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Effet des analogues de la L -thréonine et de la L -isoleucine sur la L -thréonine désaminase
J. Mol. Biol. (1962) 4, 220-225
Effet des Analogues de la L-Threonine et de la t-Isoleucine sur la L-Threonine Desamlnase Studies on the enzyme r.-threonine dcsaminase have revealed the existence of two receptor sites: the active receptor (A) and the inhibitor receptor (I). Attachment at I modifies binding at A. Enzymatic activity requires combination at A; this combination is reduced by the presence of inhibitor, L-isoleucine, at 1. L-valine, although not an inhibitor, is also attached at I and thereby protects the enzyme from L-isoleucine inhibition.
Dans une publication reoente (Changeux, 1\)61), nous avons montre que les proprietes remarquables de la t-threonine desaminase a I'egard tant de son substrat, la t-threonine, que de son inhibiteur specifique, la L-isoleucine, ne peuvent pas s'expliquer par I'hypothese classique d'une exclusion simple du substrat par l'inhibiteur. Les resultats obtenus nous ont conduit a proposer un modele qui suppose l'existence, a la surface de cet enzyme, a cote du recepteur actif (A), d'un autre recepteur dit recepteur inhibiteur (I). D'apres ce modele, les proprietes du site actif seraient modifiees selon la nature du compose fixe sur Ie recepteur inhibiteur. Ces interactions obeiraient aux regles suivantes: 1. La reaction a lieu lorsqu'une molecule de t-threonine est fixee sur Ie recepteur actif. 2. L'affinite du recepteur actif a l'egard de la t-threonine est accrue lorsque Ie recepteur inhibiteur est egalement complexe par une molecule de t-threonine. 3. L'affinite du reeepteur actif a l'egard de la t-threonine est diminuee lorsque le recepteur inhibiteur est complexe par une molecule de L-isoleucine. 4. Le recepteur actif presente une faible affinite pour la t-isoleucine. Cette affinite est accrue lorsque le recepteur inhibiteur est complexe egalement par une molecule de L-isoleucine. Le fait essentiel qui conduit a formuler de telles hypotheses est que la cinetique d'action de l'enzyme natif (en fonction de la concentration de t-threonine ainsi qu'en fonction de la concentration de L.isoleucine, a un pH voisin de 8) parait suivre une loi bimoleeulaire, tandis que divers traitements qui suppriment la sensibilite de l'enzyme it la L-isoleucine entrainent du meme coup une normalisation de la cinetique d'action en fonction de la concentration de t-threonine. Nous apportons ici de nouvelles donnees experimentales qui confirment lea hypotheses essentielles exprimees par Ie modele ci-dessus. En premier lieu, comme Ie montrent les Figures 1 et 2, aux pH voisins de 11, l'enzyme devient insensible a l'effet inhibiteur de la L-isoleucine et on constate que, correlativement, la cinetique d'action en fonction de la concentration de L-threonine est normalisee. En second lieu, si les hypotheses formulees sont adequates, il y a lieu de prevoir que deux series de corps, les uns analogues de la r.-threonine, les autres analogues de 220
LETTERS TO THE EDITOR
1jV
221
/ pH 10.65
7.70
/ 10.28 8.15
x'"
0.200
0.100
[~] (L-threonine) Mj200
Mjo4OO
Mj800
FIG. 1. Effet du pH Bur la cinlltique d'action de la L-threonine deeaminase en fonction de La concentration de L-threonine. Composition du milieu d'incubation: r.-threonine aux concentrations indiqueesj 0,1 p.g de phosphate de pyridoxal; magnesium titriplex 10-4 M; phosphate de potassium 0,1 M amene aux pH indiques ; 45 p.g de proteines d'un extrait brut d'une souche dereprimee pour Ia L-threonine deseminase d'E. coli K12. Volume total: 1,0 mI. Temperature 27°C. La production d'aoide a<-cetobutyrique est mesuree par la methode de Friedemann & Haugen.
