Ein Beitrag zur Durchführung der Fluoreszenzserologie bei Leptospirose

Kurzmitteilung

Zbl. Bakt. Hyg., 1. Abt. Orig. A 247, 138-141 (1980) Aus dem Institut fur Veterinarmedizin (Robert von Ostertag-Institut) des Bundesgesundheitsamtes Berlin (Leiter: Prof. Dr. D. Grof5klaus)

Ein Beitrag zur Durchfiihrung der Fluoreszenzserologie bei Leptospirose A Contribution to the Technique of Immunofluorescence in Leptospirosis C. STAAK und A. SCHONBERG Eingegangen am 12. November 1979

Abstract Mono- and polyvalentFITC-conjugates were prepared for detection of leptospires in artificially infected material. The organisms were concentrated by centrifugation and fixed onto glass slides after they had been mixed with serum or egg albumin. By this method, leptospires were detected down to a concentration of 102_10 4 organisms/m!.

Zusammenfassung Zum Nachweis von Leptospiren in kiinstlich infiziertem Material wurden mono- und polyvalente FITC-Konjugate hergestellt. Nach dem Konzentrieren der Erreger durch Zentrifugieren konnten diese durch Zumischen von Serum oder Eiklar auf Objekttrager fixiert werden. Die Nachweisgrenze lag zwischen 102-10 4 Keimen/ml.

Auf dem Gebiet der Leptospirose-Diagnostik wird die Fluoreszenzserologie sowohl zum Darstellen von Antigen (Bisping et al., 1; Hodges u. Ekdahl, 4; Smith et al., 8), als auch zum Nachweis von Antikorpern (Burger u. Fuchs, 2; Sulzer et al., 10; Torten et al., 11) eingesetzt. Gelegentlich bei der Durchfiihrung dieser Technik erwahnte Schwierigkeiten entstehen bei der Fixierung der Leptospiren auf Objekttragern (Pillot u. d'Azambu;a, 6; Stahlheim, 9). Die Aussagen hinsichtlich der Spezifitat der Reaktionen sind widerspriichlich. Material und Methodik Ais Untersuchungsmaterial wurden Ebersperma sowie Schweinestallabwasser verwendet, denen abgestufte Mengen von Leptospiren zugesetzt worden waren. Zur Reinigung der

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Suspension von groberen Partikeln wurde zunachst bei 220 x g zentrifugiert (White u. Ristic, 12). Der dabei auftretende Verlust an Leptospiren betrug bei L. patoc 27%, bei L. sao paulo 19% und bei L. canicola 45%, jeweils berechnet auf eine Keimausgangskonzentration von 10 7 Leptospiren/ml. Keimzahlbestimmungen erfolgten in eigens zu diesem Zweck hergestellten Zahlkammem mit einer Hohe von 0,01 mm. Aus dem Oberstand wurden die Leptospiren durch eine zweite Zentrifugation bei 3000 x g iiber 40 Min. im Bodensatz angereichert. Urn nach dem anschlieEenden Ausstreichen und Hitzefixieren eine bessere Haftung der Leptospiren auf dem Objekttrager zu erzielen, wurde dem Sediment zuvor etwa 10% normales Schafserum zugemischt. Die Gewinnung von Antiseren erfolgte nach zweimal wochentlicher intravenoser Verabreichung steigender Mengen auf EMJH-Medium gewachsener Leptospiren an Kaninchen. Aus den Seren dieser Tiere gewonnene y-Globuline wurden nach dem von Cherry u. Mitarb. (3) angegebenem Verfahren mit Fluorescein iso-thiocyanat (FITC) konjugiert. Die Konjugate wurden iiber Sephadex G 25 gereinigt, in Aquacide 1 konzentriert und portionsweise lyophilisiert. Konjugate gegen mehrere Serotypen wurden nach Verabreichung von Mischkulturen an Kaninchen in der gleichen Weise hergestellt. Zur Anfarbung der fixierten Ausstriche wurden Konjugate auf Nagellack markierten Feldem in geeigneter Konzentration aufgetragen. Die Ausstriche wurden bei Raumtemperatur iiber 30 Min. in der feuchten Kammer inkubiert, anschlieEend dreimal in Phosphatgepufferter physiologischer NaCI und einmal in destilliertem Wasser gespiilt. Nach Eindeckung der Priiparate mit gepuffertem Glyzerin wurden sie mit Hilfe der groEen Fluoreszenz-Einrichtung von Zeiss im DurchIicht untersucht.

