Entwicklungsabhängige mitochondriale enzymaktivitäten bei den kasten der honigbiene

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BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA

BBA 45 691

ENTWICKLUNGSABHfi, N G I G E M I T O C H O N D R I A L E ENZYMAKTIVITfi,TEN B E I D E N KASTEN D E R H O N I G B I E N E 1 MINORU OSANAI lIND HEINZ REMBOLD Max-Planek-Institut fi~r Biochemie, Mi~nchen (Deutschland) (Eingegangen am 2. Februar, 1968)

SUMMARY

Development-dependent mitochondrial enzyme activities in castes of the honey bee Mitochondria of queen and worker honey bees were isolated and purified in various developmental stages as follows. The mitochondrial preparation free of sarcosomes, lysosomes and microsomes, was obtained b y centrifugation of a crude mitochondrial fraction in a slight gradient of sucrose containing a steep gradient of stractan AF/2 (Meyhall). The fractionated cell particles were characterized by their contents of protein and RNA, and their activities of acid phosphatase, acid ribonuclease, uricase and succinate dehydrogenase, respectively. After gradient centrifugation, three bands corresponding to the maxima of the protein content were observed in the sedimentation pattern. The middle band contained mitochondria. In the larvae and white-eyed pupae the band was separated further into lighter and heavier fractions. The quantity of the mitochondria in the queen is more than 2-fold higher than that of the worker throughout the developmental stages. When succinic acid, ~-glycerophosphoric acid and butyric acid were used as substrates of the oxidation systems, the mitochondfia of both castes demonstrated the maximal activity in the 5-day-old larva. The activities of the oxidation systems in the queen were substantially higher than those in the worker, particularly in the larval stages. It was further shown b y the difference spectra of mitochondria, that both castes were deficient in cytochrome c in the early developmental stages. The worker larva contained quantitatively less cytochrome c and cytochrome oxidase than the queen larva. It was concluded from these results, that the production of mitochondria in the queen is quantitatively and qualitatively stimulated and the cytochrome system is sufficiently built up b y the influence of the determining substance contained in royal jelly. Because of the low content of mitochondria in addition to the diminished activity of the respiratory chain, the worker larva showed an oxygen consumption half as large as that of the queen larva.

EINLEITUNG

Soweit bisher bekannt ist, steigt als erste Reaktion auf die im Weiselfutter enthaltene determinierende Substanz 2 die Atmung bei der K6niginnenlarve stark an. Biochim. Biophys. Acta, i62 (I968) 22-31

MITOCHONDRIALE ENZYMAKTIVITATENDER HONIGBIENE

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Schon bei der dreit~gigen Larve ist der Sauerstoffverbrauch doppelt so hoch wie bei der gleichaltrigen Arbeiterinnenlarve ~. Es ist denkbar, dass die Ursache fiir diese drastischen physiologischen Unterschiede in einer veischiedenen Aktivit~it der Mitochondrien beider Kasten begriindet ist. Dabei kann die Menge, abet auch die Qualitiit dieser Zellorganellen verschieden sein. Um zu kliiren, wie weit das Energie liefernde System an der Entstehung der weiblichen Kasten bei der Honigbiene beteiligt sein kann, haben wit Mitochondrien aus K6niginnen und Arbeiterinnen folgender Entwicklungsstadien isoliert: 3- und 5-t~igige Larven, weiss~iugige und schwarz~iugige Puppen, frisch geschliipfte Imagines. Fiir zwei unabh~ingige Untersuchungsreihen wurden knapp IOOO K6niginnen und etwa die doppelte Menge Arbeiterinnen verschiedener Entwicklungsstadien aufgearbeitet.

