- Email: [email protected]
Eine spektralphotometrische bestimmung von kupfer in serum, harn und faeces
CLINICA CHIMICA ACTA
119
CCA4854
EINE
SPEKTRALPHOTOMETRISCHE
SERUM, HARN
BESTIMMUNG
VON
KUPFER
IN
UND FAECES
WOLFGANG BEYER 1nstitut fiiv Medizinische Chemie der Universitiit Graz (Osterreich) (Eingegangen am 25. Oktober 1971)
SUMMARY Sfiectrophotometric
Determination
of Copper
in Serum, Urine
and Faeces
A simple spectrophotometric mination
procedure for the rapid and reproducible deterof copper in serum, urine and faeces with a new reagent is proposed. The
organic reagent is morpholinium-4-carbodithioate. The easy synthesis of this reagent is described. The reagent solution is stable for several months. It allows to determine copper and iron in the same sample of both urine and faeces. Comparison with a method using bathocuproine as a reagent in the case of serum copper determination shows no significant differences. The results are treated statistically. The method was tested by recovery and determination of test serum samples. The normal range of ten human sera was found to be go-I50 15-31 ,ug Cu/d.
,ug CU/IOO ml and that of ten urine samples
EINLEITUNG Zur spektralphotometrischen Bestimmung des Spurenelementes Kupfer in biologischem Material und in Korperfltissigkeiten wurden fur Zwecke der klinischchemischen Analyse bisher eine Reihe von Reagenzien vorgeschlagen, von denen hier nur einige angefiihrt werden kiinnen : Natriumdiathyldithiocarbamatl, Bathocuproin2, 1,5-Diphenylcarbohydrazid5v6 und Dithizon’. 0xaldihydrazid3p4, In der vorliegenden Mitteilung wird ein neues Reagens zur Bestimmung von Kupfer beschrieben. Auch wird auf die Mijglichkeit eingegangen, bei der Kupferbestimmung in Ham und Faeces in einem Arbeitsgang gleichzeitig den Eisengehalt des biologischen Materials mitzubestimmen. Das Reagens wurde in vorangegangenen Arbeiten auf seine Eignung tralphotometrischen Bestimmung von Spurenelementen untersucht, wobei die Anwendung auf biologisches Material beriicksichtigt wurdes-ll. Es handelt sich bei dem Reagens urn ein substituiertes Dithiocarbamat, die Namen morpholin-N-dithiocarbonsaures Morpholinium (MDCM) oder linium-+carbodithioat bzw. Morpholinium-N-dithiocarbamat hat. MDCM
zur spekvor allem welches Morphoist leicht
CL&. Chim. Acta, 38 (1972) IIg--1z6
120
BEYER
herzustellen, hat eine gute Empfindlichkeit, ist in schwach alkalischer Losung praktisch unbegrenzt haltbar, erlaubt eine schnelle und einfache Arbeitsweise und zeigt bei der statistischen Priifung gute Werte fiir Standardabweichung, Varianz und Bestimmungsgrenze. Es wurde an Harn- und Serumkupferproben im klinischen Labor ein Jahr lang getestet. Da es bei Kupferstoffwechselstiirungen vorteilhaft ist, die Verschiebung der Kupfergehalte in biologischem Material mit einer einheitlichen Methodik zu verfolgen, wurden Methoden zur Kupferbestimmung fur klinische Zwecke ausgearbeitet. MATERIALEN
Das Reagens:
Darstellung und Eigenschaften
der miissrigen Liisung
17.4 g Morpholin (Merck) werden in ca. IOO ml Athanol gel&t und unter Rtihren mit einer Losung von 7.6 g Schwefelkohlenstoff in IOO ml Athanol nach und nach zur Reaktion gebracht. Die sofort ausfallende Verbindung wird tiber eine Nutsche filtriert und mit Athanol gewaschen. Das Praparat wird im Trockenschrank bei 8o”getrocknet. Es ist auf Grund seiner salzartigen Natur in Wasser bis zu 2% gut loslich. Die schwach alkalisch gemachte Losung ist unter Verschluss in dunkler Glasflasche gut haltbar. Bei langerem Stehen kijnnen Kristalle des Disulfids der Verbindung ausfallen, die abfiltriert werden und keinen Einfluss auf die Wirksamkeit des Reagens haben. In saurem Medium zerfallt MDCM in Morpholin und Schwefelkohlenstoff. iiber die Zersetzungsgeschwindigkeit von MDCM in Abhangigkeit vom pH-Wert, seine Extrahierbarkeit in Chloroform und seine analytischen Eigenschaften wurde schon frtiher berichtetl”. Die Reaktion vou MDCM mit Kupjeer Das Reagens reagiert mit Cul+ und Cu 2+ -1onen sehr rasch unter Bildung eines gelb-braun gefarbten Chelates, das sich schon in 4 N-salzsaurer Losung quantitativ ausbildet und bis pH 9 gleiche Absorptionseigenschaften hat. Es ist in Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Ather, Benzol, Toluol, Xylol und Trichlorathylen extrahierbar. Der chloroformische Extrakt hat sein Absorptionsmaximum bei 438 nm. Die Empfindlichkeit betragt 0.0049 ,ug Cu cm .rnl-l bei einer Extinktion von 0.001. Das Beer’sche Gesetz ist von 0.2-4.5 rug Cu . ml-l erftillt (I cm-Ktivette). Da such Eisen mit MDCM reagiert, kijnnen Eisen und Kupfer aus gepufferter Losung mit Chloroform extrahiert werden. Durch Messung bei zwei Wellenlangen werden aus der Summe der Einzelextinktionen die entsprechenden Gehalte der beiden Metalle berechnet. Diesbeztigliche Reaktionsbedingungen wurden in einer vorangegangenen Arbeit an wassrigen Lijsungen von Kupfer- und Eisengemischen untersucht13. Die Reaktiolz ~10~8 MDCM mit Eisen Das Reagens reagiert mit Fe”-‘- und Fe 3+ -1onen in einem pH-Bereich von 2-6 quantitativ. Der Komplex ist in Chloroform extrahierbar. Der Extrakt hat sein Absorptionsmaximum bei 310 nm. Die Empfindlichkeit betragt o.or75pg Fe . cm ml-l bei einer Extinktion von 0.001. Das Beer’sche Gesetz ist im Bereich von 0.8-16 ,ug Fe ml-l erftillt.
