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Détermination fluorimétrique de la bilirubine amniotique
Revue Fran~ai~e de Transfusion. T. XI. N° 3. -- 1968
NOTE
243
TECHNIQUE
Ddtermination fluorim trique de la bilirubine amniotique p a r C. V I G N E R O N , B. G E N E T E T et F. S T R E I F F Avec la collaboration technique de B. TUMELERO. Centre rSgional de Transtusion Sanguine - Nancy nombreuses techniques de d~,termination de 1,a bilirubine amnio. D IEtique ont 4t$ proposSes depuis les travaux de BEvIs et de LILEY. L'indiee optique d6crit par ce dernier auteur est notamment un trSs bon 61$:ment dans l'appr6ciation du risque f,tetal de l'iso-immunisation rh6sus. Toutes les techniques conduisent souvent h des difficult6s d'interpr$tation, qu'elles soient chimiques ou qu'elles reposent sur l'$tude de la courbe spectrophotom6trique du liquide (~LEMING et WoLFf). C'est p ourquoi nous nous proposons de d6crire une m6thode ,de dosage ttuorim6trique de la bHirubinamnie. I1 s'agit de 1'application au liq u i d e amniotique d'une technique pr6conis6e par ROTH, apptiquSe quant h erie au dosage de la bilirubine s6rique.
Principe Le principe de cette mSthode est le suivant : en prSsence =de concentrations appropriSes d'albumine et d'ions H +, la bilirubine se transforme en une forme fluorescente par liaison de l'albnmine et de la bilirubine. Nous avons rSalis6 une Stude critique des conditions de la
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C. V I G N E R O N et collab.
r6action, ceci sera expos6 par ailleurs, et nous voulons simplement nous attacher ~ .d6crire les conditions de la technique.
R~alisation
pratique
MATI~RIEL
- - F l u o r i m b t r e E p p e n d o r f (filtre primaire 436 nm, filtre secondaire 470 nm). - - P a p i e r W h a t m a n n ° 4 ou seringue h y p o d e r m i q u e coupl6e un dispositif de filtration Millipore XX 30 012 00 $quip6 de membranes SSWP 0 13 00. REACTIFS
- - Bilirubine Merck. Solution stock de bilirubine ~ 100 rag/1. OpSrer ~ robscurit$. Peser 1 mg de bilirubine sur un petit verre de montre. 'I)issoudre avec 0,2 ml NaOH 0,05 N e t ajouter 9,6 ml de solution d'albumine ~ 6 %. --
M6langer et ajouter 0~2 ml H Ct 0,05 N. RSpartir ]a solution obtenue en fractions de 0,5 ml darts des tubes h6mo'lyse. Congeler ~ --20°~C. Cette solution est stable au moins 2 mois. ou --Versatol << p$diatrique >> 6talonn6 ~ 200 mg/1 de bilirubine ~Pr6cibio). -Solution de bilirubine ~ 10 mg/1 obtenue par dilution au 1/10 de la solution stock de bilirubine dans l'albumine h 6 % ou au 1/20 du Versatol P~diatrique dans l'eau distill6e. -Albumine h u m a i n e en solution ~ 17,5 %. Diluer ~ 6 % dans l'eau physiologique. - - A.cide O-phosphorique 85 %, d = 1,71 (Merck). PRI~LEVEMENT
10 ml de liquide amniotique sont recueillis st6rilement dans un tube ento~r6 d'un Spais papier noir et conserv6s h -~- 4°~C. Ce volume permet en outre la r~alisation des tests ctassiques : courbe et groupage fcetM.
BILIRUBINE AMNIOTIQUE
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'CLARIFICATION
La turbidit6 souvent i m p o r t a n t e du liquide amniotique est un 6cueil qui reste parfois partiellement insurmontable. NSanmoins, une centrifugation 6nergic[ue (4000 t / r a n p e n d a n t 10 ran) ~ -+- 4°C, suivie de ]a ,filtration du surnageant sur p a p i e r W h a t m a n n ° 4 ou sur memb r a n e fi'hrante Millipore, conduit h l'obtention d ' u n liquide limpide. DOSA6E
I1 est n6cessaire d'introduire 2 t6moins ,$ 1 et 5 mg de bilirurine par litre dans ch.aque s~rie de dosage. Ces t6moins sont respe,ctivement contenus dan,s 10 et 50 ,al de la solution de bi'lirubine h 10 mg/1.