MATERIALUND METHODIK

Isolierung der Mitochondrien

Die frisch gesammelten Tiere (lO-5O g Frischgewicht) wurden in der zehnfachen Menge eiskalter 0.3 M Saccharosel6sung mit einem Homogenisator nach Potter (Teflonstempel) 3 Min lang homogenisiert. Die erwachsenen Bienen wurden zuerst im eisgekiihlten M6rser fein zerrieben, die erhaltene Suspension durch drei Lagen Mull filtriert und dann wie oben beschrieben homogenisiert. Die weitere Aufarbeitung ist in Schema I dargestellt. Die iibliche Methode der Zentrifugation im SaccharoseDichtegradienten fiihrt, im Gegensatz z.B. zum Rattenleber-Homogenat, nicht zur Trennung von Mitochondrien und Lysosomen. Die nach Zentrifugation des Gesamthomogenats zwischen 120o und 30000 × g erhaltene rohe Mitochondrien-Fraktion wurde deshalb einem flachen Saccharose-Gradienten tiberschichtet, der gleichzeitig einen steilen linearen Polysaccharid-Gradienten enth~ilt (Abb. I). Aus einer Serie verschieden hochmolekularer Verbindungen erhielten wit mit Stractan AF/2* die besten Trennergebnisse. Das Gesamtvolumen betrug 56-58 ml; fiir die Zentrifugation wurde der Ausschwingrotor SW 25/2 mit der pr~iparativen Ultrazentrifuge L 2 (Beckman) verwendet. Dutch Zentrifugation bei 12oo × g werden die Sarkosomen der frisch geschliipften erwachsenen Tiere abgetrennt. Zum Homogenisieren und bei der Zentrifugation bis 30000 X g wurde eine mit IO-a M Trispuffer auf pH 7.2 eingestellte 0.3 M Saccharosel6sung verwendet. Die nach der Gradientenzentrifugation abgetrennte Mitochondrien-Fraktion wurde durch eine 15 Min lange Zentrifugation bei IOOOOO × g gesammelt. E iweiss- und RNA-Gehalt

Nach der Gradientenzentrifugation wurde der Eiweissgehalt jeder Fraktior, nach LowRY et al} bestimmt. RNA wurde zuerst nach Schmidt-ThannhauserSchneider fraktioniert und dann der durch Orcin-Reaktion gebildete Farbstoff kolorimetrisch bei 660 m~ gemessen 5. * Stractan AF/2 ist ein stark verzweigtes Arabinogalaktan aus Lgrchenholz, welches in IO ~/o wiissriger L6sung eine Viskosit~it yon lO-2O cP besitzt. Die Autoren danken der Firma Meyhall, Kreuzlingen, Schweiz, fiir die 13berlassung verschiedener Polysaccharide. Biochim. Biophys. Acta, 162 (1968) 22-31

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M. OSANAI, H. REMBOLD

Enzymaktivie~ten Die Succinatdehydrogenaseaktivit~it (Succinate:(acceptor) oxidoreductase, EC 1.3.99.1) wurde nach SLATER UND BONNER6 bestimmt. Nach der Reaktion wurde die Abnahme der Lichtintensit~it von Kaliumferricyanid je Min bei 420 m/~ gemessen. Homogenat in 0.3 M Saccharoselbsung I 1200 x g , lOMin

I

Niederschlag (in 0.3MSaccharoselbsung suspendiert)

Uberstand

1200 x g, 10Min

I Niederschlag

Uberstand 1 200× g, 10Min

[ Niederschlag

..]

Uberstand

(in 0.3MSaccharoselSsung suspendiert) ] 200 x g, 10 Min

I I Niederschlag

Uberstand 30 000 x g, 10Min

[

Niederschlag

Ube~stand

(in 0.3MSaccharosel~sung suspendiert) 30000 x g, 10 Min I Niederschla~

I

Uberstand

(in 0.3MSaccharoselbsung I suspendiert)

Gradientenzentrifug. (10% Stractan in 1.3 M SaccharoselSsung-

l l.2MSaccharoselSsung) 75 500 x g, 1Std

Schema I. Isolierung von Mitochondrien aus der Honigbiene.

Zur Messung der Aktivit~it von Uricase (Urate:oxygen oxidoreductase, EC 1.7.3.3) und saurer Ribonuclease (Ribonucleate pyrimidine-nucleotido-2'-transferase, EC

2.7.7.16 )

wurde

nach

S C H N E I D E R UND H O G E B O O M 7 b z w .

