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Das Vorkommen von Phenoloxidase enthaltenden Zellen (= POZ) während der embryonalen Entwicklung des Huhnes (POZ - Zellen des Immunsystems?)
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--liO (I\Ji7)
l'ilyS:ologi,;.. h-chf·mi5ehcs Instit.ut. del' Mart.in-Luther·UniversiHit. in Halle (Saalc) (Dirokt.or: Prof. Dr. H. HANSON) und An l.to ni ,c;1-Histologisch·Embryologisches lnstitut d 'J' \1 ',li7.ini-lchen Univarsitat in Debrecen (Ungarn) (Direktor: Prof. Dr, GY, SZEKELY)
Das Vorkommen von Phenoloxidase enthaltenden ZeBen ( = POZ) wahrend der embryonalen Entwicklung des Huhnes (POZ - Zellen des Immunsystems?) The occurrenCe of phenoloxidase containing cells (= POZ) during the embryonary development of the hen (POZ - cells of the immunologicl;'.l system?) \'on HANS SCHMIDT und L.(SZLO MODIS \lit :H Abbilclungen (Eiug
Zus1.lJmmenfassung :VIit Hilfp dar Phenoloxidase-H,oaktion wurde nachgcwiosen, daf3 die paz nach 6tligiger Bebriitung in den blutbildenden Z:)llinsoln des Dottersackes und nach IItagiger BEbriitung in embryonalcn Gew"b" auftret.en, Be\·oI7.ugt,e Zdorgane sind Milz lmd Knochcnmal'k, obwohl zum gleichen Z~itpunkt aueh sehon vE'n'inzelt,e Z31lE'n im BindegewebC' des Embryos erseheimon. Die paz sind aueh in del' Rursa FABR1Cif nachwE'isbar, In del' Diskussion wird auf die miiglichc Beteiligung del' 'POZ an immllnologisehf'll Reaktionen hing,·wiesE'n.
Summary By mJans of the p\::n!oxi,hs;, reaetioll it would be shown that the POZ appear in haemopoctic cell islands of the yolk sac being hat,ched 6 days and being hatched Ii days, they appear in embryonary tissues. Favoured target organs aI''' the spleen and the bone marrow, though also at the same time can be seen some cells in the conneetive tissue of the embryo. paz can also be found in the bursa of FABRICIUS, The participation of the paz in immunological reactions is supposed.
Einleitung
Duel'
die Funktioncn del' im Bindegewebe verschiedener Species (SCHMIDT und
MODIS 1970, 1974; SCHMIDT 1971; SCHl\fiDT und STINTZ 1975) nachgewiesenen POZ
ist bisher nichts Sicheres bekannt. Einige Moglichkeiten wurden fruher (SCHl\fiDT und MODIS 1970, 1974) diskutiert. Es wllrde damals angcnommen, daB eine wandernde
Bindegewebszelle vorliegt. Diese Annahme wul'dc inzwischen dul'ch das Vel'halten del' POZ im Gebiet del' an Lichenificatio gigantea hypel'trophicans erkrankten mensch-
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lichen Raut (SCHMIDT, STINTZ und WOZNIAK, im Druck) bestatigt. Bei dieser Erkrankung treten POZ subepidermal gehauft auf und durchwandern offensichtlich auch das erkrankte Epithel, da sie direkt im Stratum corneum nachgewiesen werden konnen. Aus diesem Verhalten der POZ und den fur diese Erkrankung diskutierten atiologischen Faktoren sowie aus anderen, noch nicht verOffentlichten Befunden ergibt sich eine Bestatigung fur die schon seit langerer Zeit vermutete Beteiligung der POZ an immunologischen Prozessen. In den gegenwartigen Vorstellungen uber die Organisation der humoralen und gewebsabhangigen Immunabwehr spielen die sogenannten T- und B-Lymphocyten eineentscheidende Rolle (COOPER und LAWTON III 1974). Es wird postuliert, daB sich beide Zelltypen von den bisher nicht naher definierten hamatopoetischen Stammzellen im Dottersack herleiten. Bei Vogeln sollen diese Stammzellen vom Dottersack in das Knochenmark wandern und sich hier zu verschiedenen Blutzellen differenzieren. Jene Zellen, die am Ende ihrer Entwicklung Lymphocyten werden, bedurfen der weiteren Entwicklung auBerhalb des Knochenmarks. T-Lymphocyten sollen ihre Immunkompezenz im Thymus, B-Lymphocytenin der Bursa FABRICn (bei Vogeln) erhalten. Diese Vorstellungen zusammen mit den bereits oben angefUhrten Grunden gaben Veranlassung, das Verhalten der mittels der Phenoloxidase-Reaktion erkennbaren POZ bei der embryonalen Entwicklung des Huhnes zu untersuchen.
Material und Methoden Untsrsucht wurden 10 bis 20,um dicke Kryostatschnitte von 3, 6, 7, 9, 11, 13, 14, 15, 17, 18 und knapp 21 Tage bebriiteten Hiihnereiern1 ). Bis zum 14. Bebriitungstag wurden entweder der gemmte Embryo oder Teile des Embryos mit Dottersack geschnitten. Ab 15. Bebriitungstag wurden Lunge, Leber, Milz, Darm, Dottersack und Knochenmark des Embryos untersucht. Yom KnochEDmark wurden zumeist Fingerprints hergestellt. AuJ3erdEm wurdEn Schnitte ven Lunge, Leber, Milz und Darm 2 und 4 Tage alter Kiiken sowie 6 bis 8 Wochen alter HiihnchEn angefertigt. Bei den 4 Tage und 6 bis 8 Wochen alten Tieren wurden auJ3erdEm die BurEa FABRICII und das Knochem:nark prapariert. Der Nachweis der Phenoloxidase (PO) erfolgte nach SCHMIDT und M6DIS (1974) in der Modifikation von SCHMIDT und KISS (1975). Es wurden jeweils 1 Hauptversuch (HV) und 2 Kontrollversuche (KV1 und KV2 ) angesetzt. Beim KV1 wurde unter gleichEn Bedingungen wie beim HV, jedoch mit 10 min in 90 DC heiJ3em destilliertem Wasser inaktivierten Schnitten inkubiert. Der KV2 enthielt kein Substrat (L-DOPA). Die Inkubation erfolgte bei 37 DC Kiivetteninnentemperatur unter Beliiftung mittels Aquariumpumpe. Ein Teil der Schnitte wurde m.it Kresylechtviolett nech SCHMIDT (1965) gefarbt.
