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Essai de mise en évidence d'un rôle régulateur des tRNA dans la synthèse des protéines de l'œuf de poule
BIOCHIM1E, 1974, 56, 537-539.
Essai de mise en dvidence d'un r61e rdgulateur des tRNA dans la synthbse des protdines de l'ceuf de poule. II. Etude de l'affinit6 de la s6ryl-tRNA synth6tase de foie de poule pour diff6rents tRNAser. M. A. LE MEUR, J. P. LE PENNEC, P. GERI,INGER et J. P. EBEL. Institut d'Embryologie , Facultd de M~decine, UniversitJ Louis Pasteur, Rue H u m a n n , 67085 Slrasbourg Cedex - - France. lnstitut de Biologie MolJculaire et celhdairc, Laboratoire de Biochimie. 15, rue Descartes, 67000 Strasbourg - - Frtmce. (10-1£-1973).
Summary. - - The seryl-tRNA synthetases from rooster and from hen liver which is physiologically stimulated by oestrogens, have been compared. These seryl-tRNA synthetases have the same chromatographic and electrophoretie properties. The Km's of both synthetases with all 4 seryl-tRNA isoaecepting species of hen liver are not significatively different. They are in the range of 10-s M. Both synthetases have the same affinity for rat liver and rabbit liver tRNAser isoaceepting species. Likewise a seryl-tRNA synthetase from rat liver recognizes the tRNAser from hen liver with the same affinity. The results suggest that there is low probability for a hormonal regulation at the aminoacyl-tRNA syuthetases level.
La r6action d ' a m i n o a c y l a t i o n repr6sente u n e 6tape i m p o r t a n t e de la synth6se protgique et la t r a d u c t i o n correcte du message g6n6tique d6pend de la r e c o n n a i s s a n c e des tRNA p a r les aminoacyl-tRNA synth6tases c o r r e s p o n d a n t e s . Des travaux ant6rieurs [1-3] ont montr6 l'existenee de diff6rences dans la r6partition des tRNA isoaccepteurs de la s6rine entre les foies de poule en ponte et de poule i m m a t u r e , diff6rences que l'on peut mettre en r a p p o r t avec la synthbse de prot6ines du j a u n e d'~euf p a r t i c u l i 6 r e m e n t riches en s6rine (phosvitine, vitellines). L'hypoth6se a 6t6 formul6e qu'il p o u r r a i t 6galement exister u n e r6gulation, 6ventuellement sous contr61e h o r m o n a l , de la synth6se prot6ique p a r l ' i n t e r m 6 d i a i r e des aminoacyl-tRNA synth6tases. La pr6sence en plus ou m o i n s grande quantit6 des tRNA isoaccepteurs d ' u n a m i n o a c i d e donn6, associ6e /t des diff6rences au niveau de l'affinit6 de l ' a m i n o a c y l - t R ~ A synth6tase p o u r ces tRNA, p o u r r a i t repr6senter u n m o y e n de contr61e de la synth6se prot6ique. Dans le but d'essayer de v6rifier la seconde hypothbse, nous avons compar6 les affinit6s des s6ryl-tRNA synth6tases de foie de poule en ponte, physiologiq u e m e n t stimul6e p a r les cestrog6nes, et de coq, pris comme a n i m a l t6moin, p o u r ]es diff6rents tRNA isoaccepteurs de la s6rine.
MATERHSL. La L-[14C] sdrine (50 mCi/mM) et la DL-[3HI s6rine (48 Ci/mM) p r o v e n a i e n t du CEA, Saclay (France). Le DEAE Sephadex A50 a 6t6 f o u r n i p a r P h a r m a c i a (Subde). METHOI)ES. Nous avons utilis6 des poules et des coqs de race Leghorn, aliment~s n o r m a l e m e n t j u s q u ' a u m o m e n t des exp6riences. a) Purification de la s~ryl-tRNA synthdtase. Nous avons utilis6 des enzymes de foie de poule en ponte et de coq, purifi6s selon la m6thode d6crite p a r I.e Meur et coll. [4]. La s6ryl-tRNA synth6tase a 6t6 pr6parge ~ p a r t i r de s u r n a g e a n t 135.000 × g p a r p r 6 e i p i t a t i o n au sulfate d ' a m m o n i u m (45-60 p. cent) suivie de c h r o m a t o g r a p h i e s successives sur colonnes de Sephadex G25, DEAE cellulose, Phosphocellulose et Hydroxyapatite. L'enzyme a 6t~ purifi6e e n v i r o n 1100 fois et poss6dait une activitg sp~cifique de 160 u n i t 6 s / m g (une unit6 d ' e n z y m e catalyse la fixation d ' u n e nmole d ' a m i n o a c i d e par minute). Les enzymes ont 6t6 conserv6es /l - - 2 0 ° dans le t a m p o n : phosphate
538
M. A. L e M e u r , J. P. L e P e n n e c , P. Gerlinger et J. P. EbeI.
de K 0,02 M p H 7,5 ; d i t h i o t h r e i t o l 0,0005 M ; E D T A 0,000,1 M ; g l y e 6 r o l 50 p. cent. La c o n c e n t r a t i o n en p r o t 6 i n e s a dr6 e s t i m 6 e p a r u n d o s a g e s e l o n L o w r y et coll. [5] apr~s d i a l y s e de la solut i o n d ' e n z y m e c o n t r e le m 6 m e t a m p o n d d p o u r v u de d i t h i o t h r 6 i t o l et de g l y c d r o l qui f a u s s e n t le dosage colorimdtrique.