"I. inhibition 100
--.... x \ . t-lsoleuclne
3.10-4 M
\ x
e.t-allcthreenlne 5.10-3 M
10
8
9
FIG. 2. Effet du pH Bur l'inhibition de La u-threonine desaminase par La L-isoleucine et par La D,L-allothreonine. Memes conditions que pour Ia figure 1. Concentration de r-threonine Mj50.
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/ t-allothreonlne • 10- 2 M
'Iv
L-allothrl!Orii~e 10- 3 M
0.100
0.050
~ (t.-threon lne) Mltoo
M/200
""'500
FIG. 3. I nhibitian de la L-throonine desami1Ul8e par la s.-allothreonine. L'in verse de la vitesse de deaamina t ion es t porte en fon ct ion d e I'inverse de la conce ntration de substrat, Memes cond itions "que pour la figu re 1. pH 8,0 5.
.
0.1000
/ D.L-allothrl!onine
Vv
0.500
i
r
, x.......
a
x/X concent rat ions d' inhihit eur
,~'2
10"
FIG. 4. Inhibition. de la L-threonine desami1Ul8e par la L- et la D,L-allothreoni ne. L 'inve rse d e la vitesse de d esamin a t ion est po rte en fon ction de la concentra t ion d 'inhibi teur . Memes cond it ions que pour la figure I , sauf pH 8,05 , L-threonin e M/50.
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LETTERS TO THE EDITOR
Ia L-isoleucine, pourraient modifier I'aetivite de l'enzyme, les uns en tant qu'inhibiteurs specifiques competitifs du recepteur actif, les autres en tant que oompetiteurs de la L-isoleucine pour Ie recepteur inhibiteur. On peut resumer eomme suit un ensemble d'observations qui confirment pleinement ces predictions: 1. La D,L- et la L-allothreonine, qui ne sont pas substrats, inhibent fortement la desaminabion de la r-threonine. La oinetique d'inhibition suit la loi de Henry-Michaelis (Figs. 3 et 4) et aux pH superieurs a 10, pour lesquels l'enzyme n'est plus sensible a la L-isoleucine, l'activite desaminasique est toujours inhibee par I'allothreonine (Fig. 2). L'allothreonine est dono un inhibiteur oompebitif speoifique du recepteur actif.
._-----
v ~V M t~to otide/mn
A_
o.t-Isoleucine
·----_l-isoleucine 10-4 M 2.10-& M e-
e
concentrations de l-valine I
10-
3
M
10-
,
2 t1
2.10- 2 M
FIG. 5. Effet de la L-valine sur l'inhibition de la ti-threonine desaminase par la x-ieoleucine. Memes conditions que pour la figure 1, sauf pH 8,05, r.-threonine M/50.
2. Divers composes voisins de la L-isoleucine, qui n'inhibent pas la r-threonine desaminase, restaurent partiellement I'activite de l'enzyme inhibe par Ia L-isoleucine. Les resultats d'une serie d'experienees de ce type sont consignee sur Ie Tableau 1. Les corps les plus actifs a cet egard sont des aminoacides a chaine aliphatique longue et symetrique : la L-norleucine et la r-valine par exemple; toutefois Ia L-Ieucine n'a aucun effet. La L-norleucine et la L-valine ne presentent dono pas les conditions structurales requises pour etre inhibiteurs, mais elles agissent comme des competiteurs de Ia L-isoleucine pour Ie reeepteur inhibiteur. II importe de noter que la restauration d'aetivite obtenue par la L-valine n'est pas complete et varie en fonction de Ia concentration de L-isoleucine: a des concentrations croissantes de L-isoleucine, on observe une serie de courbes de saturation; la valeur des plateaux obtenus est une fonction approximativement lineaire de la concentration de L-isoleucine (Fig. 5). Ce resultat signifie que Ia L-isoleucine presente de l'afflnite pour Ie recepteur actif et peut encore en deplacer la L-threonine, meme lorsque la concentration de L-valine est suffisante pour deplacer la L-isoleucine du reoepteur inhibiteur.
