´ment puis cultive´s dans diffe´rents milieux de culture montrent tous des alte´rations e´pige´ne´tiques au niveau de zones soumises a` empreinte, en comparaison avec les embryons de souris se de´veloppant in vivo [36] (cf. plus haut). 4.1. Terme de naissance et milieu de culture Dans la mesure ou` les ge`nes soumis a` empreinte jouent un roˆle dans le de´veloppement placentaire, des anomalies de mise en place de l’empreinte ge´ne´tique pendant la pe´riode pre´-implantatoire peuvent avoir un impact sur les fonctions placentaires, et par la`, sur la survenue de pathologies de la grossesse, sur le de´veloppement fœtal puis de l’enfant voire meˆme sur la survenue de maladies de l’adulte [50]. Une e´tude re´trospective canadienne concernant 12 712 enfants ne´s, soit apre`s un transfert d’embryon j3, soit de blastocyste mettait en e´vidence une pre´maturite´ (< 37 semaines) plus fre´quente dans le groupe transfert de blastocystes, odds ratio = 1,32 [1,17–1,49]. Les auteurs sugge´raient que la culture prolonge´e
Pour citer cet article : Koscinski I, et al. Conditions de culture pour les game`tes et embryons : quels milieux de culture ? et quelle incidence sur le nouveau-ne´ ? Gyne´cologie Obste´trique Fertilite´ & Se´nologie (2018), https://doi.org/10.1016/j.gofs.2018.03.010
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puisse avoir un impact ge´ne´tique et e´pige´ne´tique sur le de´veloppement du trophectoderme, et donc de la placentation, a` l’origine de la pre´maturite´ [51]. Les auteurs confirmaient leur observation dans une revue syste´matique et une me´ta-analyse de la litte´rature [52]. 4.2. Poids de naissance du nouveau-ne´ et milieux de culture Soulignant depuis plusieurs anne´es des diffe´rences de poids de naissance entre enfants conc¸us apre`s AMP et enfants conc¸us spontane´ment, Nelissen et d’autres auteurs ont mis en e´vidence l’impact du milieu de culture sur le poids de naissance des enfants uniques [50] comme des jumeaux, que ce soit apre`s transfert d’embryons frais ou congele´s [15]. Dans ces e´tudes, aucune relation n’a e´te´ retrouve´e entre le terme de naissance et le milieu de culture utilise´. D’autres e´tudes comparant les meˆmes milieux de culture confirment cette observation [53,54]. Dans les e´tudes se´lectionne´es par Zandstra et al. dans leur revue et comparant milieux uniques et se´quentiels, le poids de naissance e´tait similaire dans tous les groupes (Eaton et al., 2012 ; Lin et al., 2013 ; Zandstra et al., 2015). Enfin, la dernie`re me´ta-analyse de Wang [55] compare les donne´es ne´onatales de grossesses uniques obtenues apre`s transferts d’embryons au stade blastocyste ou au stade d’embryons clive´s : il conclut a` un risque accru de pre´maturite´ et de grande pre´maturite´ en cas de transfert de blastocystes frais. Concernant le poids rapporte´ au terme, le transfert au stade blastocyste semble lie´ a` un risque accru de haut poids pour l’aˆge gestationnel alors que le transfert au stade clive´ semble lie´ a` un risque de faible poids pour l’aˆge gestationnel. Tout rapporter uniquement a` la dure´e de la culture et aux milieux utilise´s pour cette culture serait abusif, mais cela souligne la de´licate alchimie inte´grant un grand nombre de facteurs dont la qualite´ endome´triale pour une pratique de l’Aide me´dicale a` la procre´ation la mieux maıˆtrise´e possible. Cette qualite´ de l’endome`tre qui est davantage maıˆtrise´e lors des transferts d’embryons congele´s est probablement un e´le´ment majeur expliquant la similitude des devenirs pe´rinataux des nouveaune´s ne´s apre`s TEC quel que soit le stade de l’embryon de´congele´ transfe´re´. Re´cemment, la dure´e de stockage d’un milieu de culture a e´te´ associe´e avec une diminution du poids de naissance des nouveaune´s, sugge´rant que la dure´e de stockage, en de´gradant certains composants du milieu de culture perturbait l’expression de ge`nes, aboutissant a` un de´faut de croissance fœtale [56]. Dans leur revue des parame`tres des milieux de culture influenc¸ant les taux d’implantation et de grossesse, Wale et Gardner [57] insistent sur la de´gradation des acides amine´s dans les milieux de culture, produisant de l’ammonium. Ils font l’hypothe`se que le de´veloppement embryonnaire et l’expression de ge`nes soumis a` empreinte tels IGFIIR puisse participer a` l’impact des milieux de culture sur le poids du nouveau-ne´. Dans leur e´tude comparative des composants de milieux de culture, Morbeck et al. [22] ont mis en e´vidence la pre´sence de glutamine dans certains milieux. Or la glutamine est connue pour son instabilite´ et sa de´gradation spontane´e produisant de l’ammonium ayant un effet ne´faste sur les embryons humains [58,59]. Cela pourrait expliquer en partie les plus faibles poids de naissance observe´s chez les enfants conc¸us a` partir d’embryons cultive´s dans un tel milieu [10,15,53,54]. Au contraire, les fournisseurs de milieu unique utilisent de la L-alanyl-L-glutamine ou de la glycyl-L-glutamine plus stables au lieu de la glutamine, e´vitant ainsi la de´gradation de cette dernie`re [23]. L’importance de l’impact du milieu de culture sur le poids des nouveaux-ne´s doit eˆtre toutefois module´e par les re´sultats rapporte´s par Vidal et al. dans leur re´cente publication : les auteurs e´tudient entre autres donne´es pe´rinatales, le poids de naissance des enfants ne´s apre`s transfert d’embryons frais et
congele´s suite a` un don d’ovocyte. Ils en concluent que les effets observe´s dans les e´tudes ante´rieures pourraient eˆtre dus a` la stimulation de l’ovulation et/ou la pre´paration endome´triale plutoˆt qu’aux milieux de culture [12]. 5. Conclusion L’importance des milieux de culture embryonnaire est en rapport avec leur classification en tant que produits me´dicaux de classe III. En revanche, la seule exigence pour leur utilisation en Europe, qui est leur marquage CE (conformite´ europe´enne), est trop limite´e. Leur composition est inconnue des utilisateurs ce qui apparaıˆt en totale contradiction avec l’importance du retentissement sur le de´veloppement embryonnaire et de la sante´ des enfants. Cette situation paradoxale est pourtant, en 2018, en total conformite´ avec la loi ! ˆ ts De´claration de liens d’inte´re Les auteurs de´clarent ne pas avoir de liens d’inte´reˆts. Re´fe´rences [1] Gardner DK. Mammalian embryo culture in the absence of serum or somatic cell support. Cell Biol Int 1994;18(12):1163–79. [2] Gardner DK, Lane M. Alleviation of the ‘‘2-cell block’’ and development to the blastocyst of CF1 mouse embryos: role of amino acids. EDTA and physical parameters. Hum Reprod 1996;11(12):2703–12. [3] Mantikou E, Youssef MFM, van Wely M, van der Veen F, Al-Inany HG, Repping S, et al. Embryo culture media and IVF/ICSI success rates: a systematic review. Hum Reprod Update 2013;19(3):210–20. [4] Lemmen JG, Pinborg A, Rasmussen S, Ziebe S. Birthweight distribution in ART singletons resulting from embryo culture in two different