BLANC
TUBES
EtMon bilirubine 10 mg/1 #1 Eau distill6e /11 Liquide amniotique #1 Albumine humaine 6 % #1 Hs PO4 ml
50 0,6
ETALON i rag/1
ETALON 5 rag/1
10 90
50 50
50 0,6
50 0,6
T~MOIN DOSAGE
100 50
DOSAGE
100 50 0,6
Attendre 1 minute au m i n i m u m Eau distill& Ha P 0 4
ml ml
2
2
2
2 0,6
2
Lire la fluorescence aprbs 15 ran.
Au fluorim&re E p p e n d o r f , les lectures sont rSalis6es h 3 sensibilit.~s diff&entes (plots 5, 7 et 9). ILe 100 % de l ' a p p a r e i l est rSgl6 arbit r a i r e m e n t avec t'&alon de fluorescence vert ,Eppendorf 106502 (plot 6). Se reporter aux gammes d ' & a l o n n a g e correspondant aux plots 5, 7 ou 9 selon la concentration en bilirubine de l'6ch~antillon. ETALONNAGE
La g a m m e d'&alonnage, &ablie .de 0 ~ 5 ou 10 mg de bilirubine par litre, est obtenue par pipetage de volumes croissants d ' u n e solution au 1/20 d'ans l'eau distill~e d'un s6rum &alon dtt type Versatol PSdiatrique : la compo.sition d ' u n e telle dilution de s6rum 6talon a
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C. V I G N E R O N et collab.
l'avantage d'&re tr6s proche de celle d ' u n liqui,de amniotique normal, en particulier en Ce qui con, cerne le taux de prot6ines. C o m m e pour le dosage, la g a m m e ainsi r6alis6e est lue successivem e n t h 3 sensibilit6s croiss,antes du fluorim&re E p p e n d o r f ('plots 5, 7 et 9) et 3 courbes sont construites (fig. 1). Cette fa~on d ' o p 6 r e r a p o u r but de se placer pour chaque point de gamme dans la portion de l'6che]le gradu6e de l ' a p p a r e i l compatible avec une lecture correcte.
5O
plat 5.
~0
plot 7
30
=
20
plot 9
10
2~
" bllirubin~bmg/l
5 1
I0 2
plot 5 plot 7 plot 9
FIG. 1. -- E t a l o n n a g e
R6sultats Nous avons soumis depuis quelques mois un grand n o m b r e de liquides amniotiques ~ cette 6rude, et les r6suhats obtenus ont 6t6 parfaitement compatibles ,avec les donn6es cliniques et biologiques. II nous est arriv6 souvent, p a r le pass6, ,de r e c o m m e n e e r une detLxi~me ponction parce que les r6suhats obtenns 1ors de la premi6re 6talent d'interpr6tation d61icate. Nous pensons que si nous avions eu notre disposition la technique d6,crite, nous aurions pu ~ partir d'nne amniocent6se unique obtenir une image plus p a r f a i t e de l'6tat ~o~t.al.
BILIRUBINE AMNIOTIQUE
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Conclusion : N o u s d 6 cri v o n s n n e m 6 t h o d e s i m p l e de dosage de la b i l i r u b i n e a m n i o t i q u e , t e c h n i q u e f o n d $ e sur la f l u o r i m S t r i e 'de ce p i g m e n t lorsq u ' i l est c o n j u g u 6 .~ l ' a l b u m i n e . C e t t e t e c h n i q u e f a c i l e p e r m e t u n e a p p r o c h e plus r~elle de l ' $ t a t f,mtal et est doric c a p a b l e d ' a i d e r d ' u n e p a r t l ' i m m u n o - h 6 m a t o l o g i s t e et d ' a u t r e p a r t l ' o b s t 6 t r i c i e n . Dr C. VIGNERON, Centre R6gional de Transfusion Sanguine, 9, rue Lionnois, 54-Nancy
BIBLIOGRAPHIE [1] BEVlS D. C. A. - - The antenatal prediction of haemolytic disease of the newborn. Lancet, 1, 395, 1952. [2] FLEMINC M. F., WOOLF A. J. - - A spectrophotometric method for the quantitative estimation of bilirubin in liquor amnii. Clin. Chim. Acta, 12, 67-74, 1965. [3] LILEY A. V/. - - Liquor amnii analysis in the management of the pregnancy complicated by rhesus sensitization. Amer. ]. Obstet. Gynec., 82, 1359, 1961. [4] RoTH M. - - Dosage fluorim6trique de la bilirubine. Clin. Chim. Acta, 17, 487-492, 1967.
