Dünnschichtchromatographie der 2,4-dinitrophenylderivate wasserdampfflüchtiger amine und ihre anwendung auf die trennung pflanzlicher amine

JOURNAL

OF CHROMATOGRAPHY

119

C$-IIIOAM.Go77 DUNNSCHICHTCHROMATOGRAI’HIE 2,+DINITROPHENYLDERIVATE UND

IHRE

ANWENDUNG

DER WASSERDAMPFFL~CHTIGER

AUF

DIE

TRENNUNG

PPLANZLICHER

AMINE AMINE

SUMMARY

Three solvent systems are described for separating the dinitrophenyl derivatives of steam volatile amines (DNP-amines) on Silica Gel HI;,,,. The solvent system pentane-acetic acid-isoarnylester-ammonia (70~9 :I) is particularly useful for the separation of amines found in biological materials. The separation of higher homologous aliphatic monoamines, and the isomeric propylamines, butylamines, and amylamines, which is not practicable with these solvents, has been carried out successfully by using a chromatogra.phic system described by SCHWARTZ et al. lo. Some examples are given to illustrate the efficiency of th,is method. Thus the occurrence of octylamine (apple fruit) and of a-methylbutylamixre (Lyclz& coro?aaria) has been demonstrated in plants for the first time. DNP-amines separated on Silica Gel H can be determined quantitatively by spectrophotometric methods after elution with methanol.

EINLEITUNG

Die durch alkalische Wasserdampfdestillation aus biologischem Material isolierbaren Amine stellen eine verhgltnism%ssig einlreitliche Fraktion dar, die sich, von wenigen Ausnahmen abgesehen (PA A, &A) *, aus den homologen aliphatischen Monoaminen zusammensetzt. Diese im Pflanzenreich weit verbreitet, zumeist in Gemischen, vorkommenden Amine192 lassen sic11 als Salze, zumeist Hydrochloride, oder in Form geeigneter Derivate auftrennen. Wghrend sich zur Trennung der hydrophilen Aminhydrochloride die Papierchromatographie bewtihrt3, bietet sic11 zur Trennung der lipophilen Aminderivate die, Diinnschichtchromatographie (DC) an. Zur Trennung der Amine nach uberfilhrung in geeignete Derivate liegen zahlreiche VorschKge vor : 3,g-Dinitro~Nitroazobenzolcarbons&ure-+smideO; r-Dimethylaminonaphtalinbenzamide4*b; /3- PhenylazobenzolsulfonarnidefO; 2,6 - Dinitrophenylhydrazon5 -sulfonamide’ -0;

W.-I.ILERT, T. I-IARTMANN

120

4-Dimcthylamino-3,5-dinipyruvamidelr ; /3-Aminovinyl-o-l~ydrosyphenyll~etone~z; z,4-Dinitrophenylaminel41”“. trobenzoylamider3; Bei eigenen Untersuchungen haben sich die zuletzt genannten Dinitrophenylderivate (DNP-Amine) besonders bcw~hrt 10J7. Die im folgenden beschriebene Methode erlaubt die DC-Trennung aller bisher aus der Natur bekannten wasserdampffllichtigen primaren und sekundairen Amine, einschliesslich der problematischen Propyl-, Butyl-, und Amylamine. EXPERIMENTELLES Die Aminestraktion aus biologischem durch all~aliscl~e Wasserdampfdestillation~~lfl.

Material

erfolgte

in bekannter

Weise

Zur Synthese der Testsubstanzen werden 5 mmol Amin-I-ICI und 5 mmol z,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB) in 50 ml Aceton mit einer L&sung von IO mmol NaHCO, in 50 ml Wasser gemischt und 40 min bei Go” gehalten. Nach dem Abktihlen wird etwas festes NaHCO, zugesetzt und das DNP-Amin durch Ausschiitteln mit Ather extrahiert. Die vereinigten Atherextrakte werden mit Na,SO, sicc. getrocknet und eingedampft. Das DNP-Amin wird dreimal aus heissem Methanol (DAA aus 96 y0 Athanol) umkristallisiert. Zur Umsetzung van Aminfraktionen aus biologischem Material fur qualitative und quantitative Untersuchungen siehe HARTMANN”O.