culture media compared with the national population. Hum Reprod 2014;29(10):2326–32. [5] Davies MJ, Haan EA. Reproductive technologies: the alchemy of life. Med J Aust 2012;197(5):259–60. [6] Eaton JL, Lieberman ES, Stearns C, Chinchilla M, Racowsky C. Embryo culture media and neonatal birthweight following IVF. Hum Reprod 2012;27(2):375–9. [7] Leese HJ, Baumann CG, Brison DR, McEvoy TG, Sturmey RG. Metabolism of the viable mammalian embryo: quietness revisited. Mol Hum Reprod 2008;14(12):667–72. [8] Vergouw CG, Kostelijk EH, Doejaaren E, Hompes PGA, Lambalk CB, Schats R. The influence of the type of embryo culture medium on neonatal birthweight after single embryo transfer in IVF. Hum Reprod 2012;27(9):2619–26. [9] Hemkemeyer SA, Schwarzer C, Boiani M, Ehmcke J, Le Gac S, Schlatt S, et al. Effects of embryo culture media do not persist after implantation: a histological study in mice. Hum Reprod 2014;29(2):220–33. [10] Dumoulin JC, Land JA, Van Montfoort AP, Nelissen EC, Coonen E, Derhaag JG, et al. Effect of in vitro culture of human embryos on birthweight of newborns. Hum Reprod 2010;25(3):605–12. [11] Nelissen ECM, Van Montfoort APA, Smits LJM, Menheere PPCA, Evers JLH, Coonen E, et al. IVF culture medium affects human intrauterine growth as early as the second trimester of pregnancy. Hum Reprod 2013;28(8):2067–74. [12] Vidal M, Vellve´ K, Gonza´lez-Comadran M, Robles A, Prat M, Torne´ M, et al. Perinatal outcomes in children born after fresh or frozen embryo transfer: a Catalan cohort study based on 14,262 newborns. Fertil Steril 2017;107(4):940–7. [13] Gardner DK. Dissection of culture media for embryos: the most important and less important components and characteristics. Reprod Fertil Dev 2008;20(1):9–18. [14] Basile N, Morbeck D, Garcı´a-Velasco J, Bronet F, Meseguer M. Type of culture media does not affect embryo kinetics: a time-lapse analysis of sibling oocytes. Hum Reprod 2013;28(3):634–41. [15] Nelissen EC, Van Montfoort AP, Coonen E, Derhaag JG, Geraedts JP, Smits LJ, et al. Further evidence that culture media affect perinatal outcome: findings after transfer of fresh and cryopreserved embryos. Hum Reprod 2012;27(7):1966–76. [16] Morbeck DE, Baumann NA, Oglesbee D. Composition of single-step media used for human embryo culture. Fertil Steril 2017;107(4) [1055–1060.e1]. [17] Ikeda S, Sugimoto M, Kume S. Importance of methionine metabolism in morula-to-blastocyst transition in bovine preimplantation embryos. J Reprod Dev 2012;58(1):91–7. [18] Kwong WY, Adamiak SJ, Gwynn A, Singh R, Sinclair KD. Endogenous folates and single-carbon metabolism in the ovarian follicle, oocyte and pre-implantation embryo. Reprod Camb Engl 2010;139(4):705–15. [19] O’Neill C. Endogenous folic acid is essential for normal development of preimplantation embryos. Hum Reprod 1998;13(5):1312–6.
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GOFS-227; No. of Pages 7 Gyne´cologie Obste´trique Fertilite´ & Se´nologie xxx (2018) xxx–xxx
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Mise au point
Conditions de culture pour les game`tes et embryons : quels milieux de culture ? et quelle incidence sur le nouveau-ne´ ?§ Culture conditions for gametes and embryos: Which culture medium? Which impact on newborn? I. Koscinski a,*,b, M. Merten b,c, N. Kazdar d, J.-L. Gue´ant b,c a
Laboratoire de biologie de la reproduction, CHRU de Nancy, 10, rue du Dr-Heydenreich, 54000 Nancy, France Unite´ Inserm 954 N-GERE, 9, avenue de la Foreˆt-de-Hayes, CS 5018, 54505 Vandœuvre-le`s-Nancy, France c Laboratoire de biochimie, CHRU de Nancy, rue du Morvan, 54511 Vandœuvre-le`s-Nancy, France d Laboratoire Eylau-Unilabs, clinique Pierre-Cherest, 5, rue Pierre-Cherest, 92200 Neuilly-sur-Seine, France b
I N F O A R T I C L E
R E´ S U M E´
Historique de l’article : Rec¸u le 6 juin 2017
L’impact des milieux de culture sur la cine´tique de de´veloppement embryonnaire humain a e´te´ largement e´tudie´ en termes d’efficacite´ de la culture, mais peu d’e´tudes s’inte´ressent au suivi au long cours de la sante´ des enfants conc¸us apre`s fe´condation in vitro en fonction du milieu de culture. Pourtant, depuis plusieurs anne´es, des e´tudes animales signalent de possibles effets des techniques de culture embryonnaire in vitro sur la sante´ de la descendance. Dans l’espe`ce humaine, ces effets sont plus difficiles a` e´tablir dans la mesure ou` l’ensemble des conditions de la grossesse ainsi que la ge´ne´tique des ge´niteurs constituent des biais e´vidents. La composition d’un milieu de culture doit eˆtre de´chiffre´e de tre`s pre`s, au-dela` du caracte`re unique ou se´quentiel correspondant au « let embryo choose » ou « back to nature » respectivement. A` partir d’une analyse de la litte´rature portant sur l’expe´rimentation animale et la clinique humaine, les principaux constituants des milieux de culture embryonnaire seront pre´sente´s en pointant les conse´quences me´taboliques et les possibles conse´quences e´pige´ne´tiques. Les me´tabolites e´nerge´tiques sont d’importants re´gulateurs de la machinerie e´pige´ne´tique, ce qui sugge`re que les anomalies me´taboliques lie´es a` des anomalies morphologiques du de´veloppement embryonnaire pourraient constituer la face visible de l’iceberg et les anomalies e´pige´ne´tiques la face cache´e.
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Mots cle´s : Milieu de culture Me´tabolisme embryonnaire E´pige´ne´tique embryonnaire Suivi des enfants FIV
A B S T R A C T
Keywords: Culture medium Embryo metabolism Embryo epigenetics IVF children follow-up
Many studies have examined the impact of cell/embryo culture media on the development of human embryo during IVF process, but few studies have followed up and compared the effects of these culture media on the developmental outcome of children conceived by IVF. As recurrent experimental evidence from animal studies suggests potential long-term effects of embryo culture media on the health outcome of IVF-conceived children, more studies are needed to clarify the role of the culture media and mechanisms underlying such effects. In human, however, the effects of culture media are difficult to pinpoint due to complications stem from both the influence of maternal nutrition during the gestational period and the parental genetic. Based on a simple review of the literature integrating animal experimentations and human clinic studies, we suggest that the composition of culture medium should be considered beyond the character of unique or sequential medium, corresponding to ‘‘let embryo choose’’ or ‘‘back to nature’’ respectively. Instead, we suggest that the main components of embryo culture media should be considered from the point of view of metabolic consequences and potential epigenetic effects. Given that energetic metabolites can regulate epigenetic machinery, we hypothesize that metabolic abnormalities linked to morphological abnormalities could reveal epigenetic defects in embryos.