Ergebnisse Gegen 7 verschiedene Serotypen von Leptospiren gerichtete monospezifische Konjugate wurden gegeniiber dem homologen und den 6 heterologen Antigenen in der direkten Fluoreszenztechnik austitriert (Tab. 1). Tabelle 1. Titer der Leptospirenkonjugate gegeniiber homologen und heterologen Leptospiren-Antigenen Konjugat gegen

A

B

C

16

1 8 2 2

Leptospiren Serotyp D E

F

G

16':·

A B C D E F

1 1 4 8

8

16 32

G

* Reziproke Titer. A: L. grippotyphosa B:. L. autumnalis A C: L. icterohaemorrhagiae D: L. canicola 1

Aquadice II A Calbiochem AG.

E: L. pomona F: L. tarassovi G: L. sao paulo

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C. Staak und A. Schonberg

Zwischen L. pomona und L. canicola-Konjugaten kam es zu einer Kreuzreaktion, die eine Differenzierung zwischen dies en beiden Erregertypen nicht zulieK Bei den ubrigen Konjugaten wurden keine oder nur sehr geringe Kreuzreaktionen beobachtet. Zur Feststellung der Nachweisgrenze wurden fallende Mengen von Leptospiren der 7 oben ange£uhrten Serotypen Schweinesamenproben zugesetzt, so dag in den Mischungen Keimzahlen von 107/ml, 106/ml usw. bis 101/ml enthalten waren. Nach der beschriebenen Sauberung und Anreicherung wurden in 16 Ansatzen mit je 7 Proben fallender Keimzahlen Leptospiren wie folgt nachgewiesen: 2 X bis zu einer Keimzahl von 104 12 X bis zu einer Keimzahl von 103 2 X bis zu einer Keimzahl von 10 2 Polyvalente Konjugate, hergestellt aus Seren von Kaninchen, denen Mischkulturen verabreicht worden waren, enthielten in der Kombination "A" Antikorper gegenuber den Serotypen L. grippotyphosa, L. tarassovi, L. hebdomadis und L. hard;o, in der Kombination "B" Antikorper gegenuber den Serotypen L. icterohaemorrhagiae, L. canicola, L. pomona und L. rachmati. Bei Untersuchungen von kunstlich infiziertem Schweinestall-Abwasser zeigten beide polyvalenten Konjugate ein den Serotypen entsprechendes Verhalten. Diskussion 1m diagnostischen Routinebetrieb ist eine schnelle und direkte Nachweismethode fur Leptospiren deswegen besonders wunschenswert, wei! die Kultivierung der Erreger hohe Anspruche an den Nahrboden stellt und langwierig ist. Fur einen schnell en Nachweis von Leptospiren bot sich die Fluoreszenz-Serologie an, jedoch war die Loslosung der Erreger vom Objekttrager beim Fixierungsprozeg und bei der Farbung von Nachtei! (Pillot, 5). Die hier angewendete Methode der Zumischung von Schafserum als Klebstoff bewahrte sich bei unseren Untersuchungen. Ebenso bewirkte die Verwendung von Eiklar eine gute Haftung der Erreger auf dem Objekttrager. Die Aussagen hinsichtlich der Serotypen-Spezifitat sind widerspruchlich: Hodges u. Ekdahl (4) wiesen ein hohes Mag dieser Spezifitat nach, wahrend Torten u. Mitarb. (11) bei ihren Untersuchungen an menschlichen Patienten auf eine Vielzahl moglicher Antikorper lediglich L. patoc als Antigen verwendeten. Die Autoren erklarten diese Diskrepanz mit der Feststellung, dag im Fruhstadium der Infektion sowohl genus- als auch serotypenspezifische Antikorper auftreten, wahrend im spateren Stadium lediglich noch serotypen-spezifische Antikorper nachzuweisen seien. Dbertragen auf die Herstellung von Antiseren zu diagnostischen Zwecken konnte das bedeuten, dag kurzfristig nach der Verabreichung eines bestimmten LeptospiraSerotyps an Versuchstiere polyvalente Antiseren zu gewinnen waren, ohne dag es notwendig ist, Mischkulturen zu verwenden. Jedoch schien uns zur Herstellung polyvalenter Konjugate der Weg uber die Verabreichung von Mischkulturen eine bessere Kontrollmoglichkeit zu bieten. Fur den diagnostischen Betrieb wird vorgeschlagen, zunachst die polyvalenten Konjugate zur Feststellung einer Leptospiren" Infektion anzuwenden und anschliegend mit den monovalenten Konjugaten den Serotyp zu bestimmen. Die Ergebnisse wurden an kiinstlich infiziertem Material gewonnen, das von 10