MCDONALD s u n d

SUMNER 9

gearbeitet. Bei der sauren Ribonuclease wurde die Enzyml6sung mit dem Substrat bei pH 5.0 und 37 ° I Std lang inkubiert. Zur Messung der sauren Phosphataseaktivit~it (Orthophosphoric monoester phosphohydrolase, EC 3.1.3.2) wurde als Substrat pNitrophenylphosphat 1° verwendet, o.I ml Fraktionsl6sung wurden I.O ml 2. IO -~ M Dinatrium-p-NitrophenylphosphatlSsung in 0.05 M Zitratpuffer (pH 5.0) zugesetzt und bei 37 ° 3o Min lang inkubiert. Die Enzymreaktion wurde durch Zusatz yon I ml i o % Trichloressigs~iure beendet und der gebildete Eiweiss-Niederschlag abzentrifugiert. 1.5 ml der tiberstehenden LSsung wurden mit 1.5 ml ges~ittigter Natriumkarbonatlfisung versetzt und die Menge des gespaltenen p-Nitrophenols bei 430 m ~ gemessen. B i o c h i m . B i o p h y s . Acla, I 6 2 (1968) 2 2 - 3 1

HITOCHONDRIALE ENZYMAKTIVIT.&TEN DER HONIGBIENE

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0 2-Verbrauch Fiir diese Messungen wurde die manometrische Methode verwendet. Ein GefAss enth~lt die folgenden L6sungen: im Hauptraum o.I ml 5° mM Natriumsuccinat, 400 mM Natriumpyruvat mit oder ohne 20 mM Natriummalat, 4° mM x-Glycerophosphat oder 40/,M Buttersiure als Substrat, 0.05 ml 20 mM ADP, 0.05 ml 50 mM MgC12, 0.05 ml o.I % Rinderserumalbumin-L6sung, 0.o5 ml 0.2 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7.2), o.I ml 5. i o- 4M Cytochrom c, 0.05 ml o.4M D-Glucose, 0.05 ml dialysiertes Hexokinasepr~parat (2 mg/ml) der Firma Boehringer und Soehne, Mannheim, als Kofaktoren und 0.5 ml Mitochondrien-Suspension; im Einsatz o.2 ml 20 To KOH mit Filterpapier; im Seitenarm o.3 ml Wasser oder andere Kofaktoren wie NAD, Thiaminpyrophosphat, CoA oder Lipons~ure. Als Gasphase wurde Luft verwendet. Die Reaktionsl6sung wurde bei 35 ° mit einer Frequenz yon Iio/Min geschtittelt nnd alle 5 Min abgelesen. Vor der Messung des Sauerstoffverbrauchs wurden die Einflt~sse der Kofaktoren kontrolliert. ADP, MgC12, Rinderserumalbumin, Kaliumphosphat, Cytochrom c und das Glucose-Hexokinase-System aktivieren; wir haben deshalb diese Kofaktoren mit dem Substrat zugesetzt. NAD hemmt alle Oxydationssysteme leicht und wurde daher nicht zugesetzt; es scheint in den isolierten Mitochondrien in geniigender Menge vorhanden zu sein. Bei Verwendung von Pyruvat als Substrat wurde bei Zusatz von Thiaminpyrophosphat, Lipons~ure und CoA kein aktivierender Effekt festgestellt.

Differenzspektren Zur Messung der Differenzspektren wurde in die Vergleichskiavette eine Mitochondrien-Suspension mit einem Proteingehalt von 5 mg/ml als oxydierte Form gegeben, in der Messkt~vette die Suspension mit einer geringen Menge festem Natriumdithionit reduziert. Die Differenzspektlen der Mitochondrien wurden bei IO ° mit dem selbstregistrierenden Spektralphotometer SP 800 (Leitz-Unicam) unter Verwendung eines Skalendehnungs-Zusatzes aufgenommen und mit der Absorption eines Holmiumund Didymium-Filters standardisiert.

ERGEBNISSE

Zur Charakterisierung der Mitochondrien wurde nach der Gradientenzentrifugation in jeder Fraktion der Protein- und RNA-Gehalt, die Aktivit~t der sauren Phosphatase, sauren Ribonuclease, Uricase und Succinatdehydrogenase bestimmt. Die Werte wurden ferner mit denen des t~berstands und der Mikrosomenfraktion verglichen (Abb. I). Die Proteinbestimmung zeigt drei Maxima, wobei die schwere Komponente his Fraktion 3 die beim Homogenisieren nicht voneinander getrennten gemischten Partikel enth~lt, wie ein Vergleich der EnzymaktivitAten und des RNAGehalts zeigt. Der mittlere Proteingipfel deckt sich auch im Maximum mit der Uricaseund Succinatdehydrogenase-Aktivit~t. Bei der Rattenleber wurde nachgewiesen11, dass die Uricase enthaltenden Partikel von den Lysosomen verschieden sind, fiir welche Kathepsin, saure Phosphatase und saute Ribonuclease charakteristische Biochim. Biophys. Aaa, i62 (1968) 22-31