Ergebnisse Dottersack (Abb. Ibis 7) Die ersten POZ werden im Dottersack der 6 Tage bebriiteten Ruhnereier nachweisbar. Sie sind in der Nahe der sich formierenden oder auch in den Zellinseln selbst 1) Fiir die in Halle durchgefiihrten Untersuchungen wurden uns die bebriiteten Hiihnereier freundlicherweise von der G3fliigelzuchtanstalt (Leiterin: Frau KLENK) des VE Gutes Seeben zur Verfiigung gestellt, wofiir wir herzlich danken.
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und L. lVI6DIS
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lokalisiert, die als hiimatopoetisehe Stammzcllen angeschen werden. Die POZ sind zuniiehst noeh klein und enthalten nur wenig Reaktionsprodukt. In del' weiteren Entwieklung werden sic deutlieher siehtbar. ihre Anzahl steigt - soweit dies beurtcilt werden kann - ctwas an, und kurz VOl' del' Geburt bilden die POZ Zellgruppen innerhalb del' Zellinseln. Embryo (Abb. 8 his 31) 1m Embryo sPlbst kannen naeh Iltiigiger Bebriitung (Abb. 8 bis 10) die ersten POZ naehgewiesen werden. Relativ hiiufig werden sie in Milz und Knoehenmark, vereinzelt abel' aueh in Lunge und Leber gefunden. ~aeh 15tiigiger Bebriitung sind POZ in del' Milz (Abb. 11) in rciehlieher Anzahl vorhandcn, wiihrend Lunge und Leber weiterhin nul' einzelne Zellen enthalten. Eine au13crordentliche Zunahmc an POZ ist in Milz (Abb. 12) und Knochenmark (Abb. 17) nach 18tiigiger Behriitung festzustellen. Aueh die Lunge (Ahb. 16) und die tieferen Sehichten des Darm bindegcwebes (A bb. 14) cnthalten vermehrt, die Zotten voreinzelte (Abh. 1:3) ZeJlon, wiihrond die Leber (Abh. 15) naeh wie VOl' hauptsiiehlieh nul' einzeJne Zellcn aufweist. ~ur selten kannen kleinc Zellgruppen in del' Leber heobaehtet werden. Tn den bis kurz VOl" del' Geburt bebriiteten Embryonen ist die Hiiufigkeit del' Zellen in der Leber, Milz und Knoehenmark (Ahb. 18, HI, 21) iihnlieh wie naeh 18tiigiger Bebriitung. 1m Bindogewebe dol' Lunge (Abb. 20) ist die Anzahl del' POZ graDer gewordon. Tm Darmhindegewcbe ist die Hiiufigkeit untersehiedlieh: An manehen Stellen keine. an anderen Stellen zahlreiehc Zellen. Bei den 2 und 4 Tage sowie 6 bis 8 Woehen alten Hiihnehen besteht in etwa noeh das gleiehe Verteilungsbild del' POZ wie kurz VOl' del' Geburt. In del' am 4. Lehenstag untersuchten Bursa FABRICII sind zahlreiche POZ vorhandon (Abb. 22. 23). Sin sind in auffiilliger WeiRc in del' Umgebung del' Bursa-Follikel lokalisiert. vernillzeJte Zellen kcmmcn in den Follikeln VOl'. 1m Vergleieh mit del' Bursa am 4. Lebcllstag ellthiilt das 6 bis 8 Woehen alto Bursa-Gewebe trotz seiner GroBe nur noeh relativ wenige POZ (Abb. 24, 25). Die Lokalisation ist iihnlieh wie am 4. Lebellstag. Die Kontrollselmittc (KV1 und KV2 ) des Bursagewebes sind wie aile andcren Kontrollell llegativ (Ahb. 26. 27). Tn den Abbildungen 28 bis 31 sind die POZ in lVIilz. Lebel'. Lunge und Knochcnmark des 6 bis 8 Woehen alten Huhnes dargestellt .
Abb. I .- i.
2 :3 4
naeh nach mwh na"h
poz im Dou,']'"""k unt"nwhip(lli("h lungp bobriitekr Hiihmlreier. 6Uigiger !JUigiger IIUigigl'r l:ltiigigpr
Bebriltung. Bl'briitung. Rdll'iitnng. Bebriitung.
250: 250: l60: 250:
I I I
1
nach 15tagiger Bcbriitung. 250: I nach 18tiigiger Bebriiturg. 250: I 7 ~. naeh knapp 2ltagiger Bebriitung (20 Tage und 17 h). 63: 1. 5 6
Abb. 8. Einzehw POZ naeh 1 Itiigigel" Bebriitung. a im Bindegewebe des Darmes, b in del' Leber. a 500: 1; b 400: 1. 4*
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Abb. 9. Abb. 10.
H. SCHMIDT und L. MODIS
M~hrere
POZ in der Milz nach 11tagiger Bebriitung. 400: 1.
