- Email: [email protected]
Détection des gènes ica et de la production de slime parmi des souches de Staphylococcus epidermidis isolées d'infections liées aux cathéters chez des patients neutropéniques
Pathologie Biologie 55 (2007) 277–282 http://france.elsevier.com/direct/PATBIO/
Article original
Détection des gènes ica et de la production de slime parmi des souches de Staphylococcus epidermidis isolées d’infections liées aux cathéters chez des patients neutropéniques Detection of ica genes and slime production in a collection of Staphylococcus epidermidis strains from catheter-related infections in neutropenic patients A. Touati, W. Achour, M.-S. Abbassi, A. Ben Hassen* Laboratoire de microbiologie, centre national de greffe de moelle osseuse, rue Djebel-Lakhdar, bab-Saadoun, 1006 Tunis, Tunisie Reçu le 3 décembre 2005 ; accepté le 9 mars 2007 Disponible sur internet le 29 mai 2007
Résumé La production de slime, principal facteur de virulence de Staphylococcus epidermidis impliqué dans les infections liées aux cathéters veineux centraux, est codée par l’opéron icaADBC dont l’expression est sujette à une variation de phase. La transposition réversible de l’élément IS256 au niveau de cet opéron est l’un des mécanismes les plus important de cette variation. Notre étude a comparé 28 souches de S. epidermidis responsables d’infections liées aux cathéters à 28 souches de portage nasal concernant la détection de slime sur milieu rouge Congo, la recherche des gènes ica et de l’élément IS256 par PCR. L’opéron ica a été présent parmi toutes les souches productrices de slime, et absent parmi les souches slime négatif. Seules 79 % des souches porteuses des gènes ica ont été productrices de slime et aucune insertion de la séquence IS256 n’a été détectée dans les gènes ica. Une différence significative a été retrouvée entre souches responsables d’infection et souches de portage en termes de résistance à l’oxacilline (67,8 contre 35,7 %) et à l’ofloxacine (75 contre 35,7 %), de production de slime (64,2 contre 28,5 %), de phénotype variable (46,4 contre 7,1 %) et de présence des gènes ica (82,1 contre 35,7 %). Notre étude démontre le rôle des gènes ica, de la variabilité phénotypique de la production de biofilm et de la multirésistance aux antibiotiques comme facteurs de virulence des souches de S. epidermidis responsables d’infections liés aux cathéters ; elle confirme également la complexité et la diversité des mécanismes régulateurs intervenant au cours de la formation de biofilm. © 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Abstract Slime production, principal virulence factor of Staphylococcus epidermidis associated with catheter-related infections is mediated by icaADBC operon wich expression is subject to phase variation. Reversible transposition of IS256 element into this operon is one of the most important mechanisms of biofilm phenotypic variation. Our study compared 28 S. epidermidis strains from catheter-related infection to 28 strains from nasal carriage concerning slime production on Congo red agar plate and ica genes and IS256 presence by PCR. ica operon was present among all slime-producing strains, and was absent among slime-negative strains. Only 79% of ica-positive strains were slime producers and no insertion of IS256 element was detected inside ica genes. A significative difference was found between catheter-related infections strains and commensal ones in terms of oxacillin (67,8 versus 35,7%) and ofloxacin resistance (75 versus 35,7%), slime production (64,2 versus 28,5%), phase variability (46,4 versus 7,1%) and ica genes presence (82,1 versus 35,7%). Our study demonstrates the role of ica genes, of phenotypic variability of slime production and antibiotic multiresistance as virulence factors of S. epidermidis associated with catheter-related infections; it confirms also the complexity and the diversity of regulation mechanisms implicated in biofilm formation. © 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
* Auteur
correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (A. Ben Hassen).
0369-8114/$ - see front matter © 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.patbio.2007.03.003
278
A. Touati et al. / Pathologie Biologie 55 (2007) 277–282
Mots clés : Staphylococcus epidermidis ; Biofilm ; Infections liées aux cathéters ; ica ; IS256 ; Slime ; PCR Keywords: Staphylococcus epidermidis; Biofilm; Catheter-related infections; ica; IS256; Slime; PCR
1. Introduction Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis), constituant normal de la microflore cutanée et muqueuse [1], est l’espèce la plus fréquemment isolée d’infections liées aux cathéters en raison de sa prédominance dans la flore commensale cutanée et sa capacité à adhérer à la surface des biomatériaux [2] grâce à la production de biofilm (ou slime) [3]. Ce biofilm permet à S. epidermidis d’échapper à l’activité des antibiotiques [4,5] et de contrecarrer la réponse immunitaire [6–8]. La formation du biofilm implique la production d’un polysaccharide extracellulaire ou PIA [9,10] responsable de l’établissement du contact interbactérien et de l’accumulation de ces bactéries en couches superposées [11]. La synthèse de ce polysaccharide dépend de l’expression de l’opéron chromosomique ica [12], qui comporte les quatre gènes de biosynthèse icaADBC nécessaires pour une expression maximale du PIA et le gène de régulation icaR [13]. La synthèse de biofilm est un processus variable sur le plan phénotypique et génotypique (facteurs de régulation, variation de phase, réarrangements chromosomiques, mutations…). L’un des mécanismes de variation de phase les plus décrits est l’insertion et l’excision alternative d’une séquence d’insertion IS256 (élément génétique mobile des cocci Gram positif localisé à l’extrémité du transposon Tn4001 porteur de la résistance aux aminoglycosides) [14] inactivant les gènes ica. Cette insertion se produit le plus souvent au niveau de icaC, rarement icaA ou icaB [15]. C’est un élément hautement actif, responsable d’une variété d’aberrations génétiques : inactivation réversible, réarrangement d’ADN, délétions chromosomiques affectant l’expression de certains gènes de virulence ou de résistance aux antibiotiques [16]. Les patients du Centre national de greffe de moelle osseuse présentent une pathologie oncohématologique lourde nécessitant la pose de cathéters veineux centraux indispensables pour l’administration de l’antibiothérapie, de la chimiothérapie, des produits sanguins et de l’alimentation parentérale. On se propose dans ce document d’étudier les souches de S. epidermidis responsables d’infections liées aux cathéters veineux centraux chez des patients immunodéprimés et de les comparer à des souches de portage afin de rechercher une association entre virulence, production de slime et présence des gènes ica chez S. epidermidis et de déterminer si la présence de la séquence d’insertion IS256 est responsable de la variation de phase (phénotype variable ou négatif) des souches cliniques ica positif. 2. Matériel et méthodes 2.1. Souches bactériennes Trois souches de référence ont été utilisées dans cette étude : S. epidermidis CIP106510 productrice de slime,