DC-Platten werden in tiblicher Weise mit Kieselgel HI?,,, (Merck) 0.25 mm dick beschichtetl8. Vor Gebrauch wird 2 h bei IIOO aktiviert. Fliessmittel: (AI) Pentan-Essigsaure-isoamylester-Ammoniak (70:2g :I); (AII) Benzol-&hylacetatPetrolather(Siedeber.4o-Go”) (97 :2:I); (AIII) Pentan-Benzol-Tri~thylamin (45 :45 : IO). Zur Detektion der DNP-Amine gentigt in der Regel die Betrachtung im UVLicht (254 nm). Trennsystem in Anlehnung an SCHWARTZ et al.lO: 14 g bei Soo” 16-h gegltlhtes MgO (Merck $366) werden mit 7 g Kieselguhr (Merck SI2g) in einem Gemisch aus S ml Poly~thylenglykol-4oo (Fluka) und 45 ml &hanol in einem festverschlossenen Kolben 5 min kr&ftig geschtittelt. Ein’ gelegentliches Verklumpen des Gemisches I%st sich durch Zusatz einiger weiterer Milliliter &hanol beheben. Die wie tiblich beschichteten Platten werden 15 min’luftgetrocknet und anschliessend IO min bei IIO' aktiviert. Als Pliessmittel dient ?s-Heptan, gesattigt mit Poly#thylenglyk.ol-4oo (AIV). Zur i%iquilibrierung der I
1’2~ B Kieselgel

H ore 20 x 20 cm Platte)

DC

DER 2,4-DINITROPNENYI;D~RIVATI!:

~VASSI?RDr\~PPI;l.fSC~TIG~R

AMINE

121

oder AI1 entwickelt. Man kratzt die gewtinscbte Aminzone aus, estralliert wablweise mit Methanol oder nacb Zugabe einiger Milliliter wassriger NaHCO,-LBsung tmit &her. Die Estrakte werden zur Trockne eingedampft und im geeigneten System analytiscb recliromatograpliiert.

Man verwendet an Stelle von Kieselgel HI?,,.,, Kieselgel I-I obne Pluoresaenzindikator, tragt die zu bestimmende nacb HARTMANN’~~ quantitativ gewonnene DNPAminprobe stricbfijrmig (G cm) aus einer Mikroliterspritze auf und cntwickelt mit AI. Die zu bestimmenden Substanzzonen werden sorgfnltig ausgekratxt und in einem festversclilossenen Zentrifugenglas mit 5.0 ml Methanol unter lir5ftigem Schtitteln estrabiert, Als Blindwert wird eine entsprecbend grossc, aminfreie Kieselgelzone estrabiert. Nacb Abzentrifugieren des Kieselgels wird der l%erstand bei 350 nm (D = LO mm) gegen den Blindwert im Sl~ektralpbotometer ausgemessen. ERGEI3NISSE

In Tabelle I sind die RF-Werte der liberprtiften DNP-Amine in vier Trcnnsystemen zusammengefasst. Die RF-Werte sind, wie zumeist bei DC, nur annabernd reprocluzierbar, so dass es sic11 empfieblt, zur sicheren Identiiizierung stets Testsubstanzen mitzucbromatograpbieren. Die Fliessmittel AI, AII, und AI11 lassen sic11 zu aweidimensionalen Systemen kombinieren. Mit ihnen gelingt bis auf die Trennung der b6beren Homologen des I-ISA, der isomeren Propyl- und Butylamine, und der Abtrennung. von MRA von

nQA AIIA MMQA 0 MAA a L t

NH30 + 2. AI!

0 ODMA

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OBzA

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,.D#A 1 ‘AIIA I ‘-&A : 1 “MMPA : :\MA : ‘DMA : “NW3 i : : :

Fig. I. Zwciclimcnsionnlc Trermung cler DNP-Dcrivate

wassc~~nmpfflt~chtibtcrAmine an Kieselgcl

H.-I. ILERT, T. HARTMANN

122

‘.l.ABELLE

I

DER DNP-AMINE IN VEHSCNIEDENEN DC TRENNSI-STEMEN Flicssmittcl: (AI) Pcntan-EssigStationdre Phasen : Kicscl~ol I-IF,,, und Poly~thylcnglyltol. sLure-isoamylestcr-Ammonial< (70 :zg :I) : (AII) l3enzol-Athylacctat-PctrolBthcr (97 :2 :I) ; (ATIJ) (45 :45 : IO) ; (AIV) ,ir-Hcptau, scs&ttifit init Poly~thylcn~lyltol Pcntan-Benzol-‘l’ritithylnnlin (Lit. 19). Erfassungsgrcnzc cler Mcthocle: 10':~ j~.inol. - --....- ._--_---__I_._ --.- .- _---.----...-__ ____. ._.,__ ^. -._--__.____-__-.~---_.--_ ..-.- ----...----.