Clin. Chim. .4cta, 38
(1972)
119-126
BESTIMMUNG
VON KUPFER
IL1
IN SERUM
METHODIK
Analysenbedingungen
und Apparate Vor der Analyse mtissen alle Glasgerate entsprechend den Vorschriften der Spurenanalyse gereinigt werden 14. Fur alle Analysen wurde durch Ionenaustauscher demineralisiertes Wasser (DM-Wasser) verwendet. Alle Messungen wurden am ZeissSpektralphotometer PMQ II in I bzw. z cm-Kiivetten durchgeftihrt.
Reagenzien fiir die Arbeitsvorschriften (I) Reagenslosung: 0.5 g MDCM zu
von r-3 ml O.OOOI N-Natronlauge
IOO
(2) Salzsaure 37%ig (Merck) (3) 2 N-Salzsaure (4) Azetatpuffer pH 4.6: 60 g Eisessig gel&t ad IOOO ml (5) Chloroform (Merck). Arbeitsvorschrift I Bestimmung von Kupfer
durch
und
Extraktion
gel&t
136 g Natriumazetat
mit Chloroform.
.3 H,O
Bis zu 40 ml Probe-
losung (1-20 ,ug Cu enthaltend) werden in einem 250 ml-Schiitteltrichter mit Teflonktiken vorgelegt. Die Losung wird mit. 5 ml Salzsaure (2) versetzt und mit DM-Wasser auf ca. 50 ml gebracht. Es folgen 3 ml Reagens (I). Nach einmaligem Durchschtitteln
-
~_rgCu/ml chloroform
Fig. 1. Eichkurve
fiir den Cu-MDCM-Komplex
nach Extraktion
mit Chloroform.
werden 5.0 ml Chloroform (5) zugesetzt und eine Minute lang kraftig geschtittelt. Nach Phasentrennung wird der Extrakt tiber Watte, die sich im Hals des Schtitteltrichters befindet, in eine I cm-Ktivette abgelassen. Man misst bei 438 nm gegen einen Reagenzienleerwert, der analog bereitet wurde, nur statt der Probelosung 40 ml DM-Wasser enthalt. Zur Aufstellung der Eichkurve wird an Stelle der Probelosung ein Kupferstandard (I ,ug Cujml) verwendet, von dem steigende Mengen eingesetzt werden. Die Eichkurve zeigt Fig. I. Die Absorption ist tiber eine Stunde konstant. Die Methodik wird fur die Aufschlusslosung bei der Bestimmung von Kupfer im Harn verwendet.
Clin.
Chim.
Ada,
38 (1972)
IIg--I26
122
BEYER
Arbe~tsvorsch~~ft2 Bestimmung van Kupfeer in sawer, wiissriger Liisung. 1.0 ml ProbelGsung, die 0.5-S ,ug Kupfer enthalten darf, wird in einer Eprouvette mit 1.0 ml Salzsaure (3) und 2 ml Reagens (I) versetzt. Nach Umschtitteln wird fiinf Minuten spater die Losung bei 438 nm gegen einem Reagenzienleerwert in einer 2 cm-Kiivette gemessen. Zur Ermittlung der Kupferkonzentration kann, unter Berticksichtigung der Schichtdicke und des Probevolumens, die Eichkurve in Fig. I herangezogen werden. Diese Arbeitsweise liegt der Bestimmung von Kupfer im Serum zugrunde. Arbeitsvorschrz’ft 3 Bestimmung von Kupfer und Eisen dwrch Extraktiw mit Chloroform. In einem 250 ml-Schtitteltrichter werden bis zu 40 ml Probelosung (r-20 pg Cu und 4-60 yg Fe enthaltend) vorgelegt. Man fiigt ca. 5 ml Azetatpuffer (4) dazu, erganzt mit DMWasser auf 50 ml und versetzt mit 3 ml Reagens (I). Nach einmaligem Schtitteln folgen 5.0 ml Chloroform (5). Es wird eine Minute lang kraftig geschtittelt und der Extrakt, wie oben beschrieben, in eine I cm-Ktivette abgelassen. Die Extinktionen werden gegen einen Reagenzienleerwert bei 438 nm (Cu) und gro nm (Fe) gemessen. Die Eisen- und Kupfergehalte pro 5 ml Extrakt werden nach folgenden Gleichungen berechnet : pg Cu/5 ml Chloroform = 34.6 . E,,,--55.4 . E,,, lug Fe/s ml Chloroform = 134.8 . E,,,--29.6 * E,,, Die Faktoren dieser Gleichungen werden, wie in einer vorangegangenen Arbeit beschrieben13, ermittelt, wobei an StelIe der Probelosung Standards von I pg Cu/ml und 4 ,ug Fe/ml angesetzt werden. Diese Arbeitsweise wird nach Aufschluss zur Bestimmung von Kupfer und Eisen in Harn und Faeces verwendet. Statistische PrGfu~g deerBestimmurgg van K~J!$Y (Eisen) mit MDCM Nach Vorschlagen von Gottschalkls wurden die Anal~rsen~erfahren (Arbeitsvorschriften 1-3) statistisch tiberprtift. Dazu wurden Kupfer (I ,ug Cu/ml) und Eisenstandardkjsungen (4 ,ug Fe/ml) verwendet. Nach den angegebenen Arbeitsvorschriften gelangten je 24 Proben sechs verschiedener Konzentrationen in 2 cm-Kiivetten zur TABELLE STATISTISCIIE
I PRijFUNG
DER
BESTIMMUNG
VON
KUPFER
(EISEN)
MIT
MDCM
E~ty~kt~o~~ des Cu-Komplexcs in Chloroform (438 cm) Priifgrdsse Tr[<1(g5) = 2.0741 Molarer Extinktionskoeffiz~ent ~(1. mol-z 1cm--l) Standardabweichung SK (,ug .ml--*) Grenzwerte der Varianzen vo(Rel:&) vu(Rel%) Fehlerbereiche T (99) (ELM.ml-l) T (99.9) (pup. rnlw Bestimmumgsgrenze b&/q. ml--l) Bestimmumgsgrenze zugehijrige Extinktion Empfindlichkeit (E = 0.001) (,ug . cm * ml-‘) ___.._
CLdn.
Chir,z.