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M. OSANAI, H. REMBOLD

Leitenzyme sind. Im Falle der Honigbiene liisst sich nicht sicher entscheiden, ob Uricase in den Mitochondrien selbst oder in Partikeln enthalten ist, welche sich von den Mitochondrien nicht abtrennen lassen. Der zweite Proteingipfel trennt sich bei den Larven und den weisdiugigen Puppen in eine schwere und eine leichte Fraktion auf. Erst ira spiiten Puppenstadium und bei den frisch geschliiften Imagines erscheint LJberst

Mikr,osq

RNA

10C "8

I

.~_ w

I

5C

I

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~

aJ

Saure P h o s p h a t a s e

I 0.05

o

~

c Saure Ribonuklease "w~ 0 . 5 E

Uricase

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Succinatdehydrogenase

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0

5 10 15 Fruktion Nr.

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I~o.~'=

~o

20

Abb. I. Charakterisierung der gesammelten Fraktionen nach der Dichtegradientenzentrifugation.

nur noch eine Mitochondrienbande. Die dritte Proteinzone deckt sich mit dem Aktivitiitsmaximum der sauren Phosphatase, der sauren Ribonuclease und enthiilt den Anstieg der RNA. Die saure Ribonuclease verl~uft bei den verschiedenen Entwicklungsstadien immer parallel zur sauren Phosphatase und zeigt damit, dass bier die Lysosomen angereichert sind. Das Differenzspektrum zeigt die Anwesenheit einer geringen Menge Mitochondrien. Mit der beschriebenen Methode l~sst sich aus allen Entwicklungsstadien der Honigbiene ein gereinigtes Mitochondrienpr~iparat gewinnen, welches weitgehend frei yon Lysosomen, Mikrosomen und von Sarkosomen ist. Das Verfahren wurde zun~ichst dazu benutzt, bei beiden Kasten die Mitchondrienmenge in verschiedenen Biochim. Biophys. Aaa, i62 (1968) 22-31

MITOCHONDRIALE ENZYMAKTIVlTATENDER HONIGBIENE

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Entwicklungsstadien zu bestimmen (Abb. 2). Die dreitAgige K6niginnenlarve enthAlt bereits fast 6-real mehr Mitochondrien als die gleichaltrige Arbeiterinnenlarve. Wegen des sehr viel grSsseren KSrpergewichts enthAlt die K6nigin kurz vor dem Schliipfen sogar die zehnfache Menge Mitochondrien, die immer noch der doppelten Konzentration pro g KSrpergewicht entspricht.

.

x410 / l e 07 II

10C

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3-t6g.

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L(~rve

weissdug. ScHwoFZ~9 frisch 9eschl. P u p p e Puppe Imago

Abb. 2. Mitochondrienmenge (rag Protein pro g Tiergewicht) und Qo2-Werte (ffl Oa pro Std pro mg Protein) in Abh~ngigkeit yon der Entwicklung der weiblichen Kasten der Honigbiene. - K6niginnen; . . . . , Arbeiterinnen. O, Succinat; O, c¢-Glycerophosphat; O, Butyrat; A ', Pyruvat.

Zur weiteren Charakterisierung der Mitochondrien wurde der SauerstoffVerbrauch nach Zusatz der Substrate Succinat 12, ~-Glycerophosphat 1~, Pyruvat 12 und Butyrat la auf manometrischem Wege bestimmt (Abb. 2). Mit Ausnahme des Pyruvat-Oxydationssystems, dessen AktivitAt in allen Entwicklungsstadien sehr niedrig ist, zeigen die oxydierenden Systeme ein AktivitAtsmaximum in den Mitochondrien der 5-tAgigen Larven. Ihre AktivitAt ist besonders wAhrend der Larvenentwicklung in den K6niginnen wesentlich h6her als in den entsprechenden Entwicklungsstadien der Arbeiterin. Dieser qualitative Unterschied zwischen den Mitochondrien der beiden Kasten wird besonders deutlich in den Differenzspektren der Komponenten ihrer Atmungskette (Abb. 3). Mitochondrien aus frisch geschliipften erwachsenen Tieren zeigen bei beiden Kasten ein komplettes Cytochromsystem. Ein Vergleich besonders des ~-Gebiets zeigt, dass friihere Entwicldungsstadien eine gefingele Menge Cytochrom c enthalten. Dieser Unterschied ist bei den Mitochondrien aus Puppen starker als bei denen aus Larven und ist besonders ausgeprAgt bei den frisch geschlfipften weissAugigen Puppen. Neben diesem fiir beide Kasten zutreffenden Unterschied findet man beim Vergleich der Differenzspektren charakteristische Unterschiede zwischen Biochim. Biophys. Acta, i62 (1968) 22-3I