M~hrere
POZ im Knochenmark nach 11tagiger Bebriitung. 160: 1.
Abb. 11. POZ in der Milz nach 15tagiger Bebriitung. 125: 1. Abb. 12. Stark vermehrte POZ in der Milz nach 18tagiger Bebriitung. 80: 1. Abb. 13. Einzelne POZ im Bindegewebe von Darmzotten nach 18tagiger Bebriitung. 100: 1. Abb. 14. Zahlreiche POZ im tieferen Bindegewebe des Darmes nach 18tagiger BebIiitung. 80: 1. Abb. 15. Einzelne POZ in der Leber nach 18tagiger Bebriitung. 400: 1. Abb. 16. Vormchrung dor POZ in der Lunge nach 18tagiger Bebriitung. 160: 1. Abb. 17. Starke Vermehrung der POZ im Knochenmark nach 18tagiger Bebriitung. 63: 1. Abb. 18. POZ in der Milz nach knapp 2ltagiger Bebriitung. Beginnende Anordnung der POZ urn die ~Iilzfollikel. 63 X . Abb. 19. Immer noch vereinzelte POZ in der Leber naoh knapp 2ltagiger Bebriitung. 63 x. Abb. 20. Zahlreiche POZ im Lungengewebe nach knapp 2ltiigiger Bebriitung. 80: 1. Abb.21. Sehr viele POZ im Knochenmark nach knapp 2ltagiger Bebriitung. 63: 1. Abb.22. POZ in der Bursa FABRICII am 4. Lebenstag. Betonte Lagerung in der Peripherie der Bursa·Follikel. 63: 1. Abb. 23. Wie Abb. 22. 250: 1. Abb.24. Gewebsbezirk in der 6 bis 8 Woehen alten Bursa FABRICII mit nur noeh wenigen POZ. 63: 1. Abb.23. Gewebsbezirk in der Bursa FABRICII des 6 bis 8 Woehen alten Huhnes mit noch mehreren POZ. Rechts im Bild: Bursa-Strukturen mit Grauschleier. Ob es sich dabei urn PO-Aktivitat handelt, ist bisher nicht erwiesen. 63: 1. Abb.26. Kontrolle zu Abb. 22-25, KV1 . 1m Bursa-Gewebe sind keine POZ nachweisbar. 63: 1. Ab':>.27. Kontrolle zu Abb. Reaktion. 63: 1.
22~25.
Nur mit Pufferliisung inkubierter Kontrollschnitt (KV 2)' Keine
Abb.28. POZ in der Milz des 6 bis 8 Wochen alten Huhnes. Typische Lokalisation urn die MALPIGHISchen Kiirp3rchen. 63: 1. Abb. 29. Einzelne POZ und Zellhaufen von POZ in der Leber des 6 bis 8 Wochen alten Huhnes. 160: 1. Abb. 30. Zahlreiche POZ in der Lunge des 6 bis 8 Wochen alten Huhnes. 100: 1. Abb. 31. Zahlreiche POZ im Knochenmark des 6 bis 8 Wochen alten Huhnes. 63: 1.
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V(ll'k(lI11ll1l'l\ \-011 Ph('noloxida~e
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SCHMIDT
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VOJ'kornmcn von Phonoloxidase
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SCHUIDT
und L. lI6DIS
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Das VOJ'kommeIl Yon Phenoloxidase
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H. ScmnDT lind L. M:6DIS
Abb. 32. AuJ3erordentlich intensive PO-Reaktion in dem das transplantierte Kllorpelgcwebe urngebenden Bindegeweb3. Oben: aufgelockertJs, unten: kompaktes Binclegewebe. 63: 1. Abb. 33. VergroJ3erung eles 8ufgelockerten Billdegewebes. Die Zellform entspricht der "on Fibroblasten. Die Zellkerne geben eine positive PO-Reaktion. 400: l. Abb.34. VergroJ3erung des kompakten Bindegewebes. Das Reaktiollsprodukt ist anscheinend mehr im Cytosol der Zellen lokalisiert. 400: 1.