8 000 unitds de DO h 260 n m de t R N A total c o n t e n a n t 9,6 p. c e n t de t R N A "e~ s u r u n e c o l o n n e de D,EAE S e p h a d e x s e l o n N i s h i m u r a et coll. [9]. l , ' a c tivit6 a c c e p t r i c e de la s d r i n e se r 6 p a r t i t en 4 p i e s (fig. 1). Les f r a c t i o n s c o r r e s p o n d a n t h c h a c u n des
b) Preparation des tRNA. Les t R N A de foie de p o u l e et de c o q ont 6t6 pr6p a r d s s e l o n la t e c h n i q u e d d c r i t e d a n s l ' a r t i c l e prdc d d e n t [6!. Les IRNA i s o a c c e p t e u r s de la s 6 r i n e de foie de rat et de f o i e de l a p i n ont dr6 g r a c i e u s e m e n t f o u r n i s p a r le P r o f e s s e u r M. S t a e h e l i n (CibaGeigy, BMe) et p a r le D o c t e u r G. P e t r i s s a n t (CNRZ, J o u y en Josas). Les t R N A i s o a c c e p t e u r s de f o i e de rat c o r r e s p o n d a i e n t aux f r a c t i o n s I, I I a et III d 6 c r i t e s p a r Muller et coll. [7] et c o n t e n a i e n t resp e c t i v e m e n t 1127, 2,09 et 976 p i c o m o l e s de t R ' N A ~ p a r u n i t 6 de densit6 o p t i q u e h 2,60 nm. Les f r a c t i o n s de t R N A i s o a c c e p t e u r s de la s 6 r i n e de f o i e de l a p i n 2, 3 et 4 c o n t e n a i e n t r e s p e c t i v e m e n t 194, 2~6 et 1220 p i c o m o l e s de tRNAser p a r u n i t 6 de d e n sitd o p t i q u e h 260 n m [10]. c) Mesures cindtiques. Le m i l i e u r 6 a c t i o n n e l (30,0 ~l) s e r v a n t h l ' a m i n o a c y l a t i o n du tR,NA c o n t e n a i t : A T P 1 mM ; MgC12 15 m M ; GSH 2 mM ; Tris-HE1 p H 8,2 50 m M ; s d r u m a l b u m i n e b o v i n e 30 ug ; DI-[3H] s d r i n e 50 ~ C i / m l , dilu6e a v e c de la L-[I°~C] s 6 r i n e de m a n i b r e h o b t e n i r u n e c o n c e n t r a t i o n de L - s d r i n e de 5 p m o l e s / m l . Les c o n c e n t r a t i o n s en tRNAse~ et en s y n t h d t a s e s p u r i f i 6 e s v a r i a i e n t r e s p e c t i v e m e n t de 0,3 h 3 :t~g/ml et de 0,0,6 h 0,1 ~ g / m l . Les e n z y m e s o n t dt6 diludes a v e c le t a m p o n s e r v a n t h l e u r c o n s e r v a t i o n , m a t s c o n t e n a n t 1 m g / m l de s d r u m album i n e b o v i n e . Apr~s i n c u b a t i o n h 37 °, des a l i q u o t s de 50 .!xl o n t dt6 d~pos6s s u r u n e r o n d e l l e de p a p i e r W h a t m a n 3 MM et traitds s e l o n Mans et N o v e l l i [8]. N o u s a v o n s m e s u r d la f o r m a t i o n de l ' a m i n o a c y l - t R N A r a d i o a c t i f en f o n c t i o n du t e m p s p o u r 8 c o n c e n t r a t i o n s d i f f d r e n t e s de tRNA. Les p r d l ~ v e m e n t s o n t 6t6 effectuds toutes les 30 s e c o n d e s p e n d a n t 2 m i n u t e s 30, d a n s u n e z o n e de v i t e s s e i n i t i m e c o r r e s p o n d a n t h m o i n s de 20 p. c e n t de la r d a c t i o n c o m p l O e . La c o n s t a n t e de M i c h a e l i s de l ' e n z y m e (Km) et la v i t e s s e m a x i m a l e de la r d a c t i o n (Vm) ont dt6 d d t e r m i n 6 e s s e l o n la m d t h o d e de L i n e w e a v e r et Burk. RESULTATS. 1 °) Purification partielle des tRNAscr isoaccepteurs de [oie de poule. Le f r a c t i o n n e m e n t p a r t i e l des tRNAser i s o a c c e p t e u r s a dt6 rdalis6 p a r c h r o m a t o g r a p h i c de
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 4.
20[ 10 / E e
10.
g[ u
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,,,,
160
.
200 fraction
240 .
n°
FIG. 1. - - Fractionnement des tRNA de foie de poule par chromatographic sur colonne de DEAE Sephadex A50 (1,75 × 120 cm). La colonne est dquilibrde avec le tampon Tris-HC1 0,02 M pH 7,5 h 20 ° ; MgCI~ 0,008 M ; NaC1 0,375 M ; le tRNA (8000 DO h 260 nm) est dilud par addition de 5 volumes de ce tampon et ddpos6 sur la eolonne. L'dlution est effectude par un gradient lindaire en NaC1 (0,375 h 0,525 M) et en MgCl~ (0,008 M h 0,016 M) d'un volume total de 1,6 1. La vitesse d'dlution est de 22 m l / h et les fractions sont de 5 ml. L'activitd acceptrice de la s~rine est mesurde par addition de 5 ,td de chaque fraction h 100 td de milieu d'incubation d6crit dans mdthodes, contenant 0,1 ttCi de L-[14C] sdrine et un execs d'enzyme. Les zones grisdes correspondent aux 4 fractions de tRNAser utilisdes pour la suite de ce travail. TABLEAU I.
Purification partielle des tRNA isoaccepteurs de la s~rine.
Unitds de
Fractions
I 1t III
i ]t I
703 260 218
IV
]
44
DO
pm01es de sdrine fix6es par unit6 de DO
Pourcentage
256 300 374 322
17 20 25 21
de t R N A "
Les rdsultats sont obtenus en mesurant le taux d'aminoacylation au plateau des fractions de tRNA obtenues apr&s chromatographic sur DEAE cellulose (fig. 1). Le tRNA est incubd dans un milieu identique h celui ddcrit dans mdthodes, contenant 0,1 ttCi de L-[14C] s~rine et un exc~s de sdryl-tRNA synthdtase. Une unitd de DO h 260 nm contient 1480 pmoles de tRNA. p i e s o n t dt6 r a s s e m b l d e s et le t R N A p r d e i p i t 6 h l ' d t h a n o l . Le degrd de p u r i f i c a t i o n el le r e n d e m e n t de la c o l o n n e s o n t r a p p o r t 6 s d a n s le t a b l e a u I. Nous a v o n s a i n s i o b t e n u des p r d p a r a t i o n s de t R N A c o n t e n a n t en m o y e n n e 20 p. c e n t de t R N A ~er.