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M. OSANAI, H. REMBOLD

K6niginnen und Arbeiterinnen besonders im Larvenstadium. Die Arbeiterinnenlarven enthalten weniger Cytochromoxydase (a +as) und auch weniger Cytochrom c. Bei den Mitochondrien aus K6niginnenlarven erkennt man ein deutliches fiir Cytochrom c charakteristisches Maximum bei 550 m/*14, das bei den Arbeiterinnen durch ein Q-Maximum bei 553-554 m~ verdeckt ist. Bei den K6niginnenlarven ist dagegen KSnigin 0.2

Arbeiterin

c, b

u

i

Ii

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II

3-t~Jg. Larve

5-t~g. Larve o. IIi ,i

i i I

weiss~Jug, Puppe

< iii r i¢1 I ,i J

¢1 I

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ii I

schwarz~iug. Puppe

4'," f,,'~ .

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i II

i!

I,f frisch geschl. Imago

]

400

-

450 500 550 Wellenlange (rap)

]

600

650

Abb. 3. D i f f e r e n z s p e k t r e n v o n M i t o c h o n d r i e n a u s v e r s c h i e d e n e n E n t w i c k l u n g s s t a d i e n der weiblichen K a s t e n der Honigbiene.

das Maximum yon Cytochrom c i m ~-Gebiet etwa gleich oder sogar etwas h6her als das Maximum ftir die Cytochrome c 1 und b. Ob letzteres vorhanden ist, verm6gen wir besonders im Larven- und Puppenstadium nicht mit Sicherheit zu sagen. In den erwachsenen Tieren zeigt sich das charakteristische Maximum im y-Gebiet bei 430 m~, bei den Larven und Puppen dagegen bei 424-426 m~. Dieser Weft ist kleiner als der ftir Cytochrom b (430 m~) 14 und nahe von Cytochrom b5 (424 m/z) 15. HEI~OLD UND BOREI1~wiesen Cytochrom b5 durch die bei --196 ° gemessenen Spektren des Puppenhomogenats der Honigbiene nach und noch frtiher entdeckten ESTABROOK UND SACKTOR17 in Musca-Sarkosomen ein dem b5 ~hnliches Cytochrom mit einer Absorptionsbande bei 555 m/~. YAMANAKA,TOKUYAMA UND OKUNUK118 isolierten und reinigten ein Cytochrom b555 aus Musca-Larven und Puppen, dessert UltraviolettWerte be ungef~.hr gleich sind, dessen L6slichkeit aber vom mikrosomalen Cytochrom b5 verschieden ist. Diese Frage wird im Falle der Honigbiene noch weiter untersucht werden mfissen. Die Ergebnisse zeigen, dass das Cytochromsystem nur unter der Wirkung der determinierenden Substanz des Weiselzellenfuttersaftes und damit nut bei der K6niginnenlarve optimal aufgebaut werden kann. Andererseits hat die alimentitre Kastration bei der Arbeitefinnenlarve zur Folge, dass besonders Cytochrom c und seine Oxydase die Aktivit~t der Atmungskette limitieren. Zusalnmen mit einer wesentlich Biochim. Biophys. Acta, I62 (1968) 2 2 - 3 I

MITOCHONDRIALE ENZYMAKTIVIT~.TENDER HONIGBIENE

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geringeren Mitochondrienmenge ffihrt dies dazu, dass der spezifische Sauerstoffverbrauch der Arbeiterinnenlarve nur halb so hoch wie der der K6niginnenlarve ist. DISKUSSION

