Effets de traitements herbicides à base de triazine et d’urée sur la croissance, la transpiration, l’absorption des nitrates et l’activité de la nitrate réductase du froment (Triticum aestivum)

Biochem. Physiol. Pflanzen (BPP), Bd. 165, S. 175-184 (1974) Institut de Recherches Chimiques, Tervuren (Belgiqu~)

Effets de traiternents herbicides a base de triazine et d'uree sur la croissance, la transpiration, l'absorption des nitrates et l'activite de la nitrate reductase du frornent (Triticum aestivum) Par M.

DECLEIRE,

W.

DE CAT

et R.

BASTIN

Avec 2 figures (Rel,lu Ie 26 July 1973)

Effects of s-triazine and Urea Herbicides on Growth, Transpiration, Nitrate Absorption and Nitrate Reductase Activity of Wheat (Triticum aestivum) Summary Twelve old wheat seedlings were soaked 20 hrs in solutions of 1 ppm and 0.02 ppm of simazine, atrazine GS 14.259, promethrine, fenuron, fluometuron, methbenzthiazuron and linuron. Growth, transpiration and nitrate absorption were measured 10 days after the treatment; nitrate reductase "in vitro" and "in vivo" after 0, 1, 2, 3 and 5 days. At 1 ppm the herbicides produced a growth inhibition but not simazine and fenuron. The transpiration and the nitrate absorption were slightly reduced but not proportionnaly to the toxicity of the herbicides. The nitrate reductase activity determined "in vivo" was more significant than that determined "in vitro". The "in vivo" nitrate reductase activity was inhibited in the leaves of the seedlings treated with all herbicides at 1 ppm but not simazine and fenuron. Three days after the treatment, the inhibition reached 68-75 % for s-triazine herbicides and 37 - 52 % for urea herbicides. At 0.02 ppm, all herbicides produced a growth stimulation with a increase of transpiration and nitrate absorption. In this case, the nitrate reductase activity of the leaves, measured "in vivo" and "in vitro" was simular to the control; but, in the roots, the enzymic activity increased significantly by 33-81 %.

Introduction

L'assimilation de l'azote mineral constitue une etape indispensable a la biosynthese des proteines et, des lors, a la croissance et au developpement des plantes. On a pu etablir, avec certitude, que l'azote nitrate est rapidement reduit en azote ammoniacal dans les racines et les feuilles et que c'est, sous cette forme seulement, qu'il y est incorpore, principalement, dans l'acide IX cetoglutarique pour former l'acide glutamique et son amide, la glutamine (DELWICHE 1951; MENDEL et VISSER 1951).

• 176

11.

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W.

DE C\T

et R.

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Considerees comme vehicules de l'azote organique, ces deux substances cedent leur groupe amine aux autres acides cetoniques par transamination, et, contribuent 11 former ainsi divers acides amines constitutifs des proteines (YEMM et WILLIS 1956; COCKI~G et YE:\IM 1961). La reduction des nitrates en ammoniaque ne s'effectue pas d'emblee mais s'opere toujours en deux etapes: la premiere, reduction des nitrates en nitrites; la seconde, reduction des nitrites en ammoniaque; chacune d' elIe etant sous la dependance d'une reductase specifique. La nitrate reductase se revele donc etre la premiere enzyme agissant sur les nitrates en vue de leur assimilation ulterieure (EVANS et NASON 1953), et, son activite peut etre mise en relation directe avec lacroissance et la teneur en proteines des plantes (HAGEMA~ et FLESHER 1960). De nombreux travaux confirment, d'ailleurs, cette constatation. BEEVERS et coIl. (1963), par ailleurs, en traitant des plantules de concombre et de mais avec une solution letale de 4,5 10-4 M de 2,4]), respectivementsensibles et resistantes it cet herbicide, observent dans les premieres une diminution d'activite de la nitrate reductase associee 11 uP.e diminution de la teneur en proteines. Par contre, les secondes se caracterisent par une activite accrue de la nitrate reductase et une teneur plus elevee en proteines. TWEEDY et Rms (1967) constatent que l'apport de simazine it doses subletales dans Ie milieu nutritif stimule la croissance du mais et augmente sa teneur en azote et en matiere seche de 20 a 25 %. Un accroissement de poids et de teneur en proteines est observe egalement par RIES et colI. (1967) et VERGARA et colI. (1970) avec du riz; par ALLISON et PETERS (1970) avec des graminees de prairie; et par SALUNKHE et coIl. (1971) avec des pois et du mais doux. Cette stimulation de biosynthese proteique serait due, d'apres TWEEDY et Rms cites plus haut, a une activation de la nitrate reductase provoquee par la presence de traces d'herbicides triaziniques. Les travaux de SINGH et SALUNKHE (1970) apportent un element nouveau 11 l'explication proposee. Ces chercheurs demontrent, en dfet que des doses sublethales de derives de s-triazines administrees en pulverisation sur des haricots, entrainent non seulement une activite plus elevee de la nitrate reductase mais egalement une activite accrue d'autres enzymes intervenant dans Ie metabolisme des hydrates de carbone et de I'azote; tels la phosphorylase d'amidon, l' eX amylase, I'adenosine triphosphatase, la pyruvate kinase, la cytochrome oxydase, la transaminase et la glutamate deshydrogenase. C'est donc, comme Ie constatent aussi WIEDMAN et ApPLEBYL (1972), I'ensemble du metabolisme qui se voit active par les doses sublet ales d'herbicides. ])'autres fonctions telles la transpiration et la nutrition minerale peuvent egalement