S. epidermidis CIP106299 non productrice de slime (mutagenèse par mitomycine C) et Enterococcus fæcalis E9, IS256 positif, portant le Tn4001 médiateur de la résistance à la gentamicine (Leclercq R. Caen). De mai 2002 à mai 2004, un total de 56 souches de S. epidermidis, isolées de patients neutropéniques hospitalisés au CNGMO, a été analysé : 28 souches virulentes responsables de 12 ILC chez 11 patients (un patient a présenté deux épisodes d’ILC) et 28 souches de portage issues de prélèvements de nez de patients ne présentant pas d’ILC. L’identification bactérienne a été réalisée par les méthodes conventionnelles (morphologie des colonies, coloration de Gram, production de catalase) et par le système ID32 STAPH (BioMérieux®). L’étude de la sensibilité aux antibiotiques a été réalisée par la méthode de diffusion sur milieu gélosé Mueller-Hinton (Sanofi Diagnostics Pasteur) selon les normes et les recommandations du comité de l’antibiogramme de la Société française de microbiologie (CA-SFM) [17]. 2.2. Détection de la production de slime sur milieu rouge Congo : [18] Le milieu a été préparé en additionnant 0,8 g de rouge Congo (Sigma) et 36 g de saccharose (laboratoires ChémiPharma) à 1 l de gélose cœur–cervelle (Sanofi-Diagnostics Pasteur), puis autoclavé à 115 °C pendant dix minutes. Il a été ensemencé avec une anse d’une suspension de S. epidermidis (une colonie dans 20 ml d’eau distillée). La lecture a été faite après une nuit d’incubation à 37 °C et 24 heures supplémentaires à température ambiante. Les souches productrices de slime donnaient des colonies noires à surface rugueuse contre des colonies rouges, à surface lisse pour les souches non productrices. Les souches de phénotype variable donnaient des colonies à centre noir et à contour rouge, ou à centre rouge et à contour noir. 2.3. Détection des gènes ica et de la séquence d’insertion IS256 Après extraction de l’ADN bactérien par lyse thermique, quatre PCR simplex spécifiques ont été réalisées pour l’amplification des gènes icaA, icaB, icaC et de la séquence d’insertion IS256 en utilisant les séquences d’amorces décrites par Ziebuhr et al. [19]. Les concentrations finales utilisées pour la préparation d’un tube réactionnel ont été [20] : 0,5 μM pour chacune des amorces, 200 μM pour chaque dNTP (Amersham Biosciences), 2,5 mM de MgCl2 (Sigma), 2 U de Taq polymérase (Promega) et 1 X du tampon d’enzyme (Promega). Le mélange réactionnel a été complété par de l’eau ultrapure stérile pour obtenir un volume final de 50 μl en tenant compte des 5 μl d’ADN à ajouter. L’amplification a été effectuée dans un appareil pro-
A. Touati et al. / Pathologie Biologie 55 (2007) 277–282
grammable à blocs chauffant–refroidissant (Perkin Elmer 9700 Applied Biosystemes). La révélation a été réalisée par électrophorèse sur un gel d’agarose (Sigma) à 1,5 %. La taille des fragments de migration a été estimée par un marqueur de taille moléculaire de 100 pb (Amersham Pharmacia). 2.4. Analyse statistique La comparaison des fréquences observées a été validée par le test Khi2 (χ2). Un χ2 supérieur à 3,84 correspond à un risque de 5 %. La différence est significative et le degré de signification p est fixé par le risque α lu dans le tableau de χ2 pour un degré de liberté égal à 1 [21]. 3. Résultats 3.1. Sensibilité aux antibiotiques Les souches responsables d’infection ont présenté des taux élevés de résistance à toutes les familles d’antibiotiques sauf aux glycopeptides. Les souches isolées d’ILC étaient significativement plus résistantes à l’oxacilline et à l’ofloxacine par rapport à celles de portage (Tableau 1). 3.2. Production de slime sur milieu rouge Congo La recherche de slime a montré que 64,2 % (n = 18) des souches responsables d’ILC ont été productrices de slime contre 28,5 % (n = 8) des souches de portage. Les souches productrices de slime avaient un phénotype variable ou positif. Ces phénotypes ont été respectivement de 46,4 % (n = 13) et 17,8 % (n = 5) parmi les souches isolées d’ILC ; et de 7,1 % (n = 2) et 21,4 % (n = 6) parmi les souches de colonisation. Les souches d’ILC avaient significativement plus le phénotype slime variable (p < 0,02) que les souches commensales alors que les souches de portage avaient significativement plus le phénotype slime négatif (p < 0,01) que les souches associées aux ILC (respectivement 71,4 et 35,7 %) (Tableau 2).
279
Tableau 2 Fréquence de slime, des gènes ica et de l’IS256 parmi les souches de S. epidermidis
Souches productrices de slime Phénotype positif Phénotype variable
Souches isolées d'ILC 18 (64,2 %) 5 (17,8 %) 13 (46,4 %)
Souches de portage 8 (28,5 %) 6 (21,4 %) 2 (7,1 %)
Total 26 11 15
Souches non productrices de slime ica positif IS256 positif
10 (35,7 %) 23 (82,1 %) 17 (60,7 %)
20 (71,4 %) 10 (35,7 %) 12 (42,8 %)
30 33 29
3.3. Recherche des gènes ica L’amplification a donné un fragment de 814 pb pour le gène icaA, 526 pb pour le gène icaB et 989 pb pour le gène icaC (Fig. 1). Parmi les 56 souches de S. epidermidis étudiées, 23 souches isolées d’ILC et dix souches de colonisation avaient une amplification PCR positive des trois gènes. Les gènes ica ont été significativement plus prévalents parmi les souches isolées d’ILC (82,1 %) que les souches de portage (35,7 %) [p < 0,001] (Tableau 2). 3.4. Amplification de la séquence d’insertion IS256 L’amplification de la séquence d’insertion IS256 a été positive (produit de 1102 pb) (Fig. 2) chez 60,7 % des souches isolées d’ILC (17/28) et 42,8 % des souches de colonisation (12/28), la différence entre les deux fréquences n’était pas significative (p < 0,3) (Tableau 2). L’étude de la sensibilité à la gentamicine a montré que 96 % (24/25) des souches de S. epidermidis résistantes à cet antibiotique avaient la séquence d’insertion IS256 (p < 0,001) alors que cinq de nos souches (une souche de colonisation et quatre souches d’ILC) hébergeant cette séquence n’étaient pas résis-
Tableau 1 Taux de résistance aux antibiotiques des souches de S. epidermidis Souches Souches de p* Différence d'ILC colonisation n = 28 (%) n = 28 (%) Oxacilline 19 (67,8) 10 (35,7) < 0,02 S Gentamicine 13 (46,4) 12 (42,8) < 0,50 NS Érythromycine 11 (39,2) 13 (46,4) < 0,50 NS Rifampicine 12 (42,8) 10 (35,7) < 0,50 NS Ofloxacine 21 (75) 10 (35,7) < 0,01 S Tétracycline 5 (17,8) 10 (35,7) < 0,10 NS Cotrimoxazole 12 (42,8) 7(25) < 0,20 NS Fosfomycine 6 (21,4) 6 (21,4) – – Acide fusidique 16 (57,1) 10 (35,7) < 0,10 NS * p : probabilité que les fréquences de résistance soient significativement différentes chez les groupes étudiés, déterminés par la loi de χ2. S : significative, NS : non significative.
Fig. 1. Résultats de l’électrophorèse de l’amplification PCR des gènes ica d’une souche de S. epidermidis isolées d’ILC et de la souche de référence. Puits 1 : marqueur de taille 100 pb, puits 2–4 : S. epidermidis 5878 respectivement icaA, icaB et icaC positif, puits 5–7 : S. epidermidis CIP106510 icaA, icaB et icaC positif, 8 : témoin négatif.
280
A. Touati et al. / Pathologie Biologie 55 (2007) 277–282
Fig. 2. Résultats de l’électrophorèse de l’amplification PCR IS256 de cinq souches de S. epidermidis et de la souche de référence. Puits 1 : marqueur de taille 100 pb, puits 2 : S. epidermidis 4100b IS256 positif, puits 3 : S. epidermidis 4248a IS256 positif, puits 4 : S. epidermidis 4597a IS256 négatif, puits 5 : S. epidermidis 4597b IS256 positif, puits 6 : S. epidermidis 4636a IS256 négatif, puits 7 : témoin négatif, puits 8 : Enterococcus fæcalis E9 : témoin positif.