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Cet article a fait l’objet d’une communication orale lors des Journe´es de la Fe´de´ration franc¸aise d’e´tude de la fertilite´ (Tours, 13–15 septembre 2017). * Auteur correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (I. Koscinski).
https://doi.org/10.1016/j.gofs.2018.03.010 C 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits re ´ serve´s. 2468-7189/
Pour citer cet article : Koscinski I, et al. Conditions de culture pour les game`tes et embryons : quels milieux de culture ? et quelle incidence sur le nouveau-ne´ ? Gyne´cologie Obste´trique Fertilite´ & Se´nologie (2018), https://doi.org/10.1016/j.gofs.2018.03.010
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1. Introduction Un milieu de culture s’inte`gre dans un syste`me de culture embryonnaire incluant un me´lange gazeux permettant de maintenir un pH correct. A` toutes les e´tapes, la culture cellulaire peut eˆtre alte´re´e par des conditions de culture de´grade´es ou par des composants organiques volatiles (COV) e´mis par les consommables ou l’environnement plus ge´ne´ral du laboratoire de culture cellulaire, en premie`re ligne les produits de bionettoyage. Durant ces 40 dernie`res anne´es, la composition des milieux de culture embryonnaire a conside´rablement e´volue´, passant de simples solutions salines supple´mente´es en glucose et en phosphate jusqu’a`, plus re´cemment, des formules complexes contenant des acides amine´s essentiels et non essentiels, des che´lateurs comme l’EDTA, des vitamines, des macro-et oligoe´le´ments, des antibiotiques et des facteurs de croissance [1,2]. La composition des premiers milieux de culture a e´te´ e´labore´e a` partir des connaissances sur les milieux de culture cellulaires classiques et des e´tudes portant sur les fluides tubaires dans diverses espe`ces mammife`res. Dans un deuxie`me temps, une simplification des proce´dures a e´te´ propose´e. Actuellement, deux « philosophies » de culture cellulaire s’opposent : les milieux se´quentiels « back to nature » qui proposent de mimer les conditions naturelles dans les voies ge´nitales fe´minines ; les milieux uniques qui re´sultent du « let embryo choose » et pre´sentent une composition permettant la culture cellulaire de J1 au stade blastocyte avec ou sans renouvellement du milieu au troisie`me jour. Si les premiers se´duisent car plus proches de la physiologie, suivant les besoins variables de l’embryon au cours de son de´veloppement [2], ils imposent aussi des manipulations d’embryons pour changer le milieu, ce qui peut entraıˆner une de´gradation temporaire des conditions de culture (variations de tempe´rature, pH, . . .), a` l’origine de stress cellulaire. En revanche, dans les seconds, l’embryon trouve tout ce dont il a besoin tout au long de son de´veloppement pre´implantatoire ; mais ne trouve-t-il pas e´galement des substances inapproprie´es ? Le Tableau 1 pre´sente la majorite´ des milieux de culture disponibles sur le marche´ en 2017. Leur caracte`re se´quentiel ou unique y est pre´cise´. L’impact des milieux de culture sur la cine´tique de de´veloppement embryonnaire a e´te´ largement e´tudie´, principalement en termes d’efficacite´ de la culture (c’est-a`-dire, en termes de taux de blastulation, d’implantation, de naissance, obtenus avec tel ou tel milieu) [3], mais peu d’e´tudes rapportent le suivi au long cours de la sante´ des enfants conc¸us apre`s fe´condation in vitro [4] en fonction du milieu de culture. Pourtant, depuis plusieurs anne´es, des e´tudes animales signalent de possibles effets incontroˆle´s des techniques de fe´condation in vitro sur la sante´ des enfants [5–8]. Certes, ces e´tudes ne prennent souvent pas en conside´ration l’ensemble des conditions de culture mais l’alte´ration de l’expression de certains ge`nes soumis a` empreinte comme Igf2 et H19 ainsi que des modifications du poids des petits issus de fe´condation in vitro doit e´veiller l’attention [6], meˆme si l’e´tude de Hemkemeyer, plus re´cente, peut paraıˆtre rassurante concernant l’impact des milieux de culture sur le de´veloppement des fœtus post-implantation ; notons que cette e´tude purement morphohistologique rapporte toutefois que les fœtus issus d’un milieu de culture supple´mente´ en acides amine´s e´taient globalement plus grands que ceux issus d’embryons cultive´s dans un milieu pauvre ou conc¸us in vivo et que les fœtus issus de culture en milieux ISM1/ISM2 avaient des jambes (tibia et fibula) plus longues que les souriceaux conc¸us in
Tableau 1 Synthe`se des milieux de culture existant sur le marche´ en 2017. Milieu de culture
Companie
Type de milieu
BlastAssist BlastGenTM Complete Early Cleavage Medium1 (ECM1) Complete MultiBlast Medium1 EmbryoGen1 Ferticult IVF medium G-1TM G-2TM G-1TM PLUS G-2TM PLUS Gems ISM1TM IVF medium IVF-50 IVC K-SICM K-SIBM K-SIFM Multiblast P-11 Medium Quinn’s AdvantageTM Protein Plus Cleavage Quinn’s AdvantageTM Protein Plus Blastocyst Global1 GM501 G-TLTM Ham’s F-10 HTF SAGE 1-StepTM–with HSA SAGE 1-StepTM–with SPS Single Step MediumTM
Origio Origio Irvine scientific
Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel
Irvine scientific Origio Fertipro Vitrolife Vitrolife Vitrolife Vitrolife Merck Origio Vitrolife Scandinavian IVF In Vitro Care Cook Cook Cook Irvine scientific Irvine scientific Origio
Se´quentie Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel Se´quentiel
Origio
Se´quentiel
Life Global Gynemed Vitrolife Gibco Irvine scientific Origio Origio Irvine scientific
Unique Unique Unique Unique Unique Unique Unique Unique
vivo. Enfin, on peut reprocher a` cette e´tude de ne comporter aucun e´le´ment de biologie mole´culaire potentiellement plus sensible que la microscopie optique [9]. En outre, in vivo, les effets de la nutrition maternelle sur le poids de naissance et les risques de maladies me´taboliques et cardiovasculaires ont e´te´ mis en e´vidence dans diffe´rentes espe`ces. Dans l’espe`ce humaine, ces effets sont plus difficiles a` e´tablir dans la mesure ou` l’ensemble des conditions de la grossesse constitue des biais e´vidents. La corre´lation entre poids de naissance des nouveaux-ne´s et milieu de culture employe´ pour re´aliser la culture embryonnaire in vitro n’est pas claire. Certaines e´tudes sont en faveur d’un impact du milieu de culture sur le poids de naissance des nouveau-ne´s [10,11]. D’autres e´tudes concluent le contraire [6,8,12]. La revue de la litte´rature propose´e par Mantikou insiste sur les difficulte´s a` mettre en e´vidence le lien entre composition du milieu de culture embryonnaire et sante´ des enfants issus de ces cultures, meˆme s’il est bien e´tabli que des modifications de la composition des milieux de culture ont un impact sur le de´veloppement embryonnaire, notamment la concentration en glucose, lactate et pyruvate, en acides amine´s essentiels et non essentiels. Mais il ne faut pas sous-estimer l’importance des autres facteurs de culture (stabilite´ de la tempe´rature, du pH, de l’osmolarite´, . . .). Ce concept de culture embryonnaire globale de´ja` assez ancien [13] a e´te´ de´veloppe´ toujours par Gardner et repris par d’autres [4,6,14,15]. Tout re´cemment, Morbeck et al. [16] ont compare´ la culture embryonnaire murine jusqu’au stade blastocyte avec 4 milieux de culture uniques, dont les compositions en pyruvate, lactate et acides amine´s e´taient tre`s variables : ils concluent a` une sensibilite´ des embryons vis-a`-vis du milieu de culture, renforce´e par l’interaction entre le milieu de culture et la concentration en oxyge`ne qui est une condition propre a` chaque laboratoire.
