Diagnóstico precoz del cáncer mediante análisis proteómicos del suero: ¿ficción o realidad?

DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO

Diagnóstico precoz del cáncer mediante análisis proteómicos del suero: ¿ficción o realidad?

82.395

Edgar Zapico Muñiza, Josefina Mora Brugésb y Francisco Blanco Vacaa,b a

Servei de Bioquímica. Institut de Recerca. Hospital de la Santa Creu i de Sant Pau. Barcelona. España.

b

La aproximación bioquímica clásica en el diagnóstico y, sobre todo, el control del cáncer se basa en la determinación de la concentración en suero de determinadas proteínas producidas por el tejido tumoral, denominadas marcadores tumorales. Los métodos utilizados requieren el uso de anticuerpos específicos, por lo que suelen englobarse bajo el término genérico de inmunoanálisis. Estas técnicas detectan proteínas individuales (p. ej., antígeno prostático específico [PSA]) en concentraciones muy bajas (μg/l). El uso de marcadores tumorales para el diagnóstico de cáncer presenta conocidas limitaciones de sensibilidad y especificidad. Así, las enfermedades benignas relacionadas con el tejido u órgano en estudio o con el órgano de eliminación del marcador (patología hepática o renal, principalmente) aumentan su concentración en el suero y disminuyen la especificidad diagnóstica. La sensibilidad diagnóstica de los marcadores tumorales tampoco es del 100% y está relacionada con el estadio del tumor: es baja en los estadios iniciales y aumenta con la progresión tumoral. Estas limitaciones hacen que, en muchos casos, la utilidad de los marcadores tumorales durante el proceso de diagnóstico del cáncer sea limitada y que, en cambio, su mayor utilidad se encuentre en el seguimiento de la enfermedad y en la valoración de la respuesta al tratamiento. Espectrometría de masas aplicada a la proteómica En los últimos años se han desarrollado considerablemente las técnicas de análisis múltiple de proteínas (proteómica) mediante espectrometría de masas. Esta tecnología, especialmente la variante conocida como MALDI-TOF-MS (matrix assisted laser desorption/ionization-time-of-flight mass spectrometry), permite el estudio simultáneo del conjunto de proteínas (proteoma) de una muestra biológica (p. ej., el suero humano) mediante el análisis de una propiedad intrínseca de las moléculas: su relación entre masa y carga (m/z). En resumen, este proceso consiste en una ionización de la mezcla de proteínas que se fragmentan y producen un patrón específico y reproducible de péptidos que son separados según su relación m/z. El resultado del análisis se representa tradicionalmente según su intensidad relativa (en el eje de las coordenadas) y la m/z (en el eje de las abcisas) de cada péptido producido. Este análisis permite, a diferencia de los inmunoanálisis convencionales, el estudio del conjunto de proteínas, y no de un grupo reducido de ellas, e incluso la detección de posibles modificaciones (p. ej., postraduccionales) de éstas. Este trabajo fue financiado en parte por el FIS C03-08. Correspondencia: Dr. F. Blanco Vaca. Servei de Bioquímica. Hospital de la Santa Creu i de Sant Pau. Antoni Maria Claret, 167. 08025 Barcelona. España. Correo electrónico. [email protected] Recibido el 29-7-2004; aceptado para su publicación el 19-11-2004.