Die Isolierung und Reinigung von Insektenmitochondrien bereitet vor allem aus zwei Grfinden besondere Schwierigkeiten. Erstens ist es bei solch kleinen Organismen in den meisten F~llen nicht mSglich, isolierte Organe aufzuarbeiten ; man muss als Ausgangsmaterial ein Homogenat der ganzen Tiere verwenden, welches dann Zellorganellen aus verschiedenen Geweben enth~ilt. Zweitens enthalten Insektengewebe, besonders der Fettk6rper yon Larven und Puppen grosse Mengen Glykogen. Diese K6rnchen beeinflussen die Abtrennung der Mitochondrien von anderen Zellpartikeln und lassen durch ihre Trtibung die Mitochondrienzone nach der Dichtegradienten-Zentrifugation nicht so deutlich erkennen, wie es beispielsweise mit Lebermitochondrien aus glykogenarmen Hungerraten m6glich ist. Die oben beschriebene Methode der Fraktionierung im Saccharose-Stractan-Dichtegradienten erlaubt aber trotzdem die Gewinnung verhAltnism~ssig reiner Mitochondrien. Das zeigt sich besonders deutlich im Verlauf der verschiedenen Enzymaktivit~ten und des RNAGehalts fiber das Sedimentationsprofil. Die vergleichende Analyse der Differenzspektren zeigt, dass sich die Mitochondrienpr~parate der beiden weiblichen Bienenkasten vor allem im Larvenstadium stark voneinander unterscheiden. Die Aktivit~it der Atmungskette wird bei den Arbeiterinnen dutch die beiden Komponenten Cytochrom c und Cytochromoxydase limitiert. Dieser starke quantitative Unterschied darf wohl als Hauptursache ftir die grosse Differenz im Sauerstoffverbrauch von K6niginnen und Arbeiterinnen angesehen werden. Dazu kommt die gr6ssere Mitochondrienmenge bei der K6nigin, deren Atmung in allen Entwicklungsstadien 3 wesentlich h6her als die einer gleichaltrigen Arbeitsbiene ist. Man darf wohl als sicher annehmen, class for die Stimulierung des Mitochondrienwachstums und ffir die schon im Larvenstadium erfolgende Komplettierung des Cytochromsystems die im Futtersaft der K6niginnenlarve enthaltene determinierende Substanz z verantwortlich ist. Eine quantitative Aussage fiber die einzelnen Komponenten des Cytochromsystems bleibt einer Analyse bei tiefen Temperaturen vorbehalten. Wir haben aber schon jetzt verschiedene Hinweise darauf, dass die Larven und Puppen der Arbeiterin einen Mangel an Cytochrom c haben (M. OSANAI END H. REMBOLD, uner6ffentlichte Ergebnisse). So ffihrt zum Beispiel ein Zusatz dieses Kofaktors zum Gesamthomogenat aus Larven und Puppen zu einem erh6hten Sauerstoffverbrauch; ein Homogenat frisch geschlfipfter Arbeiterinnen wird nicht stimuliert. Die spezifische Aktivit~tt der Succinatdehydrogenase ist dagegen bei den Larven beider Kasten gleich hoch. Ffir die vollst~tndige Abtrennung der Sarkosomen sprechen die folgenden ('~berlegungen. Ihre Isolierung aus dem fibrill~ren Thoraxmuskel der Dipteren und Hymenopteren ist bei unterschiedlichen Schwerefeldern beschriebenlZ,19, 2°. Da diese Organellen bei der Honigbiene etwa 2-real gr6sser als gew6hnliche Mitochondrien sind 21,e2, beobachtet man bei Zentrifugation des Homogenats frisch geschlfipfter Imagines schon mit 12oo × g ein Sediment, das sich als braune Schicht auf der Kernfraktion absetzt. Bei weiterer Zentrifugation scheidet sich dann kein Niederschlag Biochim. Biophys. Acta, 162 (1968) 22-31