Pour citer cet article : Koscinski I, et al. Conditions de culture pour les game`tes et embryons : quels milieux de culture ? et quelle incidence sur le nouveau-ne´ ? Gyne´cologie Obste´trique Fertilite´ & Se´nologie (2018), https://doi.org/10.1016/j.gofs.2018.03.010
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Nous proposons ici une analyse critique de la composition des milieux de culture avec une attention particulie`re porte´e sur les e´le´ments pouvant perturber les e´ve`nements e´pige´ne´tiques ayant lieu pendant le de´veloppement embryonnaire pre´-implantatoire. Enfin, nous ferons une synthe`se des e´tudes publie´es portant sur la sante´ des nouveaux-ne´s conc¸us par FIV, notamment leur poids de naissance. Nous ne traiterons pas ici des effets potentiels de certains produits ajoute´s aux milieux de culture comme le GMCSF, la PVP, la pentoxiphiline, les cryoprotecteurs. . . utilise´s plus ou moins en routine dans les laboratoires de fe´condation in vitro ; ils me´riteraient une e´tude bibliographique a` part entie`re. Seul l’acide hyaluronique sera discute´ car pre´sent dans plusieurs milieux commercialise´s.
2. Quels parame`tres et constituants d’un milieu de culture sont susceptibles d’induire une diffe´rence de de´veloppement embryonnaire et du taux de blastulation ? 2.1. La me´thionine Des e´tudes animales soulignent l’importance du me´tabolisme de la me´thionine au stade morula tardif, en accord avec les tre`s importants e´ve`nements de me´thylation spe´cifique a` ce stade de de´veloppement embryonnaire : dans un mode`le bovin, Ikeda et al. ont montre´ que la me´thionine contribue a` la me´thylation de l’ADN via sa conversion en S-ade´nosylme´thionine, le donneur de me´thyle universel utilise´ par la DNA me´thyltransfe´rase (DNMTs). Tout dysfonctionnement du me´tabolisme de la me´thionine peut entraıˆner une hypome´thylation de l’ADN et mener a` l’alte´ration de l’expression de ge`nes importants dans la diffe´renciation cellulaire et finalement, une diminution du taux de blastulation a` partir du stade morula [17]. Cette e´tude confirmait celle de Kwong’s [18] qui avanc¸ait la ne´cessite´ de folate dans les milieux de culture pour embryons bovins, non seulement pour la synthe`se de thymidine (comme de´montre´ pre´ce´demment dans un mode`le murin) [19] mais aussi pour des raisons e´pige´ne´tiques. Ne´anmoins, des blastocystes bovins e´taient e´galement obtenus, certes en plus faibles proportions avec des concentrations non approprie´es en folates. Ces observations animales sugge`rent deux re´flexions : meˆme en dehors de concentrations optimales en donneurs de me´thyle, des embryons mammife`res e´voluent jusqu’au stade blastocyste, qui ne peut donc eˆtre conside´re´ comme le reflet de conditions optimales de culture embryonnaire, garantissant par la meˆme occasion un de´veloppement normal et la mise en œuvre physiologique d’e´ve`nements e´pige´ne´tiques tels que la me´thylation de l’ADN. Ceci sugge`re que le taux de blastulation dans l’espe`ce murine, utilise´ comme indicateur de performance par les fabricants de milieux de culture ne garantit pas du tout que le milieu teste´ soit adapte´ au de´veloppement physiologique embryonnaire et l’importance de ce test dans les certificats de qualite´ des milieux devrait eˆtre tempe´re´e ; les fournisseurs de milieu de culture commercialisent leurs produits sans en donner la composition, ce qui est scientifiquement et e´thiquement tre`s discutable. Dans leur revue de la litte´rature commandite´e par la Socie´te´ europe´enne d’embryologie et de reproduction humaine (ESHRE), Sunde et al. soulignent l’importance pour les utilisateurs finaux de connaıˆtre la composition exacte des milieux commercialise´s puisqu’ils sont responsables des effets de la culture sur les enfants, c’est-a`-dire responsables des effets des composants pre´sents dans les milieux de culture [20]. Cette situation tre`s de´licate pour l’embryologiste a pousse´ certains a` controˆler les substances
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contenues dans les milieux de culture commercialise´s [21,22]. Ainsi, Morbeck et al. ont-ils analyse´ par spectrome´trie de masse la composition en acides amine´s, acides organiques, ions et ions me´talliques contenus dans 7 milieux de culture commercialise´s : leur composition varie largement avec de grandes diffe´rences en pyruvate, lactate et diffe´rents acides amine´s. En utilisant le test de blastulation murine, les auteurs mettent en e´vidence la de´pendance en certains acides amine´s et montrent une interaction avec la concentration en oxyge`ne et la pre´sence de prote´ines [22]. 2.2. La question du glucose dans les milieux de culture au stade zygote Le glucose est connu pour eˆtre ne´faste a` la fe´condation et au de´veloppement tre`s pre´coce de l’embryon (notamment au stade 2 cellules). Cependant, la plupart des milieux de culture commercialise´s contiennent du glucose meˆme pour les milieux de culture se´quentiels pre´tendant imiter le fluide tubaire proche de l’ampoule tubaire fe´minine qui ne contient quasiment pas de glucose. La strate´gie adopte´e par les fournisseurs principalement de milieu unique, mais aussi dans une bien moindre importance par les fournisseurs de milieux se´quentiels, consiste a` ajouter dans le milieu comple´mente´ en glucose de l’acide e´thyle`nediamine te´traace´tique, plus connu sous l’acronyme EDTA. Cette substance bloque les enzymes de la glycolyse en che´latant les ions Ca++ et Mg++. Mais ces meˆmes ions sont essentiels pour les enzymes de la synthe`se de l’ADN, e´tape cruciale de la division cellulaire. Les fournisseurs utilisent les proprie´te´s me´taboliques suivantes de l’embryon : les besoins en glucose de l’embryon sont proportionnels a` son expression des enzymes de la glycolyse : ainsi, un embryon de moins de 2 jours produira peu d’enzymes de glycolyse et donc ne sera pas en mesure d’utiliser le glucose contenu dans le milieu de culture si cette faible quantite´ d’enzymes glycolytiques est bloque´e par exemple par de l’EDTA ajoute´ au milieu ; par la suite, les besoins croissants de l’embryon en glucose seront associe´s a` une production croissante d’enzymes glycolytiques ˆ a` l’EDTA pre´sent dans le permettant de de´passer le blocage du milieu. La plupart des milieux se´quentiels proposent des concentrations en glucose tre`s variables entre le milieu de segmentation (aux alentours de 0,2–0,3 mM) et le milieu de blastulation (3 mM), alors que les milieux uniques proposent la meˆme concentration en glucose (0,2–0,3 mM) tout le long de la culture. Dans une revue re´cente de la litte´rature, Chronopoulou et Harper [23] concluent que seules les concentrations importantes en glucose seraient ne´fastes pour le de´veloppement embryonnaire aux stades pre´coces de clivage [24], mais pas les concentrations mode´re´es physiologiques. De ce fait, l’addition d’EDTA pour bloquer la glycolyse dans les premiers stades de de´veloppement embryonnaire n’apparaıˆt plus essentielle. 