P a r a m ~ l r e s c i n d t i q u e s de la s d r y l - t R N A - s y n t h ~ t a s e . 2 °) Etude comparative des sdryl-tRNA syntherases de [oie de poule et de coq. La s 6 r y l - t R N A s y n t h 6 t a s e de foie de e o q p r 6 p a r 6 e d a n s les m 6 m e s c o n d i t i o n s q u e celles de f o i e de p o u l e [4] p o s s b d e e x a e t e m e n t les m 6 m e s c o m p o r t e m e n t s e h r o m a t o g r a p h i q u e s et 61ectrophor6tiques. Le r e n d e m e n t des p u r i f i c a t i o n s est a p p r o x i -
"c
i
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a v o n s 6tabli ( t a b l e a u II) les c o n s t a n t e s de M i c h a e lis et les v i t e s s e s m a x i m a l e s d ' a m i n o a c y l a t i o n des t R N A Ser purifi6s p o u r les s 6 r y l - t R N A s y n t h 6 t a s e s de foie de p o u l e en p o n t e et de coq. Les K m v a r i e n t e n t r e 3,1 et 7,7 × 10 -8 M, ce qui r e p r 6 s e n t e u n e f o r t e affinit6 de l ' e n z y m e p o u r son substrat. Les V m a x c o n s e r v e n t le m 6 m e o r d r e de g r a n d e u r q u e l q u e soit l ' i s o a c c e p t e u r c o n s i d 6 r 6 . Les c h i f f r e s r e p r 6 s e n t 6 s d a n s le t a b l e a u II c o r r e s p o n d e n t aux m o y e n n e s de 6 h 8 d 6 t e r m i n a t i o n s effectu6es d a n s des c o n d i t i o n s e o m p a r a b l e s a v e c p l u s i e u r s p r 6 p a r a t i o n s d i f f d r e n t e s de t R N A ~ et d ' e n z y m e s ; les faibles v a r i a t i o n s o b s e r v 6 e s ne s o n t p a s s i g n i f i c a tives. DISCUSSION ET CONCLUSION.
-3
-4
-2
1
-I
2
3
4
5 i~xlO 7
Fro. 2. - - Reprdsentation selon Lin~weaver et Burk de la cindtique d'aminoacylation par la s~rine d'un tRNA total de [oie de poule ou de coq, en prdsence des synthdtases homologues purifides. Les pr6parations de tRNA utilis6es contiennent respeetivement 143 et 148 pieomoles de tRNAser par unit6 de DO h 260 rrm. Le milieu r6aetionnel est d6erit dans m~thodes. Les valeurs des Km sont respeetivement de 5,2 et 2,6 × 10-8 M ; les valeurs des Vmax sont respeetivement de 540 et de 263 n m o l e s / m g / m i n .
m a t i v e m e n t le m 6 m e . D ' a u t r e p a r t , les c o n s t a n t e s c i n 6 t i q u e s s o n t trbs v o i s i n e s , le K m et V m a x a y a n t des v a l e u r s m o y e n n e s r e s p e c t i v e s de 4 × 10-s M et 400 n m o l e s / m g d ' e n z y m e / m i n . (fig. 2). C e p e n d a n t , il est p o s s i b l e q u e les s y n t h 6 t a s e s a i e n t des affinit6s d i f f 6 r e n t e s p o u r les q u a t r e t R N A i s o a c c e p t e u r s de la s6rine, sans que les K m 6tablis a v e c le t R N A total n ' e n s o i e n t affect6s. Afin de c o n f i r m e r ou d ' i n f i r m e r cette h y p o t h 6 s e , n o u s TABLEAU II. D~termination des K m et Vm des s~ryl-tRNA synthdtases de [oie de poule et de coq pour les tRNA isoaccepteurs de la s~rine.
D a n s ce t r a v a i l , n o u s a v o n s v o u l u v 6 r i f i e r s'il e x i s t a i t e n t r e la p o u l e en p o n t e et le coq, o u t r e des d i f f 6 r e n c e s d a n s les p r o p o r t i o n s r e l a t i v e s des t R N A i s o a c c e p t e u r s de la s6rine, 6 g a l e m e n t des v a r i a t i o n s au n i v e a u de la s 6 r y l - t R N A s y n t h 6 t a s e p o u v a n t O r e m i s e s en r e l a t i o n a v e c la s y n t h ~ s e sous la d 6 p e n d a n c e des ~estrogbnes, de p r o t 6 i n e s r i c h e s en s6rine. N o u s a v o n s purifi6 les s 6 r y l - t R N A s y n t h 6 t a s e s de f o i e de p o u l e et de coq. L a c o m p a r a i s o n de ces deux synth6tases a montr6 d'une part qu'elles posTABLEAU I l l . Ddtermination des K m el des Vm de la sdryl-tRNA synth~tase de [oie de poule pour les tRNA isoaccepteurs de 1o sdrine de [oie de rat et de [oie de lapin. tRNA de foie de lapin
tRNA de role de rat tRNA~.~ I
2 3 4
6 . ~ X lO-SI* 272 i 2,3 X 10 -at 145 X 10 -sl 280
d
lla Ill
Km
Vm
x lO -s X 10-sj 232
X 10-sl 290
Les Km sont exprimds en solution en mo]aritds et les Vm eu nmoles d'aminoacide fixdes par mg d'enzyme et par minute.
SRS tRNAs,r
Poule Km
I
6 ~< 10 -8
II Ill IV
4 X 10 "s 4,7 x 10 -s 4 x 10 -s
Coq
Vm i __i
Km
i Vm I
739 13,1 X lO-ai 597 I 6 X l O -sl 497 4,3 X 10-s 517 7,7 X 10 -s
522 638 619 480
Les Km sont exprimds en molaritd, la Vm en nmoles d'aminoacide fix6es par mg d'enzyme et par minute.
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 4.
s b d e n t les m 6 m e s p r o p r i 6 t 6 s c h r o m a t o g r a p h i q u e s et 6 1 e c t r o p h o r 6 t i q u e s , d ' a u t r e p a r t que l e u r s p r o pri6t6s c i n 6 t i q u e s s o n t p r a t i q u e m e n t i d e n t i q u e s . E n effet, l e u r s affinit6s p o u r d i f f 6 r e n t s t R N A isoa e e e p t e u r s de la s 6 r i n e de f o i e de p o u l e s o n t tr6s v o i s i n e s . De plus, n o u s a v o n s m o n t r 6 q u ' i l en 6tait de m 6 m e p o u r les t R N A i s o a c c e p t e u r s de la s 6 r i n e de m a m m i f ~ r e s : p i c s I, I I a et III de t R N A set de foie de rat et les p i c s 2, 3 et 4 de t R N A set de f o i e de l a p i n (tableau III). De m 6 m e il a dt6 m o n t r 6
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M. A. L e M e u r , . I . P . L e P e n n e c , P. Gerlinger el J. P. Ebel.