Effets rle traitements herbicides it base rle triazine etc'.

177

iltre modifiees par l'apport d'herbicides. Les travaux de DOl\l S;VIITH et BUCHKOLTZ (1962) revelent, en dfet une reduction de la transpiration par l'application de doses letales d'atrazine sur du soya. Ceux de FRENEY (1965) font etat d'un accroissement de l'absorption des elements du sol par du ma'is, traite par de la simazine a 0,06 ppm. 1,e present travail a pour but de mettre en relation avec la croissance des plantules de ble, traitees par des doses letales (1 ppm) et subletales (0,02 ppm) d'herbicides a base de triazine et d'uree, 1. l'activite de la nitrate reductase in vitro et in vivo dans II's limbes, 2. l'intensite de la transpiration, 3. la quantite reelle de nitrate consommee. La comparaison de ces donnees nous permettra de voir dans quelle mesure les modifications physiologiques (transpiration et absorption de nitrates) et enzymatiques (nitrate reductase) peuvent etre reliees a la toxicite des herbicides (diminution de croissance) independamment de la constitution chimique particuliere de chacun d'eux. Materiel et methodes Conditions culturales Nos experiences ont etc reaJi8ees en chambre elimatisee; nyetoperiorle rle 8 h (rle 21 h it 5 h); temperature diurne de 23 cC, nocturne de 18 cC. Veclairage est l"onstitue par des rampes de lampes Phytor alternant avec des ampoules it incandescence. VintensiM lumineuse au niveau des plantes est environ de 5000 lux. Le developpement des plantes s'effectue sur vermiculite en entonnoir depose sur becher, entoure d'un plastique noir et rempli de solution nutritive. Modalites du traitement herbicide Les entonnoirs remplis de vermiculite sont ensemences avec du froment, variete <,Palmaress» sur eau distillee it raison de quatre grains par entonnoir. Aprils 6-7 jours, ['eau distillee est remplacee par Ie milieu Hoogland legerement modifie. Aprils 12 jours, lorsque les plantules ont developpe 2 feuilles Ie milieu est remplace par la solution nutritive contenant I'herbicide it 1 ppm ou 0.02 ppm pendant 20 hemes. Ce delai ecoule, la solution herbicide est eliminee et remplacee it nouveau par Ie milieu nutritif ha b ituel. Les mesures d'activite rle la nitrate flJduetase ont eM effectuees immMiatement aprcs Ie traitement puis aprps des delais de 1, 2, 3 et 5 jours. Les mesures de croissance, de transpiration et d'absorption des nitrates ont ete effeetuees 10 jours aprils Ie traitement. Les herbicides testes sont: I' atrazine: 2 chlore-4-ethyl amino-6-isopropylamino-l-triazine la simazine: 2 chloro-4,6-bis-ethylamino-s-triazine la promethrine: 2 methylthio-4,6-bis-isopropylamino-s-triazine Ie GS 14259: 6 tert-butylamino-4-ethylamino-2-methoxy-s-triazine Ie fluometuron: N -(3-trifluoromethyl)-phenyl-N' -dimethyluree Ie linuron: N-(3,4 trichlorophenyl)-N'-methoxy-N'-mcthyluree

'ii 178

1\1. DECLEIRE, W. DE C,\'f et R.

