Disaccharidasenaktivität des jejunums subtotal pankreatektomierter ratten

CLINICA

CHIMICA

61

ACTA

~ISA~CH~~RID_4S~NAKTIVIT~T PANKREATEKTOMIERTER

Activity of M&use, createctomized Rats

DES

JE JIJNUMS

SUBTOTAL

RATTEN

Sucrase, and Lactase in the Jejunum

of Subtotally

(95%)

Pan-

Up to go days after operation there was an increase of all enzyme activities. Animals operated more than go days ago showed a decreased activity of disaccharidases in comparison to those operated 80-90 days ago. This result was interpreted as a positive selection of animals because operation. The possibilities of influencing pancreatectomy are discussed.

most of the rats die before the goth day after hydrolysis

and absorption

of disaccharides

by

EINLEITUNG

In friiheren Untersuchungen in vine hatte sich gezeigt, dass pankreatektomierte diabetische Ratten bei Perfusion des Jejunums mit Laktose-Losung signi~kant weniger Laktose spa&en als normale Kontrolltiere (BGhmer, Goberna und Rommel, unveroffentlicht). Es stellte sich die Frage, ob es sich urn eine primare Hemmung der Laktase-Aktivitgit in der Mukosa oder urn eine sekundgre Inhibierung der LaktoseSpaltung durch Anh&rfung der Spaltprodukte Glukose und Galaktose handelt, da Galaktose die Laktase-Aktivitgt hemmt’. Die ~~onosaccharidanh~ufung kann durch gehemmte ~~etabolisierl~ng bzw. ge~lemmten Transport aus der Zelle in die Blutbahn oder durch Hemmung des Monosaccharid-Carriers bedingt sein, der eng benachbart zur Laktase im Biirstensaum der Mukosazelle lokalisiert ist.2. Die vorliegende Untersuchung sol1 zur Reantwortung dieser Fragen beitragen. MATERIAL

UND

METHODIK

Die Versuche wurden an mannlichen Wistar-Ratten durchgeftihrt, welche bei einem Kijrpergewicht zwischen 80 und IOO g nach der von Shapiro und Pincus (3), Clin.

Chim. Acfa, 33 (1971) 61-67

62

B6HMER

et al.

Ingle und Thorn” und Foglias angegebenen Methode subtotal (95%) pankreatektomiert wurden. Nach 14,73, 79,88,96 und 120 Tagen wurden einige Tiere getijtet und die Disaccharidasen-Aktivitaten im Jejunum bestimmt. Als Vergleichsgruppe dienten nicht operierte Wistar-Ratten mit einem Korpergewicht von ca. 200 g. Samtliche Tiere wurden mit normaler Altromin-Kost ernahrt. Nach ra-sttindigem Hungern (Wasser ad libidum) wurden die Tiere getiitet und der Darmabschnitt 30-40 cm distal vom Pylorus entfernt. Das Darmlumen wurde mit gektihlter o.g%iger Kochsalzliisung ausgesptilt, anschliessend wurde die )Iukosa aus dem Darm herausgedriickt. Der Mukosabrei wurde umgehend gefriergetrocknet. Die Homogenisierung der gefriergetrockneten Mukosa erfolgte in 1.4 ml gektihlter o.g%iger NaCl-Losung mit einem PotterElvehjem-Homogenisator in Eiswasser 6 ma1 30 set mit jeweils I min Pause, urn eine starkere Erwarmung zu vermeiden. Im Anschluss daran wurde das Homogenat mit gektihlter o.g%iger NaCl-Losung ad 2 ml aufgeftillt. Von dem Homogenat wurden 0.5 ml zur RNS- und DNS-Bestimmung entnommen, aus dem Rest erfolgte die Disaccharidasen-Bestimmung. Dazu wurden mit o.g%iger NaCl-Lbsung folgende Verdtinnungen hergestellt : I. Zur Laktasebestimmung Verdiinnung I + I. 2. Zur Saccharasebestimmung Verdiinnung 1+9. 3. Zur Maltasebestimmung Verdtinnung 1+49. Samtliche Verdiinnungen wurden auf dem Rtittler gut gemischt. Die Disaccharidasen-Bestimmung erfolgte nach folgendem Inkubation freigesetzte