Rp-~vE~-133

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I)NP-

Arnmonialt lMcthylarnin l~inlctllylaniin Kthylamin Di!lthylainin ~+Propylaniin Isopropylaniin Ic-l3utylaniin Isobutylamin +Amylarnin Tsoaniylaniin z-iMcthylbutylnmin ,n-I-Tcsylamin Ir-Heptylaniin If,-Octylaniin g&-Decylamin ?t-Unclecylarnin Allylainin P-Phcnyl~thylamin 3-~Methylmcrcaptopropylamin l3cnzylaniin

IS2

I79 S5 113.5 79,s 95 94.5 90 s ;: 91.5 4.6-47 51 R n 42.5 n.b.b

0.12 0.21 0.1g

0.32 0.42

0.50 o-49 0.64 0.66 0.75 0.79 0.75 0.s4 o.sg

0.93 0.97 n.b.b

0.13 0.33 0.39 0.44 OS54 0.52

o-53 0.60 o.57 0.66 0.64 0.65 0.70 0.73 0.75 0.78 1l.b.”

0.03 0.30 0.3-F 0.59 0.69 0.75 0.74 0.231 o.S2

0.85 o.Y6 0.85 0.W 0.58

-’ ‘0.90 o.g2 1l.b.b

0.28

0.47 0.54 0.30

0.62 0.66 0.57

0.58

0055

0.67

RCMPA

68-75 I55 63

o-43 0.52

13zA

117.5

._._..____.______

0.00

0.01

0.03 o*o!? 0.13 0.10 0415 0.16 0.19 0.23 0.24

0.26 0.32 0*4 I 0.50

0.67 0.73 0.02 o.o_c

0.03

0.03

fi Hp.4 uric1 OA sincl bci I.~aumtcmperatur Attssig. Hph ltonnte bci -15” zur Kristallisntion gcbracht werclen. OA erstarrtc zwar unter cliescn Beclingunjien, ltristallisiertc abcr nur schlccht a.us. b

n.b. = nicht bcstimmt.

nAA die Trennung aller untersuchten Amine. AI trennt im eindimensionalen Verfahren am besten und ist zur ersten Oberprtifung eines unbekannten Amingemisches am geeignetsten. Die mit diesem Fliessmittel nicht trennbaren Paare MA-DMA, AA-MMPA, und DAA-AllA lassen sic11 im zweidimensionalen System (AI/AH) gut trennen (Fig. I). Zur Trennung von PA und PAA, die such mit diesem System nicht gelingt, muss AI mit. AI11 kombiniert werden. Bei der Analyse von Amingemischen aus biologischem Material ist die Trennung durch die oft sehr unterschiedlichen,IConzentrationen der einzelnen Amine erschwert. Zur sicheren Erfassung such der in sehr geringen Mengen vorhandenen Amine etipfiehlt sic11 eine eindimensionale prgparative Vortrennung, Elution der interessierenden Aminbanden und analytische Rechromatographie im jeweils gtinstigsten System. Bei der pr¶tiven Vortrennung von Aminextrakten aus Bltitenpflanzen beobachl$Len

wir,nelePenllich’eine

nicht

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.Srrhn+a.nz.. rlie in AT m+a-

St-l~wan~-

DC

DER

2,+DINITROI’HENYL,DERIVATE

WASS~RDAMPFI;LljCHTIC;ER

AbIlNE

In diesem Fall ist mit AI1 vorzutrennen, da die Substanz in diesem Fliessmittel htiheren RF-Wert als NsA aufweist und die Trennung nicht st8rt.

Eine

wertvoll,;

123 einen

Erg5nzung zu den oben besprochenen Trennverfahren ‘ist die von SCHWARTZ ct ul.19 zur Trennung der homologen primsiren und sekund#ren Amine als DNP-Derivate beschriebenc Methode (Tabelle I, AIV). Mit dieser Methode lassen sic11 nicht nur die h6heren homologen &Ionoamine einwanclfrei trennen, sondern es gelingt such die bisher nur in Einzelf~~llen~3~2° mijgliche Trennung der isomeren Amine. Die folgenden 13eispiele sollen die Leistungsf~higkeit dcr Methode verdeutlichen. IYiilWW lEontolo@ Mo9zonnciW? (Fig. 2.4). Die mit der Methode einwandfreie Trennung der homologen aliphatischen Monoamine bis zum DA veranlasstc uns, ein bereits frliher2” bei der papierchromstographiscllen Analyse der Arninfraktion aus .&pfeln beobachtetes Amin mit etwas hiiherem Rp-Wert als HsA erneut xu untersuchen. Nach przparativer Vortrennung des DNP-Amingemisches aus ;6ipfeln der und Rechromatograpllie der interessierenden Zone, liess Sorte “Golden Delicious” sich das fmgliche Amin als das bisher aus der Natur nicht bekannte Octylamin identifizieren. 0 ~13)~ Die beiden Propylamine werden gut getrennt. Das in Pvo&&z&~zc (IT‘&. Propylamin konnte so der Aminfraktion von Mercu~ialis +w-rennis 1,. nacligewiesene als ,iPA identifiziert werden. Auch in diesem Fall wurde zur Abtrennung der Hauptamine (MA, iAA) zunZchst eine prsparative Vortrennung durchgefiihrt. l#sst siclr ein iBA1+U&lnllailzc (Fig. aC). Wegen der geringen RF-Differenzen ?zBA-Gemisch nicllt zu scharf voneinander abgesetzten Flecken auftrennen. Eine sichere Identifizicrung der beiden Isomeren gelingt jedoch durch Cochromatogrnphie. Hierbei empfiehlt es sich die Analyse strichfijrmig mit den beiclen punlctf6rmig an (A) Fran!