tantes à la gentamicine. Une seule souche parmi les 27 souches dépourvues de l’élément IS256 était résistante à la gentamicine. 4. Discussion De mai 2002 à mai 2004, 39 infections liées aux cathéters ont été observées suite à la mise en place de 213 cathéters veineux centraux. L’incidence globale des ILC a été de 5,5 pour 1000 journées-cathéters [22]. Dans la littérature, elle est comprise entre 2 et 11 pour 1000 journées-cathéters [23–25]. Les souches de S. epidermidis isolées d’ILC ont été différentes des souches de colonisation en termes de production de slime (64,2 contre 28,5 %), de présence des gènes ica (82,1 contre 35,7 %) et de résistance à l’oxacilline (67,8 contre 35,7 %) et à l’ofloxacine (75 contre 35,7 %). La haute prévalence de la production de slime parmi les souches isolées d’ILC associée à la présence des gènes ica au sein de cette population suggère le rôle de ce facteur de virulence dans les infections liées aux cathéters. En effet, le biofilm est un système de protection de la bactérie vis-à-vis des conditions défavorables de l’environnement. Cette protection concerne aussi bien les défenses immunitaires que le traitement antimicrobien chimique (antibiotique, antiseptique, désinfectant…) ou physique (UV, pression osmotique…) [26]. Les gènes du locus ica sont strictement liés les uns autres, et ce, pour toutes les souches étudiées : les trois gènes sont soit présents, soit absents. L’opéron ica a été amplifié chez 82,1 % de nos souches responsables d’ILC. Des taux de 68,2 à 94 % sont rapportés dans d’autres études [2,20,27,28]. Toutes les souches productrices de slime avaient l’opéron ica et toutes les souches dépourvues de ce locus étaient slime
négatif. Cependant, parmi les 33 souches porteuses de l’opéron ica, seules 26 (79 %) étaient productrices de slime. Ce taux est de 59 % au Royaume-Uni [29] et de 86 % en Italie [15]. La production de slime est sous la dépendance de l’opéron ica et l’expression de ces gènes est soumise à une régulation complexe. Le caractère variable a été particulièrement retrouvé parmi les souches isolées d’ILC. En effet, parmi les 15 souches de phénotype variable, 13 étaient des souches responsables d’infection et deux des souches de portage. La variation de phase, mettant en jeu des mécanismes divers et complexes chez S. epidermidis, est une stratégie qui lui permet de se détacher du biofilm et de se disséminer pour infecter d’autres tissus [29]. En effet, la variation de l’expression des gènes de virulence, retrouvée chez les organismes pathogènes, permet à ces bactéries de survivre et de s’adapter rapidement aux conditions hostiles de l’environnement [30]. La séquence d’insertion a été retrouvée chez 60,7 % de nos souches isolées d’ILC contre 42,8 % des souches commensales et l’analyse statistique n’a pas révélé de différence significative entre ces taux. Dans une étude allemande, la séquence d’insertion IS256 est significativement plus prévalente parmi les souches responsables d’ILC (70 contre 4 %) [27]. Une association a été retrouvée entre présence de l’IS256 et résistance à la gentamicine : 96 % (24/25) de nos souches résistantes à la gentamicine possédaient la séquence d’insertion IS256 et 96 % (26/27) des souches dépourvues de l’IS256 étaient sensibles à la gentamicine. En effet, la séquence d’insertion IS256 borde les extrémités du transposon Tn4001 qui porte le gène de la résistance à la gentamicine codant pour l’enzyme bifonctionnelle AAC (6’)-APH (2’’) (Fig. 3a). Cinq de nos souches hébergeaient la séquence IS256 sans pour autant être résistantes à la gentamicine. Cette séquence peut aussi exister sous forme de multiples copies libres dans le génome des staphylocoques indépendantes du Tn4001 [31]. Aucune insertion de l’élément IS256 n’a été détectée dans le locus ica puisque tous les produits PCR ica étaient de tailles prédites indiquant ainsi un locus ica intact. Le même résultat a été également retrouvé dans une étude récente en Italie [15]. L’insertion de l’élément IS256 est à l’origine du phénotype variable ou négatif des souches ica positif dans l’étude de Ziebuhr et al. [19]. Cette inactivation des gènes ica est réversible
Fig. 3. a. Schéma du transposon Tn4001 bordé par deux séquences d’insertion IS256. b. Représentation schématique des sites d’insertion de la IS256 au niveau de l’opéron ica des souches de S. epidermidis en variation de phase [19].
A. Touati et al. / Pathologie Biologie 55 (2007) 277–282
et restaure complètement la capacité de produire le PIA [32], elle survient chez 25–30 % des variants (Fig. 3b) [33,34]. Conlon et al. ont démontré que l’insertion de cet élément en dehors du locus ica peut aussi affecter la transcription de cet opéron. Cette équipe a trouvé que chez 11,6 % des variants, la diminution de l’expression des gènes ica était associée avec l’insertion de la séquence IS256 dans le gène activateur de l’opéron sigma : rsbU. Cette étude démontre que la seule présence de cette séquence d’insertion dans le génome est associée avec une plus grande capacité de variation phénotypique chez S. epidermidis et insiste sur le potentiel des éléments transposables à influencer entre autres la flexibilité génétique et la virulence des micro-organismes Gram-positif [35]. La fréquence élevée de résistance aux antibiotiques parmi les souches responsables d’ILC est associée à une forte pression de sélection antibiotique. L’organisation multicellulaire des bactéries en biofilm leur confère l’avantage d’acquérir de nouveaux gènes. Le biofilm constitue un milieu parfait pour l’échange de plasmides de résistance [36]. L’importance du transfert horizontal d’éléments génétiques dans cet environnement est liée à la grande probabilité de contact entre les cellules et à l’effet négligeable des forces hémodynamiques évitant l’interruption de ce contact [37]. Les staphylocoques à coagulase négative ont été en tête des germes responsables d’ILC dans notre centre (16/39), en particulier S. epidermidis (75 % des SCN). En France, ce germe représente 82,5 % des SCN isolés d’infections liées aux cathéters [38]. Aux États-Unis, il est la cause de plus de 50 % des infections liées aux biomatériaux [39], de 33,5 % de bactériémies associées aux ILC [40], et de 25 % de celles observées chez les greffés de moelle osseuse [41]. Ces ILC peuvent aboutir jusqu’à 40 % d’ablation des cathéters [42]. Les souches de S. epidermidis isolées d’ILC ont présenté des taux élevés de résistance aux différentes familles d’antibiotiques sauf aux glycopeptides. Elles ont été significativement plus résistantes à l’oxacilline (67,8 contre 35,7 %) et à l’ofloxacine (75 contre 35,7 %) que les souches de portage. Au Royaume-Uni, ces souches sont significativement plus résistantes à l’oxacilline (46 %), à l’ofloxacine (91 %) et à la rifampicine (82 %) [29], alors qu’en Allemagne elles sont plus résistantes à l’oxacilline (83 %) et à la gentamicine (87 %) [27]. De même, dans une étude hollandaise, ces souches sont significativement plus résistantes (p < 0,001) à la tobramycine, la gentamicine, le cotrimoxazole, l’érythromycine et la ciprofloxacine [43]. La production de slime a été significativement plus importante parmi les souches responsables d’infections (64,2 %) par rapport aux souches de portage (28,5 %). Cette différence entre les deux populations est aussi retrouvée dans d’autres études : 85 contre 6 % [28], 51,8 contre 27,8 % [43], 62,9 contre 8,6 % [2], 48,5 contre 0 % [44] et 87 contre 6,5 % [27]. La fréquence de production de slime parmi les souches de portage varie dans les études de 0 à 27,8 %. Cette différence de fréquence est attribuée à la nature de l’échantillonnage de ces souches et au choix des malades, elle est basse lorsque les souches sont isolées chez des volontaires sains et élevée lorsqu’elles proviennent de patients hospitalisés. Dans notre étude, le taux assez
281