Diskussion Die Ergebnisse zeigen, daO es mit dem Ph3noloxidase-Nachweis moglich ist, den Weg der POZ bzw. das Verhalten dieser Z311en wahrend der cmbryonalen Entwicklung des Huhnes zu verfolgen. Aus den Untersuchungen ergibt sich folgendes Verhaltensbild: Zwischen 3. und 5. Bebriitungstag beginnen sich die POZ im Dottersack in oder in unmittelbarer Nahe der hematopoetischen Zellinseln zu entwickeln. Sie sind hier bis unmittelbar vor dem Geburtstermin nachweisbar, wobei sie sich offenbar in der letzten Entwicklungsphafe auch im Dottersack noch zu vermehren scheinen (s. Ahb. 7). In den embryonalen Geweben werden die ersten POZ nach lltagiger Bebriitung sichtbar. Milz und Knochenmark scheinen dabai bavorzugte Zielorgane zu sein, obwohl zurn gleichen Zeitpunkt auch schon vereinzelte Zellen im Bindegewebe des Embryos auftreten. Zwischen 15. und 18. Entwicklungstag des Embryos folgt dann eine intensive Vermehrung der POZ in Milz und Knochenmark, aber offensichtlich aue:h im Bindegewehe. In der Milz beginnt sich Zll diesem Zeitpunkt jenes Zustandsbild herauszubilden, wie es am geschliipften Tier zu beobachten ist, namlich eine strenge Anordnung der POZ urn die MALPIGHISchen Korperchen (SCHMIDT und M6DIS 1974). Die Haufigkeit der POZ im Knochenmark scheint nach dem 18. Bebriitungstag im beobachteten Entwicklungszeitraum keine wesentliche Veranderung zu erfahren. Ob dieser Zustand jedoch im weiteren Lebensverlauf des Huhnes unverandert bleibt oder nicht, bedarf noch der weiteren
Das Vorkommen von Phenoloxidase
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Unt,3l'suehung. B.>i erwachsenen Ratten kormten beispielsweise im Knochenmark keine POZ gefunden werden (SCHMIDT und M6nrs 1974). Hier konnen abel' aueh Speeiesunterschiede vorliegen, da zum BJispiel die L)ber 1,2 und 3 Tage alter Ratten (unverOffentliehte Ergebnisse) sehr viele, die des Huhnes nUl' wenige POZ enthiilt. 1m Bindegewebe del' Lunge ist die Vermehrung del' POZ zwischen IR. lIIHI 21. Bebriitungstag, also kurz VOl' del' Funktionsaufnahme, auffiillig. Infolgc del' schon eingangs erwahnten Bedeutung del' Bursa FABRICII bei den heutigen Vorstellungen iiber (lie Entwieklung immunkompetenter Zollen ist dom Verhalten del' POZ in diesem Organ bosonclere Aufnwrksamkeit zu widmen. Xach OLAH, RiiHLIcH und TiiRii (1975) entwiokolt sioh die Bursa in den erst on ;3 \Vochen naeh del' Geburt. Zwisehon 3. und 8. Woehe bleibt sie dann konstant, urn sieh danaeh zuriiekzubilden. Die Bursa \l'urdc somit zu Beginn ihrer Entwieklung (4. Lobenstag) und kurz \"rJl' ihrel' IIl\'olution (6 bis R \Voehen alt) untel'sucht. Dio Ergebnisse weisen aus, daE die Hiiufigkeit del' POZ in b2id(m Ent\l'ieklungsstadien vcrsehieden ist. Jm sioh entwickelnden Organ sind viole. im involutionsnahen Organ l,,'lativ wenige Zellen vorhanden. Diesel' Befund woist auf Beziehungen zwischen Hiillfigkeit del' I'OZ und Funktionszustand del' Bursa FABRICII hin. Aus clem dargdegten Verhalten del' I'OZ ]wi del' Entwieklung des Huhnos ergibt sieh, daE die POZ oino Z"llpoplliation sui generis darstellen, die in den blutbildenden Zellinseln des Dottersaekes enbteht un(I deren Entwicklungsgang sieh teilweise zu dem del' eingangs erwahnten '1'- und BLymphocyten in Beziehung setzen liif.Jt. Ais Konsequenz ergibt sieh daraus, daE zum Beispiel fUr dif' naeh einer Bursa-Exstirpation auftretenden immunologisehen Fehlleistungen aueh die POZ verantwortlich Selin k"nnen. Aus eigeIH'n, ZlllTt Tei! bisher unvoroffentliehten Untersuehungen haben sieh sehon zahlrpi('he Hinweise el'geben, dip flir pine Beteiligung del' POZ an immunologisehen ProZeSS"Il sprechen. ~o sind zum Belispiel im Granulationsgewebe, das bei del' Implantation von Deckgliisehen in die BalH·hhiihle \-on Ratten auftritt, zahlreicho POZ nachweis bar. Bei del' Liehenificatio gigantea hypcrtrophieans (~CH~llDT, STI~'l'Z und WOZXIAK) (im Druck), die als Reaktion del' Haut auf Chemikalien, Proteine, Bakterien odeI' Pilze angesohon wirel (LEVER 1958), sind, wie sehon erwiihnt, vermehrt POZ vOl'handcn. Aueh die beim Melanom naehgewicsenen POZ (SCHMIDT und STINTZ 1\)75) kbnnten als im Dienstc dc,; Immunsystems stehonde Zellen interpretiert werden, und sehlie/3liehliefern die zahlreichen bei del' Implantation von Rindernasenseheidewandknorpel in das subkutane Gewebe del' Hatte auftretenden POZ (Abb. :12 bis ;34) eincn direkten Nachweis fUr ihre Mitwirktmg bei del' Abwehl' (Killerzelle'!) von Fremdgewebe. Auf del' Basis del' gegenwiirtigen Kenntnisse iiber die 1'OZ und im Zusammenhang mit den Vorstellungen iiber (Ii" Entwieklung immunologisch aktiver Zellen el'seheint es nieht unmbglich, daE aueh die POZ cineI' Differenzierung llutel'liegen und in versehiedcncn Kompetenzbcreiehcn, wie bei del' gewcbsabhiingigen und humoralen Immunabwehr odeI' dcr Bildung von Granulationsgewebc, tMig Wpnlpll.
Literatur SCHMIDT, H., und ~I6Dls, L., Das Verhalten versehiodener Dehydrogenasen und Oxydasen del' Rattenhaut bei lokaler Ischamie. Acta histochem. 37, 80~ 104 (1970). ~ Del' Nachweis von Phenoloxidase enthaltenden Zellen (= POZ) m verschiedenen Geweben uud Organen del' Ratte·. Acta histochem. 51, 286-300 (1974).
Histotopochemiseher Nachweis n,rsehiedenor Dehydl'ogenasen und Oxydasen in del' mensch· lichen Zahnpulpa (Ein B:)itrag zur Dal'st"llung del' Pulpanerven). Dtseh. Zahn-, Mund- u. Kieferheilk. 56, 302-:114 (1971). und ST1"
~
tfid KISS, F. A., Ein Reitrag :I06~:H4 (197.5).