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Un esquema un poco más detallado del proceso del análisis de muestras biológicas mediante espectrometría de masas (EM) sería el siguiente. Previamente al análisis, se requiere la separación de las proteínas de la muestra mediante técnicas del tipo de la electroforesis bidimensional y/o la cromatografía en tándem. A continuación elegiremos las proteínas que, de forma constante en diferentes experimentos, encontremos aumentadas o disminuidas al comparar 2 muestras de nuestro interés (p. ej., normal y patológica) (fig. 1). El análisis por EM de estas proteínas aisladas nos dará como resultado un listado con la relación m/z de cada péptido y su intensidad relativa (espectro de masas). Adicionalmente, los espectrómetros de masas más sofisticados pueden aislar cada uno de las fragmentos obtenidos en un espectro de masas, ionizarlos y generar un nuevo espectro de masas. Son los llamados espectros de masas-masas que permiten obtener la secuencia de aminoácidos de un péptido. Comparando el espectro de masas generado con otros disponibles mediante el uso de bases de datos, se puede llegar en muchos casos a la identificación de la proteína. En unos casos, mediante el análisis de la denominada «huella peptídica» (peptid mass fingerprinting), que consiste en comparar las m/z obtenidas y sus intensidades con las de diferentes proteínas almacenadas en bases de datos y en otros, mediante la «secuenciación peptídica», a partir de espectros de masas-masas que generan secuencias cortas de aminoácidos de los péptidos en que se ha fragmentado una proteína al ser ionizada. También en este caso, las proteínas que originan este perfil se identican en bases de datos a partir de la secuencia de aminoácidos obtenida. Este tipo de estrategias constituye una herramienta potente para la identificación de nuevos marcadores biológicos de enfermedad, aunque su utilidad en la práctica clínica es, por su complejidad y falta de estandarización, prácticamente nula. Si los datos obtenidos son de suficiente interés, se podría plantear la identificación de la proteína cuya concentración en el individuo enfermo difiere de la del sano, y el desarrollo de uno o más inmunoanálisis específicos para la determinación sistemática de la concentración sérica de la proteína. Una variante más heterodoxa, desde el punto de vista metodológico, es la que ha generado los estudios en que se basa esta revisión. Se trata de la generación de espectros de masas de proteínas, que no han sido sometidas a procesos de separación exhaustivos, de especímenes de suero de individuos de control y de enfermos (grupo de entrenamiento). Una vez obtenidos, se procede a la creación de un algoritmo de clasificación a partir de las decenas, centenares o miles de picos que se obtiene de la EM, mediante el uso de diferentes aproximaciones bioestadísticas y bioinformáticas. El algoritmo se construye a partir de las diferencias entre individuos control y enfermos de la intensidad de los picos (representativa de la abundancia de un péptido) y su relación m/z (representativa del péptido) (fig. 2), sin que en ese momento se sepa a qué péptido o proteína corresponde un Med Clin (Barc). 2005;124(5):181-5

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Fig. 1. Separación de proteínas por electroforesis en 2 dimensiones para el estudio diferencial de proteomas.

espectro determinado. Este algoritmo se aplica en una segunda fase a individuos control y enfermos diferentes de los anteriores (grupo de validación) de forma ciega, y se calcula la sensibilidad y la especificidad diagnósticas obtenidas, entre otros parámetros. Es fundamental que el grupo de entrenamiento esté compuesto por individuos bien caracterizados clínicamente, para obtener patrones de espectros de masas inequívocos de la enfermedad estudiada. De igual manera, es básico que la aproximación estadística utilizada sea capaz no sólo de clasificar correctamente a los individuos como normales o enfermos, sin que se confundan con otros procesos. En los últimos años, esta aplicación se ha estudiado como posible estrategia diagnóstica a partir de muestras de suero de diferentes tipos de tumores (ovario, mama y próstata, principalmente). Esta estrategia se basa en la hipótesis de que el proteoma del suero refleja, desde estadios muy precoces, la actividad tumoral, ya sea por secreción aumentada o disminuida de ciertas proteínas, o por diferencias en el grado de proteólisis, glucosilación u otras modificaciones químicas que sufren las proteínas.