2.3. Lien entre composition du milieu de culture et variation de cine´tique de de´veloppement embryonnaire Absalon-Medina et al. proposent une lecture du me´tabolisme embryonnaire a` la lumie`re de l’expe´rimentation animale et d’e´tudes cliniques humaines [25]. Gardner et Harvey [26] re´sument ainsi certaines explications de la variation de cine´tique de de´veloppement embryonnaire : le de´veloppement embryonnaire est de´pendant des acides amine´s, du glucose et de certaines conditions de culture comme la concentration en oxyge`ne : une concentration e´leve´e en oxyge`ne (21 %) ralentit la cine´tique de de´veloppement pendant la phase de segmentation et aussi lors de la compaction de la morula. Lors de l’emploi de milieux se´quentiels, il est possible que les manipulations embryonnaires qu’ils imposent (changement de goutte de milieu) soient a` l’origine d’une plus lente cine´tique de de´veloppement embryonnaire que
Pour citer cet article : Koscinski I, et al. Conditions de culture pour les game`tes et embryons : quels milieux de culture ? et quelle incidence sur le nouveau-ne´ ? Gyne´cologie Obste´trique Fertilite´ & Se´nologie (2018), https://doi.org/10.1016/j.gofs.2018.03.010
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celle observe´e pour des embryons cultive´s dans un milieu unique. C’est e´galement ce que sugge`rent Hardarson et al. qui comparent la culture dans un incubateur de type time-lapse avec un milieu unique et avec un milieu se´quentiel : les deux moitie´s de cohortes ovocytaires me`nent a` une meˆme proportion de blastocystes de bonne qualite´, meˆme si quantitativement, le milieu se´quentiel permet l’obtention d’un nombre significativement plus important d’embryons au troisie`me jour. Enfin, la production d’ions ammonium, conse´quence du me´tabolisme des composants du milieu embryonnaire par l’embryon en de´veloppement et associe´e a` un moindre de´veloppement embryonnaire, est augmente´e dans le milieu se´quentiel par rapport au milieu unique [27].
chef d’orchestre du me´tabolisme e´nerge´tique cellulaire et la cible de la rapamycin (mTOR) qui semblent eˆtre implique´s dans la cine´tique de de´veloppement embryonnaire aux stades de segmentation comme au stade plus tardif de de´veloppement du trophectoderme du blastocyste. L’importance du glucose et des acides amine´s pendant le de´veloppement embryonnaire est illustre´e par le lien observe´ entre obe´site´ maternelle, restriction de croissance fœtale et re´duction de l’activite´ mTOR placentaire. Ceci sugge`re que toute perturbation de l’activite´ de mTOR au niveau embryonnaire, trophectodermique et placentaire se traduit par une diminution de la vitalite´ embryonnaire, blastocystique et fœtale [26,28,29].
2.4. Lien entre composition en acides amine´s du milieu de culture et variation du taux d’implantation embryonnaire
2.6. Interactions entre me´tabolisme e´nerge´tique et me´canismes e´pige´ne´tiques dans l’espe`ce humaine
Physiologiquement, l’implantation du blastocyste dans l’endome`tre est facilite´e par le lactate produit par le blastocyste luimeˆme. Ce lactate est synthe´tise´ par l’embryon a` partir du stock ovocytaire de glycoge`ne. Ainsi, in vitro, tout ce qui pourrait perturber cette production de lactate pourrait e´galement avoir un impact ne´gatif sur l’implantation. Tout de´ficit du milieu de culture en acides amine´s du stade de segmentation au stade blastocyste force l’embryon et plus particulie`rement le blastocyste a` utiliser le glucose pre´sent dans le milieu de culture ou, si cela n’est pas suffisant, a` utiliser son stock de glycoge`ne, exposant plus tard le blastocyste a` ne plus pouvoir produire des quantite´s suffisantes de lactate pour permettre l’implantation. Les milieux de culture riches en acides amine´s, notamment en alanine, en glycine, se´rine, pre´curseurs du pyruvate et donc du lactate prote`geraient ainsi l’embryon d’une glycolyse pre´coce excessive. Les milieux commercialise´s contiennent des quantite´s de ces acides amine´s variant du simple au double [22].
Le lien entre me´tabolisme e´nerge´tique et me´canismes e´pige´nomiques, dont la me´thylation de l’ADN et la me´thylation et l’ace´tylation des histones, a e´te´ largement expose´ par Gardner et Harvey [26] : il re´sulte du fait que plusieurs me´tabolites e´nerge´tiques comme la S-ade´nosylme´thionine (SAM), l’ace´tylCoA et le NAD modulent l’activite´ de la machinerie e´pige´ne´tique [30], graˆce a` SIRT 1 de la famille des Sirtuines (SIRTs), une famille d’histones de´pendantes du NAD et des prote´ines de´ace´tylases. Cette de´pendance au NAD des SIRTs les relie a` la re´gulation a` la fois de l’AMPK [31] et de mTOR [32]. L’impact des me´tabolites e´nerge´tiques sur l’e´pige´ne´tique du nouveau-ne´ est donc ine´vitable. Me´tabolisme e´nerge´tique et me´canismes e´pige´nomiques se trouvent a` des points cle´s de re´gulation dans des situations cruciales tout au long de la vie, comme par exemple la re´ponse a` la restriction e´nerge´tique, la longe´vite´, la te´ratogene`se ou encore la cance´rogene`se. . . le suivi des enfants issus de l’AMP et plus pre´cise´ment de FIV est indispensable pour e´valuer leur poids de naissance, mais aussi leur susceptibilite´ a` de´velopper plus tard une pathologie en lien avec un syndrome me´tabolique ou une pathologie de´ge´ne´rative ou oncologique.