Methodik des Phenoloxidasenachweises. Aeta histochem. 53,
ZUI'
ein PO-Zellen-Tumor? Arch. Geschwulstforseh. 45,146-
Histotopochemi,;che UntJrsuchungen mit dcm metaehromatisehcn Farbstoff Kresylechtviolett. Acta histochem. 21, :J55--;361 (1965).
60
H. SCHlIIIDT und L. M{)OIS, Das Vorkommcn von Phcnoloxidasc
COOPER, AI. D., ancl LAWTO?i" HI, A. R., Thc dcvl'iopmcnt of tlw immunc systcm. Scientific Amer. 231,59-72 (19i4). LEVER, ,"V. F., Histopathologio del' Haut. G. FischEl', Stuttgart 1958. OLAH, 1., ROHLICH, P., ancl TORi), 1., Ultrastrul'tul'c of lymphoid organs. Akadcmiai Kiad6, Budapest 1975. Anschrift der Verfasser: Doz. Dr. Dr. H. SCHlIIlDT, Physiologisch-ehernisehes Institut der MartinLuther-Univel'sitat, DDR - 402 Halle (Saate), HoIlystraLle 1, l'Gstfiwh 184 und Dr. L. MODIS, C. Sc., Anatomiseh-Histologiseh-Ernbryologisehes Institut der lVIedizinischen Universitat, H - 4012 Debl'eeen, Ungarn.
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l'ilyS:ologi,;.. h-chf·mi5ehcs Instit.ut. del' Mart.in-Luther·UniversiHit. in Halle (Saalc) (Dirokt.or: Prof. Dr. H. HANSON) und An l.to ni ,c;1-Histologisch·Embryologisches lnstitut d 'J' \1 ',li7.ini-lchen Univarsitat in Debrecen (Ungarn) (Direktor: Prof. Dr, GY, SZEKELY)
Das Vorkommen von Phenoloxidase enthaltenden ZeBen ( = POZ) wahrend der embryonalen Entwicklung des Huhnes (POZ - Zellen des Immunsystems?) The occurrenCe of phenoloxidase containing cells (= POZ) during the embryonary development of the hen (POZ - cells of the immunologicl;'.l system?) \'on HANS SCHMIDT und L.(SZLO MODIS \lit :H Abbilclungen (Eiug
Zus1.lJmmenfassung :VIit Hilfp dar Phenoloxidase-H,oaktion wurde nachgcwiosen, daf3 die paz nach 6tligiger Bebriitung in den blutbildenden Z:)llinsoln des Dottersackes und nach IItagiger BEbriitung in embryonalcn Gew"b" auftret.en, Be\·oI7.ugt,e Zdorgane sind Milz lmd Knochcnmal'k, obwohl zum gleichen Z~itpunkt aueh sehon vE'n'inzelt,e Z31lE'n im BindegewebC' des Embryos erseheimon. Die paz sind aueh in del' Rursa FABR1Cif nachwE'isbar, In del' Diskussion wird auf die miiglichc Beteiligung del' 'POZ an immllnologisehf'll Reaktionen hing,·wiesE'n.
Summary By mJans of the p\::n!oxi,hs;, reaetioll it would be shown that the POZ appear in haemopoctic cell islands of the yolk sac being hat,ched 6 days and being hatched Ii days, they appear in embryonary tissues. Favoured target organs aI''' the spleen and the bone marrow, though also at the same time can be seen some cells in the conneetive tissue of the embryo. paz can also be found in the bursa of FABRICIUS, The participation of the paz in immunological reactions is supposed.
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die Funktioncn del' im Bindegewebe verschiedener Species (SCHMIDT und
MODIS 1970, 1974; SCHMIDT 1971; SCHl\fiDT und STINTZ 1975) nachgewiesenen POZ
ist bisher nichts Sicheres bekannt. Einige Moglichkeiten wurden fruher (SCHl\fiDT und MODIS 1970, 1974) diskutiert. Es wllrde damals angcnommen, daB eine wandernde
Bindegewebszelle vorliegt. Diese Annahme wul'dc inzwischen dul'ch das Vel'halten del' POZ im Gebiet del' an Lichenificatio gigantea hypel'trophicans erkrankten mensch-
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H. SCH:VIIDT und L. M6D1s
lichen Raut (SCHMIDT, STINTZ und WOZNIAK, im Druck) bestatigt. Bei dieser Erkrankung treten POZ subepidermal gehauft auf und durchwandern offensichtlich auch das erkrankte Epithel, da sie direkt im Stratum corneum nachgewiesen werden konnen. Aus diesem Verhalten der POZ und den fur diese Erkrankung diskutierten atiologischen Faktoren sowie aus anderen, noch nicht verOffentlichten Befunden ergibt sich eine Bestatigung fur die schon seit langerer Zeit vermutete Beteiligung der POZ an immunologischen Prozessen. In den gegenwartigen Vorstellungen uber die Organisation der humoralen und gewebsabhangigen Immunabwehr spielen die sogenannten T- und B-Lymphocyten eineentscheidende Rolle (COOPER und LAWTON III 1974). Es wird postuliert, daB sich beide Zelltypen von den bisher nicht naher definierten hamatopoetischen Stammzellen im Dottersack herleiten. Bei Vogeln sollen diese Stammzellen vom Dottersack in das Knochenmark wandern und sich hier zu verschiedenen Blutzellen differenzieren. Jene Zellen, die am Ende ihrer Entwicklung Lymphocyten werden, bedurfen der weiteren Entwicklung auBerhalb des Knochenmarks. T-Lymphocyten sollen ihre Immunkompezenz im Thymus, B-Lymphocytenin der Bursa FABRICn (bei Vogeln) erhalten. Diese Vorstellungen zusammen mit den bereits oben angefUhrten Grunden gaben Veranlassung, das Verhalten der mittels der Phenoloxidase-Reaktion erkennbaren POZ bei der embryonalen Entwicklung des Huhnes zu untersuchen.