élevé (28,5 %) est observé parmi des souches isolées de malades hospitalisés en oncohématologie. 5. Conclusion Dans notre étude, la présence des gènes ica, la variabilité phénotypique de la production de biofilm et la multirésistance aux antibiotiques ont été significativement associées à la virulence des souches de S. epidermidis responsables d’ILC leur conférant un avantage sélectif et une grande capacité d’adaptation. L’insertion de l’élément IS256 dans le locus ica, mécanisme fréquemment impliqué dans la variation de phase, n’a pas été retrouvée parmi nos souches confirmant la complexité et la diversité des mécanismes régulateurs intervenant au cours de ce phénomène. Références [1] Kloos WE, Bannerman TL. Update on clinical significance of coagulasenegative staphylococci. Clin Microbiol Rev 1994;7(1):117–40. [2] Galdbart JO, Allignet J, Tung H-S, Rydèn C, El Solh N. Screening for Staphylococcus epidermidis markers discriminating between skin flora strains and those responsible for infection of joint protheses. J Infect Dis 2000;182:351–5. [3] Greenberg EP. Bacterial communication and group behaviour. J Clin Invest 2003;112(9):1288–90. [4] König C, Schwank S, Blaser J. Factors compromising antibiotic activity against biofilms of Staphylococcus epidermidis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2001;20:20–6. [5] Donlan RM, Costerton JW. Biofilms: survival mecanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev 2002;15(2):167–93. [6] Heinzelmann M, Herzig DO, Swain B, Mercer-Jones MA, Bergamini TM, Polk Jr. CP. Phagocytosis and oxidative-burst response of planctonic Staphylococcus epidermidis RP62A and its non-slime-producing variant in human neutrophils. Clin Diagn Labo Immunol 1997;4(6): 705–10. [7] Johnson GM, Lee DA, Regelmann WE, Gray ED, Peters G, Quie PG. Interference with granulocyte function by Staphylococcus epidermidis slime. Infect Immun 1986;54(1):13–20. [8] Costerton JW, Veeh R, Shirtliff M, Pasmore M, Post C, Ehrich G. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. J Clin Invest 2003;112:1466–77. [9] Ziebuhr W, Lößner I, Krimmer V, Hacker J. Methods to detect and analyse phenotypic variation in biofilm-forming staphylococci. Methods Enzymol 2001;336:195–203. [10] Mack D, Fischer W, Korbotsch A, Leopold K, Hartmann R, Egge H, et al. The intercellular adhesin involved in biofilm accumulation of Staphylococcus epidermidis is a linear β-1,6-linked glucosaminoglycan: Purification and structural analysis. J Bacteriol 1996;178(1):175–83. [11] Rachid S, Ohlsen K, Witte W, Hacker J, Ziebuhr W. Effect of subinhibitory antibiotic concentrations on polysaccharide intercellular adhesin expression in biofilm-forming Staphylococcus epidermidis. Antimicrob Agents Chemother 2000;44(12):3357–63. [12] Dobinsky S, Kiel K, Rohde H, Bartscht K, Knobloch J-M, Horstkotte MA, et al. Glucose-related dissociation between icaADBC transcription and biofilm expression by Staphylococcus epidermidis: Evidence for an additional factor required for Polysaccharide Intercellular Adhesin synthesis. J Bacteriol 2003;185(9):2879–86. [13] Fey PD, Ulphani JS, Götz F, Heilmann C, Mack D, Rupp ME. Characterization of the relationship between Polysaccharide Intercellular Adhesin and hemagglutination in Staphylococcus epidermidis. J Infect Dis 1999; 179:1561–4. [14] O’Gara JP, Humphreys H. Staphylococcus epidermidis and biofilms: importance and implication. J Med Microbiol 2001;50:582–7. [15] Arciola CR, Campoccia D, Gamberini S, Rizzi S, Donati ME, Baldassari L, et al. Search for the insertion element IS256 within the ica locus of
282
[16]
[17] [18]
[19]
[20]
[21]
[22]
[23]
[24]
[25]
[26]
[27]
[28]
[29]
A. Touati et al. / Pathologie Biologie 55 (2007) 277–282 Staphylococcus epidermidis clinical isolates from biomaterial-associated infections. Biomaterials 2004;25:4117–25. Loessner I, Dietrich K, Dittrich D, Hacker J, Ziebuhr W. Transposasedependent formation of circular IS256 derivates in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus. J Bacteriol 2002;184(17):4709–14. Soussy CJ. Comité de l’antibiogramme de la Société française de microbiologie. Communiqué 2004. Édition janvier 2004:32–34. Freeman DJ, Falkiner FR, Keane CT. New method for detecting slime production by coagulase negative staphylococci. J Clin Pathol 1989;42: 872–4. Ziebuhr W, Krimmer V, Rachid S, Lößner I, Götz F, Jörg H. A novel mechanism of phase variation of virulence in Staphylococcus epidermidis: evidence for control of the polysaccharide intercellular adhesions synthesis by alternating insertion and excision of the insertion sequence element IS256. Mol Microbiol 1999;32(2):345–56. Frebourg NB, Lefebvre S, Baert S, Lemeland JF. PCR based assay for discrimination between invasive and contaminating staphylococci. J Clin Microbiol 2000;38(2):877–80. Schwartz D. In: Le test χ2 et la comparaison de plusieurs répartitions observées. In: Méthodes statistiques à l’usage des médecins et des biologistes. Flammarion Médecine-Sciences. 4e édition; 1994. p. 67–88. Abdelkefi A, Achour W, Torjman L, Ben Othman T, Ladeb S, Lakhal A, et al. Difference in time to positivity is useful for the diagnosis of catheter-related-blood stream infection in hematopoietic cell transplant recipients. Bone Marrow Transplant 2005;35:397–401. Groeger JS, Lucas AB, Thaler HT, Friedlander-Klar H, Brown AE, Kiehlen TE, et al. Infectious morbidity associated with long-term use of venous access devices in patients with cancer. Ann Intern Med 1993; 119:1168–74. Keung YK, Watkins K, Chen SC, Groshen S, Levine AM, Douer D. Increased incidence of central venous catheter-related infections in bone marrow transplant patients. Am J Clin Oncol 1995;18:469–74. Nouwen JL, Van Belkum A, de Marie S, Sluijs J, Wielenga JJ, Kluytmans JAJW, et al. Clonal expansion of Staphylococcus epidermidis causing Hickman catheter related infection in an hemato-oncologic departement. J Clin Microbiol 1998;36(9):2696–702. Adam B, Baillie GS, Douglas LJ. Mixed species biofilms of Candida albicans and Staphylococcus epidermidis. J Med Microbiol 2002; 51:344–9. Kozitskaya S, Cho S-H, Dietrich K, Marre R, Naber K, Ziebuhr W. The bacterial insertion sequence IS256 occurs preferentially in nosocomial Staphylococcus epidermidis isolates: association with biofilm formation and resistance to aminoglycosides. Infect Immun 2004;72(2):1210–5. Ziebuhr W, Heilmann C, Götz F, Meyer P, Wilms K, Straube E, et al. Detection of intercellular adhesion gene cluster (ica) and phase variation in Staphylococcus epidermidis blood culture strains and mucosal isolates. Infect Immun 1997;65(3):890–6. Silva (de) GDI, Kantzanou M, Justice A, Massey RC, Wilkinson AR, Day NPJ, et al. The ica operon and biofilm production in coagulasenegative staphylococci associated with carriage and disease in neonatal intensive care unit. J Clin Microbiol 2002;40(2):382–8.
[30] Filloux A, Vallet I. Biofilm: mise en place et organisation d’une communauté bactérienne. Med Sci (Paris) 2003;19:77–83. [31] Deplano A, Vaneechoutte M, Verschreagen G, Struelens MJ. Typing of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis strains by PCR analysis of inter-IS256 spacer lengh polymorphisms. J Clin Microbiol 1997;35(10):2580–7. [32] Dunne Jr. WM. Bacterial adhesion: seen any good biofilms lately. Clin Microbiol Rev 2002;15(2):155–66. [33] Conlon KM, Humphreys H, O’Gara JP. icaR encodes a transcriptional repressor involved in environmental regulation of ica operon expression and biofilm formation in Staphylococcus epidermidis. J Bacteriol 2002; 184(16):4400–8. [34] Knobloch J-M, Horstkotte MA, Rohde H, Kauflers PM, Mack D. Alcoholic ingredients in skin disinfectants increase biofilm expression of Staphylococcus epidermidis. J Antimicrob Chemother 2002;49:683–7. [35] Conlon KM, Humphreys H, O’Gara JP. Inactivation of rsbU and sarA by IS256 represent a novel mechanisms of biofilm phenotypic variation in Staphylococcus epidermidis. J Bacteriol 2004;86(18):6208–19. [36] Watnick P, Kolter R. Biofilm: city of microbes. J Bacteriol 2000;182 (10):2675–9. [37] Donlan RM. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin Infect Dis 2001;33:1387–92. [38] Frebourg NB, Cauliez B, Lemeland JF. Evidence for nasal carriage of methicillin resistant colonizing intravascular devices. J Clin Microbiol 1999;37(4):1182–5. [39] Rupp ME, Archer GL. Coagulase-negative staphylococci: pathogens associated with medical progress. Clin Infect Dis 1994;19:231–45. [40] Rupp ME, Ulphani JS, Fey PD, Mack D. Characterization of Staphylococcus epidermidis PIA/Hemagglutination in the pathogenesis of intravascular catheter-associated infection in a rat model. Infect Immun 1999;67(5):2656–9. [41] Donlan RM, Murga R, Bell M, Toscano CM, Carr JH, Novicki TJ, et al. Protocol for detection of biofilms on needleless connectors attached to central venous catheters. J Clin Microbiol 2001;39(2):750–3. [42] Bakker J, Van Overhagen H, Wielenga JJ, de Marie S, Nouwen J, de Ridder MA, et al. Infectious complications of radiologically inserted Hickman catheters in patients with hematologic disorders. Cardiovasc Intervent Radiol 1998;21:116–21. [43] Mulder JG, Degener JE. Slime production properties of coagulasenegative staphylococci isolated from blood cultures. Clin Microbiol Infect 1998;4:689–94. [44] Arciola CR, Baldassari L, Montanaro L. Presence of icaA and icaD and slime production in a collection of staphylococcal strains from catheterassociated infection. J Clin Microbiol 2001;39(6):2151–6.
Glossaire PIA ica CNGMO ILC SCN
polysaccharide intercellular adhesin. intercellular adhesion. Centre national de greffe de moelle osseuse. infections liées aux cathéters veineux centraux. Staphylocoques à coagulase négative.