duns n o t r e l a b o r a t o i r e [I01 q u ' u n e s 6 r y l - t R N A s y n t h d t a s e de foie de rat, p r d p a r 6 e p a r c h r o m a t o g r a p h i c d'affinitd a v e c du t R N A set 4 de foie de l a p i n , p r d s e n t e la m S m e affinitd p o u r les t R N A i s o a c c e p t e u r s de la s d r i n e de f o i e de l a p i n et de foie de poule. I1 a p p a r a i t , duns les r d a c t i o n s d ' a m i n o a c y l a t i o n h 6 t d r o l o g u e s dtudides duns ce t r a v a i l , q u ' a u c u n des p a r a m O r e s c i n d t i q u e s n ' e s t modifid. Ce r d s u l t a t s ' o p p o s e h d ' a u t r e s o b s e r v a t i o n s du l a b o r a t o i r e [1.3] q u i o n t m o n t r d , d a n s des rdaetions d'aminoacylation hdtdrologues diffdrentes, q u e non s e u l e m e n t l'affinitd de la s y n t h 6 t a s e p o u r le tRNA, m a t s e n c o r e la v i t e s s e m a x i m a l e de la r d a c t i o n p o u v a i e n t 6tre f o r t e m e n t d i m i n u d e s p a r r a p p o r t h la r d a c t i o n h o m o l o g u e . I1 faut t o n t e f o i s r e m a r q u e r q u e duns ces d e r n i ~ r e s e x p d r i e n c e s , il s ' a g i s s a i t de systbrnes h d t d r o l o g u e s i m p l i q u a n t des r 6 a c t i o n s e n t r e t R N A d ' e u c a r y o t e s ( l e v u r e ) et a n d n o a c y l - t R N A s y n t h d t a s e s de p r o c a r y o t e s (E. Colt) ou v i c e versa, a]ors q u e duns ce t r a v a i l il s ' a g i t de r d a c t i o n s h 6 t d r o l o g u e s e n t r e e u c a r y o t e s . P a r r o t les t R N A set i s o a c c e p t e u r s d o n t n o u s a v o n s disposd p o u r cette dtude, les tRNA .~¢r I e t I I I de_role de rat p o s s b d e n t des s t r u c t u r e s p r i m a i r e s tr~s d i f f d r e n t e s [11]. Le fair que les s d r y l - t R N A s y n t h d t a s e s catal y s e n t u n e r d a c t i o n d ' a m i n o a c y l a t i o n spdcifique, ayant pour tousles t R N A i s o a c c e p t e u r s de la s d r i n e des c o n s t a n t e s c i n 6 t i q u e s p r a t i q u e m e n t i d e n t i q u e s , i m p l i q u e l ' e x i s t e n c e d ' a n a l o g i e s de c o n f i g u r a t i o n t e r t i a i r e h la fois e n t r e les d i f f d r e n t s t R N A i s o a c c e p t e u r s de la s d r i n e et d ' u n e esp~ce a n i m a l e h r a u t r e . Ces rdsultats, en a c c o r d a v e c c e u x de Myers et coll. [12] t e n d e n t h m o n t r e r q u ' i l e x i s t e u n e a n a l o g i e duns la c o n f i g u r a t i o n de ces m o l 6 c u l e s . S'il e x i s t e une r d g u l a t i o n de la s y n t h b s e p r o t d i q u e h ce n i v e a u , elle s e r a i t p l u t S t f o n c t i o n de la q u a n t i t d des tR,NA p r d s e n t s q u e des p a r a m b t r e s c i n d t i q u e s de la r d a c t i o n d ' a m i n o a c y l a t i o n . On c o m p r e n d c e p e n d a n t e n c o r e real c o m m e n t s ' o p b r e n t les c h a n g e m e n t s a d a p t i f s des t a u x r e l a tifs des d i f f d r e n t s t R N A i s o a c c e p t e u r s l o r s de la s y n t h b s e , sous d d p e n d a n c e h o r m o n a l e , de p r o tdines spdcifiques. De m 6 m e , le r61e e x a c t de l ' e x i s t e n c e d ' u n g r a n d n o m b r e de t R N A i s o a c c e p t e u r s reste encore obscur.
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 4.
Remerciements. Nous remercions vivement le Professeur M. Staehelin et le Docteur G. Pdtrissant qui ont bien voulu mettre aimablement h notre disposition des tRNAser purifids. Ce travail a dtd rdalisd grace h 1'aide du Centre National de la Recherche Scientifique (laboratoire assoeid n ° 119); de la D~16gation Gdndrale h la Recherche Scientifique et Technique ; du Commissariat h l'Energie Atomique et de la Fondation pour la Recherche Mddicale Frangaise. R~su~i~. Nous avons voulu vdrifier si les sdryl-tRNA synth6tases pr6pardes h partir de roles d'animaux physiologiquement stimulds par les cestrog6nes (ponte) et des animaux non stimulds prdsentent des diffdrences. Les sdryl-tRNA synthdtases purifides h partir de foie de poule en ponte et de coq ont les m~mes propridtds chromatographiques et dlectrophordtiques. Le Km de ces synthdtases pour les 4 sdryl-tRNA isoaccepteurs de foie de poule ne sont pus significativement diffdrents, il est de l'ordre de 10-8 M. Ces synthdtases reeonnaissent avec la m6me affinitd les tRNAser isoaceepteurs de foie de rat et de foie de lapin. De mdme, la sdryltRNA synthdtase de foie de rat reeonnait, avec les m~mes constantes cindtiques, les tRNAser de foie de ponle. I1 est peu probable qu'une rdgulation hormonale s'erxerce au niveau des aminoacyl-tRNA synthdtases. BIBLIOGRAPHIE. 1. Beck, G., Hentzen, D. & Ebel, J. P. (1970) Biochim. Biophys. Acta, 213, 68-76. 2. M~ienpiia, P. H. & Bernfield, M. R. (1969) Biochem., 8, 4926-4934. 3. M~ier~piia, P. H. (1972) Biochem. Biophys. Res. Commun., 47, 917-974. 4. Le Meur, M. A., Gerlinger, P., Clavert, J. & Ebel, J. P. (1972) Biochimie, 54, 1391-1397. 5. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. Randall, R. J. (1951) J. Biol. Chem., 193, 265-268. 6. Illinger, D., Le Meur, M. A., Gerlinger, P. & Ebel, J. P. (1974) Biochimie, 57, 7. Muller, P., Wehrli, W. & Staehelin, M. (1971) Biochim., 10, 1885-1890. 8. Marts, R. J. ,~ Novelli, G. D. (1961) Arch. Biochem. Biophys., 94, 48-53. 9. Nishimura, S., Harada, F., Narushima, U. & Seno, T. (1967) Biochim. Biophys. Acla, 142, 133-148. 10. Befort, J. J., Befort, N., Petrissant, G., Remy, P. & Ebel, J. P. Soumis h FEBS letters. 11. Rogg, H., Muller, P. & Staehelin, M. (1973) Experienlia, 29, 757. 12. Myers, G., Blank, H. U. & $611, D. (1971) J. Biol. Chem., 246, 4955-4964. 13. Ebel, J. P., Giegd, R., Bonnet, J., Kern, D., Befort, N., Bollack, C., Fasiolo, F., Gangloff, J. & Dirheimer, G. (1973) Biochimie, 55, 547-557.