Material und Methoden Untsrsucht wurden 10 bis 20,um dicke Kryostatschnitte von 3, 6, 7, 9, 11, 13, 14, 15, 17, 18 und knapp 21 Tage bebriiteten Hiihnereiern1 ). Bis zum 14. Bebriitungstag wurden entweder der gemmte Embryo oder Teile des Embryos mit Dottersack geschnitten. Ab 15. Bebriitungstag wurden Lunge, Leber, Milz, Darm, Dottersack und Knochenmark des Embryos untersucht. Yom KnochEDmark wurden zumeist Fingerprints hergestellt. AuJ3erdEm wurdEn Schnitte ven Lunge, Leber, Milz und Darm 2 und 4 Tage alter Kiiken sowie 6 bis 8 Wochen alter HiihnchEn angefertigt. Bei den 4 Tage und 6 bis 8 Wochen alten Tieren wurden auJ3erdEm die BurEa FABRICII und das Knochem:nark prapariert. Der Nachweis der Phenoloxidase (PO) erfolgte nach SCHMIDT und M6DIS (1974) in der Modifikation von SCHMIDT und KISS (1975). Es wurden jeweils 1 Hauptversuch (HV) und 2 Kontrollversuche (KV1 und KV2 ) angesetzt. Beim KV1 wurde unter gleichEn Bedingungen wie beim HV, jedoch mit 10 min in 90 DC heiJ3em destilliertem Wasser inaktivierten Schnitten inkubiert. Der KV2 enthielt kein Substrat (L-DOPA). Die Inkubation erfolgte bei 37 DC Kiivetteninnentemperatur unter Beliiftung mittels Aquariumpumpe. Ein Teil der Schnitte wurde m.it Kresylechtviolett nech SCHMIDT (1965) gefarbt.
Ergebnisse Dottersack (Abb. Ibis 7) Die ersten POZ werden im Dottersack der 6 Tage bebriiteten Ruhnereier nachweisbar. Sie sind in der Nahe der sich formierenden oder auch in den Zellinseln selbst 1) Fiir die in Halle durchgefiihrten Untersuchungen wurden uns die bebriiteten Hiihnereier freundlicherweise von der G3fliigelzuchtanstalt (Leiterin: Frau KLENK) des VE Gutes Seeben zur Verfiigung gestellt, wofiir wir herzlich danken.
Das Vorkommen von Phenoloxidose
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SCHMIDT
und L. lVI6DIS
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Das Vorkomrnen H)n Phenoloxidasp
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lokalisiert, die als hiimatopoetisehe Stammzcllen angeschen werden. Die POZ sind zuniiehst noeh klein und enthalten nur wenig Reaktionsprodukt. In del' weiteren Entwieklung werden sic deutlieher siehtbar. ihre Anzahl steigt - soweit dies beurtcilt werden kann - ctwas an, und kurz VOl' del' Geburt bilden die POZ Zellgruppen innerhalb del' Zellinseln. Embryo (Abb. 8 his 31) 1m Embryo sPlbst kannen naeh Iltiigiger Bebriitung (Abb. 8 bis 10) die ersten POZ naehgewiesen werden. Relativ hiiufig werden sie in Milz und Knoehenmark, vereinzelt abel' aueh in Lunge und Leber gefunden. ~aeh 15tiigiger Bebriitung sind POZ in del' Milz (Abb. 11) in rciehlieher Anzahl vorhandcn, wiihrend Lunge und Leber weiterhin nul' einzelne Zellen enthalten. Eine au13crordentliche Zunahmc an POZ ist in Milz (Abb. 12) und Knochenmark (Abb. 17) nach 18tiigiger Behriitung festzustellen. Aueh die Lunge (Ahb. 16) und die tieferen Sehichten des Darm bindegcwebes (A bb. 14) cnthalten vermehrt, die Zotten voreinzelte (Abh. 1:3) ZeJlon, wiihrond die Leber (Abh. 15) naeh wie VOl' hauptsiiehlieh nul' einzeJne Zellcn aufweist. ~ur selten kannen kleinc Zellgruppen in del' Leber heobaehtet werden. Tn den bis kurz VOl" del' Geburt bebriiteten Embryonen ist die Hiiufigkeit del' Zellen in der Leber, Milz und Knoehenmark (Ahb. 18, HI, 21) iihnlieh wie naeh 18tiigiger Bebriitung. 1m Bindogewebe dol' Lunge (Abb. 20) ist die Anzahl del' POZ graDer gewordon. Tm Darmhindegewcbe ist die Hiiufigkeit untersehiedlieh: An manehen Stellen keine. an anderen Stellen zahlreiehc Zellen. Bei den 2 und 4 Tage sowie 6 bis 8 Woehen alten Hiihnehen besteht in etwa noeh das gleiehe Verteilungsbild del' POZ wie kurz VOl' del' Geburt. In del' am 4. Lehenstag untersuchten Bursa FABRICII sind zahlreiche POZ vorhandon (Abb. 22. 23). Sin sind in auffiilliger WeiRc in del' Umgebung del' Bursa-Follikel lokalisiert. vernillzeJte Zellen kcmmcn in den Follikeln VOl'. 1m Vergleieh mit del' Bursa am 4. Lebcllstag ellthiilt das 6 bis 8 Woehen alto Bursa-Gewebe trotz seiner GroBe nur noeh relativ wenige POZ (Abb. 24, 25). Die Lokalisation ist iihnlieh wie am 4. Lebellstag. Die Kontrollselmittc (KV1 und KV2 ) des Bursagewebes sind wie aile andcren Kontrollell llegativ (Ahb. 26. 27). Tn den Abbildungen 28 bis 31 sind die POZ in lVIilz. Lebel'. Lunge und Knochcnmark des 6 bis 8 Woehen alten Huhnes dargestellt .