A&, 38
(1972)
119-126
r.-jo 13120 + 0.0150 + 0.75 zt 15.0 f 0.042 i 0.057 0.081 0.035 0.00‘+g
Cu-KompEex in wiissviger L&LVlg (438 nml 0.28
I3240 * 0.0095 * 0.48 i 9.6 f 0.027 f 0.036 + o.ogr 0.022 o.oo.@
Ertrakt des Fe-Kom~lexe in Chloroforn (po nm) 0.686
3210 rf: 0.048 -k 0.61 -& 12.1 ir: 0.135 + 0.182 0.258 0.030 0.0174
BESTIMMUNG
VON
KUPFER
I23
IN SERUM
Messung. Die Korrelationsrechnung
ergab, dass das Beer’sche
Gesetz in den unter-
suchten Konzentrationsbereichen (0.2-4.5 ,ug Cu/ml und 0.8-16 ,~g Fe/ml) streng erftillt ist. In Tabelle I sind die statistischen Daten zusammengestellt. Die Angaben der molaren Extinktionskoeffizienten (ref. 16) ermittelt .
und der Empfindlichkeiten
Bestimmung van Kupfer im Serum Das Serum wird mit Salzsaure hydrolysiert slure gefallt. Im sauren Zentrifugat
wurden nach Sandell
und das Serumeiweiss
mit Trichloressig-
wird das Kupfer direkt bestimmt.
Reagenzien (6) (7) (8) (9)
Salzsaure I N 1.22 M-Trichloressigsaure (zoo g Trichloressigdure Kupferstandard (260 pg CU/IOO ml) Reagenslosung 0.5%.
ad IOOO ml DM-Wasser)
Arbeitsvorsckift 2 ml Serum werden in IO ml-Zentrifugenriihrchen pipettiert, 1.0 ml SalzsaureG zugesetzt und gut gemischt. Nach 20 Minuten wird I ml Trichloressigsaure (7) zugesetzt, durchgemischt und scharf zentrifugiert. Vom Ijberstand werden 2.0 ml in eine Eprouvette pipettiert, mit 2.0 ml Reagens (9) versetzt und nach 5 Minuten bei 438 nm gegen einen Reagenzienleerwert in 2 cm-Ktivetten gemessen. Fur jede Serie wird ein Kupferstandard mitgefiihrt. Leerwert und Kupferstandard werden wie folgt hergestellt : I ml DM-Wasser bzw. I ml Kupferstandard (8) wird mit 0.5 ml Salzsaure (6), 0.5 ml Trichloressigsaure erfolgt nach der Gleichung : pg
Cu/roo
ml =
(7) und mit 2.0 ml Reagens (9) versetzt. Die Berechnung
Ext
Probe
Ext
Standard
’
260
Die Bestimmung van Kupfer (Eisen) im Harn. Reagenzien (IO) Schwefelsaure 95-97 %ig (Merck) (II) Salpetersaure 65 %ig (Merck) (12) Perchlorsaure: 35 ml Perchlorsaure 70 %ig (Merck) mit 23 ml DM-Wasser verdiinnt (13) Phenolphthalein : I %ige Losung in Athanol (14) Natronlauge 30 %ig “Suprapur” (Merck) IOO ml des z4-Stunden-Harnes, der in Pyrexglas oder Polyathylenbehaltern gesammelt wurde, werden in einen IOOO ml-Pyrex-Rundkolben iiberftihrt, der zwei gut gereinigte Glasperlen enthalt. Es folgen 4 ml Schwefelsaure (IO), 15 ml Salpetersaure (II) und 2.5 ml Perchlorsaure (12). Es wird in dem Mass, wie es das Schaumen zulasst, erhitzt, bis unter Entweichen von SO,-Nebeln die Aufschlusslosung klar wird. Nach vorsichtigem Abkiihlen wird mit IO ml DM-Wasser versetzt und nochmals abgeraucht. Zur Bestimmung von Kupfer wird die schwefelsaure Aufschlusslijsung in einen 250 ml-Schtitteltrichter tiberftihrt und wie unter Arbeitsvorschrift I angegeben weitergearbeitet. Bei Harnen mit starker Proteinurie verbleibt nach dem Aufschluss ein Kohlertickstand. Er wird durch nochmaliges Abrauchen mit Schwefelsaure (IO) beseitigt. Will man gleichzeitig den Eisengehalt des Harnes bestimmen, so Clin. Chinz. Acta, 38 (1972) 119-126
BEYER
124
muss die Aufschlussl~sung mit ca. 15 ml DM-Wasser in einen 250 ml-Sch~tteltrichier gespiilt werden, mit zwei Tropfen Phenolphthalein (13) versetzt und mit Natronlauge (14) bis zur Rosafsrbung titriert werden. Es wird nach Arbeitsvorschrift 3 weitergearbeitet .
Bestimmung volz Kupfev (Eisen) in Faeces. Reagenzielt (15) SalpetersZure 65 %ig (Merck) (16) 2 N-Salzsaure (17) Azetatpuffer pH 4.6 IO g vorher homogenisierter Stuhl aus der Tagesmenge werden in einer Quarzschale mit 50 ml Salpetersaure (IS) versetzt, gut verrtihrt und mit einem OberA&chenverdampfer zur Trockene eingeengt; anschliessend bei 550” im Muffelofen mineralisiert und der Riickstand in 40 ml 2 N-Salzsaure (16) gel&t. Die Lijsung wird in einen 50 ml-Messkolben filtriert, mit 2 N-SalzsPure (16) nachgewaschen und zur Marke aufgefiillt. Von dieser Liisung wird I ml in eine Eprouvette pipettiert und die Probe nach Arbeitsvorschrift 2 weiterbehandelt. Will man Kupfer und Eisen bestimmen, so wird I ml Aufschlusslosung in einen 250 ml-Schiitteltrichter pipettiert, mit IO ml Azetatpuffer (17) versetzt und wie bei Arbeitsvorschrift 3 angegeben weitergearbeitet. Bei starken Schwankungen der Stuhlmenge muss man Probenmenge und Volumen des Extraktionsmittels variieren. ERGEBNISSE UND DISKUSSION
F~~f~~g Deb cathode mit Hi2fe eines Testserwzs. Die Methode wurde an einem Testserum gepriift (Seronorm), fiir das ein empfohlener Wert von 105 pg CU/IOO ml angegeben war. Die Tabelle II zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von Kupfer mit MDCM und mit Bathocuproin” als Vergleichsmethode. Die weitgehende ubereinstimmung der Werte zeigt die Verwendbarkeit der Methode fiir die Serumkupferbestimmung. PrGfung der Methode durch das Atifstockverfahren. Das Testserum (Seronorm) wurde geeignet verdunnt und mit x ml von Kupferliisungen versetzt, die 150, 200, 260 und 300 pg Cu/roo ml enthielten. Durch Variation von Serum- und Kupferlosungen ergaben sich die in Tabelle III angefiihrten Konzentrationen.