Essai de mise en dvidence d'un r61e rdgulateur des tRNA dans la synthbse des protdines de l'ceuf de poule. II. Etude de l'affinit6 de la s6ryl-tRNA synth6tase de foie de poule pour diff6rents tRNAser. M. A. LE MEUR, J. P. LE PENNEC, P. GERI,INGER et J. P. EBEL. Institut d'Embryologie , Facultd de M~decine, UniversitJ Louis Pasteur, Rue H u m a n n , 67085 Slrasbourg Cedex - - France. lnstitut de Biologie MolJculaire et celhdairc, Laboratoire de Biochimie. 15, rue Descartes, 67000 Strasbourg - - Frtmce. (10-1£-1973).
Summary. - - The seryl-tRNA synthetases from rooster and from hen liver which is physiologically stimulated by oestrogens, have been compared. These seryl-tRNA synthetases have the same chromatographic and electrophoretie properties. The Km's of both synthetases with all 4 seryl-tRNA isoaecepting species of hen liver are not significatively different. They are in the range of 10-s M. Both synthetases have the same affinity for rat liver and rabbit liver tRNAser isoaceepting species. Likewise a seryl-tRNA synthetase from rat liver recognizes the tRNAser from hen liver with the same affinity. The results suggest that there is low probability for a hormonal regulation at the aminoacyl-tRNA syuthetases level.
La r6action d ' a m i n o a c y l a t i o n repr6sente u n e 6tape i m p o r t a n t e de la synth6se protgique et la t r a d u c t i o n correcte du message g6n6tique d6pend de la r e c o n n a i s s a n c e des tRNA p a r les aminoacyl-tRNA synth6tases c o r r e s p o n d a n t e s . Des travaux ant6rieurs [1-3] ont montr6 l'existenee de diff6rences dans la r6partition des tRNA isoaccepteurs de la s6rine entre les foies de poule en ponte et de poule i m m a t u r e , diff6rences que l'on peut mettre en r a p p o r t avec la synthbse de prot6ines du j a u n e d'~euf p a r t i c u l i 6 r e m e n t riches en s6rine (phosvitine, vitellines). L'hypoth6se a 6t6 formul6e qu'il p o u r r a i t 6galement exister u n e r6gulation, 6ventuellement sous contr61e h o r m o n a l , de la synth6se prot6ique p a r l ' i n t e r m 6 d i a i r e des aminoacyl-tRNA synth6tases. La pr6sence en plus ou m o i n s grande quantit6 des tRNA isoaccepteurs d ' u n a m i n o a c i d e donn6, associ6e /t des diff6rences au niveau de l'affinit6 de l ' a m i n o a c y l - t R ~ A synth6tase p o u r ces tRNA, p o u r r a i t repr6senter u n m o y e n de contr61e de la synth6se prot6ique. Dans le but d'essayer de v6rifier la seconde hypothbse, nous avons compar6 les affinit6s des s6ryl-tRNA synth6tases de foie de poule en ponte, physiologiq u e m e n t stimul6e p a r les cestrog6nes, et de coq, pris comme a n i m a l t6moin, p o u r ]es diff6rents tRNA isoaccepteurs de la s6rine.
MATERHSL. La L-[14C] sdrine (50 mCi/mM) et la DL-[3HI s6rine (48 Ci/mM) p r o v e n a i e n t du CEA, Saclay (France). Le DEAE Sephadex A50 a 6t6 f o u r n i p a r P h a r m a c i a (Subde). METHOI)ES. Nous avons utilis6 des poules et des coqs de race Leghorn, aliment~s n o r m a l e m e n t j u s q u ' a u m o m e n t des exp6riences. a) Purification de la s~ryl-tRNA synthdtase. Nous avons utilis6 des enzymes de foie de poule en ponte et de coq, purifi6s selon la m6thode d6crite p a r I.e Meur et coll. [4]. La s6ryl-tRNA synth6tase a 6t6 pr6parge ~ p a r t i r de s u r n a g e a n t 135.000 × g p a r p r 6 e i p i t a t i o n au sulfate d ' a m m o n i u m (45-60 p. cent) suivie de c h r o m a t o g r a p h i e s successives sur colonnes de Sephadex G25, DEAE cellulose, Phosphocellulose et Hydroxyapatite. L'enzyme a 6t~ purifi6e e n v i r o n 1100 fois et poss6dait une activitg sp~cifique de 160 u n i t 6 s / m g (une unit6 d ' e n z y m e catalyse la fixation d ' u n e nmole d ' a m i n o a c i d e par minute). Les enzymes ont 6t6 conserv6es /l - - 2 0 ° dans le t a m p o n : phosphate
538
M. A. L e M e u r , J. P. L e P e n n e c , P. Gerlinger et J. P. EbeI.
de K 0,02 M p H 7,5 ; d i t h i o t h r e i t o l 0,0005 M ; E D T A 0,000,1 M ; g l y e 6 r o l 50 p. cent. La c o n c e n t r a t i o n en p r o t 6 i n e s a dr6 e s t i m 6 e p a r u n d o s a g e s e l o n L o w r y et coll. [5] apr~s d i a l y s e de la solut i o n d ' e n z y m e c o n t r e le m 6 m e t a m p o n d d p o u r v u de d i t h i o t h r 6 i t o l et de g l y c d r o l qui f a u s s e n t le dosage colorimdtrique.