Article original
Détection des gènes ica et de la production de slime parmi des souches de Staphylococcus epidermidis isolées d’infections liées aux cathéters chez des patients neutropéniques Detection of ica genes and slime production in a collection of Staphylococcus epidermidis strains from catheter-related infections in neutropenic patients A. Touati, W. Achour, M.-S. Abbassi, A. Ben Hassen* Laboratoire de microbiologie, centre national de greffe de moelle osseuse, rue Djebel-Lakhdar, bab-Saadoun, 1006 Tunis, Tunisie Reçu le 3 décembre 2005 ; accepté le 9 mars 2007 Disponible sur internet le 29 mai 2007
Résumé La production de slime, principal facteur de virulence de Staphylococcus epidermidis impliqué dans les infections liées aux cathéters veineux centraux, est codée par l’opéron icaADBC dont l’expression est sujette à une variation de phase. La transposition réversible de l’élément IS256 au niveau de cet opéron est l’un des mécanismes les plus important de cette variation. Notre étude a comparé 28 souches de S. epidermidis responsables d’infections liées aux cathéters à 28 souches de portage nasal concernant la détection de slime sur milieu rouge Congo, la recherche des gènes ica et de l’élément IS256 par PCR. L’opéron ica a été présent parmi toutes les souches productrices de slime, et absent parmi les souches slime négatif. Seules 79 % des souches porteuses des gènes ica ont été productrices de slime et aucune insertion de la séquence IS256 n’a été détectée dans les gènes ica. Une différence significative a été retrouvée entre souches responsables d’infection et souches de portage en termes de résistance à l’oxacilline (67,8 contre 35,7 %) et à l’ofloxacine (75 contre 35,7 %), de production de slime (64,2 contre 28,5 %), de phénotype variable (46,4 contre 7,1 %) et de présence des gènes ica (82,1 contre 35,7 %). Notre étude démontre le rôle des gènes ica, de la variabilité phénotypique de la production de biofilm et de la multirésistance aux antibiotiques comme facteurs de virulence des souches de S. epidermidis responsables d’infections liés aux cathéters ; elle confirme également la complexité et la diversité des mécanismes régulateurs intervenant au cours de la formation de biofilm. © 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Abstract Slime production, principal virulence factor of Staphylococcus epidermidis associated with catheter-related infections is mediated by icaADBC operon wich expression is subject to phase variation. Reversible transposition of IS256 element into this operon is one of the most important mechanisms of biofilm phenotypic variation. Our study compared 28 S. epidermidis strains from catheter-related infection to 28 strains from nasal carriage concerning slime production on Congo red agar plate and ica genes and IS256 presence by PCR. ica operon was present among all slime-producing strains, and was absent among slime-negative strains. Only 79% of ica-positive strains were slime producers and no insertion of IS256 element was detected inside ica genes. A significative difference was found between catheter-related infections strains and commensal ones in terms of oxacillin (67,8 versus 35,7%) and ofloxacin resistance (75 versus 35,7%), slime production (64,2 versus 28,5%), phase variability (46,4 versus 7,1%) and ica genes presence (82,1 versus 35,7%). Our study demonstrates the role of ica genes, of phenotypic variability of slime production and antibiotic multiresistance as virulence factors of S. epidermidis associated with catheter-related infections; it confirms also the complexity and the diversity of regulation mechanisms implicated in biofilm formation. © 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés.
* Auteur
correspondant. Adresse e-mail : [email protected] (A. Ben Hassen).
0369-8114/$ - see front matter © 2007 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. doi:10.1016/j.patbio.2007.03.003
278
A. Touati et al. / Pathologie Biologie 55 (2007) 277–282
Mots clés : Staphylococcus epidermidis ; Biofilm ; Infections liées aux cathéters ; ica ; IS256 ; Slime ; PCR Keywords: Staphylococcus epidermidis; Biofilm; Catheter-related infections; ica; IS256; Slime; PCR
1. Introduction Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis), constituant normal de la microflore cutanée et muqueuse [1], est l’espèce la plus fréquemment isolée d’infections liées aux cathéters en raison de sa prédominance dans la flore commensale cutanée et sa capacité à adhérer à la surface des biomatériaux [2] grâce à la production de biofilm (ou slime) [3]. Ce biofilm permet à S. epidermidis d’échapper à l’activité des antibiotiques [4,5] et de contrecarrer la réponse immunitaire [6–8]. La formation du biofilm implique la production d’un polysaccharide extracellulaire ou PIA [9,10] responsable de l’établissement du contact interbactérien et de l’accumulation de ces bactéries en couches superposées [11]. La synthèse de ce polysaccharide dépend de l’expression de l’opéron chromosomique ica [12], qui comporte les quatre gènes de biosynthèse icaADBC nécessaires pour une expression maximale du PIA et le gène de régulation icaR [13]. La synthèse de biofilm est un processus variable sur le plan phénotypique et génotypique (facteurs de régulation, variation de phase, réarrangements chromosomiques, mutations…). L’un des mécanismes de variation de phase les plus décrits est l’insertion et l’excision alternative d’une séquence d’insertion IS256 (élément génétique mobile des cocci Gram positif localisé à l’extrémité du transposon Tn4001 porteur de la résistance aux aminoglycosides) [14] inactivant les gènes ica. Cette insertion se produit le plus souvent au niveau de icaC, rarement icaA ou icaB [15]. C’est un élément hautement actif, responsable d’une variété d’aberrations génétiques : inactivation réversible, réarrangement d’ADN, délétions chromosomiques affectant l’expression de certains gènes de virulence ou de résistance aux antibiotiques [16]. Les patients du Centre national de greffe de moelle osseuse présentent une pathologie oncohématologique lourde nécessitant la pose de cathéters veineux centraux indispensables pour l’administration de l’antibiothérapie, de la chimiothérapie, des produits sanguins et de l’alimentation parentérale. On se propose dans ce document d’étudier les souches de S. epidermidis responsables d’infections liées aux cathéters veineux centraux chez des patients immunodéprimés et de les comparer à des souches de portage afin de rechercher une association entre virulence, production de slime et présence des gènes ica chez S. epidermidis et de déterminer si la présence de la séquence d’insertion IS256 est responsable de la variation de phase (phénotype variable ou négatif) des souches cliniques ica positif. 2. Matériel et méthodes 2.1. Souches bactériennes Trois souches de référence ont été utilisées dans cette étude : S. epidermidis CIP106510 productrice de slime,