TABELLE II
C,u gefunden mit Bathocuproin pg CU~IOO ml
CMgefundrn mit MDCM pg Culroo ml
‘05
98
105
IQ-l.
10s
108
10s
IOL
106
195 195 195
Gin.
99 I“5
Claim. Acta,
38 (1972) lrg-126
IQ1
195 “‘7 193
BESTI~~UNG TABELLE
VOX
KUPFER
III
AUFSTOCKVERFAHREN --
~10.5 ‘05 52 52
ml
103
105
.i2 52 105 105
TABELLE
FiiR
KUPFER
zugesetzt pg Cul100
Serum
pg Cu/roo
IN SERUM
-.-.._
Gesamtkupfer pg Cu/roo ml
ml
Cu
gefunden
pg
CulIoo
32 52 103 53
‘37 ‘57 155 10s
140 ‘64 160
52 1z9 I33 68 31 75
157 136 18.5 120 136
150 rr6 ‘79 123 =30
X80
‘72
FiiR
KUPFER
,q/roo ml
Fe gefunden pg/Ioo ml
Idgil
1.4 I-JI,4
3.9 3-9 3.9
2.6 13.0 30.0
cu
SERUM
ml
Cu wiedergefunden 0, 10 IO2
=04 103
106
III
96 93 97 103 95 96
--
IV
AUFSTOCKVERFAHREN
gefunden
IM
UND
Cu zugesetat ml
EISEN
IM HARN
Fe .rugesetxt
Cu gefunden
pg/roo
pg/roo
5.0
ml
3.7 14.0
IO.0
15.0
ml
Fe gefunden
-
#ug/gllooml 8.5 12.9
34-I
19.0
Cu
Fe
Ref.
.Yf.
93 97
95 93
“A
108
9’0
101
Priifung der Methode durch das Aufsto~k~leyfah~c~. In &em Sammelharn (Spontanharn mehrerer Personen) wurden fur Kupfer 1.4 yglroo ml und fur Eisen 3.9 ,uug/~ooml gefunden. Durch Zusetzen steigender Kupfer- und Eisenmengen wurden die in Tabelle IV angegebenen Werte gefunden. Es wurde mit der unter lYestimmung zlon KufifeY wzd Eisen im Harn angegebenen Arbeitsweise vorgegangen, die Extraktion jedoch mit IO ml Chloroform durchgefiihrt.
Normahcrte Die Normalwerte von Sera IO erwachsener Personen lagen zwischen 90 und 150 pugC.U/IOOml bei einem ~ittelwert von 122 pg CU/IOO ml. Bei einem ~~is~hserum 20 erwachsener Personen ergab sich ein Mittelwert von 127 pg Cu/xoo ml f8 Bestimmungen) bei einer Standardabweichun~ von i_ 3.5. Bei IO “Normalharnen” (keine Proteinurie) ergaben sich Werte zwischen 15 und 31 ,LJ~Cu/d bei einem relativen Fehler von -& 7%. In drei untersuchten Sttihlen wurden Mittelwerte von 1.9 mg Cu und 6.0 mg Fe bei einer mittleren Tagesmenge von etwa IOOg gefunden. StGrei~zj&sse bei der Bestimmung
vow Ka@fer mit MDCiV
Unter den gewghlten Versuchsbedingungen fiir die Bestimmung von Kupfer in Serum, Barn und Faeces ist das Reagens bei Vorliegen physiologischer Konzentrationen anderer Elemente speziflsch. Bei Intoxikationen erhijhte Gehalte an Blei, Quecksilber, Thal~um und Arsen stiiren nicht. Aussch~esslich Nickel und ~~olybd~n wiirden in unph~siologische hohen Konzentrationen die Bestimmung stiiren. Clin. Chim. Acta, 38
(1972)
119-126
BEYER
r&i
Besondere Vorteile der Methode sind ihre breite Anwendbarkeit auf biologisches Material und die gleichzeitige Erfassung von Kupfer und Eisen, deren Wirkung such in den biologischen Systemen gekoppelt ist. Die Empfindlichkeit ist mit 0.08 FcgCu/mI (in der 2 cm-Kiivette) geniigend hoch. Dazu kommt die grosse Stabilitat der Reagenslosung, die weitgehende Unabhangigkeit von pH4ndernden Einfliissen auf den Ansatz bei Beriicksichtigung des Eisens und die Farbbestlndigkeit des Komplexes.
Eine s~ektral~hot~metrische Bestimmung von Kupfer in Serum, Ham und Faeces mit einem neuen Reagens wird beschrieben. Die Darstellung ist einfach und wird angegeben. Die wassrige Losung ist tiber Monate stab& Morpholin-N-dithiocarbonsaures Morpholinium (MDCM) gibt mit Kupfer schon in stark saurem Medium ein gefgrbtes Chelat, welches eine sasche und reproduzierbare Bestimmung dieses Elementes erlaubt. Daneben wird such die ~~~glic~~kei~beschrieben, die Summe von Kupfer und Eisen durch Estraktion aus gepufferter Losung und Messnng des Extraktes bei zwei Wellenl%rgen zu bestimmen. Arbeitsvorschriften zur Kupfer- (und Eisen-) Bestimmung werden angegeben und die Ergebnisse statistisch gepriift. Die Serumkupferbestimmnng wird an Hand eines Testserums tiberpriift und mit der “~athocuproinmethode” verghthen. Die Normalwerte fur Serum lag-en zwischen oo und ISO pg Cu/~on ml, die fur Barn zwischen 15 und 3r pg Cu/d und der Mittefwert von drei untersuchten Stiihlen bei 1.9 mg Cu/d.
I A. Enerv UP~D H. H. GREEN, Biocketn. J,. 34 (1940) 2 I$. ZAIi,
Cl&%. Cki@2.
AC&
~202.
3 (1958) 328.
3 c-. n. STARK UND c. R. DAWSOX, AIzaE. C?W?~., 30 (1958) Igr. J 5 G. WELSHMAN, Clin. Chinz. Actn, 5 (rgbo) 497. 5 II, MIKAC-DEW& Cl&t. Chi+n. Acta, 7 (~962) 788. 6 .D. MIKAC-DEVIC, CEin. Chim. -4&a, 26 (x969) 117. 7 E. J. %UTLER UND G. E. NEWMAN, Clin. Chim. Acta, 11 (1965) 452. 8 W. XEYER UND R. D. OTT, ~~~~k~ock~~~~. Acta, ir965) I 130.