Si ésta hipótesis fuera correcta, los cambios en el proteoma se producirían antes del inicio de los síntomas clínicos y, además, la detección de cambios de múltiples proteínas tal vez aportara ventajas sobre la detección de una única proteína para el diagnóstico precoz del cáncer. Proteómica del suero y diagnóstico precoz del cáncer Cáncer de ovario Petricoin et al1 fueron los primeros autores en aplicar esta estrategia para el diagnóstico del cáncer de ovario. El grupo de entrenamiento consistía en 50 mujeres control (37 sin evidencia de quistes ováricos, 11 con quistes ováricos benignos pequeños [< 2,5 cm] y 2 con quistes grandes [> 2,5 cm]) y 50 mujeres con cáncer de ovario (6 en estadio I y 44 en estadios II-IV). El algoritmo generado se aplicó a una muestra de 66 mujeres control que, además de las categorías citadas para el grupo de entrenamiento, incluían procesos ginecológicos benignos y procesos inflamatorios no ginecológicos, y 50 mujeres con cáncer de ovario en diferentes estadios (18 en estadio I y 32 en estadios II-IV).

Fig. 2. Estrategia de diagnóstico basado en algoritmos construidos a partir de las diferencias entre individuos controles y enfermos.

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En este grupo se obtuvo una sensibilidad diagnóstica del 100% y una especificidad diagnóstica del 95%, con un valor predictivo positivo del 94%. Este valor predictivo fue significativamente muy superior al obtenido con un marcador tumoral clásico, el CA 125, en el mismo grupo, que fue del 35%. Cuando se aplicó el algoritmo para el cáncer de ovario a un grupo de 266 pacientes con procesos benignos y malignos de próstata, éste no fue capaz de clasificar a los pacientes como normales o afectados de cáncer de ovario. Por tanto, los citados pacientes con patología prostática quedaron inclasificados. Estos resultados generaron un gran optimismo y han llevado a 3 compañías americanas a desarrollar de forma conjunta un test para la detección de cáncer de ovario que será denominado Ovacheck. Se está a la espera de la conclusión de estudios que corroboren su sensibilidad y especificidad diagnósticas, así como de la solución de otros aspectos controvertidos, que serán comentados en el apartado de limitaciones de esta revisión2. Mientras tanto, el grupo de autores del citado estudio está evaluando la utilidad de esta tecnología en el control de la recurrencia de enfermedad en mujeres con cáncer de ovario. Cáncer de mama Otro grupo de investigadores publicó un estudio similar al mencionado1 para el cáncer de mama3. El grupo de entrenamiento estaba formado en este caso por 108 mujeres (41 sanas, 25 con tumor benigno de mama y 42 con cáncer de mama en estadios 0). El grupo de validación estaba formado por 66 mujeres control (41 sanas y 25 con tumor benigno) y 103 mujeres con cáncer de mama. En este estudio se obtuvo una sensibilidad diagnóstica del 93% (el 93% en estadios 0-I, el 85% en estadios II y el 94% en estadio III) y una especificidad diagnóstica del 91%, significativamente superiores a las obtenidas con el CA 15.3 (sensibilidad diagnóstica del 23% y especificidad diagnóstica del 69%). Cáncer de próstata Cuatro grupos independientes han intentado aplicar la estrategia proteómica objeto de esta revisión al cáncer de próstata. El primer estudio4 generó un algoritmo de decisión a partir de un grupo de entrenamiento compuesto por 167 pacientes con cáncer de próstata (84 localizados y 83 con extensión demostrada a otros tejidos u órganos), 77 varones con hiperplasia benigna de próstata y 82 individuos normales. El grupo de validación estaba formado por 60 varones: 30 con cáncer de próstata (15 en estadios I-II y 15 en estadios IIIIV), 15 con hiperplasia benigna de próstata y 15 sanos. El algoritmo de decisión fue capaz de separar los 3 grupos, clasificando correctamente a todos los individuos normales, a 14 de los 15 pacientes con hiperplasia benigna y a 25 de los 30 pacientes con cáncer. Por tanto, la sensibilidad diagnóstica del cáncer de próstata fue del 83% (el 80% en estadio I-II y el 86,6% en estadios III-IV), con una especificidad diagnóstica del 97%. Los mismos autores4 publicaron posteriormente unos resultados basados en el mismo grupo de pacientes, pero aplicando una estrategia estadística diferente para la generación del algoritmo de decisión5. En este caso, se obtuvo una sensibilidad y una especificidad del 97%, muy superiores también al 90% de sensibilidad y el 25% de especificidad obtenidos con el PSA. El segundo estudio6 obtuvo una sensibilidad diagnóstica del 95% (el 100% en pacientes en estadio I y el 94% en pacientes en estadios II-III) y una especificidad diagnóstica del 77% en un grupo de validación que incluía a 228 individuos 31