S. epidermidis CIP106299 non productrice de slime (mutagenèse par mitomycine C) et Enterococcus fæcalis E9, IS256 positif, portant le Tn4001 médiateur de la résistance à la gentamicine (Leclercq R. Caen). De mai 2002 à mai 2004, un total de 56 souches de S. epidermidis, isolées de patients neutropéniques hospitalisés au CNGMO, a été analysé : 28 souches virulentes responsables de 12 ILC chez 11 patients (un patient a présenté deux épisodes d’ILC) et 28 souches de portage issues de prélèvements de nez de patients ne présentant pas d’ILC. L’identification bactérienne a été réalisée par les méthodes conventionnelles (morphologie des colonies, coloration de Gram, production de catalase) et par le système ID32 STAPH (BioMérieux®). L’étude de la sensibilité aux antibiotiques a été réalisée par la méthode de diffusion sur milieu gélosé Mueller-Hinton (Sanofi Diagnostics Pasteur) selon les normes et les recommandations du comité de l’antibiogramme de la Société française de microbiologie (CA-SFM) [17]. 2.2. Détection de la production de slime sur milieu rouge Congo : [18] Le milieu a été préparé en additionnant 0,8 g de rouge Congo (Sigma) et 36 g de saccharose (laboratoires ChémiPharma) à 1 l de gélose cœur–cervelle (Sanofi-Diagnostics Pasteur), puis autoclavé à 115 °C pendant dix minutes. Il a été ensemencé avec une anse d’une suspension de S. epidermidis (une colonie dans 20 ml d’eau distillée). La lecture a été faite après une nuit d’incubation à 37 °C et 24 heures supplémentaires à température ambiante. Les souches productrices de slime donnaient des colonies noires à surface rugueuse contre des colonies rouges, à surface lisse pour les souches non productrices. Les souches de phénotype variable donnaient des colonies à centre noir et à contour rouge, ou à centre rouge et à contour noir. 2.3. Détection des gènes ica et de la séquence d’insertion IS256 Après extraction de l’ADN bactérien par lyse thermique, quatre PCR simplex spécifiques ont été réalisées pour l’amplification des gènes icaA, icaB, icaC et de la séquence d’insertion IS256 en utilisant les séquences d’amorces décrites par Ziebuhr et al. [19]. Les concentrations finales utilisées pour la préparation d’un tube réactionnel ont été [20] : 0,5 μM pour chacune des amorces, 200 μM pour chaque dNTP (Amersham Biosciences), 2,5 mM de MgCl2 (Sigma), 2 U de Taq polymérase (Promega) et 1 X du tampon d’enzyme (Promega). Le mélange réactionnel a été complété par de l’eau ultrapure stérile pour obtenir un volume final de 50 μl en tenant compte des 5 μl d’ADN à ajouter. L’amplification a été effectuée dans un appareil pro-
A. Touati et al. / Pathologie Biologie 55 (2007) 277–282
grammable à blocs chauffant–refroidissant (Perkin Elmer 9700 Applied Biosystemes). La révélation a été réalisée par électrophorèse sur un gel d’agarose (Sigma) à 1,5 %. La taille des fragments de migration a été estimée par un marqueur de taille moléculaire de 100 pb (Amersham Pharmacia). 2.4. Analyse statistique La comparaison des fréquences observées a été validée par le test Khi2 (χ2). Un χ2 supérieur à 3,84 correspond à un risque de 5 %. La différence est significative et le degré de signification p est fixé par le risque α lu dans le tableau de χ2 pour un degré de liberté égal à 1 [21]. 3. Résultats 3.1. Sensibilité aux antibiotiques Les souches responsables d’infection ont présenté des taux élevés de résistance à toutes les familles d’antibiotiques sauf aux glycopeptides. Les souches isolées d’ILC étaient significativement plus résistantes à l’oxacilline et à l’ofloxacine par rapport à celles de portage (Tableau 1). 3.2. Production de slime sur milieu rouge Congo La recherche de slime a montré que 64,2 % (n = 18) des souches responsables d’ILC ont été productrices de slime contre 28,5 % (n = 8) des souches de portage. Les souches productrices de slime avaient un phénotype variable ou positif. Ces phénotypes ont été respectivement de 46,4 % (n = 13) et 17,8 % (n = 5) parmi les souches isolées d’ILC ; et de 7,1 % (n = 2) et 21,4 % (n = 6) parmi les souches de colonisation. Les souches d’ILC avaient significativement plus le phénotype slime variable (p < 0,02) que les souches commensales alors que les souches de portage avaient significativement plus le phénotype slime négatif (p < 0,01) que les souches associées aux ILC (respectivement 71,4 et 35,7 %) (Tableau 2).
279
Tableau 2 Fréquence de slime, des gènes ica et de l’IS256 parmi les souches de S. epidermidis
Souches productrices de slime Phénotype positif Phénotype variable
Souches isolées d'ILC 18 (64,2 %) 5 (17,8 %) 13 (46,4 %)
Souches de portage 8 (28,5 %) 6 (21,4 %) 2 (7,1 %)
Total 26 11 15
Souches non productrices de slime ica positif IS256 positif
10 (35,7 %) 23 (82,1 %) 17 (60,7 %)
20 (71,4 %) 10 (35,7 %) 12 (42,8 %)
30 33 29
3.3. Recherche des gènes ica L’amplification a donné un fragment de 814 pb pour le gène icaA, 526 pb pour le gène icaB et 989 pb pour le gène icaC (Fig. 1). Parmi les 56 souches de S. epidermidis étudiées, 23 souches isolées d’ILC et dix souches de colonisation avaient une amplification PCR positive des trois gènes. Les gènes ica ont été significativement plus prévalents parmi les souches isolées d’ILC (82,1 %) que les souches de portage (35,7 %) [p < 0,001] (Tableau 2). 3.4. Amplification de la séquence d’insertion IS256 L’amplification de la séquence d’insertion IS256 a été positive (produit de 1102 pb) (Fig. 2) chez 60,7 % des souches isolées d’ILC (17/28) et 42,8 % des souches de colonisation (12/28), la différence entre les deux fréquences n’était pas significative (p < 0,3) (Tableau 2). L’étude de la sensibilité à la gentamicine a montré que 96 % (24/25) des souches de S. epidermidis résistantes à cet antibiotique avaient la séquence d’insertion IS256 (p < 0,001) alors que cinq de nos souches (une souche de colonisation et quatre souches d’ILC) hébergeant cette séquence n’étaient pas résis-
Tableau 1 Taux de résistance aux antibiotiques des souches de S. epidermidis Souches Souches de p* Différence d'ILC colonisation n = 28 (%) n = 28 (%) Oxacilline 19 (67,8) 10 (35,7) < 0,02 S Gentamicine 13 (46,4) 12 (42,8) < 0,50 NS Érythromycine 11 (39,2) 13 (46,4) < 0,50 NS Rifampicine 12 (42,8) 10 (35,7) < 0,50 NS Ofloxacine 21 (75) 10 (35,7) < 0,01 S Tétracycline 5 (17,8) 10 (35,7) < 0,10 NS Cotrimoxazole 12 (42,8) 7(25) < 0,20 NS Fosfomycine 6 (21,4) 6 (21,4) – – Acide fusidique 16 (57,1) 10 (35,7) < 0,10 NS * p : probabilité que les fréquences de résistance soient significativement différentes chez les groupes étudiés, déterminés par la loi de χ2. S : significative, NS : non significative.
Fig. 1. Résultats de l’électrophorèse de l’amplification PCR des gènes ica d’une souche de S. epidermidis isolées d’ILC et de la souche de référence. Puits 1 : marqueur de taille 100 pb, puits 2–4 : S. epidermidis 5878 respectivement icaA, icaB et icaC positif, puits 5–7 : S. epidermidis CIP106510 icaA, icaB et icaC positif, 8 : témoin négatif.
280
A. Touati et al. / Pathologie Biologie 55 (2007) 277–282
Fig. 2. Résultats de l’électrophorèse de l’amplification PCR IS256 de cinq souches de S. epidermidis et de la souche de référence. Puits 1 : marqueur de taille 100 pb, puits 2 : S. epidermidis 4100b IS256 positif, puits 3 : S. epidermidis 4248a IS256 positif, puits 4 : S. epidermidis 4597a IS256 négatif, puits 5 : S. epidermidis 4597b IS256 positif, puits 6 : S. epidermidis 4636a IS256 négatif, puits 7 : témoin négatif, puits 8 : Enterococcus fæcalis E9 : témoin positif.