119
CCA4854
EINE
SPEKTRALPHOTOMETRISCHE
SERUM, HARN
BESTIMMUNG
VON
KUPFER
IN
UND FAECES
WOLFGANG BEYER 1nstitut fiiv Medizinische Chemie der Universitiit Graz (Osterreich) (Eingegangen am 25. Oktober 1971)
SUMMARY Sfiectrophotometric
Determination
of Copper
in Serum, Urine
and Faeces
A simple spectrophotometric mination
procedure for the rapid and reproducible deterof copper in serum, urine and faeces with a new reagent is proposed. The
organic reagent is morpholinium-4-carbodithioate. The easy synthesis of this reagent is described. The reagent solution is stable for several months. It allows to determine copper and iron in the same sample of both urine and faeces. Comparison with a method using bathocuproine as a reagent in the case of serum copper determination shows no significant differences. The results are treated statistically. The method was tested by recovery and determination of test serum samples. The normal range of ten human sera was found to be go-I50 15-31 ,ug Cu/d.
,ug CU/IOO ml and that of ten urine samples
EINLEITUNG Zur spektralphotometrischen Bestimmung des Spurenelementes Kupfer in biologischem Material und in Korperfltissigkeiten wurden fur Zwecke der klinischchemischen Analyse bisher eine Reihe von Reagenzien vorgeschlagen, von denen hier nur einige angefiihrt werden kiinnen : Natriumdiathyldithiocarbamatl, Bathocuproin2, 1,5-Diphenylcarbohydrazid5v6 und Dithizon’. 0xaldihydrazid3p4, In der vorliegenden Mitteilung wird ein neues Reagens zur Bestimmung von Kupfer beschrieben. Auch wird auf die Mijglichkeit eingegangen, bei der Kupferbestimmung in Ham und Faeces in einem Arbeitsgang gleichzeitig den Eisengehalt des biologischen Materials mitzubestimmen. Das Reagens wurde in vorangegangenen Arbeiten auf seine Eignung tralphotometrischen Bestimmung von Spurenelementen untersucht, wobei die Anwendung auf biologisches Material beriicksichtigt wurdes-ll. Es handelt sich bei dem Reagens urn ein substituiertes Dithiocarbamat, die Namen morpholin-N-dithiocarbonsaures Morpholinium (MDCM) oder linium-+carbodithioat bzw. Morpholinium-N-dithiocarbamat hat. MDCM
zur spekvor allem welches Morphoist leicht
CL&. Chim. Acta, 38 (1972) IIg--1z6
120
BEYER
herzustellen, hat eine gute Empfindlichkeit, ist in schwach alkalischer Losung praktisch unbegrenzt haltbar, erlaubt eine schnelle und einfache Arbeitsweise und zeigt bei der statistischen Priifung gute Werte fiir Standardabweichung, Varianz und Bestimmungsgrenze. Es wurde an Harn- und Serumkupferproben im klinischen Labor ein Jahr lang getestet. Da es bei Kupferstoffwechselstiirungen vorteilhaft ist, die Verschiebung der Kupfergehalte in biologischem Material mit einer einheitlichen Methodik zu verfolgen, wurden Methoden zur Kupferbestimmung fur klinische Zwecke ausgearbeitet. MATERIALEN
Das Reagens:
Darstellung und Eigenschaften
der miissrigen Liisung
17.4 g Morpholin (Merck) werden in ca. IOO ml Athanol gel&t und unter Rtihren mit einer Losung von 7.6 g Schwefelkohlenstoff in IOO ml Athanol nach und nach zur Reaktion gebracht. Die sofort ausfallende Verbindung wird tiber eine Nutsche filtriert und mit Athanol gewaschen. Das Praparat wird im Trockenschrank bei 8o”getrocknet. Es ist auf Grund seiner salzartigen Natur in Wasser bis zu 2% gut loslich. Die schwach alkalisch gemachte Losung ist unter Verschluss in dunkler Glasflasche gut haltbar. Bei langerem Stehen kijnnen Kristalle des Disulfids der Verbindung ausfallen, die abfiltriert werden und keinen Einfluss auf die Wirksamkeit des Reagens haben. In saurem Medium zerfallt MDCM in Morpholin und Schwefelkohlenstoff. iiber die Zersetzungsgeschwindigkeit von MDCM in Abhangigkeit vom pH-Wert, seine Extrahierbarkeit in Chloroform und seine analytischen Eigenschaften wurde schon frtiher berichtetl”. Die Reaktion vou MDCM mit Kupjeer Das Reagens reagiert mit Cul+ und Cu 2+ -1onen sehr rasch unter Bildung eines gelb-braun gefarbten Chelates, das sich schon in 4 N-salzsaurer Losung quantitativ ausbildet und bis pH 9 gleiche Absorptionseigenschaften hat. Es ist in Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Ather, Benzol, Toluol, Xylol und Trichlorathylen extrahierbar. Der chloroformische Extrakt hat sein Absorptionsmaximum bei 438 nm. Die Empfindlichkeit betragt 0.0049 ,ug Cu cm .rnl-l bei einer Extinktion von 0.001. Das Beer’sche Gesetz ist von 0.2-4.5 rug Cu . ml-l erftillt (I cm-Ktivette). Da such Eisen mit MDCM reagiert, kijnnen Eisen und Kupfer aus gepufferter Losung mit Chloroform extrahiert werden. Durch Messung bei zwei Wellenlangen werden aus der Summe der Einzelextinktionen die entsprechenden Gehalte der beiden Metalle berechnet. Diesbeztigliche Reaktionsbedingungen wurden in einer vorangegangenen Arbeit an wassrigen Lijsungen von Kupfer- und Eisengemischen untersucht13. Die Reaktiolz ~10~8 MDCM mit Eisen Das Reagens reagiert mit Fe”-‘- und Fe 3+ -1onen in einem pH-Bereich von 2-6 quantitativ. Der Komplex ist in Chloroform extrahierbar. Der Extrakt hat sein Absorptionsmaximum bei 310 nm. Die Empfindlichkeit betragt o.or75pg Fe . cm ml-l bei einer Extinktion von 0.001. Das Beer’sche Gesetz ist im Bereich von 0.8-16 ,ug Fe ml-l erftillt.