Abb. I .- i.
2 :3 4
naeh nach mwh na"h
poz im Dou,']'"""k unt"nwhip(lli("h lungp bobriitekr Hiihmlreier. 6Uigiger !JUigiger IIUigigl'r l:ltiigigpr
Bebriltung. Bl'briitung. Rdll'iitnng. Bebriitung.
250: 250: l60: 250:
I I I
1
nach 15tagiger Bcbriitung. 250: I nach 18tiigiger Bebriiturg. 250: I 7 ~. naeh knapp 2ltagiger Bebriitung (20 Tage und 17 h). 63: 1. 5 6
Abb. 8. Einzehw POZ naeh 1 Itiigigel" Bebriitung. a im Bindegewebe des Darmes, b in del' Leber. a 500: 1; b 400: 1. 4*
52
Abb. 9. Abb. 10.
H. SCHMIDT und L. MODIS
M~hrere
POZ in der Milz nach 11tagiger Bebriitung. 400: 1.
M~hrere
POZ im Knochenmark nach 11tagiger Bebriitung. 160: 1.
Abb. 11. POZ in der Milz nach 15tagiger Bebriitung. 125: 1. Abb. 12. Stark vermehrte POZ in der Milz nach 18tagiger Bebriitung. 80: 1. Abb. 13. Einzelne POZ im Bindegewebe von Darmzotten nach 18tagiger Bebriitung. 100: 1. Abb. 14. Zahlreiche POZ im tieferen Bindegewebe des Darmes nach 18tagiger BebIiitung. 80: 1. Abb. 15. Einzelne POZ in der Leber nach 18tagiger Bebriitung. 400: 1. Abb. 16. Vormchrung dor POZ in der Lunge nach 18tagiger Bebriitung. 160: 1. Abb. 17. Starke Vermehrung der POZ im Knochenmark nach 18tagiger Bebriitung. 63: 1. Abb. 18. POZ in der Milz nach knapp 2ltagiger Bebriitung. Beginnende Anordnung der POZ urn die ~Iilzfollikel. 63 X . Abb. 19. Immer noch vereinzelte POZ in der Leber naoh knapp 2ltagiger Bebriitung. 63 x. Abb. 20. Zahlreiche POZ im Lungengewebe nach knapp 2ltiigiger Bebriitung. 80: 1. Abb.21. Sehr viele POZ im Knochenmark nach knapp 2ltagiger Bebriitung. 63: 1. Abb.22. POZ in der Bursa FABRICII am 4. Lebenstag. Betonte Lagerung in der Peripherie der Bursa·Follikel. 63: 1. Abb. 23. Wie Abb. 22. 250: 1. Abb.24. Gewebsbezirk in der 6 bis 8 Woehen alten Bursa FABRICII mit nur noeh wenigen POZ. 63: 1. Abb.23. Gewebsbezirk in der Bursa FABRICII des 6 bis 8 Woehen alten Huhnes mit noch mehreren POZ. Rechts im Bild: Bursa-Strukturen mit Grauschleier. Ob es sich dabei urn PO-Aktivitat handelt, ist bisher nicht erwiesen. 63: 1. Abb.26. Kontrolle zu Abb. 22-25, KV1 . 1m Bursa-Gewebe sind keine POZ nachweisbar. 63: 1. Ab':>.27. Kontrolle zu Abb. Reaktion. 63: 1.
22~25.
Nur mit Pufferliisung inkubierter Kontrollschnitt (KV 2)' Keine
Abb.28. POZ in der Milz des 6 bis 8 Wochen alten Huhnes. Typische Lokalisation urn die MALPIGHISchen Kiirp3rchen. 63: 1. Abb. 29. Einzelne POZ und Zellhaufen von POZ in der Leber des 6 bis 8 Wochen alten Huhnes. 160: 1. Abb. 30. Zahlreiche POZ in der Lunge des 6 bis 8 Wochen alten Huhnes. 100: 1. Abb. 31. Zahlreiche POZ im Knochenmark des 6 bis 8 Wochen alten Huhnes. 63: 1.
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V(ll'k(lI11ll1l'l\ \-011 Ph('noloxida~e
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Das VOJ'kommeIl Yon Phenoloxidase
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H. ScmnDT lind L. M:6DIS
Abb. 32. AuJ3erordentlich intensive PO-Reaktion in dem das transplantierte Kllorpelgcwebe urngebenden Bindegeweb3. Oben: aufgelockertJs, unten: kompaktes Binclegewebe. 63: 1. Abb. 33. VergroJ3erung eles 8ufgelockerten Billdegewebes. Die Zellform entspricht der "on Fibroblasten. Die Zellkerne geben eine positive PO-Reaktion. 400: l. Abb.34. VergroJ3erung des kompakten Bindegewebes. Das Reaktiollsprodukt ist anscheinend mehr im Cytosol der Zellen lokalisiert. 400: 1.