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Ddtermination fluorim trique de la bilirubine amniotique p a r C. V I G N E R O N , B. G E N E T E T et F. S T R E I F F Avec la collaboration technique de B. TUMELERO. Centre rSgional de Transtusion Sanguine - Nancy nombreuses techniques de d~,termination de 1,a bilirubine amnio. D IEtique ont 4t$ proposSes depuis les travaux de BEvIs et de LILEY. L'indiee optique d6crit par ce dernier auteur est notamment un trSs bon 61$:ment dans l'appr6ciation du risque f,tetal de l'iso-immunisation rh6sus. Toutes les techniques conduisent souvent h des difficult6s d'interpr$tation, qu'elles soient chimiques ou qu'elles reposent sur l'$tude de la courbe spectrophotom6trique du liquide (~LEMING et WoLFf). C'est p ourquoi nous nous proposons de d6crire une m6thode ,de dosage ttuorim6trique de la bHirubinamnie. I1 s'agit de 1'application au liq u i d e amniotique d'une technique pr6conis6e par ROTH, apptiquSe quant h erie au dosage de la bilirubine s6rique.
Principe Le principe de cette mSthode est le suivant : en prSsence =de concentrations appropriSes d'albumine et d'ions H +, la bilirubine se transforme en une forme fluorescente par liaison de l'albnmine et de la bilirubine. Nous avons rSalis6 une Stude critique des conditions de la
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C. V I G N E R O N et collab.
r6action, ceci sera expos6 par ailleurs, et nous voulons simplement nous attacher ~ .d6crire les conditions de la technique.
R~alisation
pratique
MATI~RIEL
- - F l u o r i m b t r e E p p e n d o r f (filtre primaire 436 nm, filtre secondaire 470 nm). - - P a p i e r W h a t m a n n ° 4 ou seringue h y p o d e r m i q u e coupl6e un dispositif de filtration Millipore XX 30 012 00 $quip6 de membranes SSWP 0 13 00. REACTIFS
- - Bilirubine Merck. Solution stock de bilirubine ~ 100 rag/1. OpSrer ~ robscurit$. Peser 1 mg de bilirubine sur un petit verre de montre. 'I)issoudre avec 0,2 ml NaOH 0,05 N e t ajouter 9,6 ml de solution d'albumine ~ 6 %. --
M6langer et ajouter 0~2 ml H Ct 0,05 N. RSpartir ]a solution obtenue en fractions de 0,5 ml darts des tubes h6mo'lyse. Congeler ~ --20°~C. Cette solution est stable au moins 2 mois. ou --Versatol << p$diatrique >> 6talonn6 ~ 200 mg/1 de bilirubine ~Pr6cibio). -Solution de bilirubine ~ 10 mg/1 obtenue par dilution au 1/10 de la solution stock de bilirubine dans l'albumine h 6 % ou au 1/20 du Versatol P~diatrique dans l'eau distill6e. -Albumine h u m a i n e en solution ~ 17,5 %. Diluer ~ 6 % dans l'eau physiologique. - - A.cide O-phosphorique 85 %, d = 1,71 (Merck). PRI~LEVEMENT
10 ml de liquide amniotique sont recueillis st6rilement dans un tube ento~r6 d'un Spais papier noir et conserv6s h -~- 4°~C. Ce volume permet en outre la r~alisation des tests ctassiques : courbe et groupage fcetM.
BILIRUBINE AMNIOTIQUE
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'CLARIFICATION
La turbidit6 souvent i m p o r t a n t e du liquide amniotique est un 6cueil qui reste parfois partiellement insurmontable. NSanmoins, une centrifugation 6nergic[ue (4000 t / r a n p e n d a n t 10 ran) ~ -+- 4°C, suivie de ]a ,filtration du surnageant sur p a p i e r W h a t m a n n ° 4 ou sur memb r a n e fi'hrante Millipore, conduit h l'obtention d ' u n liquide limpide. DOSA6E
I1 est n6cessaire d'introduire 2 t6moins ,$ 1 et 5 mg de bilirurine par litre dans ch.aque s~rie de dosage. Ces t6moins sont respe,ctivement contenus dan,s 10 et 50 ,al de la solution de bi'lirubine h 10 mg/1.