Clin. Chim. .4cta, 38
(1972)
119-126
BESTIMMUNG
VON KUPFER
IL1
IN SERUM
METHODIK
Analysenbedingungen
und Apparate Vor der Analyse mtissen alle Glasgerate entsprechend den Vorschriften der Spurenanalyse gereinigt werden 14. Fur alle Analysen wurde durch Ionenaustauscher demineralisiertes Wasser (DM-Wasser) verwendet. Alle Messungen wurden am ZeissSpektralphotometer PMQ II in I bzw. z cm-Kiivetten durchgeftihrt.
Reagenzien fiir die Arbeitsvorschriften (I) Reagenslosung: 0.5 g MDCM zu
von r-3 ml O.OOOI N-Natronlauge
IOO
(2) Salzsaure 37%ig (Merck) (3) 2 N-Salzsaure (4) Azetatpuffer pH 4.6: 60 g Eisessig gel&t ad IOOO ml (5) Chloroform (Merck). Arbeitsvorschrift I Bestimmung von Kupfer
durch
und
Extraktion
gel&t
136 g Natriumazetat
mit Chloroform.
.3 H,O
Bis zu 40 ml Probe-
losung (1-20 ,ug Cu enthaltend) werden in einem 250 ml-Schiitteltrichter mit Teflonktiken vorgelegt. Die Losung wird mit. 5 ml Salzsaure (2) versetzt und mit DM-Wasser auf ca. 50 ml gebracht. Es folgen 3 ml Reagens (I). Nach einmaligem Durchschtitteln
-
~_rgCu/ml chloroform
Fig. 1. Eichkurve
fiir den Cu-MDCM-Komplex
nach Extraktion
mit Chloroform.
werden 5.0 ml Chloroform (5) zugesetzt und eine Minute lang kraftig geschtittelt. Nach Phasentrennung wird der Extrakt tiber Watte, die sich im Hals des Schtitteltrichters befindet, in eine I cm-Ktivette abgelassen. Man misst bei 438 nm gegen einen Reagenzienleerwert, der analog bereitet wurde, nur statt der Probelosung 40 ml DM-Wasser enthalt. Zur Aufstellung der Eichkurve wird an Stelle der Probelosung ein Kupferstandard (I ,ug Cujml) verwendet, von dem steigende Mengen eingesetzt werden. Die Eichkurve zeigt Fig. I. Die Absorption ist tiber eine Stunde konstant. Die Methodik wird fur die Aufschlusslosung bei der Bestimmung von Kupfer im Harn verwendet.
Clin.
Chim.
Ada,
38 (1972)
IIg--I26
122
BEYER
Arbe~tsvorsch~~ft2 Bestimmung van Kupfeer in sawer, wiissriger Liisung. 1.0 ml ProbelGsung, die 0.5-S ,ug Kupfer enthalten darf, wird in einer Eprouvette mit 1.0 ml Salzsaure (3) und 2 ml Reagens (I) versetzt. Nach Umschtitteln wird fiinf Minuten spater die Losung bei 438 nm gegen einem Reagenzienleerwert in einer 2 cm-Kiivette gemessen. Zur Ermittlung der Kupferkonzentration kann, unter Berticksichtigung der Schichtdicke und des Probevolumens, die Eichkurve in Fig. I herangezogen werden. Diese Arbeitsweise liegt der Bestimmung von Kupfer im Serum zugrunde. Arbeitsvorschrz’ft 3 Bestimmung von Kupfer und Eisen dwrch Extraktiw mit Chloroform. In einem 250 ml-Schtitteltrichter werden bis zu 40 ml Probelosung (r-20 pg Cu und 4-60 yg Fe enthaltend) vorgelegt. Man fiigt ca. 5 ml Azetatpuffer (4) dazu, erganzt mit DMWasser auf 50 ml und versetzt mit 3 ml Reagens (I). Nach einmaligem Schtitteln folgen 5.0 ml Chloroform (5). Es wird eine Minute lang kraftig geschtittelt und der Extrakt, wie oben beschrieben, in eine I cm-Ktivette abgelassen. Die Extinktionen werden gegen einen Reagenzienleerwert bei 438 nm (Cu) und gro nm (Fe) gemessen. Die Eisen- und Kupfergehalte pro 5 ml Extrakt werden nach folgenden Gleichungen berechnet : pg Cu/5 ml Chloroform = 34.6 . E,,,--55.4 . E,,, lug Fe/s ml Chloroform = 134.8 . E,,,--29.6 * E,,, Die Faktoren dieser Gleichungen werden, wie in einer vorangegangenen Arbeit beschrieben13, ermittelt, wobei an StelIe der Probelosung Standards von I pg Cu/ml und 4 ,ug Fe/ml angesetzt werden. Diese Arbeitsweise wird nach Aufschluss zur Bestimmung von Kupfer und Eisen in Harn und Faeces verwendet. Statistische PrGfu~g deerBestimmurgg van K~J!$Y (Eisen) mit MDCM Nach Vorschlagen von Gottschalkls wurden die Anal~rsen~erfahren (Arbeitsvorschriften 1-3) statistisch tiberprtift. Dazu wurden Kupfer (I ,ug Cu/ml) und Eisenstandardkjsungen (4 ,ug Fe/ml) verwendet. Nach den angegebenen Arbeitsvorschriften gelangten je 24 Proben sechs verschiedener Konzentrationen in 2 cm-Kiivetten zur TABELLE STATISTISCIIE
I PRijFUNG
DER
BESTIMMUNG
VON
KUPFER
(EISEN)
MIT
MDCM
E~ty~kt~o~~ des Cu-Komplexcs in Chloroform (438 cm) Priifgrdsse Tr[<1(g5) = 2.0741 Molarer Extinktionskoeffiz~ent ~(1. mol-z 1cm--l) Standardabweichung SK (,ug .ml--*) Grenzwerte der Varianzen vo(Rel:&) vu(Rel%) Fehlerbereiche T (99) (ELM.ml-l) T (99.9) (pup. rnlw Bestimmumgsgrenze b&/q. ml--l) Bestimmumgsgrenze zugehijrige Extinktion Empfindlichkeit (E = 0.001) (,ug . cm * ml-‘) ___.._
CLdn.
Chir,z.