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auf 1 ml konzentriert wurde. Dabei ist es vorstellbar, dag die Empfindlichkeit des Nachweises durch starkeres Konzentrieren einer grogeren Materialmenge erhoht werden kann. Nach Versuchen von Sleight (7) zur intravaginalen Dbertragung von Leptospirose bei Rindem erwiesen sich eine Gesamtkeimzahl von 105 im Ham und Von 8 X 106 im Samenverdunner ohne Antibiotikum als minim ale infektiose Dosis. Die Nachweisgrenze des angegebenen fluoreszenzserologischen Nachweises lag unterhalb dieser Keimkonzentration. Literatur 1. Bisping, W.,I.Dimitriadis, M.,Pozvari, H.Redlich und E. Weiland: Die Verb rei tung der Leptospirose bei Rindern und Schweinen in Nordwestdeutschland und ihre Bedeutung fur die Fleischbeschau. Schlacht- u. Viehh.-Ztg. 71 (1971) 173-178 2. Burger, G. und H. P. Fuchs: Zur Empfindlichkeit der direkten Immunofluoreszenzfarbung in der Leptospirose-Serodiagnostik. Zbl. Bakt., LAbt. Orig. 207 (1968) 63-82 3. Cherry, W.B., M.Goldman, and T.R.Carski: Fluorescent Antibody Techniques in the Diagnosis of Communicable Diseases. u.s. Public Health Servo Publ. 729 (1960) 4. Hodges, R. T. and M.O.Ekdahl: Use of a Fluorescent Antibody Technique for the Serological Differentiation of Leptospiral Serotypes in Cultures and in Bovine Urine. N. Z. vet. J. 21 (1973) 109-115 5. Pillot,].: Analytical Serology of Treponemataceae. In Kwapinski,]. B. G.: Analytical Serology of Microorganisms. Interscience Publishers (1969) 6. Pillot,]. et d'Azambuja: L'immunofluorescence indirecte et la reaction de fixationdu complement realisees avec Leptospira icterohaemorrhagiae. Ann. Inst. Pasteur 104 (1963) 137-141 7. Sleight, S. D.: The Role of Penicillin and Streptomycin in the Prevention of Transmission of Bovine Leptospirosis by Artificial Insemination. Amer. J. vet. Res. 26 (1965) 365-368 8. Smith, R.E., I.M.Reynolds, and G. W.Clark: Immunofluorescence in the Diagnosis of Bovine Fetal Leptospirosis. Cornell Vet. 57 (1967) 517-526 9. Stahlheim, o. H. V.: Leptospirosis Diagnosis by Immunofluorescence: Improved Procedure for Antigen Preparation. Amer. J. vet. Res. 32 (1971) 2107-2109 10. Sulzer, C. R., T. W. Harvey, and M. M. Galton: Comparison of Diagnostic Technics for the Detection of Leptospires in Rats. Hlth Lab. Sci. 5 (1968) 171-173 11. Torten, M., E. Shenberg, and]. van der Hoeden: The Use of Immunofluorescence in the Diagnosis of Human Leptospirosis by a Genus-Specific Antigen. J. infect. Dis. 116 (1966) 537-543 12. White, F.H. and M.Ristic: Detection of Leptospira pomona in Guinea Pig and Bovine Urine with Fluorescein Labelled Antibody. J. infect. Dis. 105 (1959) 118-123 Dr. C.Staak, Bundesgesundheitsamt, Postfach, D-I000 Berlin 33