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JEAN -PIERRE OHANGEUX
3. On observe en outre que la cinetique d'action en fonction de la concentration de t-threonine, en presence d'une concentration donnee de t-valine, ne suit plus une loi bimoleoulaire: aux faibles concentrations de r-threonine, la vitesse de la reaction est superieure aux valeurs prevues par la loi de Michaelis-Henry (au lieu d'etre inferieure, ainsi qu'on l'observe en I'absence de L-valine). Ce resu\tat indique que Is L-valine fixee sur Ie recepteur inhibiteur aceroit l'affinite du reeepteur actif a l'egard de la r.-threonine (Fig. 6). Ilv
/ 0 Valine
•
0.200
0.100
m
l-threonine
M/IOO
"V200
"/400
FIG. 6. EJJet de la L-valine sur la cinetique d'action de la L-threonine de8amifla8e en [onetiot» de la concentration de L-threonine. Memes conditions que pour la figure 1, ssuf pH 8,05.
II existe meme certains composes, la Nvchloracetyl-r-valine et la NvchloraoetylL-isoleucine, qni, fixes sur le reeepteur inhibiteur, accroissent plus efficacement que la L-isoleucine elle-meme l'affinite du reoepteur actif pour la L-isoleucine (Tableau I}. TABLEAU 1 Effet de divers analogues structuraux de la L-isoleucine ,sur l'inhibition de la L-threonine desaminase par la L-isoZeucine Sans r.-isoleucine % L-isoleucine 2.10- 4 M Inhibition Sans analogue r.-norleucine L-valine L-lX-aminobutyrate r.-mefhionine r-alanine L-norvaline Glycine
10- 2 M
L-Ieucine L-isoleucine amide HOI D-isoleucine N-chloracetyI-D,L-isoleucine 2.10- 3 N -ehloracetyl-n-valine 10- 2 M
M
1.000 980 940 920 1.010 1.000 760 980
170 815 650 590 415 225 160 190
83 17 31 36 54 78 79 80,5
700 970 1.000
120 150 145
83 84,5 85,5
830 800
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Ces deux dernieres observations sont une confirmation directe de I'hypothese selon laquelle tous les effets observes sont dfis a des modifications des parametres caracteristiques du reoepteur actif sous l'influence des produits fixes sur Ie reeepteur inhibiteur. En conclusion, l'ensemble des resultats presentes confirme que: 1. les groupements constituants les recepteurs (I) et (A) sont distincts; 2. deux molecules de substrat ou d'inhibiteur, ou une d'inhibiteur et une de substrat, peuvent se fixer simultanement sur l'enzyme; 3. la fixation de differents composes sur Ie recepteur inhibiteur (I) modifie les proprietes du recepteur actif (A). Plus precisement, on voit que I'etude des effets de la L-valine confirme directement les principales propositions qui definissent Ie modele: 1. La t-isoleucine a de I'affinite simultanement pour le reeepteur actif et pour Ie reoepteur inhibiteur (Propositions 4 et 3); 2. La L-valine n'a d'affinite que pour Ie recepteur inhibiteur et peut remplacer la t-threonine ou la L-isoleucine sur le reeepteur inhibiteur. Fixee sur le recepteur (I) elle augmente l'affinite du reoepteur (A) et joue a cet egard le role attribue ala L-threonine (Proposition 2); 3. La fixation de la L-valine sur Ie recepteur inhibiteur provoque une diminution de l'affinite du recepteur actif pour la n-isoleucine (Proposition 3). A saturation en L-valine, le reeepteur actif presente cependant encore une affinite non negligeable a I'egard de la L-isoleucine (Proposition 4). Diverses observations recentes effectuees avec d'autres systemes enzymatiques (Martin, communication personnelle; Patte et Cohen, communication personnelle) suggerent que les hypotheses essentielles exprimees par ee modele sont applicables de faeon generale aux enzymes de regulation dont l'aotivite depend du produit final d'une chaine de biosynthese ou, pour employer la terminologie proposee par Monod & Jacob (1961), aux systemes enzymatiques qui sont l'objet d'effets "allosteriques". Il est interessant de souligner que ce modele permettrait d'expliquer des types d'interactions tres varies, y compris en particulier des effets aotivateurs, Les resultats montrent en effet que la L-valine, produit d'une autre sequence biosynthetique, peut in vivo aetiver la synthese de la L-isoleucine en agissant au niveau de la n-threonine desaminase. Institut Pasteur Service de Biochimie Cellulaire Paris, France
JEAN-PIERRE CHANGEuxt
Received 29 December 1961 REFERENCES Changeux, J.-P. (1961). Cold Spr, Harb, Symp. Quant. Biol. 26, in the press. Friedemann, T. E. & Haugen, G. E. (1943). J. Biol. Ohem., 147, 415. Monod, J. & Jacob, F. (1961). Cold Spr, Harb, Symp. Quant. Biol. 26, in the press.