8 000 unitds de DO h 260 n m de t R N A total c o n t e n a n t 9,6 p. c e n t de t R N A "e~ s u r u n e c o l o n n e de D,EAE S e p h a d e x s e l o n N i s h i m u r a et coll. [9]. l , ' a c tivit6 a c c e p t r i c e de la s d r i n e se r 6 p a r t i t en 4 p i e s (fig. 1). Les f r a c t i o n s c o r r e s p o n d a n t h c h a c u n des
b) Preparation des tRNA. Les t R N A de foie de p o u l e et de c o q ont 6t6 pr6p a r d s s e l o n la t e c h n i q u e d d c r i t e d a n s l ' a r t i c l e prdc d d e n t [6!. Les IRNA i s o a c c e p t e u r s de la s 6 r i n e de foie de rat et de f o i e de l a p i n ont dr6 g r a c i e u s e m e n t f o u r n i s p a r le P r o f e s s e u r M. S t a e h e l i n (CibaGeigy, BMe) et p a r le D o c t e u r G. P e t r i s s a n t (CNRZ, J o u y en Josas). Les t R N A i s o a c c e p t e u r s de f o i e de rat c o r r e s p o n d a i e n t aux f r a c t i o n s I, I I a et III d 6 c r i t e s p a r Muller et coll. [7] et c o n t e n a i e n t resp e c t i v e m e n t 1127, 2,09 et 976 p i c o m o l e s de t R ' N A ~ p a r u n i t 6 de densit6 o p t i q u e h 2,60 nm. Les f r a c t i o n s de t R N A i s o a c c e p t e u r s de la s 6 r i n e de f o i e de l a p i n 2, 3 et 4 c o n t e n a i e n t r e s p e c t i v e m e n t 194, 2~6 et 1220 p i c o m o l e s de tRNAser p a r u n i t 6 de d e n sitd o p t i q u e h 260 n m [10]. c) Mesures cindtiques. Le m i l i e u r 6 a c t i o n n e l (30,0 ~l) s e r v a n t h l ' a m i n o a c y l a t i o n du tR,NA c o n t e n a i t : A T P 1 mM ; MgC12 15 m M ; GSH 2 mM ; Tris-HE1 p H 8,2 50 m M ; s d r u m a l b u m i n e b o v i n e 30 ug ; DI-[3H] s d r i n e 50 ~ C i / m l , dilu6e a v e c de la L-[I°~C] s 6 r i n e de m a n i b r e h o b t e n i r u n e c o n c e n t r a t i o n de L - s d r i n e de 5 p m o l e s / m l . Les c o n c e n t r a t i o n s en tRNAse~ et en s y n t h d t a s e s p u r i f i 6 e s v a r i a i e n t r e s p e c t i v e m e n t de 0,3 h 3 :t~g/ml et de 0,0,6 h 0,1 ~ g / m l . Les e n z y m e s o n t dt6 diludes a v e c le t a m p o n s e r v a n t h l e u r c o n s e r v a t i o n , m a t s c o n t e n a n t 1 m g / m l de s d r u m album i n e b o v i n e . Apr~s i n c u b a t i o n h 37 °, des a l i q u o t s de 50 .!xl o n t dt6 d~pos6s s u r u n e r o n d e l l e de p a p i e r W h a t m a n 3 MM et traitds s e l o n Mans et N o v e l l i [8]. N o u s a v o n s m e s u r d la f o r m a t i o n de l ' a m i n o a c y l - t R N A r a d i o a c t i f en f o n c t i o n du t e m p s p o u r 8 c o n c e n t r a t i o n s d i f f d r e n t e s de tRNA. Les p r d l ~ v e m e n t s o n t 6t6 effectuds toutes les 30 s e c o n d e s p e n d a n t 2 m i n u t e s 30, d a n s u n e z o n e de v i t e s s e i n i t i m e c o r r e s p o n d a n t h m o i n s de 20 p. c e n t de la r d a c t i o n c o m p l O e . La c o n s t a n t e de M i c h a e l i s de l ' e n z y m e (Km) et la v i t e s s e m a x i m a l e de la r d a c t i o n (Vm) ont dt6 d d t e r m i n 6 e s s e l o n la m d t h o d e de L i n e w e a v e r et Burk. RESULTATS. 1 °) Purification partielle des tRNAscr isoaccepteurs de [oie de poule. Le f r a c t i o n n e m e n t p a r t i e l des tRNAser i s o a c c e p t e u r s a dt6 rdalis6 p a r c h r o m a t o g r a p h i c de
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 4.
20[ 10 / E e
10.
g[ u
•
,,,,
160
.
200 fraction
240 .
n°
FIG. 1. - - Fractionnement des tRNA de foie de poule par chromatographic sur colonne de DEAE Sephadex A50 (1,75 × 120 cm). La colonne est dquilibrde avec le tampon Tris-HC1 0,02 M pH 7,5 h 20 ° ; MgCI~ 0,008 M ; NaC1 0,375 M ; le tRNA (8000 DO h 260 nm) est dilud par addition de 5 volumes de ce tampon et ddpos6 sur la eolonne. L'dlution est effectude par un gradient lindaire en NaC1 (0,375 h 0,525 M) et en MgCl~ (0,008 M h 0,016 M) d'un volume total de 1,6 1. La vitesse d'dlution est de 22 m l / h et les fractions sont de 5 ml. L'activitd acceptrice de la s~rine est mesurde par addition de 5 ,td de chaque fraction h 100 td de milieu d'incubation d6crit dans mdthodes, contenant 0,1 ttCi de L-[14C] sdrine et un execs d'enzyme. Les zones grisdes correspondent aux 4 fractions de tRNAser utilisdes pour la suite de ce travail. TABLEAU I.
Purification partielle des tRNA isoaccepteurs de la s~rine.
Unitds de
Fractions
I 1t III
i ]t I
703 260 218
IV
]
44
DO
pm01es de sdrine fix6es par unit6 de DO
Pourcentage
256 300 374 322
17 20 25 21
de t R N A "
Les rdsultats sont obtenus en mesurant le taux d'aminoacylation au plateau des fractions de tRNA obtenues apr&s chromatographic sur DEAE cellulose (fig. 1). Le tRNA est incubd dans un milieu identique h celui ddcrit dans mdthodes, contenant 0,1 ttCi de L-[14C] s~rine et un exc~s de sdryl-tRNA synthdtase. Une unitd de DO h 260 nm contient 1480 pmoles de tRNA. p i e s o n t dt6 r a s s e m b l d e s et le t R N A p r d e i p i t 6 h l ' d t h a n o l . Le degrd de p u r i f i c a t i o n el le r e n d e m e n t de la c o l o n n e s o n t r a p p o r t 6 s d a n s le t a b l e a u I. Nous a v o n s a i n s i o b t e n u des p r d p a r a t i o n s de t R N A c o n t e n a n t en m o y e n n e 20 p. c e n t de t R N A ~er.