con enfermedad benigna (75 con valores de PSA < 4 μg/l, 137 con PSA de 4-10 μg/l y 16 con PSA > 10 μg/l) y 38 con cáncer de próstata (7 en estadio I y 31 en estadios II-III). La especificidad diagnóstica disminuyó notablemente con el aumento de la concentración de PSA (el 93% en el grupo con PSA < 4 μg/l, el 71% en el grupo con PSA de 4-10 μg/l y el 63% en el grupo con PSA > 10 (μg/l). El tercer estudio7 comparó un grupo de 106 pacientes con cáncer de próstata en estadios II-III con 56 varones sanos y PSA < 4,0 μg/l. Este estudio obtuvo una sensibilidad diagnóstica del 63% para una especificidad diagnóstica del 77%. Por último, el cuarto estudio8 comparó un grupo de 246 varones con cáncer de próstata (148 localizados y 98 extendidos fuera de ésta) con un grupo de 94 varones con enfermedad benigna de próstata, y obtuvo una sensibilidad y especificidad diagnósticas del 67%. El PSA produjo, con la misma sensibilidad, una especificidad diagnóstica del 38%. Por tanto, aunque estos resultados no son tan espectaculares como los de anteriores estudios, siguen suponiendo una mejora diagnóstica respecto a los marcadores convencionales. Carcinoma hepatocelular El marcador bioquímico utilizado convencionalmente en el diagnóstico de este tipo de tumor es la alfafetoproteína (AFP). Las concentraciones < 10 μg/l suelen considerarse «normales», mientras que las concentraciones > 500 μg/l suelen asociarse con el carcinoma hepatocelular. Los valores entre 10 y 500 constituyen una zona intermedia, no diagnóstica, en la que se incluyen tanto los pacientes con cáncer como los que presentan una enfermedad hepática crónica. Un estudio9 analizó mediante las mencionadas técnicas de proteómica clínica a un grupo de 38 pacientes con carcinoma hepatocelular (6 en estadio I, 8 en estadio II, 17 en estadio III y 7 en estadio IV) divididos en 2 subgrupos, según la concentración de AFP. El grupo control estaba formado por 20 pacientes con enfermedad hepática crónica con concentración de AFP < 500 μg/l. Del estudio de todos los grupos mediante la aplicación de una aproximación estadística basada en redes neuronales se obtuvo una sensibilidad diagnóstica del 92% y una especificidad diagnóstica del 90%. La sensibilidad ascendía al 95% cuando se consideró únicamente al grupo de pacientes con cáncer cuya concentración de AFP no era diagnóstica. Además, la red neuronal clasificó correctamente a un paciente con enfermedad hepática crónica y AFP > 500 μg/l, y a 2 pacientes tras la resección del tumor, uno en remisión completa y otro con cáncer residual. Adenocarcinoma pancreático En un estudio aplicado al diagnóstico de adenocarcinoma pancreático10 se incluyeron 3 grupos de individuos: 60 pacientes con cáncer de páncreas en diferentes estadios, analizados antes de la resección del tumor, 60 pacientes con enfermedad pancreática no maligna (26 pancreatitis, 8 tumores neuroendocrinos, 8 quistes pancreáticos, 6 adenomas quísticos y 12 con otros procesos) y 60 individuos de control, aparentemente sanos. El análisis del perfil de EM obtuvo una sensibilidad diagnóstica del 78% y una especificidad diagnóstica del 97%, cuando se emplearon sólo los grupos con cáncer de páncreas y los controles. En esta misma situación, el marcador tumoral CA 19.9, comúnmente utilizado en este tipo de tumores, produjo una sensibilidad del 65% a la misma especificidad (97%). Sin embargo, cuando se comparó el grupo de cáncer de páncreas con controles sanos más pacientes con procesos benignos, el análisis proteómico no mostró superioridad con respecto al Med Clin (Barc). 2005;124(5):181-5