t Ce travail a beneficie de I'aide de la "National Science Foundation", du "National Institutes of Health" et du "Jane Coffin Childs Memorial Fund".
Effet des Analogues de la L-Threonine et de la t-Isoleucine sur la L-Threonine Desamlnase Studies on the enzyme r.-threonine dcsaminase have revealed the existence of two receptor sites: the active receptor (A) and the inhibitor receptor (I). Attachment at I modifies binding at A. Enzymatic activity requires combination at A; this combination is reduced by the presence of inhibitor, L-isoleucine, at 1. L-valine, although not an inhibitor, is also attached at I and thereby protects the enzyme from L-isoleucine inhibition.
Dans une publication reoente (Changeux, 1\)61), nous avons montre que les proprietes remarquables de la t-threonine desaminase a I'egard tant de son substrat, la t-threonine, que de son inhibiteur specifique, la L-isoleucine, ne peuvent pas s'expliquer par I'hypothese classique d'une exclusion simple du substrat par l'inhibiteur. Les resultats obtenus nous ont conduit a proposer un modele qui suppose l'existence, a la surface de cet enzyme, a cote du recepteur actif (A), d'un autre recepteur dit recepteur inhibiteur (I). D'apres ce modele, les proprietes du site actif seraient modifiees selon la nature du compose fixe sur Ie recepteur inhibiteur. Ces interactions obeiraient aux regles suivantes: 1. La reaction a lieu lorsqu'une molecule de t-threonine est fixee sur Ie recepteur actif. 2. L'affinite du recepteur actif a l'egard de la t-threonine est accrue lorsque Ie recepteur inhibiteur est egalement complexe par une molecule de t-threonine. 3. L'affinite du reeepteur actif a l'egard de la t-threonine est diminuee lorsque le recepteur inhibiteur est complexe par une molecule de L-isoleucine. 4. Le recepteur actif presente une faible affinite pour la t-isoleucine. Cette affinite est accrue lorsque le recepteur inhibiteur est complexe egalement par une molecule de L-isoleucine. Le fait essentiel qui conduit a formuler de telles hypotheses est que la cinetique d'action de l'enzyme natif (en fonction de la concentration de t-threonine ainsi qu'en fonction de la concentration de L.isoleucine, a un pH voisin de 8) parait suivre une loi bimoleeulaire, tandis que divers traitements qui suppriment la sensibilite de l'enzyme it la L-isoleucine entrainent du meme coup une normalisation de la cinetique d'action en fonction de la concentration de t-threonine. Nous apportons ici de nouvelles donnees experimentales qui confirment lea hypotheses essentielles exprimees par Ie modele ci-dessus. En premier lieu, comme Ie montrent les Figures 1 et 2, aux pH voisins de 11, l'enzyme devient insensible a l'effet inhibiteur de la L-isoleucine et on constate que, correlativement, la cinetique d'action en fonction de la concentration de L-threonine est normalisee. En second lieu, si les hypotheses formulees sont adequates, il y a lieu de prevoir que deux series de corps, les uns analogues de la r.-threonine, les autres analogues de 220
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FIG. 1. Effet du pH Bur la cinlltique d'action de la L-threonine deeaminase en fonction de La concentration de L-threonine. Composition du milieu d'incubation: r.-threonine aux concentrations indiqueesj 0,1 p.g de phosphate de pyridoxal; magnesium titriplex 10-4 M; phosphate de potassium 0,1 M amene aux pH indiques ; 45 p.g de proteines d'un extrait brut d'une souche dereprimee pour Ia L-threonine deseminase d'E. coli K12. Volume total: 1,0 mI. Temperature 27°C. La production d'aoide a<-cetobutyrique est mesuree par la methode de Friedemann & Haugen.