P a r a m ~ l r e s c i n d t i q u e s de la s d r y l - t R N A - s y n t h ~ t a s e . 2 °) Etude comparative des sdryl-tRNA syntherases de [oie de poule et de coq. La s 6 r y l - t R N A s y n t h 6 t a s e de foie de e o q p r 6 p a r 6 e d a n s les m 6 m e s c o n d i t i o n s q u e celles de f o i e de p o u l e [4] p o s s b d e e x a e t e m e n t les m 6 m e s c o m p o r t e m e n t s e h r o m a t o g r a p h i q u e s et 61ectrophor6tiques. Le r e n d e m e n t des p u r i f i c a t i o n s est a p p r o x i -
"c
i
539
a v o n s 6tabli ( t a b l e a u II) les c o n s t a n t e s de M i c h a e lis et les v i t e s s e s m a x i m a l e s d ' a m i n o a c y l a t i o n des t R N A Ser purifi6s p o u r les s 6 r y l - t R N A s y n t h 6 t a s e s de foie de p o u l e en p o n t e et de coq. Les K m v a r i e n t e n t r e 3,1 et 7,7 × 10 -8 M, ce qui r e p r 6 s e n t e u n e f o r t e affinit6 de l ' e n z y m e p o u r son substrat. Les V m a x c o n s e r v e n t le m 6 m e o r d r e de g r a n d e u r q u e l q u e soit l ' i s o a c c e p t e u r c o n s i d 6 r 6 . Les c h i f f r e s r e p r 6 s e n t 6 s d a n s le t a b l e a u II c o r r e s p o n d e n t aux m o y e n n e s de 6 h 8 d 6 t e r m i n a t i o n s effectu6es d a n s des c o n d i t i o n s e o m p a r a b l e s a v e c p l u s i e u r s p r 6 p a r a t i o n s d i f f d r e n t e s de t R N A ~ et d ' e n z y m e s ; les faibles v a r i a t i o n s o b s e r v 6 e s ne s o n t p a s s i g n i f i c a tives. DISCUSSION ET CONCLUSION.
-3
-4
-2
1
-I
2
3
4
5 i~xlO 7
Fro. 2. - - Reprdsentation selon Lin~weaver et Burk de la cindtique d'aminoacylation par la s~rine d'un tRNA total de [oie de poule ou de coq, en prdsence des synthdtases homologues purifides. Les pr6parations de tRNA utilis6es contiennent respeetivement 143 et 148 pieomoles de tRNAser par unit6 de DO h 260 rrm. Le milieu r6aetionnel est d6erit dans m~thodes. Les valeurs des Km sont respeetivement de 5,2 et 2,6 × 10-8 M ; les valeurs des Vmax sont respeetivement de 540 et de 263 n m o l e s / m g / m i n .
m a t i v e m e n t le m 6 m e . D ' a u t r e p a r t , les c o n s t a n t e s c i n 6 t i q u e s s o n t trbs v o i s i n e s , le K m et V m a x a y a n t des v a l e u r s m o y e n n e s r e s p e c t i v e s de 4 × 10-s M et 400 n m o l e s / m g d ' e n z y m e / m i n . (fig. 2). C e p e n d a n t , il est p o s s i b l e q u e les s y n t h 6 t a s e s a i e n t des affinit6s d i f f 6 r e n t e s p o u r les q u a t r e t R N A i s o a c c e p t e u r s de la s6rine, sans que les K m 6tablis a v e c le t R N A total n ' e n s o i e n t affect6s. Afin de c o n f i r m e r ou d ' i n f i r m e r cette h y p o t h 6 s e , n o u s TABLEAU II. D~termination des K m et Vm des s~ryl-tRNA synthdtases de [oie de poule et de coq pour les tRNA isoaccepteurs de la s~rine.
D a n s ce t r a v a i l , n o u s a v o n s v o u l u v 6 r i f i e r s'il e x i s t a i t e n t r e la p o u l e en p o n t e et le coq, o u t r e des d i f f 6 r e n c e s d a n s les p r o p o r t i o n s r e l a t i v e s des t R N A i s o a c c e p t e u r s de la s6rine, 6 g a l e m e n t des v a r i a t i o n s au n i v e a u de la s 6 r y l - t R N A s y n t h 6 t a s e p o u v a n t O r e m i s e s en r e l a t i o n a v e c la s y n t h ~ s e sous la d 6 p e n d a n c e des ~estrogbnes, de p r o t 6 i n e s r i c h e s en s6rine. N o u s a v o n s purifi6 les s 6 r y l - t R N A s y n t h 6 t a s e s de f o i e de p o u l e et de coq. L a c o m p a r a i s o n de ces deux synth6tases a montr6 d'une part qu'elles posTABLEAU I l l . Ddtermination des K m el des Vm de la sdryl-tRNA synth~tase de [oie de poule pour les tRNA isoaccepteurs de 1o sdrine de [oie de rat et de [oie de lapin. tRNA de foie de lapin
tRNA de role de rat tRNA~.~ I
2 3 4
6 . ~ X lO-SI* 272 i 2,3 X 10 -at 145 X 10 -sl 280
d
lla Ill
Km
Vm
x lO -s X 10-sj 232
X 10-sl 290
Les Km sont exprimds en solution en mo]aritds et les Vm eu nmoles d'aminoacide fixdes par mg d'enzyme et par minute.
SRS tRNAs,r
Poule Km
I
6 ~< 10 -8
II Ill IV
4 X 10 "s 4,7 x 10 -s 4 x 10 -s
Coq
Vm i __i
Km
i Vm I
739 13,1 X lO-ai 597 I 6 X l O -sl 497 4,3 X 10-s 517 7,7 X 10 -s
522 638 619 480
Les Km sont exprimds en molaritd, la Vm en nmoles d'aminoacide fix6es par mg d'enzyme et par minute.
BIOCHIMIE, 1974, 56, n ° 4.
s b d e n t les m 6 m e s p r o p r i 6 t 6 s c h r o m a t o g r a p h i q u e s et 6 1 e c t r o p h o r 6 t i q u e s , d ' a u t r e p a r t que l e u r s p r o pri6t6s c i n 6 t i q u e s s o n t p r a t i q u e m e n t i d e n t i q u e s . E n effet, l e u r s affinit6s p o u r d i f f 6 r e n t s t R N A isoa e e e p t e u r s de la s 6 r i n e de f o i e de p o u l e s o n t tr6s v o i s i n e s . De plus, n o u s a v o n s m o n t r 6 q u ' i l en 6tait de m 6 m e p o u r les t R N A i s o a c c e p t e u r s de la s 6 r i n e de m a m m i f ~ r e s : p i c s I, I I a et III de t R N A set de foie de rat et les p i c s 2, 3 et 4 de t R N A set de f o i e de l a p i n (tableau III). De m 6 m e il a dt6 m o n t r 6