2.5. Concentrations en lactate/pyruvate et cine´tique de de´veloppement embryonnaire Une des grandes diffe´rences entre la composition des milieux se´quentiels et des milieux uniques consiste en une concentration en lactate (et surtout le rapport lactate/pyruvate) supe´rieure dans les milieux uniques par rapport aux milieux se´quentiels correspondant au stade de segmentation embryonnaire. Ainsi, l’embryon en segmentation qui utilise le lactate comme source d’e´nergie premie`re peut-il trouver imme´diatement re´ponse a` tous ses besoins dans le milieu de culture unique. En revanche, cultive´ dans un milieu de culture se´quentiel pauvre en lactate dans les stades de clivage/ segmentation, l’embryon doit synthe´tiser lui-meˆme le lactate qu’il utilise dans un deuxie`me temps comme source d’e´nergie. Cette variation de composition explique la variation de cine´tique de de´veloppement pendant les stades de segmentation lorsque les embryons sont cultive´s dans un milieu unique (nombre de cellules plus important obtenu plus vite, notamment premier clivage plus rapide) ou dans un milieu se´quentiel (nombre de cellules moins important, premier clivage plus tardif). La plupart des milieux commercialise´s sont faiblement supple´mente´s en pyruvate, sugge´rant que ce sont davantage les proprie´te´s antioxydantes de ce dernier qui sont recherche´es plutoˆt que son utilisation par l’embryon comme substrat e´nerge´tique a` la place du glucose [22,26]. De plus, le ratio de concentrations pyruvate/lactate du milieu de culture peut re´guler le me´tabolisme embryonnaire ainsi que le potentiel redox intracellulaire [26]. Certains milieux se´quentiels sont tre`s fortement supple´mente´s en lactate tant pour les stades de segmentation que pour la blastulation [22]. Le me´tabolisme embryonnaire comporte encore des incompre´hensions, notamment concernant les interactions entre la se´rine-thre´onine kinase 11, l’AMP-activated protein kinase (AMPK),
2.7. Effet de l’acide hyaluronique (AH) Meˆme si l’acide hyaluronique (AH) sort le´ge`rement du cadre de cet article, il nous a paru inte´ressant de le mentionner du fait qu’il entre dans la composition de plusieurs milieux de culture commercialise´s [23]. L’AH est une macromole´cule naturellement pre´sente autour de l’ovocyte au moment de l’ovulation. On en trouve e´galement des quantite´s importantes se´cre´te´es par l’endome`tre. On en trouve de grandes quantite´s dans la circulation fœtale et dans le liquide amniotique. Au moment de l’implantation, il est conside´re´ comme facilitant l’implantation embryonnaire du fait de ses proprie´te´s antiinflammatoires et immunosuppressives. Des re´cepteurs a` l’AH sont pre´sents sur les cellules endome´triales, sur l’embryo et meˆme le spermatozoı¨de, ce qui lui a valu d’eˆtre propose´ comme moyen de se´lection des spermatozoı¨des a` injecter. Concernant les milieux de culture embryonnaire, une revue re´cente de la Cochrane [33] conclut, a` partir de 16 e´tudes randomise´es, a` l’innocuite´ de l’AH et a` son efficacite´ a` ame´liorer l’implantation et donc les taux de grossesse et de naissance (a` partir de 6 e´tudes seulement). Il serait ne´anmoins ne´cessaire de disposer de davantage d’e´tudes randomise´es confirmant cet inte´reˆt d’autant qu’une re´cente e´tude de Nishigara comparant des transferts de blastocystes congele´s dans un milieu de transfert comportant une concentration variable en AH ne retrouve pas de diffe´rence ni dans les taux d’implantation, ni dans les taux de fausses couches ou d’accouchement [34]. On ne retrouve pas d’e´tude exposant un quelconque effet inde´sirable de l’acide hyaluronique.
Pour citer cet article : Koscinski I, et al. Conditions de culture pour les game`tes et embryons : quels milieux de culture ? et quelle incidence sur le nouveau-ne´ ? Gyne´cologie Obste´trique Fertilite´ & Se´nologie (2018), https://doi.org/10.1016/j.gofs.2018.03.010
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Son introduction dans les milieux de culture en remplacement d’autres macromole´cules comme l’HSA a e´te´ salue´e comme un avantage dans la mesure ou` l’HSA n’e´tait pas pure et l’effet des autres mole´cules pre´sentes dans le se´rum humain employe´ n’est pas maıˆtrise´ notamment au niveau e´pige´ne´tique. On en trouve ainsi en quantite´ variable selon les milieux, mais c’est principalement dans les milieux utilise´s pour transfe´rer les embryons que sa spe´cificite´ est exploite´e.
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conclusion de cette expe´rimentation doit eˆtre prise avec re´serve dans la mesure ou` le milieu de Whitten est un milieu trop pauvre en acides amine´s pour assurer une me´thylation de l’ADN correcte pendant le de´veloppement pre´-implantatoire [36]. L’e´tude purement morphohistologique de Hemkemeyer comparant e´galement le de´veloppement embryonnaire en fonction de diffe´rents milieux de culture dont les milieux Whitten, KSOMaa, mais e´galement ISM1 et 2 et HTF/Multiblast montre que les fœtus issus d’embryons cultive´s en KSOMaa e´taient globalement plus grands que ceux issus d’embryons cultive´s en milieu Whitten ou in vivo [9].
3. E´pige´ne´tique et milieu de culture Ce que nous apportent les expe´rimentations animales : les expe´rimentations animales ont mis en e´vidence que les embryons de souris obtenus par FIV pre´sentaient une expression aberrante de ge`nes a` empreinte parentale [35]. La perturbation de l’empreinte e´tait la plus marque´e lorsque c’e´tait le milieu de Whitten (milieu tre`s pauvre) qui e´tait employe´ et moins marque´e lorsque c’e´tait le milieu KSOM, milieu supple´mente´ en acides amine´s. La majorite´ des ge`nes en question e´taient d’expression mono-alle´lique, exprime´s dans le placenta et implique´s dans la re´gulation de la croissance et du de´veloppement placentaires (par exemple : Igf2, Igf2r, Ascl2, Peg3, Peg1/Mest, Phlda2/Ipl, Cdkn1, Grb10) et ses fonctions (par exemple : Igf2, Slc22a1, Slc22a2, Slc22a3). En 2010, Market-Velker et al. ont compare´, en fe´condation in vitro murine, deux par deux, cinq milieux de culture embryonnaire humains commercialise´s (KSOMaa, Global, Human Tubal Fluid, Preimplantation 1/Multiblast et G1v5PLUS/G2v5PLUS) avec le milieu de culture embryonnaire le plus pauvre, le milieu de Whitten [36]. Ils ont compare´ les embryons obtenus en fe´condation in vitro et cultive´s du stade 2 cellules au stade blastocyste, avec des embryons de souris conc¸us in vivo (puis re´cupe´re´s par flushing ute´rin). La me´thylation de l’ADN e´tait e´tudie´e a` des loci connus pour eˆtre soumis a` empreinte, dans les ge`nes H19, Peg3, et Snrpn. Les auteurs ont montre´ que les embryons cultive´s dans les cinq milieux pre´sentaient une perte de me´thylation aux zones d’empreinte, en comparaison aux embryons issus de fe´condation spontane´e. En outre, cette perte de