tantes à la gentamicine. Une seule souche parmi les 27 souches dépourvues de l’élément IS256 était résistante à la gentamicine. 4. Discussion De mai 2002 à mai 2004, 39 infections liées aux cathéters ont été observées suite à la mise en place de 213 cathéters veineux centraux. L’incidence globale des ILC a été de 5,5 pour 1000 journées-cathéters [22]. Dans la littérature, elle est comprise entre 2 et 11 pour 1000 journées-cathéters [23–25]. Les souches de S. epidermidis isolées d’ILC ont été différentes des souches de colonisation en termes de production de slime (64,2 contre 28,5 %), de présence des gènes ica (82,1 contre 35,7 %) et de résistance à l’oxacilline (67,8 contre 35,7 %) et à l’ofloxacine (75 contre 35,7 %). La haute prévalence de la production de slime parmi les souches isolées d’ILC associée à la présence des gènes ica au sein de cette population suggère le rôle de ce facteur de virulence dans les infections liées aux cathéters. En effet, le biofilm est un système de protection de la bactérie vis-à-vis des conditions défavorables de l’environnement. Cette protection concerne aussi bien les défenses immunitaires que le traitement antimicrobien chimique (antibiotique, antiseptique, désinfectant…) ou physique (UV, pression osmotique…) [26]. Les gènes du locus ica sont strictement liés les uns autres, et ce, pour toutes les souches étudiées : les trois gènes sont soit présents, soit absents. L’opéron ica a été amplifié chez 82,1 % de nos souches responsables d’ILC. Des taux de 68,2 à 94 % sont rapportés dans d’autres études [2,20,27,28]. Toutes les souches productrices de slime avaient l’opéron ica et toutes les souches dépourvues de ce locus étaient slime
négatif. Cependant, parmi les 33 souches porteuses de l’opéron ica, seules 26 (79 %) étaient productrices de slime. Ce taux est de 59 % au Royaume-Uni [29] et de 86 % en Italie [15]. La production de slime est sous la dépendance de l’opéron ica et l’expression de ces gènes est soumise à une régulation complexe. Le caractère variable a été particulièrement retrouvé parmi les souches isolées d’ILC. En effet, parmi les 15 souches de phénotype variable, 13 étaient des souches responsables d’infection et deux des souches de portage. La variation de phase, mettant en jeu des mécanismes divers et complexes chez S. epidermidis, est une stratégie qui lui permet de se détacher du biofilm et de se disséminer pour infecter d’autres tissus [29]. En effet, la variation de l’expression des gènes de virulence, retrouvée chez les organismes pathogènes, permet à ces bactéries de survivre et de s’adapter rapidement aux conditions hostiles de l’environnement [30]. La séquence d’insertion a été retrouvée chez 60,7 % de nos souches isolées d’ILC contre 42,8 % des souches commensales et l’analyse statistique n’a pas révélé de différence significative entre ces taux. Dans une étude allemande, la séquence d’insertion IS256 est significativement plus prévalente parmi les souches responsables d’ILC (70 contre 4 %) [27]. Une association a été retrouvée entre présence de l’IS256 et résistance à la gentamicine : 96 % (24/25) de nos souches résistantes à la gentamicine possédaient la séquence d’insertion IS256 et 96 % (26/27) des souches dépourvues de l’IS256 étaient sensibles à la gentamicine. En effet, la séquence d’insertion IS256 borde les extrémités du transposon Tn4001 qui porte le gène de la résistance à la gentamicine codant pour l’enzyme bifonctionnelle AAC (6’)-APH (2’’) (Fig. 3a). Cinq de nos souches hébergeaient la séquence IS256 sans pour autant être résistantes à la gentamicine. Cette séquence peut aussi exister sous forme de multiples copies libres dans le génome des staphylocoques indépendantes du Tn4001 [31]. Aucune insertion de l’élément IS256 n’a été détectée dans le locus ica puisque tous les produits PCR ica étaient de tailles prédites indiquant ainsi un locus ica intact. Le même résultat a été également retrouvé dans une étude récente en Italie [15]. L’insertion de l’élément IS256 est à l’origine du phénotype variable ou négatif des souches ica positif dans l’étude de Ziebuhr et al. [19]. Cette inactivation des gènes ica est réversible
Fig. 3. a. Schéma du transposon Tn4001 bordé par deux séquences d’insertion IS256. b. Représentation schématique des sites d’insertion de la IS256 au niveau de l’opéron ica des souches de S. epidermidis en variation de phase [19].
A. Touati et al. / Pathologie Biologie 55 (2007) 277–282
et restaure complètement la capacité de produire le PIA [32], elle survient chez 25–30 % des variants (Fig. 3b) [33,34]. Conlon et al. ont démontré que l’insertion de cet élément en dehors du locus ica peut aussi affecter la transcription de cet opéron. Cette équipe a trouvé que chez 11,6 % des variants, la diminution de l’expression des gènes ica était associée avec l’insertion de la séquence IS256 dans le gène activateur de l’opéron sigma : rsbU. Cette étude démontre que la seule présence de cette séquence d’insertion dans le génome est associée avec une plus grande capacité de variation phénotypique chez S. epidermidis et insiste sur le potentiel des éléments transposables à influencer entre autres la flexibilité génétique et la virulence des micro-organismes Gram-positif [35]. La fréquence élevée de résistance aux antibiotiques parmi les souches responsables d’ILC est associée à une forte pression de sélection antibiotique. L’organisation multicellulaire des bactéries en biofilm leur confère l’avantage d’acquérir de nouveaux gènes. Le biofilm constitue un milieu parfait pour l’échange de plasmides de résistance [36]. L’importance du transfert horizontal d’éléments génétiques dans cet environnement est liée à la grande probabilité de contact entre les cellules et à l’effet négligeable des forces hémodynamiques évitant l’interruption de ce contact [37]. Les staphylocoques à coagulase négative ont été en tête des germes responsables d’ILC dans notre centre (16/39), en particulier S. epidermidis (75 % des SCN). En France, ce germe représente 82,5 % des SCN isolés d’infections liées aux cathéters [38]. Aux États-Unis, il est la cause de plus de 50 % des infections liées aux biomatériaux [39], de 33,5 % de bactériémies associées aux ILC [40], et de 25 % de celles observées chez les greffés de moelle osseuse [41]. Ces ILC peuvent aboutir jusqu’à 40 % d’ablation des cathéters [42]. Les souches de S. epidermidis isolées d’ILC ont présenté des taux élevés de résistance aux différentes familles d’antibiotiques sauf aux glycopeptides. Elles ont été significativement plus résistantes à l’oxacilline (67,8 contre 35,7 %) et à l’ofloxacine (75 contre 35,7 %) que les souches de portage. Au Royaume-Uni, ces souches sont significativement plus résistantes à l’oxacilline (46 %), à l’ofloxacine (91 %) et à la rifampicine (82 %) [29], alors qu’en Allemagne elles sont plus résistantes à l’oxacilline (83 %) et à la gentamicine (87 %) [27]. De même, dans une étude hollandaise, ces souches sont significativement plus résistantes (p < 0,001) à la tobramycine, la gentamicine, le cotrimoxazole, l’érythromycine et la ciprofloxacine [43]. La production de slime a été significativement plus importante parmi les souches responsables d’infections (64,2 %) par rapport aux souches de portage (28,5 %). Cette différence entre les deux populations est aussi retrouvée dans d’autres études : 85 contre 6 % [28], 51,8 contre 27,8 % [43], 62,9 contre 8,6 % [2], 48,5 contre 0 % [44] et 87 contre 6,5 % [27]. La fréquence de production de slime parmi les souches de portage varie dans les études de 0 à 27,8 %. Cette différence de fréquence est attribuée à la nature de l’échantillonnage de ces souches et au choix des malades, elle est basse lorsque les souches sont isolées chez des volontaires sains et élevée lorsqu’elles proviennent de patients hospitalisés. Dans notre étude, le taux assez
281