540
M. A. L e M e u r , . I . P . L e P e n n e c , P. Gerlinger el J. P. Ebel.
duns n o t r e l a b o r a t o i r e [I01 q u ' u n e s 6 r y l - t R N A s y n t h d t a s e de foie de rat, p r d p a r 6 e p a r c h r o m a t o g r a p h i c d'affinitd a v e c du t R N A set 4 de foie de l a p i n , p r d s e n t e la m S m e affinitd p o u r les t R N A i s o a c c e p t e u r s de la s d r i n e de f o i e de l a p i n et de foie de poule. I1 a p p a r a i t , duns les r d a c t i o n s d ' a m i n o a c y l a t i o n h 6 t d r o l o g u e s dtudides duns ce t r a v a i l , q u ' a u c u n des p a r a m O r e s c i n d t i q u e s n ' e s t modifid. Ce r d s u l t a t s ' o p p o s e h d ' a u t r e s o b s e r v a t i o n s du l a b o r a t o i r e [1.3] q u i o n t m o n t r d , d a n s des rdaetions d'aminoacylation hdtdrologues diffdrentes, q u e non s e u l e m e n t l'affinitd de la s y n t h 6 t a s e p o u r le tRNA, m a t s e n c o r e la v i t e s s e m a x i m a l e de la r d a c t i o n p o u v a i e n t 6tre f o r t e m e n t d i m i n u d e s p a r r a p p o r t h la r d a c t i o n h o m o l o g u e . I1 faut t o n t e f o i s r e m a r q u e r q u e duns ces d e r n i ~ r e s e x p d r i e n c e s , il s ' a g i s s a i t de systbrnes h d t d r o l o g u e s i m p l i q u a n t des r 6 a c t i o n s e n t r e t R N A d ' e u c a r y o t e s ( l e v u r e ) et a n d n o a c y l - t R N A s y n t h d t a s e s de p r o c a r y o t e s (E. Colt) ou v i c e versa, a]ors q u e duns ce t r a v a i l il s ' a g i t de r d a c t i o n s h 6 t d r o l o g u e s e n t r e e u c a r y o t e s . P a r r o t les t R N A set i s o a c c e p t e u r s d o n t n o u s a v o n s disposd p o u r cette dtude, les tRNA .~¢r I e t I I I de_role de rat p o s s b d e n t des s t r u c t u r e s p r i m a i r e s tr~s d i f f d r e n t e s [11]. Le fair que les s d r y l - t R N A s y n t h d t a s e s catal y s e n t u n e r d a c t i o n d ' a m i n o a c y l a t i o n spdcifique, ayant pour tousles t R N A i s o a c c e p t e u r s de la s d r i n e des c o n s t a n t e s c i n 6 t i q u e s p r a t i q u e m e n t i d e n t i q u e s , i m p l i q u e l ' e x i s t e n c e d ' a n a l o g i e s de c o n f i g u r a t i o n t e r t i a i r e h la fois e n t r e les d i f f d r e n t s t R N A i s o a c c e p t e u r s de la s d r i n e et d ' u n e esp~ce a n i m a l e h r a u t r e . Ces rdsultats, en a c c o r d a v e c c e u x de Myers et coll. [12] t e n d e n t h m o n t r e r q u ' i l e x i s t e u n e a n a l o g i e duns la c o n f i g u r a t i o n de ces m o l 6 c u l e s . S'il e x i s t e une r d g u l a t i o n de la s y n t h b s e p r o t d i q u e h ce n i v e a u , elle s e r a i t p l u t S t f o n c t i o n de la q u a n t i t d des tR,NA p r d s e n t s q u e des p a r a m b t r e s c i n d t i q u e s de la r d a c t i o n d ' a m i n o a c y l a t i o n . On c o m p r e n d c e p e n d a n t e n c o r e real c o m m e n t s ' o p b r e n t les c h a n g e m e n t s a d a p t i f s des t a u x r e l a tifs des d i f f d r e n t s t R N A i s o a c c e p t e u r s l o r s de la s y n t h b s e , sous d d p e n d a n c e h o r m o n a l e , de p r o tdines spdcifiques. De m 6 m e , le r61e e x a c t de l ' e x i s t e n c e d ' u n g r a n d n o m b r e de t R N A i s o a c c e p t e u r s reste encore obscur.
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Remerciements. Nous remercions vivement le Professeur M. Staehelin et le Docteur G. Pdtrissant qui ont bien voulu mettre aimablement h notre disposition des tRNAser purifids. Ce travail a dtd rdalisd grace h 1'aide du Centre National de la Recherche Scientifique (laboratoire assoeid n ° 119); de la D~16gation Gdndrale h la Recherche Scientifique et Technique ; du Commissariat h l'Energie Atomique et de la Fondation pour la Recherche Mddicale Frangaise. R~su~i~. Nous avons voulu vdrifier si les sdryl-tRNA synth6tases pr6pardes h partir de roles d'animaux physiologiquement stimulds par les cestrog6nes (ponte) et des animaux non stimulds prdsentent des diffdrences. Les sdryl-tRNA synthdtases purifides h partir de foie de poule en ponte et de coq ont les m~mes propridtds chromatographiques et dlectrophordtiques. Le Km de ces synthdtases pour les 4 sdryl-tRNA isoaccepteurs de foie de poule ne sont pus significativement diffdrents, il est de l'ordre de 10-8 M. Ces synthdtases reeonnaissent avec la m6me affinitd les tRNAser isoaceepteurs de foie de rat et de foie de lapin. De mdme, la sdryltRNA synthdtase de foie de rat reeonnait, avec les m~mes constantes cindtiques, les tRNAser de foie de ponle. I1 est peu probable qu'une rdgulation hormonale s'erxerce au niveau des aminoacyl-tRNA synthdtases. BIBLIOGRAPHIE. 1. Beck, G., Hentzen, D. & Ebel, J. P. (1970) Biochim. Biophys. Acta, 213, 68-76. 2. M~ienpiia, P. H. & Bernfield, M. R. (1969) Biochem., 8, 4926-4934. 3. M~ier~piia, P. H. (1972) Biochem. Biophys. Res. Commun., 47, 917-974. 4. Le Meur, M. A., Gerlinger, P., Clavert, J. & Ebel, J. P. (1972) Biochimie, 54, 1391-1397. 5. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. Randall, R. J. (1951) J. Biol. Chem., 193, 265-268. 6. Illinger, D., Le Meur, M. A., Gerlinger, P. & Ebel, J. P. (1974) Biochimie, 57, 7. Muller, P., Wehrli, W. & Staehelin, M. (1971) Biochim., 10, 1885-1890. 8. Marts, R. J. ,~ Novelli, G. D. (1961) Arch. Biochem. Biophys., 94, 48-53. 9. Nishimura, S., Harada, F., Narushima, U. & Seno, T. (1967) Biochim. Biophys. Acla, 142, 133-148. 10. Befort, J. J., Befort, N., Petrissant, G., Remy, P. & Ebel, J. P. Soumis h FEBS letters. 11. Rogg, H., Muller, P. & Staehelin, M. (1973) Experienlia, 29, 757. 12. Myers, G., Blank, H. U. & $611, D. (1971) J. Biol. Chem., 246, 4955-4964. 13. Ebel, J. P., Giegd, R., Bonnet, J., Kern, D., Befort, N., Bollack, C., Fasiolo, F., Gangloff, J. & Dirheimer, G. (1973) Biochimie, 55, 547-557.