des Darmhomogenates mit verschiedenen Glukose mit Hilfe von ATP, Hexokinase

Prinzip : Nach

Disacchariden wurde die und Glukose-6-Phosphat-

Dehydrogenase im U.V.-Test bestimmt (Testpack Boehringer, Mannheim). Substratlosungen dienten 0.056 M Liisungen der entsprechenden Disaccharide 0.1 M Maleatpuffer von pH 5.8 : MG 360: 1.008 g Maltose Saccharose MG 342: 0.958 g ad 50 ml Maleatpuffer MG 360: 1.008 g Laktose

Als in

Herstellung des 0.1 M Maleatpuffer pH 5.8 5.80 g Maleinsaure wurden in ca. 70 ml I N NaOH und ca. 400 ml dest. Wasser gel&t. Der Puffer wurde exakt auf pH 5.8 eingestellt und anschliessend mit Wasser ad 500 ml aufgeftillt. Bestimmwng der Disaccharidasen Die Bestimmungen der Maltase, Laktase jeweils als Doppelbestimmungen durchgeftihrt.

und Saccharase-Aktivitat

wurden

Reaktionsansatz im Eppendorf-Reaktionsgefiiss I. Probe : IOO ,ul Substrat + IOO ~1 Enzymverdiinnung. 2. Substratleerwert: IOO ~1 Substrat+roo ~1 0.9% NaCl. 3. Enzymleerwert: IOO$ Enzymverdtinnung+roo $0.9 NaCl. Urn vorzeitige Hydrolyse zu vermeiden, wurden zuerst die Substrat- und NaCl-Losungen, zuletzt in rascher Folge die Enzymverdtinnungen einpipettiert. Die Reaktionsgefasse wurden verschlossen, auf dem Rtittler kurz geschtittelt und auf dem Eppendorf-Thermostaten bei 37” genau eine Stunde inkubiert. Die enzymatische Hydrolyse Clin. Chim.

Acta,

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DISACCHARIDASEN

DES JEJUNUMS

wurde durch Eintauchen

IN RATTEN

63

der Gefasse in kochendes

Wasser fiir

Nach Abkiihlung der Losungen wurden sie zentrifugiert fiir die Glukosebestimmung verwendet.

2

min unterbrochen.

und IOO ,ul vom Uberstand

Da Disaccharide bei der Glukosebestimmung durch die zur Enteiweissung benijtigte Perchlorsaure schnell hydrolysiert werden, wurden die Messungen mijglichst bald nach Zusatz der Perchlorsaure durchgeftihrt. Vor allem bei der Bestimmung der aus Saccharose freigesetzten Glukose sollte der Substratleerwert unbedingt gleichzeitig mit den Analysen gemessen werden. Zur Kontrolle einen Gluckosestandard (IOO rng% Glukose in gesattigter laufen. Bereclznung der Enzymaktivitiiten Die Aktivitaten der Disaccharidasen

werden

(I.U.) angegeben. Eine I.U. ist die Enzymmenge, freisetzt. Fur Maltase ergibt sich die Formel: I.U./z

ml/Homogenat

= mg%

Fur Laktase und Saccharase I.U./z

ml/Homogenat

(F = Verdtinnungsfaktor

G1ukose 540

liessen wir in jeder Serie Benzoesaurelosung) mit-

in “internationalen

Einheiten”

die bei 37’ in I min I ,uMol Substrat

F

ergibt sich: rng% Glukose = -~~~ 270

F

des Homogenates)

RN.5 lDhT.S-Bestinzmung Die Bestimmung der DNS erfolgte mit Hilfe der Diphenylamin-Reaktion Dische in Anlehnung an die von Schneider7 angegebene Methode. Die Bestimmung der RNS erfolgte mit der Orcin-Probe in Anlehnung Methode von Mejbaums.