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1

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I24

T. WARTltlANN

den Strichenden aufgetragenen Testsubstanzen zu chromatographicren. Auf diese Weise liess sich das BA aus lWe~zrriaZis peg#elz& als iBA identifizieren. f ~ylnz&~e (Fig. 20). Die isomeren Amylamine urnfassen uAA, ,iAA und MBA. Mit dem Fliessmittel AIV gelingt die Abtrennung des MBA VOID den beiden anderen, Isomeren. Letztere lassen sich jedoch nach mit diesem System nicht trennbaren, in Kombination mit Elution aus der Platte mit dem Fliessmittel AI - gegebenenfalls ALI -auf Kieselgel voneinander trennen (Fig. I). Mit diesem Verfahren konnten wir aus dem Aminextrakt von Lychzi’s corounrin neben iAA such das bisher aus der Natur nicht bekannte z-Methylbutylamin nachweisen.

DNP-Amine lassen sich papierchromatographisch quantitativ tremlen und bestimmenl~~sl, Die quantitive Aminbestimmung ist such in Kombination mit DC mGglich. Eichkurven der an Kieselgel H mit dem Pliessmittel AI getrennten und nach Elution mit Methanol bestimmten DNP-Amine verlaufen linear. Die molaren Extinktionskoeffizienten (a) der DNP-Amine liegen etwas niedriger als bei direkter Bestimmung ohne Chromatographie (z.B. ?&PA, E = 1.735 104 bzw. x.794’ ro4 ; HxA, Trennung nicht E = 1,765 9 104 bzw. r.840* rod), Diese bei der chromatographischen vermeidbaren Verluste von 3 bis 4 o/osind konstant, machen jedoch die Aufstellung eigener Eichkurven notwendig. Der fur die Bestimmung gtinstigste Estinktionsbereich liegt bei 0.2-0.6, entsprechend 0.06-0.17 ,umol Amin pro Bestimmungsansatz (5 ml). Leerextrakte zeigen irn Messbereich der DNP-Amine (350 nm) eine nur geringe und konstante Absorption (E = 0.002-0.003 pro cm2 I
ZUSAMMENFASSUNG

Drei Fliessmittelsysteme zur Trennung wasserdampffltichtiger Amine in Form ihrer Dinitrophenylderivate (DNP-Amine) an Kieselgel HI?,,, werden beschrieben. Resonders geeignet zur Auftrennung von Amingemischen aus biologischem Material ist das System Pentan-Essigsaure-isoamylester-Ammoniak (70 :2g : I). Die mit diesen Systemen nicht mijgliche Trennung der h8heren homologen aliphatischen Monoamine lasst sich mit dem von SCHWARTZ und isomeren Propyl-, Butyl-, und Amylamine et aZ.10beschriebenen Verfahren erreichen. An einigen Beispielen wird die Leistungsfahigkeit der Methode verdeutlicht. So gelang der chromatograpbische Nachweis des aus der Natur bisher nicht bekannten Octylamins aus Apfeln und des 2-Methylbutylamins aus Lyc&zis corona& Die an Kieselgel 1-I aufgetrennten DNP-Amine lassen sich nach Elution mit Methanol spektralphotometrisch quantitativ bestimmen. LITERATUR V. %VdIENSlCI, Phda, 50 (1957) 515. SMITH, Riol. Rev., 46 (1971) 201. 3 E. STIZIN v. KAMIENSKI; Planla, 50 (1957) 291. 4 M. Vdi~An UND J. GASPARIC, Cium. Ilad., (1957) 263. 5 M. VECHZA UND J, GASPARI~, CoZlecl. Czccl~ Clrem. Cornmtcn., 24 (1959) 6 G. NEURATH UND E, DCJRK, ChemLBev.! 97. (rg64) 172: I

E.

z T.

STEIN

A.

465.

DC

DER

2,4-DINITROPW~NYLDERIVnTE

WASS~RDAMPFPLijCHTIGER

AMINE

=25

,/.Cfuorrrntog~.,71 (1972) 119-125