BASTIN

Ie frnuron: X -phenyl- X' -1\' -dimethylunle Ie methbenzthiazUfon: N -benzthiozalyl-X-methyl-X' -methyl UTIle Determination de la, croissance des plantes La croissance des plantes est determinee par Ie poids moyen des limbes provenant de 10 plantules, 10 jours aprils Ie traitement herbicide. Mesure de la transpiration Comme au cours de experiences la turgescence normale des plantes n'est pas affecMe, la transpiration a simplement eM mesuree par la determination du volume de solution nutritive consommee par une douzaine de plantules. Absorption des nitrates Elle s'obtient en soustrayant la quantite de nitrate rest ant dans Ie milieu de culture au moment de la recolte de la quantite totale de nitrate administree. Les nitrates ont He doses par la methode D'HENRIOUL (1963). Mesure de l'activite «in vitro,) de la nitrate reductase Les limbes de 12 a 16 plantules sont extraits au mortier a 4 °C par un nombre de ml de tampon (Tris-HCl 0,1 M, Na 2 EDTA 5 mM, cysteine 5 mM, pH = 7,6) egal it cinq fois Ie poids de limbe. Aprils centrifugation de 20 min it 20000 g a 4°C, une partie aliquote (0,3 ml) est dilUlle par 1 ml de tampon phosphate M/15 de pH = 7,6; 0,2 ml KNO a 0,1 M; 0,5 ml NADH (7 mg/10 ml), Ie blanco etant prive de NADH. On laisse incuber 20 min a 27°C puis on ajoute 0,2 ml d'acetate de zinc M et 3 ml d'alcool. Apres centrifugation it 5000 t/min on preJeve 2 ml auquel on ajoute successivement 1 ml de sulfanilamide 1 % dans HCI N et 1 ml d'une solution de naphtylethyHme diamine it 0,01 %. On mesure les densiMs optiques it 540 nm apres 30 minutes. Les plantules traitees et Ie tCmoin sont toujours analyses simultanement. Mesure de I'activite «in vivo') de la nitrate reductase La mesure de I'activite reductase «in vivo') s'effectue suivant la methode proposee par KLEPPER et colI. (1971) avec les modifications sllivantes: 0,6 g de limbes (provenant uniquement des deuxiemes feuilles) sont decoupes en morceaux de 0,3 it 0,5 em et infiltres sous vide dans un tube surmonte d'un robinet rode contenant 10 ml du tampon KH 2 P0 4 - K 2 HP0 4 0,1 M, KNO a, 0,2 M de pH = 7,6. Le tube ayant eM mis sous vide est agiM doucement pendant une heure, dans un bain maintenu a 33°C et it l'obscurite. On prelilve alors 0,2 ml de la solution, on y ajoute les deux reactifs Tllvelateurs des nitrites et on mesnre it 540 nm. Les essais s'effectuent paralleiement au tilmoin.

Resultats et discussion

Les graphiques 1 et 2 groupent les resultats relatifs a la croissance des plantcles, leur transpiration et l'absorption des nitrates. Dans nos conditions experimenbies, a la dose de 1 ppm pendant 20 heures, Ie fenuron et la simazine se reveient tre':: peu toxiques, la croissance etant respectivement de 92 et 84 % par rapport au temoin. Les autres herbicides manifestent une toxicite variable, les croissances oscillant entre 68 % pour Ie fluometuron et 36 % pour Ie GS.14.259.

Effets lit- traitements herbicides

a base de triazine etc.

179

A dose subletale, tous les herbicides stimulent la croissance. L'augmentation est homoglm.e (± 115 %) pour les derives d'uree. Elle fluctue de 108 a 128 % pour les derives des triazines, l'accroissement les plus faible n'etant pas en relation avec l'herbicide Ie plus nocif. % lWr-

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Fen.

Lin.