A&, 38
(1972)
119-126
r.-jo 13120 + 0.0150 + 0.75 zt 15.0 f 0.042 i 0.057 0.081 0.035 0.00‘+g
Cu-KompEex in wiissviger L&LVlg (438 nml 0.28
I3240 * 0.0095 * 0.48 i 9.6 f 0.027 f 0.036 + o.ogr 0.022 o.oo.@
Ertrakt des Fe-Kom~lexe in Chloroforn (po nm) 0.686
3210 rf: 0.048 -k 0.61 -& 12.1 ir: 0.135 + 0.182 0.258 0.030 0.0174
BESTIMMUNG
VON
KUPFER
I23
IN SERUM
Messung. Die Korrelationsrechnung
ergab, dass das Beer’sche
Gesetz in den unter-
suchten Konzentrationsbereichen (0.2-4.5 ,ug Cu/ml und 0.8-16 ,~g Fe/ml) streng erftillt ist. In Tabelle I sind die statistischen Daten zusammengestellt. Die Angaben der molaren Extinktionskoeffizienten (ref. 16) ermittelt .
und der Empfindlichkeiten
Bestimmung van Kupfer im Serum Das Serum wird mit Salzsaure hydrolysiert slure gefallt. Im sauren Zentrifugat
wurden nach Sandell
und das Serumeiweiss
mit Trichloressig-
wird das Kupfer direkt bestimmt.
Reagenzien (6) (7) (8) (9)
Salzsaure I N 1.22 M-Trichloressigsaure (zoo g Trichloressigdure Kupferstandard (260 pg CU/IOO ml) Reagenslosung 0.5%.
ad IOOO ml DM-Wasser)
Arbeitsvorsckift 2 ml Serum werden in IO ml-Zentrifugenriihrchen pipettiert, 1.0 ml SalzsaureG zugesetzt und gut gemischt. Nach 20 Minuten wird I ml Trichloressigsaure (7) zugesetzt, durchgemischt und scharf zentrifugiert. Vom Ijberstand werden 2.0 ml in eine Eprouvette pipettiert, mit 2.0 ml Reagens (9) versetzt und nach 5 Minuten bei 438 nm gegen einen Reagenzienleerwert in 2 cm-Ktivetten gemessen. Fur jede Serie wird ein Kupferstandard mitgefiihrt. Leerwert und Kupferstandard werden wie folgt hergestellt : I ml DM-Wasser bzw. I ml Kupferstandard (8) wird mit 0.5 ml Salzsaure (6), 0.5 ml Trichloressigsaure erfolgt nach der Gleichung : pg
Cu/roo
ml =
(7) und mit 2.0 ml Reagens (9) versetzt. Die Berechnung
Ext
Probe
Ext
Standard
’
260
Die Bestimmung van Kupfer (Eisen) im Harn. Reagenzien (IO) Schwefelsaure 95-97 %ig (Merck) (II) Salpetersaure 65 %ig (Merck) (12) Perchlorsaure: 35 ml Perchlorsaure 70 %ig (Merck) mit 23 ml DM-Wasser verdiinnt (13) Phenolphthalein : I %ige Losung in Athanol (14) Natronlauge 30 %ig “Suprapur” (Merck) IOO ml des z4-Stunden-Harnes, der in Pyrexglas oder Polyathylenbehaltern gesammelt wurde, werden in einen IOOO ml-Pyrex-Rundkolben iiberftihrt, der zwei gut gereinigte Glasperlen enthalt. Es folgen 4 ml Schwefelsaure (IO), 15 ml Salpetersaure (II) und 2.5 ml Perchlorsaure (12). Es wird in dem Mass, wie es das Schaumen zulasst, erhitzt, bis unter Entweichen von SO,-Nebeln die Aufschlusslosung klar wird. Nach vorsichtigem Abkiihlen wird mit IO ml DM-Wasser versetzt und nochmals abgeraucht. Zur Bestimmung von Kupfer wird die schwefelsaure Aufschlusslijsung in einen 250 ml-Schtitteltrichter tiberftihrt und wie unter Arbeitsvorschrift I angegeben weitergearbeitet. Bei Harnen mit starker Proteinurie verbleibt nach dem Aufschluss ein Kohlertickstand. Er wird durch nochmaliges Abrauchen mit Schwefelsaure (IO) beseitigt. Will man gleichzeitig den Eisengehalt des Harnes bestimmen, so Clin. Chinz. Acta, 38 (1972) 119-126
BEYER
124
muss die Aufschlussl~sung mit ca. 15 ml DM-Wasser in einen 250 ml-Sch~tteltrichier gespiilt werden, mit zwei Tropfen Phenolphthalein (13) versetzt und mit Natronlauge (14) bis zur Rosafsrbung titriert werden. Es wird nach Arbeitsvorschrift 3 weitergearbeitet .
Bestimmung volz Kupfev (Eisen) in Faeces. Reagenzielt (15) SalpetersZure 65 %ig (Merck) (16) 2 N-Salzsaure (17) Azetatpuffer pH 4.6 IO g vorher homogenisierter Stuhl aus der Tagesmenge werden in einer Quarzschale mit 50 ml Salpetersaure (IS) versetzt, gut verrtihrt und mit einem OberA&chenverdampfer zur Trockene eingeengt; anschliessend bei 550” im Muffelofen mineralisiert und der Riickstand in 40 ml 2 N-Salzsaure (16) gel&t. Die Lijsung wird in einen 50 ml-Messkolben filtriert, mit 2 N-SalzsPure (16) nachgewaschen und zur Marke aufgefiillt. Von dieser Liisung wird I ml in eine Eprouvette pipettiert und die Probe nach Arbeitsvorschrift 2 weiterbehandelt. Will man Kupfer und Eisen bestimmen, so wird I ml Aufschlusslosung in einen 250 ml-Schiitteltrichter pipettiert, mit IO ml Azetatpuffer (17) versetzt und wie bei Arbeitsvorschrift 3 angegeben weitergearbeitet. Bei starken Schwankungen der Stuhlmenge muss man Probenmenge und Volumen des Extraktionsmittels variieren. ERGEBNISSE UND DISKUSSION
F~~f~~g Deb cathode mit Hi2fe eines Testserwzs. Die Methode wurde an einem Testserum gepriift (Seronorm), fiir das ein empfohlener Wert von 105 pg CU/IOO ml angegeben war. Die Tabelle II zeigt die Ergebnisse der Bestimmung von Kupfer mit MDCM und mit Bathocuproin” als Vergleichsmethode. Die weitgehende ubereinstimmung der Werte zeigt die Verwendbarkeit der Methode fiir die Serumkupferbestimmung. PrGfung der Methode durch das Atifstockverfahren. Das Testserum (Seronorm) wurde geeignet verdunnt und mit x ml von Kupferliisungen versetzt, die 150, 200, 260 und 300 pg Cu/roo ml enthielten. Durch Variation von Serum- und Kupferlosungen ergaben sich die in Tabelle III angefiihrten Konzentrationen.