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marcador tumoral. Por último, cuando se utilizaron el CA 19.9 y el perfil proteico combinados, la sensibilidad diagnóstica obtenida fue del 62% con una especificidad del 89%, similar a la obtenida unicamente con el marcador tumoral. Glioma Un último ejemplo sobre la utilidad de los patrones de espectros de masas en el diagnóstico del cáncer a partir de muestras de suero ha sido publicado recientemente, de forma preliminar11. En este caso se estudió a 34 individuos con glioma y 22 individuos normales, y se obtuvo una sensibilidad diagnóstica del 96% y una especificidad diagnóstica del 91%. Proteómica de tejidos y uso de modelos animales para estudios de «prueba de concepto» Dado que los espectros de masas diferenciales que se obtienen en el suero deben provenir de las células tumorales, su análisis directo debería también probar diferencias con el espectro de masas proveniente de células normales. Por otra parte, se han desarrollado ratones modificados genéticamente que constituyen modelos de cáncer que también pueden ser utilizados para la prueba de concepto que se intenta demostrar. Es decir, los espectros diferenciales obtenidos corresponden a proteínas que se expresan y/o secretan diferencialmente por las células cancerosas al medio extracelular. Por otra parte, es posible su validación también en modelos animales que permiten un estudio mucho más exhaustivo y controlado que en el caso de pacientes. Hay ya algunos estudios en este sentido, que se comenta a continuación. Cáncer de pulmón Se ha estudiado el proteoma de 50 tejidos pulmonares, 8 correspondientes a tejido normal y 42 a diferentes tipos histológicos de cáncer de pulmón: 34 tumores primarios de células no pequeñas, 1 tumor carcinoide y 7 metástasis pulmonares (2 de tumor primario de pulmón de células no pequeñas y 5 de tumor primario de otros tejidos)12. Con este grupo se creó un algoritmo de decisión que se aplicó a un grupo de validación consistente en muestras de 32 tumores primarios de pulmón de célula no pequeña, 5 metástasis pulmonares y 6 pulmones sanos. El algoritmo clasificó correctamente el 100% de los casos. Asimismo, fue capaz de separar en todos los casos a los individuos sanos de los pacientes con cáncer primario, y a los individuos con cáncer primario de los pacientes con metástasis. Adicionalmente, también se consiguió, con frecuencias que oscilan entre el 75 y el 100% de los casos, distinguir tipos histológicos de cáncer primario de célula no pequeña. Por último, se demostró la utilidad de los perfiles de espectros de masas en el pronóstico de 66 individuos tras la resección del tumor primario de células no pequeñas. Se encontró que un conjunto de picos del espectro de masas era capaz de separar significativamente a los 66 individuos en 2 grupos: uno con mejor pronóstico (n = 41) con una supervivencia media de 33 meses y otro de peor pronóstico (n = 25) con una supervivencia media de 6 meses. Cáncer de cérvix Con una metodología similar a la anterior12, se ha analizado el proteoma de tejido cervical de 62 mujeres, 35 con cáncer de cérvix de células escamosas y 27 mujeres con procesos