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FIG. 2. Effet du pH Bur l'inhibition de La u-threonine desaminase par La L-isoleucine et par La D,L-allothreonine. Memes conditions que pour Ia figure 1. Concentration de r-threonine Mj50.
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FIG. 3. I nhibitian de la L-throonine desami1Ul8e par la s.-allothreonine. L'in verse de la vitesse de deaamina t ion es t porte en fon ct ion d e I'inverse de la conce ntration de substrat, Memes cond itions "que pour la figu re 1. pH 8,0 5.
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FIG. 4. Inhibition. de la L-threonine desami1Ul8e par la L- et la D,L-allothreoni ne. L 'inve rse d e la vitesse de d esamin a t ion est po rte en fon ction de la concentra t ion d 'inhibi teur . Memes cond it ions que pour la figure I , sauf pH 8,05 , L-threonin e M/50.
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Ia L-isoleucine, pourraient modifier I'aetivite de l'enzyme, les uns en tant qu'inhibiteurs specifiques competitifs du recepteur actif, les autres en tant que oompetiteurs de la L-isoleucine pour Ie recepteur inhibiteur. On peut resumer eomme suit un ensemble d'observations qui confirment pleinement ces predictions: 1. La D,L- et la L-allothreonine, qui ne sont pas substrats, inhibent fortement la desaminabion de la r-threonine. La oinetique d'inhibition suit la loi de Henry-Michaelis (Figs. 3 et 4) et aux pH superieurs a 10, pour lesquels l'enzyme n'est plus sensible a la L-isoleucine, l'activite desaminasique est toujours inhibee par I'allothreonine (Fig. 2). L'allothreonine est dono un inhibiteur oompebitif speoifique du recepteur actif.
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FIG. 5. Effet de la L-valine sur l'inhibition de la ti-threonine desaminase par la x-ieoleucine. Memes conditions que pour la figure 1, sauf pH 8,05, r.-threonine M/50.
2. Divers composes voisins de la L-isoleucine, qui n'inhibent pas la r-threonine desaminase, restaurent partiellement I'activite de l'enzyme inhibe par Ia L-isoleucine. Les resultats d'une serie d'experienees de ce type sont consignee sur Ie Tableau 1. Les corps les plus actifs a cet egard sont des aminoacides a chaine aliphatique longue et symetrique : la L-norleucine et la r-valine par exemple; toutefois Ia L-Ieucine n'a aucun effet. La L-norleucine et la L-valine ne presentent dono pas les conditions structurales requises pour etre inhibiteurs, mais elles agissent comme des competiteurs de Ia L-isoleucine pour Ie reeepteur inhibiteur. II importe de noter que la restauration d'aetivite obtenue par la L-valine n'est pas complete et varie en fonction de Ia concentration de L-isoleucine: a des concentrations croissantes de L-isoleucine, on observe une serie de courbes de saturation; la valeur des plateaux obtenus est une fonction approximativement lineaire de la concentration de L-isoleucine (Fig. 5). Ce resultat signifie que Ia L-isoleucine presente de l'afflnite pour Ie recepteur actif et peut encore en deplacer la L-threonine, meme lorsque la concentration de L-valine est suffisante pour deplacer la L-isoleucine du reoepteur inhibiteur.
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3. On observe en outre que la cinetique d'action en fonction de la concentration de t-threonine, en presence d'une concentration donnee de t-valine, ne suit plus une loi bimoleoulaire: aux faibles concentrations de r-threonine, la vitesse de la reaction est superieure aux valeurs prevues par la loi de Michaelis-Henry (au lieu d'etre inferieure, ainsi qu'on l'observe en I'absence de L-valine). Ce resu\tat indique que Is L-valine fixee sur Ie recepteur inhibiteur aceroit l'affinite du reeepteur actif a l'egard de la r.-threonine (Fig. 6). Ilv
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FIG. 6. EJJet de la L-valine sur la cinetique d'action de la L-threonine de8amifla8e en [onetiot» de la concentration de L-threonine. Memes conditions que pour la figure 1, ssuf pH 8,05.