TABELLE II
C,u gefunden mit Bathocuproin pg CU~IOO ml
CMgefundrn mit MDCM pg Culroo ml
‘05
98
105
IQ-l.
10s
108
10s
IOL
106
195 195 195
Gin.
99 I“5
Claim. Acta,
38 (1972) lrg-126
IQ1
195 “‘7 193
BESTI~~UNG TABELLE
VOX
KUPFER
III
AUFSTOCKVERFAHREN --
~10.5 ‘05 52 52
ml
103
105
.i2 52 105 105
TABELLE
FiiR
KUPFER
zugesetzt pg Cul100
Serum
pg Cu/roo
IN SERUM
-.-.._
Gesamtkupfer pg Cu/roo ml
ml
Cu
gefunden
pg
CulIoo
32 52 103 53
‘37 ‘57 155 10s
140 ‘64 160
52 1z9 I33 68 31 75
157 136 18.5 120 136
150 rr6 ‘79 123 =30
X80
‘72
FiiR
KUPFER
,q/roo ml
Fe gefunden pg/Ioo ml
Idgil
1.4 I-JI,4
3.9 3-9 3.9
2.6 13.0 30.0
cu
SERUM
ml
Cu wiedergefunden 0, 10 IO2
=04 103
106
III
96 93 97 103 95 96
--
IV
AUFSTOCKVERFAHREN
gefunden
IM
UND
Cu zugesetat ml
EISEN
IM HARN
Fe .rugesetxt
Cu gefunden
pg/roo
pg/roo
5.0
ml
3.7 14.0
IO.0
15.0
ml
Fe gefunden
-
#ug/gllooml 8.5 12.9
34-I
19.0
Cu
Fe
Ref.
.Yf.
93 97
95 93
“A
108
9’0
101
Priifung der Methode durch das Aufsto~k~leyfah~c~. In &em Sammelharn (Spontanharn mehrerer Personen) wurden fur Kupfer 1.4 yglroo ml und fur Eisen 3.9 ,uug/~ooml gefunden. Durch Zusetzen steigender Kupfer- und Eisenmengen wurden die in Tabelle IV angegebenen Werte gefunden. Es wurde mit der unter lYestimmung zlon KufifeY wzd Eisen im Harn angegebenen Arbeitsweise vorgegangen, die Extraktion jedoch mit IO ml Chloroform durchgefiihrt.
Normahcrte Die Normalwerte von Sera IO erwachsener Personen lagen zwischen 90 und 150 pugC.U/IOOml bei einem ~ittelwert von 122 pg CU/IOO ml. Bei einem ~~is~hserum 20 erwachsener Personen ergab sich ein Mittelwert von 127 pg Cu/xoo ml f8 Bestimmungen) bei einer Standardabweichun~ von i_ 3.5. Bei IO “Normalharnen” (keine Proteinurie) ergaben sich Werte zwischen 15 und 31 ,LJ~Cu/d bei einem relativen Fehler von -& 7%. In drei untersuchten Sttihlen wurden Mittelwerte von 1.9 mg Cu und 6.0 mg Fe bei einer mittleren Tagesmenge von etwa IOOg gefunden. StGrei~zj&sse bei der Bestimmung
vow Ka@fer mit MDCiV
Unter den gewghlten Versuchsbedingungen fiir die Bestimmung von Kupfer in Serum, Barn und Faeces ist das Reagens bei Vorliegen physiologischer Konzentrationen anderer Elemente speziflsch. Bei Intoxikationen erhijhte Gehalte an Blei, Quecksilber, Thal~um und Arsen stiiren nicht. Aussch~esslich Nickel und ~~olybd~n wiirden in unph~siologische hohen Konzentrationen die Bestimmung stiiren. Clin. Chim. Acta, 38
(1972)
119-126
BEYER
r&i
Besondere Vorteile der Methode sind ihre breite Anwendbarkeit auf biologisches Material und die gleichzeitige Erfassung von Kupfer und Eisen, deren Wirkung such in den biologischen Systemen gekoppelt ist. Die Empfindlichkeit ist mit 0.08 FcgCu/mI (in der 2 cm-Kiivette) geniigend hoch. Dazu kommt die grosse Stabilitat der Reagenslosung, die weitgehende Unabhangigkeit von pH4ndernden Einfliissen auf den Ansatz bei Beriicksichtigung des Eisens und die Farbbestlndigkeit des Komplexes.
Eine s~ektral~hot~metrische Bestimmung von Kupfer in Serum, Ham und Faeces mit einem neuen Reagens wird beschrieben. Die Darstellung ist einfach und wird angegeben. Die wassrige Losung ist tiber Monate stab& Morpholin-N-dithiocarbonsaures Morpholinium (MDCM) gibt mit Kupfer schon in stark saurem Medium ein gefgrbtes Chelat, welches eine sasche und reproduzierbare Bestimmung dieses Elementes erlaubt. Daneben wird such die ~~~glic~~kei~beschrieben, die Summe von Kupfer und Eisen durch Estraktion aus gepufferter Losung und Messnng des Extraktes bei zwei Wellenl%rgen zu bestimmen. Arbeitsvorschriften zur Kupfer- (und Eisen-) Bestimmung werden angegeben und die Ergebnisse statistisch gepriift. Die Serumkupferbestimmnng wird an Hand eines Testserums tiberpriift und mit der “~athocuproinmethode” verghthen. Die Normalwerte fur Serum lag-en zwischen oo und ISO pg Cu/~on ml, die fur Barn zwischen 15 und 3r pg Cu/d und der Mittefwert von drei untersuchten Stiihlen bei 1.9 mg Cu/d.
I A. Enerv UP~D H. H. GREEN, Biocketn. J,. 34 (1940) 2 I$. ZAIi,
Cl&%. Cki@2.
AC&
~202.
3 (1958) 328.
3 c-. n. STARK UND c. R. DAWSOX, AIzaE. C?W?~., 30 (1958) Igr. J 5 G. WELSHMAN, Clin. Chinz. Actn, 5 (rgbo) 497. 5 II, MIKAC-DEW& Cl&t. Chi+n. Acta, 7 (~962) 788. 6 .D. MIKAC-DEVIC, CEin. Chim. -4&a, 26 (x969) 117. 7 E. J. %UTLER UND G. E. NEWMAN, Clin. Chim. Acta, 11 (1965) 452. 8 W. XEYER UND R. D. OTT, ~~~~k~ock~~~~. Acta, ir965) I 130.