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benignos. El grupo de entrenamiento del algoritmo de decisión estaba formado por 20 muestras de cáncer de cérvix en diferentes estadios (I-IV) y 15 normales. El uso del algoritmo generó en el grupo de validación una sensibilidad diagnóstica del 87%, una especificidad diagnóstica del 100%, un valor predictivo positivo del 100% y un valor predictivo negativo del 56%. Adenocarcinoma de páncreas Un estudio13 realizado con suero de ratones modificados genéticamente, como modelo de progresión de neoplasia intraepitelial pancreática, mostró una sensibilidad diagnóstica del 90% y una especificidad diagnóstica del 87%, tras comparar un grupo de 39 ratones modificados genéticamente con 40 ratones control. El análisis histológico del páncreas de todos los ratones no mostró evidencias de enfermedad invasiva o metastásica en el grupo de ratones modificados genéticamente ni de neoplasia intraepitelial pancreático en el grupo de ratones control. Estos datos demuestran la utilidad de los perfiles proteínicos en el diagnóstico precoz de la enfermedad en un ámbito experimental muy controlado. Limitaciones de estos estudios Los estudios citados, aunque pequeños en número, han generado muchas expectativas en el diagnóstico precoz del cáncer. Quizás por ello mismo han sido y son objeto de intensa discusión y polémica14-16. En el apartado de limitaciones se debe hacer constar, en primer lugar, que el diagnóstico se basa en unos picos de un espectro que representan péptidos de una determinada relación m/z pero que no han sido asignados a ninguna proteína en concreto. Este hecho genera críticas, en parte justificadas, por intentar basar el diagnóstico en proteínas de entidad desconocida. Sin embargo, y visto desde otro punto de vista, esta estrategia diagnóstica puede considerarse como una herramienta de investigación muy útil. En teoría, a partir de los datos obtenidos se debería poder identificar las proteínas que causan las diferencias obtenidas. En segundo lugar, el hecho de que proteínas específicas, como el PSA en el cáncer de próstata y el CA 125 en cáncer de ovario, detectadas en los inmunoanálisis en concentraciones de μg/l no sean detectadas y reconocidas en los espectros de masas analizados por esta tecnología parece indicar una baja sensibilidad analítica del método (detección del orden de mg/l o g/l). Por ello, otras proteínas específicas que se encuentran en concentraciones del orden de μg/l en el suero podrían no ser detectadas. Aunque, en contraposición, también se ha apuntado17 la posibilidad de que algunos fragmentos de estas proteínas específicas se unan a proteínas mayoritarias, como la albúmina o las inmunoglobulinas, y se pueda detectarlas así. En cualquier caso, hay aproximaciones técnicas de EM más sensibles que las utilizadas en la mayoría de estos estudios que ya se están empezando a aplicar a esta área de investigación11. Es posible, pues, que esta limitación sea al menos en parte superable. En tercer lugar, quedan por resolver ciertos temas, como la reproducibilidad y el control de calidad tanto del instrumento como del proceso. En este sentido, se debe subrayar que la Human Proteome Organization, junto con la OMS, la Cruz Roja Americana, la Food and Drug Administration y el National Institute of Standards and Technology trabajan conjuntamente en el desarrollo de materiales de referencia que aseguren la calidad de los resultados y su comparación entre diferentes centros. Asimismo, se trabaja en la protocolización de la recogida, el almacenamiento y el procesamien32

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to de especímenes, así como en el estudio de la influencia de aspectos como el ciclo menstrual, los procesos inflamatorios o la dieta en los perfiles proteínicos18, todos ellos aspectos primordiales en cualquier análisis que pretenda extraer datos de utilidad clínica. Conclusión Los estudios presentados parecen indicar que el análisis proteómico del suero mediante EM es una potente herramienta de investigación dirigida a la identificación de nuevos marcadores biológicos aplicables al diagnóstico clínico. Y quizá, en un futuro, pueda aplicarse incluso directamente al diagnóstico clínico19, a pesar de todas las limitaciones enumeradas. Sin embargo, y antes de plantearse cualquier aplicación asistencial, deberán completarse al menos 2 aspectos: a) la realización de estudios más completos que delimiten mejor el grado de certidumbre (e incertidumbre) existente para cada una de las aplicaciones propuestas, y b) la estandarización de la recogida de muestras y de la metodología empleada.

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