nach an die

ERGEBNISSE

Das Verhalten der Disaccharidasen-Aktivitaten und des RNS/DNS-Quotienten nach subtotaler Pankreatektomie ist aus Tab. I und Abb. I zu ersehen. Bei allen drei untersuchten Enzymen (Maltase, Laktase und Saccharase) kommt es zu einer Aktivitatsvermehrung bis ca. zum 80. bis 90. Tag post operationem. Anschliessend erfolgt wieder ein Abfall der Enzymaktivitaten. Der RNS/DNS-Quotient bleibt konstant bis auf geringftigige Schwankungen, die in keinem Falle signifikant sind. Beim statistischen Vergleich der Maltase-Aktivitaten mit dem Normalkollektiv zeigt sich, dass mit Ausnahme des 120. Tages post operationem samtliche Aktivitatssteigerungen signifikant sind. Die Steigerung der Laktase-Aktivitat gegentiber Normaltieren ist vom 73. bis 96. signifikant, keine Signifikanz besteht am 14. und 120. Tag. Die Steigerung der Saccharase-Aktivitat gegentiber Normaltieren ist mit Ausnahme des 14Tage-Wertes zu allen Zeiten signifikant (Tab. II).

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Ada,

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stimfm et al.

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120 loge noch Operatton

Abb. I Disaccharidasen-_4ktivit&tcn subtotaler Pankreatektomie. --?--:Trase/DNS, -A-A-Lalctase/DNS.

TABELLE

I PRO

DISACCHARIDASENAKTIVIT.~TEX TOTALER

(mu/;))

DXS-GEHALT

UKD RNS/DNS

~UOTIEZ;T PACH

SUB-

PANKREATEKTOMIE

Laktase/DNS

Saccharase /DNS

Tage I4

73

4 3.2x0

4

1305

I.531 0.765

5 IO.588 4.622 r.ob7

0.903

9 9

4 0.146

SEM

0.057 0.028

N

post op.

Kontvoll-

tier?

SEX1

5.665

0.2j7

o.o.+o

0.115

0.018

5 3.210

5 I.796

5 1.864

0..+21

0. j40

0.865 0.387

0.272 O.I22

5 2.158

5 I.726

0.579 0.259

0.353 0.158

0.203

5 2.2_+0

SEA1

0.5’4 0.257

0.375 0.187

0.338 O.I5I

0.793 0.355 5 0.194

0.233

4 2.178

3.353 I.450 5 0.492

5

4 2.188

5 5.260

5 0.646 0.205 0.092

5 2.o.p 0.52I

N x

5 9.746

5 0.571 0.097 o.o44

1.x+1

0.241

0.135

120

-1.117

0.188

0.269

96

I.403 0.628

5 3.0’4

0.097

s SBJI

61-67

3

12.538

5 3.702 I.OI9 0.456

0.218

4 0.708 0.476 0.238

C&x. Chim. Acta. 33 (1971)

5 r1.5q

88

5 0.704

0.300

4

7Y

-l 0.235 0.076 0.03x

h

r

RNS /DM

(mlT/y) und RNS/DNS-Quotient im Ratten-Diinndarm nach RNS/DNS, -:--‘\Maltase/DNS, -O-OSaccha-

2.482 0.455

DISACCHARIDASEN TABELLE

IN RATTEN

65

II

SIGNIFIKANZPRtiFUNG

Kontrolltiere Kontrolltiere Kontrolltiere Kontrolltiere Kontrolltiere Kontrolltiere

DES JEJUNUMS

gegen gegen gegen gegen gegen gegen

DER

14

73 79 88 96 I 20

DISACCHARIDASENAKTIVITkTEN

Tage Tage ‘rage Tagc Tage Tage

MIT

RNS/DNS

Maltase

P

P


(0.05 <0.0125 <0.0005 <0.0025

DEM

STUDENT-t-TEST

Saccharase

Laktase

P - ~__________

P
co.10

<0.0025

<0.0005 < 0.0005 <0.0005 <0.005 <0.0005

<0.0005 <0.0025 <0.05 (0.10

DISKUSSION

Nach subtotaler Pankreatektomie verbleiben noch ca. 5% des Pankreasgewebes. Mannliche Ratten entwickeln einige Wochen nach der Operation im Anschluss an einen zunachst latenten Diabetes einen manifesten DiabetesgIl mit Anstieg des Glukose-Ntichternspiegels, signifikanter Verminderung