me´thylation variait conside´rablement d’un milieu a` un autre, parfois de fac¸on tre`s proche de ce qui e´tait observe´ avec le milieu pauvre de Whitten. Les auteurs en ont de´duit que le traitement de l’ovulation et la culture embryonnaire par elle-meˆme pouvaient augmenter les perturbations de la mise en place de l’empreinte ge´ne´tique. Ils ont conclu par une re´serve concernant toutes les manipulations embryonnaires et ont propose´ que les proce´dures d’AMP soient les plus restreintes possible pour rester le plus proche possible du de´veloppement pre´-implantatoire physiologique, comportant la mise en place de l’empreinte ge´ne´tique. Deux ans plus tard, conside´rant que la lenteur de de´veloppement embryonnaire murin in vitro e´tait une anomalie (un jour de plus par rapport au de´veloppement in vivo) Market-Velker et al. ont fait l’hypothe`se que les embryons ayant la cine´tique de de´veloppement la plus lente e´taient probablement ceux pre´sentant les plus importants de´ficits de me´thylation de l’ADN [37]. Contrairement a` leur hypothe`se, ils ont observe´ que les embryons se de´veloppant le plus rapidement dans le milieu de Whitten, avec le plus grand nombre de cellules au stade de segmentation puis les plus expanse´s au stade blastocyste pre´sentaient en fait les plus importantes perturbations de leur me´thylation de l’ADN et de l’expression de leurs marqueurs me´taboliques. Les embryons avec une cine´tique de de´veloppent pre´-implantatoire plus lente avaient un profil de me´thylation plus proche des embryons de´veloppe´s in vivo (meˆme nombre de cellules, meˆme volume blastocystique, semblable me´thylation de Snrpn et H19, semblable expression de H19, Atp1a1 et Slc2a1). La
4. Effet des milieux de culture sur la sante´ des enfants Le concept de fœto-programming de´veloppe´ par Barker [38] relie un grand nombre de pathologies de l’adulte a` des de´sordres e´pige´ne´tiques pre´nataux. Plusieurs e´tudes ont mis en e´vidence que l’expression de ge`nes soumis a` empreinte, comme IGF2, H19 et DMR2, pouvait eˆtre modifie´e selon le milieu de culture employe´ [35,37,39] rendant crucial le suivi des enfants conc¸us par FIV. Quarante ans apre`s la naissance de Louise Brown, a` travers le monde, plus de 5 millions d’enfants ont e´te´ conc¸us par FIV. Des observations rapportent chez ces enfants un risque accru de petit poids de naissance, de pre´maturite´, de retard de croissance in utero, de mort pe´rinatale [40,41] ainsi que des malformations conge´nitales [42,43]. D’autres e´tudes pointent une e´le´vation de la glyce´mie [44], une dyslipide´mie, voire meˆme un risque accru de cancer [23,45]. Ceci sugge`re que les proce´dures de FIV, particulie`rement des conditions de culture suboptimales puissent eˆtre a` l’origine d’alte´rations e´pige´ne´tiques exposant au de´veloppement de syndrome me´tabolique [46]. En faveur de cet impact sur l’e´pige´ne´tique embryonnaire, une enqueˆte mene´e en 2003 par Maher et al. retrouvait une incidence du syndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS) de 4 % parmi les enfants conc¸us par fe´condation in vitro (classique ou ICSI) contre 1,2 % dans la population ge´ne´rale (p = 0,009) [47]. Cette alerte e´tait confirme´e 6 ans plus tard par Manipalviratn et al., qui publiaient que 90 % des enfants BWS conc¸us par AMP pre´sentent des de´fauts d’empreinte ge´ne´tique contre 40–50 % des enfants BWS issus de grossesses spontane´es [48]. Dans le meˆme sens que cette observation, la revue de la litte´rature de Hiura et al. pointe des diffe´rences en termes de de´fauts de me´thylation associe´s aux anomalies d’empreinte chez les enfants conc¸us par FIV par rapport a` ceux conc¸us spontane´ment [49]. Toutes ces e´tudes humaines sont e´galement en accord avec les expe´rimentations animales : ainsi, des embryons de souris conc¸us spontane´ment puis cultive´s dans diffe´rents milieux de culture montrent tous des alte´rations e´pige´ne´tiques au niveau de zones soumises a` empreinte, en comparaison avec les embryons de souris se de´veloppant in vivo [36] (cf. plus haut). 4.1. Terme de naissance et milieu de culture Dans la mesure ou` les ge`nes soumis a` empreinte jouent un roˆle dans le de´veloppement placentaire, des anomalies de mise en place de l’empreinte ge´ne´tique pendant la pe´riode pre´-implantatoire peuvent avoir un impact sur les fonctions placentaires, et par la`, sur la survenue de pathologies de la grossesse, sur le de´veloppement fœtal puis de l’enfant voire meˆme sur la survenue de maladies de l’adulte [50]. Une e´tude re´trospective canadienne concernant 12 712 enfants ne´s, soit apre`s un transfert d’embryon j3, soit de blastocyste mettait en e´vidence une pre´maturite´ (< 37 semaines) plus fre´quente dans le groupe transfert de blastocystes, odds ratio = 1,32 [1,17–1,49]. Les auteurs sugge´raient que la culture prolonge´e
Pour citer cet article : Koscinski I, et al. Conditions de culture pour les game`tes et embryons : quels milieux de culture ? et quelle incidence sur le nouveau-ne´ ? Gyne´cologie Obste´trique Fertilite´ & Se´nologie (2018), https://doi.org/10.1016/j.gofs.2018.03.010
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puisse avoir un impact ge´ne´tique et e´pige´ne´tique sur le de´veloppement du trophectoderme, et donc de la placentation, a` l’origine de la pre´maturite´ [51]. Les auteurs confirmaient leur observation dans une revue syste´matique et une me´ta-analyse de la litte´rature [52]. 4.2. Poids de naissance du nouveau-ne´ et milieux de culture Soulignant depuis plusieurs anne´es des diffe´rences de poids de naissance entre enfants conc¸us apre`s AMP et enfants conc¸us spontane´ment, Nelissen et d’autres auteurs ont mis en e´vidence l’impact du milieu de culture sur le poids de naissance des enfants uniques [50] comme des jumeaux, que ce soit apre`s transfert d’embryons frais ou congele´s [15]. Dans ces e´tudes, aucune relation n’a e´te´ retrouve´e entre le terme de naissance et le milieu de culture utilise´. D’autres e´tudes comparant les meˆmes milieux de culture confirment cette observation [53,54]. Dans les e´tudes se´lectionne´es par Zandstra et al. dans leur revue et comparant milieux uniques et se´quentiels, le poids de naissance e´tait similaire dans tous les groupes (Eaton et al., 2012 ; Lin et al., 2013 ; Zandstra et al., 2015). Enfin, la dernie`re me´ta-analyse de Wang [55] compare les donne´es ne´onatales de grossesses uniques obtenues apre`s transferts d’embryons au stade blastocyste ou au stade d’embryons clive´s : il conclut a` un risque accru de pre´maturite´ et de grande pre´maturite´ en cas de transfert de blastocystes frais. Concernant le poids rapporte´ au terme, le transfert au stade blastocyste semble lie´ a` un risque accru de haut poids pour l’aˆge gestationnel alors que le transfert au stade clive´ semble lie´ a` un