BLANC
TUBES
EtMon bilirubine 10 mg/1 #1 Eau distill6e /11 Liquide amniotique #1 Albumine humaine 6 % #1 Hs PO4 ml
50 0,6
ETALON i rag/1
ETALON 5 rag/1
10 90
50 50
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T~MOIN DOSAGE
100 50
DOSAGE
100 50 0,6
Attendre 1 minute au m i n i m u m Eau distill& Ha P 0 4
ml ml
2
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2 0,6
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Lire la fluorescence aprbs 15 ran.
Au fluorim&re E p p e n d o r f , les lectures sont rSalis6es h 3 sensibilit.~s diff&entes (plots 5, 7 et 9). ILe 100 % de l ' a p p a r e i l est rSgl6 arbit r a i r e m e n t avec t'&alon de fluorescence vert ,Eppendorf 106502 (plot 6). Se reporter aux gammes d ' & a l o n n a g e correspondant aux plots 5, 7 ou 9 selon la concentration en bilirubine de l'6ch~antillon. ETALONNAGE
La g a m m e d'&alonnage, &ablie .de 0 ~ 5 ou 10 mg de bilirubine par litre, est obtenue par pipetage de volumes croissants d ' u n e solution au 1/20 d'ans l'eau distill~e d'un s6rum &alon dtt type Versatol PSdiatrique : la compo.sition d ' u n e telle dilution de s6rum 6talon a
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C. V I G N E R O N et collab.
l'avantage d'&re tr6s proche de celle d ' u n liqui,de amniotique normal, en particulier en Ce qui con, cerne le taux de prot6ines. C o m m e pour le dosage, la g a m m e ainsi r6alis6e est lue successivem e n t h 3 sensibilit6s croiss,antes du fluorim&re E p p e n d o r f ('plots 5, 7 et 9) et 3 courbes sont construites (fig. 1). Cette fa~on d ' o p 6 r e r a p o u r but de se placer pour chaque point de gamme dans la portion de l'6che]le gradu6e de l ' a p p a r e i l compatible avec une lecture correcte.
5O
plat 5.
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plot 7
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plot 9
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2~
" bllirubin~bmg/l
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I0 2
plot 5 plot 7 plot 9
FIG. 1. -- E t a l o n n a g e
R6sultats Nous avons soumis depuis quelques mois un grand n o m b r e de liquides amniotiques ~ cette 6rude, et les r6suhats obtenus ont 6t6 parfaitement compatibles ,avec les donn6es cliniques et biologiques. II nous est arriv6 souvent, p a r le pass6, ,de r e c o m m e n e e r une detLxi~me ponction parce que les r6suhats obtenns 1ors de la premi6re 6talent d'interpr6tation d61icate. Nous pensons que si nous avions eu notre disposition la technique d6,crite, nous aurions pu ~ partir d'nne amniocent6se unique obtenir une image plus p a r f a i t e de l'6tat ~o~t.al.
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Conclusion : N o u s d 6 cri v o n s n n e m 6 t h o d e s i m p l e de dosage de la b i l i r u b i n e a m n i o t i q u e , t e c h n i q u e f o n d $ e sur la f l u o r i m S t r i e 'de ce p i g m e n t lorsq u ' i l est c o n j u g u 6 .~ l ' a l b u m i n e . C e t t e t e c h n i q u e f a c i l e p e r m e t u n e a p p r o c h e plus r~elle de l ' $ t a t f,mtal et est doric c a p a b l e d ' a i d e r d ' u n e p a r t l ' i m m u n o - h 6 m a t o l o g i s t e et d ' a u t r e p a r t l ' o b s t 6 t r i c i e n . Dr C. VIGNERON, Centre R6gional de Transfusion Sanguine, 9, rue Lionnois, 54-Nancy
BIBLIOGRAPHIE [1] BEVlS D. C. A. - - The antenatal prediction of haemolytic disease of the newborn. Lancet, 1, 395, 1952. [2] FLEMINC M. F., WOOLF A. J. - - A spectrophotometric method for the quantitative estimation of bilirubin in liquor amnii. Clin. Chim. Acta, 12, 67-74, 1965. [3] LILEY A. V/. - - Liquor amnii analysis in the management of the pregnancy complicated by rhesus sensitization. Amer. ]. Obstet. Gynec., 82, 1359, 1961. [4] RoTH M. - - Dosage fluorim6trique de la bilirubine. Clin. Chim. Acta, 17, 487-492, 1967.