Diskussion Die Ergebnisse zeigen, daO es mit dem Ph3noloxidase-Nachweis moglich ist, den Weg der POZ bzw. das Verhalten dieser Z311en wahrend der cmbryonalen Entwicklung des Huhnes zu verfolgen. Aus den Untersuchungen ergibt sich folgendes Verhaltensbild: Zwischen 3. und 5. Bebriitungstag beginnen sich die POZ im Dottersack in oder in unmittelbarer Nahe der hematopoetischen Zellinseln zu entwickeln. Sie sind hier bis unmittelbar vor dem Geburtstermin nachweisbar, wobei sie sich offenbar in der letzten Entwicklungsphafe auch im Dottersack noch zu vermehren scheinen (s. Ahb. 7). In den embryonalen Geweben werden die ersten POZ nach lltagiger Bebriitung sichtbar. Milz und Knochenmark scheinen dabai bavorzugte Zielorgane zu sein, obwohl zurn gleichen Zeitpunkt auch schon vereinzelte Zellen im Bindegewebe des Embryos auftreten. Zwischen 15. und 18. Entwicklungstag des Embryos folgt dann eine intensive Vermehrung der POZ in Milz und Knochenmark, aber offensichtlich aue:h im Bindegewehe. In der Milz beginnt sich Zll diesem Zeitpunkt jenes Zustandsbild herauszubilden, wie es am geschliipften Tier zu beobachten ist, namlich eine strenge Anordnung der POZ urn die MALPIGHISchen Korperchen (SCHMIDT und M6DIS 1974). Die Haufigkeit der POZ im Knochenmark scheint nach dem 18. Bebriitungstag im beobachteten Entwicklungszeitraum keine wesentliche Veranderung zu erfahren. Ob dieser Zustand jedoch im weiteren Lebensverlauf des Huhnes unverandert bleibt oder nicht, bedarf noch der weiteren
Das Vorkommen von Phenoloxidase
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Unt,3l'suehung. B.>i erwachsenen Ratten kormten beispielsweise im Knochenmark keine POZ gefunden werden (SCHMIDT und M6nrs 1974). Hier konnen abel' aueh Speeiesunterschiede vorliegen, da zum BJispiel die L)ber 1,2 und 3 Tage alter Ratten (unverOffentliehte Ergebnisse) sehr viele, die des Huhnes nUl' wenige POZ enthiilt. 1m Bindegewebe del' Lunge ist die Vermehrung del' POZ zwischen IR. lIIHI 21. Bebriitungstag, also kurz VOl' del' Funktionsaufnahme, auffiillig. Infolgc del' schon eingangs erwahnten Bedeutung del' Bursa FABRICII bei den heutigen Vorstellungen iiber (lie Entwieklung immunkompetenter Zollen ist dom Verhalten del' POZ in diesem Organ bosonclere Aufnwrksamkeit zu widmen. Xach OLAH, RiiHLIcH und TiiRii (1975) entwiokolt sioh die Bursa in den erst on ;3 \Vochen naeh del' Geburt. Zwisehon 3. und 8. Woehe bleibt sie dann konstant, urn sieh danaeh zuriiekzubilden. Die Bursa \l'urdc somit zu Beginn ihrer Entwieklung (4. Lobenstag) und kurz \"rJl' ihrel' IIl\'olution (6 bis R \Voehen alt) untel'sucht. Dio Ergebnisse weisen aus, daE die Hiiufigkeit del' POZ in b2id(m Ent\l'ieklungsstadien vcrsehieden ist. Jm sioh entwickelnden Organ sind viole. im involutionsnahen Organ l,,'lativ wenige Zellen vorhanden. Diesel' Befund woist auf Beziehungen zwischen Hiillfigkeit del' I'OZ und Funktionszustand del' Bursa FABRICII hin. Aus clem dargdegten Verhalten del' I'OZ ]wi del' Entwieklung des Huhnos ergibt sieh, daE die POZ oino Z"llpoplliation sui generis darstellen, die in den blutbildenden Zellinseln des Dottersaekes enbteht un(I deren Entwicklungsgang sieh teilweise zu dem del' eingangs erwahnten '1'- und BLymphocyten in Beziehung setzen liif.Jt. Ais Konsequenz ergibt sieh daraus, daE zum Beispiel fUr dif' naeh einer Bursa-Exstirpation auftretenden immunologisehen Fehlleistungen aueh die POZ verantwortlich Selin k"nnen. Aus eigeIH'n, ZlllTt Tei! bisher unvoroffentliehten Untersuehungen haben sieh sehon zahlrpi('he Hinweise el'geben, dip flir pine Beteiligung del' POZ an immunologisehen ProZeSS"Il sprechen. ~o sind zum Belispiel im Granulationsgewebe, das bei del' Implantation von Deckgliisehen in die BalH·hhiihle \-on Ratten auftritt, zahlreicho POZ nachweis bar. Bei del' Liehenificatio gigantea hypcrtrophieans (~CH~llDT, STI~'l'Z und WOZXIAK) (im Druck), die als Reaktion del' Haut auf Chemikalien, Proteine, Bakterien odeI' Pilze angesohon wirel (LEVER 1958), sind, wie sehon erwiihnt, vermehrt POZ vOl'handcn. Aueh die beim Melanom naehgewicsenen POZ (SCHMIDT und STINTZ 1\)75) kbnnten als im Dienstc dc,; Immunsystems stehonde Zellen interpretiert werden, und sehlie/3liehliefern die zahlreichen bei del' Implantation von Rindernasenseheidewandknorpel in das subkutane Gewebe del' Hatte auftretenden POZ (Abb. :12 bis ;34) eincn direkten Nachweis fUr ihre Mitwirktmg bei del' Abwehl' (Killerzelle'!) von Fremdgewebe. Auf del' Basis del' gegenwiirtigen Kenntnisse iiber die 1'OZ und im Zusammenhang mit den Vorstellungen iiber (Ii" Entwieklung immunologisch aktiver Zellen el'seheint es nieht unmbglich, daE aueh die POZ cineI' Differenzierung llutel'liegen und in versehiedcncn Kompetenzbcreiehcn, wie bei del' gewcbsabhiingigen und humoralen Immunabwehr odeI' dcr Bildung von Granulationsgewebc, tMig Wpnlpll.
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