1 ppm pendant lOH.

c::::J POURCENTAGES PAR RAPPORT AU TE!10IN DU POIDS DE LI!1BE c::::J DE LA SOL. NUTR. CONSO!1!1EE

Fig. 1

IlIllIlIIIl

ET DES NITRATES ABSORBES

0/0

7'tO ,I

720 - - - - -!OO

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c::::J POURCEIVTAGES PAR RAPPORT AU TEND/IV OU PolOS DE LI!1BE c::::J OE LA SOL. NUT!? CONSOI1I1EE

IlIllIlIIIl

ET OES NITRATES ABSORBES

--

--

I

0.02 ppm pendani 20fl

Fig. 2

--

-

i

I.!I 11[: - -

Illill If 259

-

111--

Fen.

180

M.

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DE CAT

et R.

BASTIN

Parallelement, la transpiration se voit effectivement reduite par les traitements herbicides it la dose letale de 1 ppm; comme l'ont observe DOM SMITH et BOCHKOLTZ (1962). Il en est de meme pour l'absorption des nitrates. La reduction est faible pour les derives d'uree et plus importante pour les derives triaziniques. Elle n'est cependant jamais proportionnelle it l'inhibition de croissance. Aux doses subletales, la transpiration ail'.si que l'absorption des nitrates se situent toujours au dessus des valeurs du temoin. Ce fait confirme les resultats du travail de RIES et WERT (1972). Ces auteurs administrent des doses subletales de simazine it de l'avoine, de l'orge et du riz et observent, parallelement it une augmentation de poids et de proteines totales, une absorption plus elevee de nitrate associee it une transpiration plus intense. Le surplus de nitrate consomme correspond quantitativement it l'accroissement de l'azote proteique total des plantules. Le comportement de la nitrate reductase foliaire «in vitro» des cinq premiers jours qui suivent Ie traitement, peut etre compare dans Ie tableau 1. Parmi les plantules traitees aux doses letales, celles ayant re~m la simazine et Ie fenuron, consideres dans nos conditions experimentalcs comme peu toxiques, donnent des valeurs d'activite tres voisines du temoin. L'atrazine, la promethrine, Ie GS 14.259, Ie methbenzthiazuron, Ie fluometuron et Ie linuron, nuisibles it des degres divers, provoquent une diminution d'activite de la nitrate reductase surtout it partir du deuxieme jour. Les valeurs d'activite accusent un ralentissement des processus de biosynthese mais ne se revelent pas rigoureusement proportionnelles it l'inhibition de croissance. Des resultats beaucoup plus homogenes sont obtenus par les mesures d'activite enzymatique au sein meme du tissu foliaire, comme en fait foi Ie tableau 2. Les plantules traitees avec 1 ppm d'herbicides accusent, des Ie lendemain du traitement, une baisse d'activite. Faible pour la simazine et Ie fenuron, elle atteint 28 it 32 % pour les autres herbicides avec un point de diminution culminant de 61 % pour l'atrazine. L'activite enzymatique decroit, ensuite, dans des proportions variables. Apres 3 jours, on constate une diminution de 67 % pour l'atrazine, de 75 % pour Ie promethrine, de 68 % pour Ie GS 14.259, de 48 % pour Ie methbenzthiazuron, de 37 % pour Ie fluometuron et de 44 % pour Ie linuron. L'inhibition de l'enzyme «in vivo» se revele donc differente suivant la nature de l'herbicide. L'activite residuelle des plantules traitees aux derives triaziniques se situe entre 32 et 25 % apres 3 jours; celle des plantules traitees aux derives d'uree entre 63 et 48 %. Compares aux activites «in vitro» (66 it 88 %) les resultats «in vivo» sont beaucoup plus represen.tatifs du pouvoir toxique des herbicides sans etre, cependant, rigoureusement proportionnels.

Tableau 1

Activite <
% par rapport au temoin1 )

~

""

J ours apres

1 ppm

Ie traitement

Atrazine

0 1 2 3 5

101 97 75 71

45

0 1 2 3 5

0,02 ppm GS 14.259

Simazine

Atrazine

Promethrine

GS 14.259

Simazine

'"'"'"

94 87 84 88 87

93 72 GG 72 49

120 11G 95 88 101

105 117 105 109 97

105 9G 9G 97 94

95 98 9G 90 85

130 122 107 102 107

'" a

Linuron

91 97 70

103 75

71

88 93

87 89 80 GG 72

GO

>=:-

Promethrine

Fluom cturon

Methbenz

'" it

71

Fenuron

138 102 108 lOG 88

Methbenz

101 lOG 98 9G 78

FIllOmeturOn

130 110 93 9G 93

Linuron

Fenuron

97 9G 105 94 91

11G 138 119 111 100

e:.'"' '"'"

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~

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'"

1) L'activite des temoins se situe entre 2,9 et 3,G micromoles N0 2 /20 min/g.