II existe meme certains composes, la Nvchloracetyl-r-valine et la NvchloraoetylL-isoleucine, qni, fixes sur le reeepteur inhibiteur, accroissent plus efficacement que la L-isoleucine elle-meme l'affinite du reoepteur actif pour la L-isoleucine (Tableau I}. TABLEAU 1 Effet de divers analogues structuraux de la L-isoleucine ,sur l'inhibition de la L-threonine desaminase par la L-isoZeucine Sans r.-isoleucine % L-isoleucine 2.10- 4 M Inhibition Sans analogue r.-norleucine L-valine L-lX-aminobutyrate r.-mefhionine r-alanine L-norvaline Glycine
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L-Ieucine L-isoleucine amide HOI D-isoleucine N-chloracetyI-D,L-isoleucine 2.10- 3 N -ehloracetyl-n-valine 10- 2 M
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Ces deux dernieres observations sont une confirmation directe de I'hypothese selon laquelle tous les effets observes sont dfis a des modifications des parametres caracteristiques du reoepteur actif sous l'influence des produits fixes sur Ie reeepteur inhibiteur. En conclusion, l'ensemble des resultats presentes confirme que: 1. les groupements constituants les recepteurs (I) et (A) sont distincts; 2. deux molecules de substrat ou d'inhibiteur, ou une d'inhibiteur et une de substrat, peuvent se fixer simultanement sur l'enzyme; 3. la fixation de differents composes sur Ie recepteur inhibiteur (I) modifie les proprietes du recepteur actif (A). Plus precisement, on voit que I'etude des effets de la L-valine confirme directement les principales propositions qui definissent Ie modele: 1. La t-isoleucine a de I'affinite simultanement pour le reeepteur actif et pour Ie reoepteur inhibiteur (Propositions 4 et 3); 2. La L-valine n'a d'affinite que pour Ie recepteur inhibiteur et peut remplacer la t-threonine ou la L-isoleucine sur le reeepteur inhibiteur. Fixee sur le recepteur (I) elle augmente l'affinite du reoepteur (A) et joue a cet egard le role attribue ala L-threonine (Proposition 2); 3. La fixation de la L-valine sur Ie recepteur inhibiteur provoque une diminution de l'affinite du recepteur actif pour la n-isoleucine (Proposition 3). A saturation en L-valine, le reeepteur actif presente cependant encore une affinite non negligeable a I'egard de la L-isoleucine (Proposition 4). Diverses observations recentes effectuees avec d'autres systemes enzymatiques (Martin, communication personnelle; Patte et Cohen, communication personnelle) suggerent que les hypotheses essentielles exprimees par ee modele sont applicables de faeon generale aux enzymes de regulation dont l'aotivite depend du produit final d'une chaine de biosynthese ou, pour employer la terminologie proposee par Monod & Jacob (1961), aux systemes enzymatiques qui sont l'objet d'effets "allosteriques". Il est interessant de souligner que ce modele permettrait d'expliquer des types d'interactions tres varies, y compris en particulier des effets aotivateurs, Les resultats montrent en effet que la L-valine, produit d'une autre sequence biosynthetique, peut in vivo aetiver la synthese de la L-isoleucine en agissant au niveau de la n-threonine desaminase. Institut Pasteur Service de Biochimie Cellulaire Paris, France
JEAN-PIERRE CHANGEuxt
Received 29 December 1961 REFERENCES Changeux, J.-P. (1961). Cold Spr, Harb, Symp. Quant. Biol. 26, in the press. Friedemann, T. E. & Haugen, G. E. (1943). J. Biol. Ohem., 147, 415. Monod, J. & Jacob, F. (1961). Cold Spr, Harb, Symp. Quant. Biol. 26, in the press.
t Ce travail a beneficie de I'aide de la "National Science Foundation", du "National Institutes of Health" et du "Jane Coffin Childs Memorial Fund".