pathologischen Glukose-Belastungsproben, geringer nicht des immunologisch messbaren Insulins (IMI) im Ntichtern-

blut und fehlendem Anstieg des IMI nach intravenoser Glukose-Belastung”. Subtotal pankreatektomierte Ratten spalten in viva signifikant weniger Laktose als gesunde Kontrolltiere (Bohmer, Goberna und Rommel-unveroffentlicht). Dieser Effekt kann entweder durch primare Hemmung der Laktaseaktivitat oder durch sekundare Hemmung der Laktosespaltung als Folge einer Anhaufung der Spaltprodukte Glukose und Galaktose bedingt sein. Zur Beantwortung dieser Frage wurde die vorliegende Untersuchung durchgeftihr t . Alle drei untersuchten Enzyme-Laktase, Saccharase und Maltasezeigten nach Pankreatektomie eine signifikante Aktivitatszunahme bei gleichbleibendem RNS/DNS-Quotienten. Aus der Konstanz des RNS/DNS-Quotienten kann geschlossen werden, dass keine gesteigerte Proteinsynthese in der Mukosa stattgefunden hat. Das bedeutet, dass es sich nicht urn eine mengenmassige Zunahme an Enzymmolekiilen, sondern nur urn eine Aktivitatssteigerung bereits vorhandener Enzyme handeln muss. Maltase und Laktase steigen maximal auf etwa die vier- bis ftinffache Aktivitat an, wahrend die Saccharase-Aktivitat auf das Zehnfache gesteigert wird. Der Abfall der Enzymaktivitaten nach etwa 90 Tagen post operationem beruht mijglicherweise darauf, dass die meisten Tiere im Zeitraum 70-90 Tage nach der Operation an ihrem Diabetes sterben. Es ist denkbar, dass die Steigerung der Disaccharidasen-Aktivitaten nach Pankreatektomie mit der Schwere des Diabetes zunimmt. Die nach IOO Tagen noch tiberlebenden Tiere stellen eine positive Auslese entweder mit geringer ausgepragtem Diabetes oder mit erhiihter Widerstandskraft dar, so dass die Abnahme der Disaccharidasen-Aktivitaten nur scheinbar ist. Die Ergebnisse dieser in vitro-Untersuchungen mit Erhiihung der Disaccharidasen-Aktivitaten steht zunachst im Widerspruch zu den Resultaten nach in vivoPerfusion des Jejunums pankreatektomierter Ratten mit Laktose-Losung, wobei sich eine verminderte Laktose-Digestion zeigte (Bohmer, Goberna und Rommelunveroffentlicht). Der scheinbare Widerspruch kann folgendermassen gedeutet werden Diabetische Ratten eine erhiihte Disaccharidasen-Aktivitat in der Clin. Chim.

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et d.