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M. OSANAI, H. REMBOLD

m e h r ab. Diese Befunde sprechen daftir, dass die S a r k o s o m e n der Honigbiene d u r c h zweimalige Z e n t r i f u g a t i o n bei 1200 x g vollst~ndig a b g e t r e n n t werden. Als L e i t e n z y m e der L y s o s o m e n h a b e n wir zun~chst die A k t i v i t ~ t der sauren D e s o x y r i b o n u c l e a s e u n d des K a t h e p s i n s zu b e s t i m m e n versucht. Sie ist a b e r in allen S t a d i e n so gering, dass wir zur C h a r a k t e r i s i e r u n g die saure P h o s p h a t a s e heranziehen nlussten. A u c h deren A k t i v i t ~ t l~sst sich bei V e r w e n d u n g der S u b s t r a t e fl-Glycerop h o s p h a t u n d A M P nicht q u a n t i t a t i v bestimmen. Dagegen ist p - N i t r o p h e n y l p h o s p h a t 1° als h y d r o l y s i e r b a r e s S u b s t r a t g u t geeignet, wenn auch seine R e a k t i o n von der nattirlicher S u b s t r a t e der sauren P h o s p h a t a s e verschieden ist23, 24. Die d r i t t e Proteinzone der G r a d i e n t e n z e n t r i f u g a t i o n h a t im Vergleich zur M i k r o s o m e n f r a k t i o n eine h6here Aktivit~tt der sauren P h o s p h a t a s e . Diese k a n n also nicht yon der m i k r o s o m a l e n Glucose-6-phosphatase 25 heirtihren, welche bei SAugerlebern n e b e n Glucose-6-phosphat auch p - N i t r o p h e n y l p h o s p h a t h y d r o l y s i e r e n k a n n 23. Die A k t i v i t ~ t der d r i t t e n Proteinzone ist auch h6her als die der im Zentrifugationst i b e r s t a n d v o r h a n d e n e n sauren P h o s p h a t a s e (Abb. I). I n den P a r t i k e l n der d r i t t e n P r o t e i n z o n e wird die saure P h o s p h a t a s e durch Alloxan, nicht aber durch TatronsAure g e h e m m t . I m Falle der ~ b e r s t a n d s f r a k t i o n liegen die Verh~ltnisse genau u m g e k e h r t . Neben diesem E r g e b n i s spricht auch der Verlauf der sauren Ribonuclease dafiir, dass es sich bei den im D i c h t e g r a d i e n t e n in der d r i t t e n Proteinzone s e d i m e n t i e r e n d e n Partikeln haupts~chlich um Lysosomen handelt.

DANKSAGUNG

H e r r n Professor A. BUTENANDT sind wir ftir die F 6 r d e r u n g dieser U n t e r s u c h u n g zu D a n k verpflichtet. Der A. v. HUMBOLDT-STIFTUNG d a n k e n wit fiir ein F o r s c h u n g s s t i p e n d i u m an M. OSANAI, der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t ftir Sachbeihilfen im R a h m e n des S c h w e r p u n k t p r o g r a m m s " B i o c h e m i e der Morphogenese". W e r t v o l l e technische Hilfe leistete FrAulein NANCY FITZGERALD. DAS T i e r m a t e r i a l wurde in grosszfigiger Weise yon H e r r n Dr. K. A. FORSTER, Fa. H. Mack Nachf. zur Verfiigung gestellt. LITERATUR I H. REMBOLD,Vorl. Mitt., 21st Intern. Apicult. Congr., University of Maryland, z967; M. OSANAI UND H. REMBOLD,Z. Physiol. Chem., 348 (1967) 124o. 2 H. REMBOLD UND G. I-IANSER,Z. Physiol. Chem., 339 (1964) 251; Qbersicht: I-I. REMBOLD, Vitamins, Hormones, 23 (1965) 3593 R.M. MELAMPYUND ]~. R. WILLIS,Physiol. Zool., 12 (1939) 302. 4 0 . H. LowRY, N. J. ROSEBROUGH,A. L. FARR UND R. J, RANDALL, J. Biol. Chem., 193 (1951) 265 . 5 E. VOLKINUND W. E. COHN, MethodsBiochem. Anal., I (1954) 287, 6 E. C. SLATERUND W. D. BONNER, Biochem. J., 52 (1952) 185. 7 W. C. SCHNEIDERUND G. H. HOGEBOOM,J. Biol. Chem., 195 (1952) 161. 8 M. R. MCDONALD,Methods Enzymol., 2 (1955) 427 . 9 J- ]3. SUMNER,Science, ioo (1944) 413 . IO Y. OHMORI,Enzymologia, 4 (1937) 217. I I P. L. SAWANT, S. SHIBKO, U. S. KUMTA UND A. L. TAPPEL, Biochim. Biophys. Acta, 85 (1964) 82. 12 ]~. R. BALBONI, f . Insect Physiol., I I (1965) 1559. 13 C. BOD~ UND M. KLINGENBERG, Biochem. Z., 341 (1965) 271. 14 B. CHANCE UND G. 1R. WILLIAMS, Advan. Enzymol., 17 (1956) 65.

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MITOCHONDRIALE ENZYMAKTIVIT.~TEN DER HONIGBIENE 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

~I

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