élevé (28,5 %) est observé parmi des souches isolées de malades hospitalisés en oncohématologie. 5. Conclusion Dans notre étude, la présence des gènes ica, la variabilité phénotypique de la production de biofilm et la multirésistance aux antibiotiques ont été significativement associées à la virulence des souches de S. epidermidis responsables d’ILC leur conférant un avantage sélectif et une grande capacité d’adaptation. L’insertion de l’élément IS256 dans le locus ica, mécanisme fréquemment impliqué dans la variation de phase, n’a pas été retrouvée parmi nos souches confirmant la complexité et la diversité des mécanismes régulateurs intervenant au cours de ce phénomène. Références [1] Kloos WE, Bannerman TL. Update on clinical significance of coagulasenegative staphylococci. Clin Microbiol Rev 1994;7(1):117–40. [2] Galdbart JO, Allignet J, Tung H-S, Rydèn C, El Solh N. Screening for Staphylococcus epidermidis markers discriminating between skin flora strains and those responsible for infection of joint protheses. J Infect Dis 2000;182:351–5. [3] Greenberg EP. Bacterial communication and group behaviour. J Clin Invest 2003;112(9):1288–90. [4] König C, Schwank S, Blaser J. Factors compromising antibiotic activity against biofilms of Staphylococcus epidermidis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2001;20:20–6. [5] Donlan RM, Costerton JW. Biofilms: survival mecanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev 2002;15(2):167–93. [6] Heinzelmann M, Herzig DO, Swain B, Mercer-Jones MA, Bergamini TM, Polk Jr. CP. Phagocytosis and oxidative-burst response of planctonic Staphylococcus epidermidis RP62A and its non-slime-producing variant in human neutrophils. Clin Diagn Labo Immunol 1997;4(6): 705–10. [7] Johnson GM, Lee DA, Regelmann WE, Gray ED, Peters G, Quie PG. Interference with granulocyte function by Staphylococcus epidermidis slime. Infect Immun 1986;54(1):13–20. [8] Costerton JW, Veeh R, Shirtliff M, Pasmore M, Post C, Ehrich G. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. J Clin Invest 2003;112:1466–77. [9] Ziebuhr W, Lößner I, Krimmer V, Hacker J. Methods to detect and analyse phenotypic variation in biofilm-forming staphylococci. Methods Enzymol 2001;336:195–203. [10] Mack D, Fischer W, Korbotsch A, Leopold K, Hartmann R, Egge H, et al. The intercellular adhesin involved in biofilm accumulation of Staphylococcus epidermidis is a linear β-1,6-linked glucosaminoglycan: Purification and structural analysis. J Bacteriol 1996;178(1):175–83. [11] Rachid S, Ohlsen K, Witte W, Hacker J, Ziebuhr W. Effect of subinhibitory antibiotic concentrations on polysaccharide intercellular adhesin expression in biofilm-forming Staphylococcus epidermidis. Antimicrob Agents Chemother 2000;44(12):3357–63. [12] Dobinsky S, Kiel K, Rohde H, Bartscht K, Knobloch J-M, Horstkotte MA, et al. Glucose-related dissociation between icaADBC transcription and biofilm expression by Staphylococcus epidermidis: Evidence for an additional factor required for Polysaccharide Intercellular Adhesin synthesis. J Bacteriol 2003;185(9):2879–86. [13] Fey PD, Ulphani JS, Götz F, Heilmann C, Mack D, Rupp ME. Characterization of the relationship between Polysaccharide Intercellular Adhesin and hemagglutination in Staphylococcus epidermidis. J Infect Dis 1999; 179:1561–4. [14] O’Gara JP, Humphreys H. Staphylococcus epidermidis and biofilms: importance and implication. J Med Microbiol 2001;50:582–7. [15] Arciola CR, Campoccia D, Gamberini S, Rizzi S, Donati ME, Baldassari L, et al. Search for the insertion element IS256 within the ica locus of
282
[16]
[17] [18]
[19]
[20]
[21]
[22]
[23]
[24]
[25]
[26]
[27]
[28]
[29]
A. Touati et al. / Pathologie Biologie 55 (2007) 277–282 Staphylococcus epidermidis clinical isolates from biomaterial-associated infections. Biomaterials 2004;25:4117–25. Loessner I, Dietrich K, Dittrich D, Hacker J, Ziebuhr W. Transposasedependent formation of circular IS256 derivates in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus. J Bacteriol 2002;184(17):4709–14. Soussy CJ. Comité de l’antibiogramme de la Société française de microbiologie. Communiqué 2004. Édition janvier 2004:32–34. Freeman DJ, Falkiner FR, Keane CT. New method for detecting slime production by coagulase negative staphylococci. J Clin Pathol 1989;42: 872–4. Ziebuhr W, Krimmer V, Rachid S, Lößner I, Götz F, Jörg H. A novel mechanism of phase variation of virulence in Staphylococcus epidermidis: evidence for control of the polysaccharide intercellular adhesions synthesis by alternating insertion and excision of the insertion sequence element IS256. Mol Microbiol 1999;32(2):345–56. Frebourg NB, Lefebvre S, Baert S, Lemeland JF. PCR based assay for discrimination between invasive and contaminating staphylococci. J Clin Microbiol 2000;38(2):877–80. Schwartz D. In: Le test χ2 et la comparaison de plusieurs répartitions observées. In: Méthodes statistiques à l’usage des médecins et des biologistes. Flammarion Médecine-Sciences. 4e édition; 1994. p. 67–88. Abdelkefi A, Achour W, Torjman L, Ben Othman T, Ladeb S, Lakhal A, et al. Difference in time to positivity is useful for the diagnosis of catheter-related-blood stream infection in hematopoietic cell transplant recipients. Bone Marrow Transplant 2005;35:397–401. Groeger JS, Lucas AB, Thaler HT, Friedlander-Klar H, Brown AE, Kiehlen TE, et al. Infectious morbidity associated with long-term use of venous access devices in patients with cancer. Ann Intern Med 1993; 119:1168–74. Keung YK, Watkins K, Chen SC, Groshen S, Levine AM, Douer D. Increased incidence of central venous catheter-related infections in bone marrow transplant patients. Am J Clin Oncol 1995;18:469–74. Nouwen JL, Van Belkum A, de Marie S, Sluijs J, Wielenga JJ, Kluytmans JAJW, et al. Clonal expansion of Staphylococcus epidermidis causing Hickman catheter related infection in an hemato-oncologic departement. J Clin Microbiol 1998;36(9):2696–702. Adam B, Baillie GS, Douglas LJ. Mixed species biofilms of Candida albicans and Staphylococcus epidermidis. J Med Microbiol 2002; 51:344–9. Kozitskaya S, Cho S-H, Dietrich K, Marre R, Naber K, Ziebuhr W. The bacterial insertion sequence IS256 occurs preferentially in nosocomial Staphylococcus epidermidis isolates: association with biofilm formation and resistance to aminoglycosides. Infect Immun 2004;72(2):1210–5. Ziebuhr W, Heilmann C, Götz F, Meyer P, Wilms K, Straube E, et al. Detection of intercellular adhesion gene cluster (ica) and phase variation in Staphylococcus epidermidis blood culture strains and mucosal isolates. Infect Immun 1997;65(3):890–6. Silva (de) GDI, Kantzanou M, Justice A, Massey RC, Wilkinson AR, Day NPJ, et al. The ica operon and biofilm production in coagulasenegative staphylococci associated with carriage and disease in neonatal intensive care unit. J Clin Microbiol 2002;40(2):382–8.
[30] Filloux A, Vallet I. Biofilm: mise en place et organisation d’une communauté bactérienne. Med Sci (Paris) 2003;19:77–83. [31] Deplano A, Vaneechoutte M, Verschreagen G, Struelens MJ. Typing of Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis strains by PCR analysis of inter-IS256 spacer lengh polymorphisms. J Clin Microbiol 1997;35(10):2580–7. [32] Dunne Jr. WM. Bacterial adhesion: seen any good biofilms lately. Clin Microbiol Rev 2002;15(2):155–66. [33] Conlon KM, Humphreys H, O’Gara JP. icaR encodes a transcriptional repressor involved in environmental regulation of ica operon expression and biofilm formation in Staphylococcus epidermidis. J Bacteriol 2002; 184(16):4400–8. [34] Knobloch J-M, Horstkotte MA, Rohde H, Kauflers PM, Mack D. Alcoholic ingredients in skin disinfectants increase biofilm expression of Staphylococcus epidermidis. J Antimicrob Chemother 2002;49:683–7. [35] Conlon KM, Humphreys H, O’Gara JP. Inactivation of rsbU and sarA by IS256 represent a novel mechanisms of biofilm phenotypic variation in Staphylococcus epidermidis. J Bacteriol 2004;86(18):6208–19. [36] Watnick P, Kolter R. Biofilm: city of microbes. J Bacteriol 2000;182 (10):2675–9. [37] Donlan RM. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin Infect Dis 2001;33:1387–92. [38] Frebourg NB, Cauliez B, Lemeland JF. Evidence for nasal carriage of methicillin resistant colonizing intravascular devices. J Clin Microbiol 1999;37(4):1182–5. [39] Rupp ME, Archer GL. Coagulase-negative staphylococci: pathogens associated with medical progress. Clin Infect Dis 1994;19:231–45. [40] Rupp ME, Ulphani JS, Fey PD, Mack D. Characterization of Staphylococcus epidermidis PIA/Hemagglutination in the pathogenesis of intravascular catheter-associated infection in a rat model. Infect Immun 1999;67(5):2656–9. [41] Donlan RM, Murga R, Bell M, Toscano CM, Carr JH, Novicki TJ, et al. Protocol for detection of biofilms on needleless connectors attached to central venous catheters. J Clin Microbiol 2001;39(2):750–3. [42] Bakker J, Van Overhagen H, Wielenga JJ, de Marie S, Nouwen J, de Ridder MA, et al. Infectious complications of radiologically inserted Hickman catheters in patients with hematologic disorders. Cardiovasc Intervent Radiol 1998;21:116–21. [43] Mulder JG, Degener JE. Slime production properties of coagulasenegative staphylococci isolated from blood cultures. Clin Microbiol Infect 1998;4:689–94. [44] Arciola CR, Baldassari L, Montanaro L. Presence of icaA and icaD and slime production in a collection of staphylococcal strains from catheterassociated infection. J Clin Microbiol 2001;39(6):2151–6.
Glossaire PIA ica CNGMO ILC SCN
polysaccharide intercellular adhesin. intercellular adhesion. Centre national de greffe de moelle osseuse. infections liées aux cathéters veineux centraux. Staphylocoques à coagulase négative.