risque de faible poids pour l’aˆge gestationnel. Tout rapporter uniquement a` la dure´e de la culture et aux milieux utilise´s pour cette culture serait abusif, mais cela souligne la de´licate alchimie inte´grant un grand nombre de facteurs dont la qualite´ endome´triale pour une pratique de l’Aide me´dicale a` la procre´ation la mieux maıˆtrise´e possible. Cette qualite´ de l’endome`tre qui est davantage maıˆtrise´e lors des transferts d’embryons congele´s est probablement un e´le´ment majeur expliquant la similitude des devenirs pe´rinataux des nouveaune´s ne´s apre`s TEC quel que soit le stade de l’embryon de´congele´ transfe´re´. Re´cemment, la dure´e de stockage d’un milieu de culture a e´te´ associe´e avec une diminution du poids de naissance des nouveaune´s, sugge´rant que la dure´e de stockage, en de´gradant certains composants du milieu de culture perturbait l’expression de ge`nes, aboutissant a` un de´faut de croissance fœtale [56]. Dans leur revue des parame`tres des milieux de culture influenc¸ant les taux d’implantation et de grossesse, Wale et Gardner [57] insistent sur la de´gradation des acides amine´s dans les milieux de culture, produisant de l’ammonium. Ils font l’hypothe`se que le de´veloppement embryonnaire et l’expression de ge`nes soumis a` empreinte tels IGFIIR puisse participer a` l’impact des milieux de culture sur le poids du nouveau-ne´. Dans leur e´tude comparative des composants de milieux de culture, Morbeck et al. [22] ont mis en e´vidence la pre´sence de glutamine dans certains milieux. Or la glutamine est connue pour son instabilite´ et sa de´gradation spontane´e produisant de l’ammonium ayant un effet ne´faste sur les embryons humains [58,59]. Cela pourrait expliquer en partie les plus faibles poids de naissance observe´s chez les enfants conc¸us a` partir d’embryons cultive´s dans un tel milieu [10,15,53,54]. Au contraire, les fournisseurs de milieu unique utilisent de la L-alanyl-L-glutamine ou de la glycyl-L-glutamine plus stables au lieu de la glutamine, e´vitant ainsi la de´gradation de cette dernie`re [23]. L’importance de l’impact du milieu de culture sur le poids des nouveaux-ne´s doit eˆtre toutefois module´e par les re´sultats rapporte´s par Vidal et al. dans leur re´cente publication : les auteurs e´tudient entre autres donne´es pe´rinatales, le poids de naissance des enfants ne´s apre`s transfert d’embryons frais et
congele´s suite a` un don d’ovocyte. Ils en concluent que les effets observe´s dans les e´tudes ante´rieures pourraient eˆtre dus a` la stimulation de l’ovulation et/ou la pre´paration endome´triale plutoˆt qu’aux milieux de culture [12]. 5. Conclusion L’importance des milieux de culture embryonnaire est en rapport avec leur classification en tant que produits me´dicaux de classe III. En revanche, la seule exigence pour leur utilisation en Europe, qui est leur marquage CE (conformite´ europe´enne), est trop limite´e. Leur composition est inconnue des utilisateurs ce qui apparaıˆt en totale contradiction avec l’importance du retentissement sur le de´veloppement embryonnaire et de la sante´ des enfants. Cette situation paradoxale est pourtant, en 2018, en total conformite´ avec la loi ! ˆ ts De´claration de liens d’inte´re Les auteurs de´clarent ne pas avoir de liens d’inte´reˆts. Re´fe´rences [1] Gardner DK. Mammalian embryo culture in the absence of serum or somatic cell support. Cell Biol Int 1994;18(12):1163–79. [2] Gardner DK, Lane M. Alleviation of the ‘‘2-cell block’’ and development to the blastocyst of CF1 mouse embryos: role of amino acids. EDTA and physical parameters. Hum Reprod 1996;11(12):2703–12. [3] Mantikou E, Youssef MFM, van Wely M, van der Veen F, Al-Inany HG, Repping S, et al. Embryo culture media and IVF/ICSI success rates: a systematic review. Hum Reprod Update 2013;19(3):210–20. [4] Lemmen JG, Pinborg A, Rasmussen S, Ziebe S. Birthweight distribution in ART singletons resulting from embryo culture in two different culture media compared with the national population. Hum Reprod 2014;29(10):2326–32. [5] Davies MJ, Haan EA. Reproductive technologies: the alchemy of life. Med J Aust 2012;197(5):259–60. [6] Eaton JL, Lieberman ES, Stearns C, Chinchilla M, Racowsky C. Embryo culture media and neonatal birthweight following IVF. Hum Reprod 2012;27(2):375–9. [7] Leese HJ, Baumann CG, Brison DR, McEvoy TG, Sturmey RG. Metabolism of the viable mammalian embryo: quietness revisited. Mol Hum Reprod 2008;14(12):667–72. [8] Vergouw CG, Kostelijk EH, Doejaaren E, Hompes PGA, Lambalk CB, Schats R. The influence of the type of embryo culture medium on neonatal birthweight after single embryo transfer in IVF. Hum Reprod 2012;27(9):2619–26. [9] Hemkemeyer SA, Schwarzer C, Boiani M, Ehmcke J, Le Gac S, Schlatt S, et al. Effects of embryo culture media do not persist after implantation: a histological study in mice. Hum Reprod 2014;29(2):220–33. [10] Dumoulin JC, Land JA, Van Montfoort AP, Nelissen EC, Coonen E, Derhaag JG, et al. Effect of in vitro culture of human embryos on birthweight of newborns. Hum Reprod 2010;25(3):605–12. [11] Nelissen ECM, Van Montfoort APA, Smits LJM, Menheere PPCA, Evers JLH, Coonen E, et al. IVF culture medium affects human intrauterine growth as early as the second trimester of pregnancy. Hum Reprod 2013;28(8):2067–74. [12] Vidal M, Vellve´ K, Gonza´lez-Comadran M, Robles A, Prat M, Torne´ M, et al. Perinatal outcomes in children born after fresh or frozen embryo transfer: a Catalan cohort study based on 14,262 newborns. Fertil Steril 2017;107(4):940–7. [13] Gardner DK. Dissection of culture media for embryos: the most important and less important components and characteristics. Reprod Fertil Dev 2008;20(1):9–18. [14] Basile N, Morbeck D, Garcı´a-Velasco J, Bronet F, Meseguer M. Type of culture media does not affect embryo kinetics: a time-lapse analysis of sibling oocytes. Hum Reprod 2013;28(3):634–41. [15] Nelissen EC, Van Montfoort AP, Coonen E, Derhaag JG, Geraedts JP, Smits LJ, et al. Further evidence that culture media affect perinatal outcome: findings after transfer of fresh and cryopreserved embryos. Hum Reprod 2012;27(7):1966–76. [16] Morbeck DE, Baumann NA, Oglesbee D. Composition of single-step media used for human embryo culture. Fertil Steril 2017;107(4) [1055–1060.e1]. [17] Ikeda S, Sugimoto M, Kume S. Importance of methionine metabolism in morula-to-blastocyst transition in bovine preimplantation embryos. J Reprod Dev 2012;58(1):91–7. [18] Kwong WY, Adamiak SJ, Gwynn A, Singh R, Sinclair KD. Endogenous folates and single-carbon metabolism in the ovarian follicle, oocyte and pre-implantation embryo. Reprod Camb Engl 2010;139(4):705–15. [19] O’Neill C. Endogenous folic acid is essential for normal development of preimplantation embryos. Hum Reprod 1998;13(5):1312–6.
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