'"

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00 f-'

....... X

l,:)

Tableau 2 Aetivit6 .in vivo}) de la nitrate redllrtase dans les fellilles en

.T ours apres

% par rapport all temoin1) ~,

0,02 ppm

1 ppm

Ie traitement

Atrazine

Promethrine

OS 14.259

Simazine

Atrazine

Promethrine

0 1 2 3

93 39 27 33

98

87 72 45 32

97 91 92 93

100 97 113 112

100 88 82 98

GS 14.259

Simazine

t:i ~ ~

72

53 26

98 94 87 86

99 92 103 96

OJ

~ :'1 tJ

OJ

0

I\Tethbenz

Flllometllron

Linuron

94 (i8 69 48

87

97 69 69 56

Fenuron

l\!fethbenz

Fluometuron

Linuron

Fenllron

:--

83 91 89 103

102 104 95 88

95 100 107 104

103 110 105 103

10

'co"

M-

0

1 2 3

71

70 63

93 88 85 92

1) L'urtivitr des temoins se sitlle entre 2.42 et 2.94 micro moles N0 2 /heure/g.

I:d

:--en

'Z"

Effets de traitements herbicides

a base de triazine etc.

183

Les limbes des plantules traitees avec des doses sublet ales montrent une activite enzymatique «in vivo» et «in vitro» tres proche du temoin, alors qu'elles sont Ie siege d'un metabolisme plus intense comme Ie prouvent l'augmentation du poids de limbe et l'absorption accrue des nitrates. Cette constatation surprenante no us a incite it mesurer l'activite de la nitrate reductase dans les racines, bien qu'elle soit reconnue comme faible par rapport a celIe des feuilles (EVANS et NASON 1953). Les racines provenant de huit plantules ont He pesees et broyees au mortier avec trois fois Ie poids du tampon d'extraction propose par SMITH et THOMPSON (1971). L'activite de la nitrate reductase a ete mesuree dans 0,4 ml d'extrait apres une incubation d'une heure it 30°C. Les resultats, groupes au tableau 3, font apparaitre une stimulation manifeste de l'activite de la nitrate reductase, ce qui expliquerait la rpaction favorable des plantules aux concentrations subletales d'herbicides. Tableau 3

Activite <
Jours apres Ie traitement

GS 14.259 0,02 ppm

Promethrine 0,02 ppm

Linuron 0,02 ppm

Methbenzthiazuron 0,02 ppm

2

173 148

133 150

181 166

145 168

3

1) L'activiM des temoins se situe entre 0,18 et 0,37 micro mole N02/heure/g.

Le fait d'observer, dans nos conditions experimentales, une activite enzymatique accrue dans les racines, alors que Wu, SINGH et SALUNKHE (1971) constatent une stimulation identique dans des feuilles pulverisees avec des doses subletales d'herbicides, permet de penser que seuls les tissus en contact direct avec l'herbicide sont Ie siege d'une telle stimulation. Cette difference d'activite de la nitrate reductase dans les feuilles et les racines peut des lors s'expliquer par Ie contact limite (20 h) des racines avec l'herbicide. Un trempage plus prolonge aurait vraisemblablement permis a l'herbicide d'atteindre les feuilles et d'y provoquer egalement l'activation de la nitrate reductase. Litterature ALLISON, D. W., et PETERS, R. A., Influence of simazine on crude protein and cellulose content and yield of forage grasses. Agron. J. 62, 246-250 (1970). BEEVERS, L., PETERSON, D. M., SHANNON, J. C., et HAGEMAN, R. H., Comparative effects of 2,4Dichlorophenoxyacetic acid on nitrate metabolism in corn and cucumber. Plant Physiol. 38, 675-679 (1963). 13

Bioohem. Physio!. Pflanzen, Bd. 165

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