Mukosazelle. Nach CraneI gibt es im Btirstensaum der Mukosazelle zwei verschiedene Arten von Monosaccharid-Carriern, Carrier A und B. Carrier A ist der bekannte Na+abhangige Transportcarrier, wahrend Carrier B die aus den Disacchariden entstehenden Monosaccharide transportiert. Die Beziehungen zwischen Membran-Disaccharidasen und Carrier B sind ebensowenig bekannt wie die Beziehung zwischen den beiden Carriern A und Br2. CraneI sowie Olsen und Rosenberg14 fanden bei in vitro-Untersuchungen am Dtinndarm diabetischer Ratten eine gesteigerte Aufnahme aktiv transportierter Monosaccharide, also eine Funktionssteigerung des Carriers A. Eine selektive Hemmung des Carriers B bei pankreatektomierten Tieren hatte zunachst eine Anhaufung der Disaccharidspaltprodukte vor dem Carrier zur Folge. Da z.B. Galaktose die Laktase-Aktivitat hemmtr, kommt es sekundar zu einer Verminderung der Laktose-Spaltung, wie sie bei in viva-Perfusion des Diinndarmes gefunden wurde. Die ursachliche Beteiligung des Carriers B an der nach Pankreatektomie verminderten Laktosespaltung kann bei in vitro-Untersuchungen am Mukosa-Homogenat nicht nachgewiesen werden, da bei der Disaccharidasen-Bestimmung die nach Inkubation mit dem entsprechenden Substrat enstehende Glukosemenge im Homogenat bestimmt wird. Da die Zellen der Mukosa zerstijrt sind, kommt eine Carrier-Hemmung mit folgender Einschrankung der Laktase-Aktivitat nicht in Betracht. Die entstehenden Monosaccharide verteilen sich im Gesamtvolumen des Homogenates, so dass es am Orte der Laktase nicht zu einem so hohen Galaktose-Anstieg kommt, der die weitere Laktase-Aktivitat hemmen wiirde. Unsere Beobachtungen von einer nach Pankreatektomie verminderten Laktosespaltung in viva und gesteigerter Disaccharidasen-Aktivitaten in vitro lassen sich also in bestehende Konzepte von der Organisation der intestinalen Absorption einfiigen, wenn man davon ausgeht, dass zwei Carriersysteme vorhanden sind12 und dass Galaktose die Laktaseaktivitat hemmtl. Die Maltase-, Saccharaseund Laktase-Aktivitaten im Diinndarm subtotal (95%) pankreatektomierter Ratten wurden untersucht und mit normalen Kontrolltieren verglichen. Bis ca. 90 Tage post operationem kam es zu einem Anstieg aller untersuchten Enzyme. Bei Tieren, die vor mehr als 90 Tagen operiert worden waren, fielen die Disaccharidasen-Aktivitaten wieder ab. Dieses Ergebnis wird als Folge einer positiven Auslese der Versuchstiere gedeutet. Die Moglichkeiten einer Beeinflussung der Disaccharidspaltung und -absorption durch operativ erzeugten Diabetes mellitus werden diskutiert. DANK

Diese Arbeit wurde Godesberg) durchgeftihrt.

mit

Hilfe

der Deutschen

Forschungsgemeinschaft

LITERATUR I G. SEMENZA, in: Handbook ofPhysiology, Vol. III, (1968) Amer. 2 R. K. CRANE, Amer. J. Clin. N&r., 22 (1969) 242. 3 R. SHAPIRO mm G. PINCUS, Proc. Sot. Exp. Biol.. 4 D. J. INCLE UND G. W. THORN, Amer. J. Physiol., 5 v. G. IiOGLIA, Rev. SOC. Arg. Biol., 20 (1944) 21. 6 Z. DISCHE, Mikvochemie, 8 (1930) 4. Clin.

Chim.

Acta,

33 (1971) 61-67

Physiol.

34 (1936) 416. 132 (1941) 670.

Sm.,

p. 2543.

(Bad

DISACCHSRIDASEN

DES

JEJUNUMS

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IN RATTEN

W. C. SCHNEIDER, J. Biol. Chews., 161 (1945) 293. MEJBAUM, 2. Physiol. Chem., 258 (1939) 117. 9 V. G. FOGLIA, R. BORGHELLI, R. A. CHIERI, E. FERNAXDEZ-COLLAZO, J. SPINDER UTXD 0. WESELY, Diabetes, 12 (1963) 231. F. H. MARTIN UND P. E. LA&, Diabetes, 12 (1963) 328. IO R. GOBERNA, R. D. FUSSGXXGER, S. RAPTIS, H. DITSCHUNEIT UND E. F. PFEIFFER. Hormone II Metab. Res., I (1969) 175. Conference on Biochemical and 12 R. K. CRANE, in K. ROMMEL uxi~ P. H. CLODI (Herausg.), Clinical Aspects of Sugar Absorption, F. K. Schattauer Verlag, Stuttgart, 1970. Biophys. Res. Commun., 4 (1961) 436. 13 R. K. CRANE, B&hem. 14 W. A. OLSEN UND J. H. ROSENBERG, J. Clin. Invest., 49 (1970) 96.

s7 W.

Clin.

Chim.

Ada,

33 (1971) 61-67