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Etude comparee des erythrocytes de quatre especes animales dans la determination de l'activite hemolytique des voies classique et alterne du complement bovin
Comp. lmmun. Microbiol. infect. Dis. Vol. 7, No. 1, pp. 27 34, 1984 Printed in Great Britain
0147-9571/84 $3.00+0.00 Pergamon Press Ltd
ETUDE COMPAREE DES ERYTHROCYTES DE QUATRE ESPECES ANIMALES DANS LA DETERMINATION DE L'ACTIVITE HEMOLYTIQUE D E S V O I E S C L A S S I Q U E ET A L T E R N E D U COMPLEMENT BOVIN CHANTAL BOULARD et FIFI BENCHARIF I.N.R.A.C.R. de Tours-Nouzilly, Station de Pathologie Aviaire et de Parasitologie 37380, Monnaie, France (Reeu le 1983)
R6sum~--L'activit6 du compl6ment bovin activ6 suivant les voies classique ou alterne dans quatre types de syst6me h~molytique faisant intervenir des 6rythrocytes de mouton, lapin, cobaye et poulet, a 6t6 +tudi6e. L'existence d'une cytolyse importante associ6e ~i une activation directe par la voie alterne dans les immunoh6molyses faisant appeI aux 6rythrocytes de lapin, de cobaye et de poulet, rend ces syst6mes h6molytiques trop impr6cis pour explorer l'int6grit6 fonctionnetle des deux voies d'activation du compl6ment bovin. Nous ne retiendrons que ies 6rythrocytes de mouton pour analyser l'activation du compl6ment selon la voie classique. L'6tude de l'activation via la voie alterne peut ~tre r+alis6e avec les 6rythrocytes des trois autres esp6ces animales. Mots-clefs: Complbment bovin, voie alterne, voie classique, syst6me h6molytique, 6rythrocyte mouton, ~rythrocyte lapin, 6rythrocyte poulet, 6rythrocyte cobaye
COMPARATIVE STUDY OF FOUR DIFFERENT ANIMAL SPECIES ERYTHROCYTES IN THE DETERMINATION OF HEMOLYTIC ACTIVITY OF BOVINE COMPLEMENT IN CLASSICAL OR ALTERNATIVE PATHWAYS Abstract--The hemolytic activity of bovine complement activated via the classical or alternative pathways was studied employing as target cells, erythrocytes of sheep, rabbit, guinea-pig and chicken. A spontaneous activation of bovine complement via the alternative pathway by rabbit and guinea-pig erythrocytes at a high level and chicken erythrocytes at a lower degree, was observed. Consequently hemolytic activity following activation via the classical pathway reflects activation via the two pathways when erythrocytes of these three species were used. In spite of a low degree of hemolysis, sheep erythrocytes have been chosen for their high specificity in the evaluation of bovine complement activation via the classical pathway. Activation via the alternative pathway can be performed by the erythrocytes of the three other species studied. Key words: Bovine complement, classical pathway, alternative pathway, hemolytic system, sheep erythrocyte, rabbit erythrocyte, chicken erythrocyte, guinea-pig erythrocyte
INTRODUCTION Le syst6me d u c o m p l 6 m e n t , un des p r i n c i p a u x m 6 c h a n i s m e s qui p a r t i c i p e n t fi la d6fense de l ' o r g a n i s m e c h e z les vert6br6s, est e x p l o r ~ c o u r a m m e n t c h e z l ' h o m m e et p l u s i e u r s esp6ces a n i m a l e s . D e s m 6 t h o d e s s t a n d a r d i s 6 e s bas6es n o t a m m e n t sur l'activit6 c y t o l y t i q u e d u c o m p l + m e n t o n t p e r m i s d ' a p p r 6 c i e r le degr6 de p a r t i c i p a t i o n des d e u x voies d ' a c t i v a t i o n 27
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de ce syst6me de d6fense en pr6sence de divers agents pathog~nes d'origine bact~rienne [1], virale [2, 3] ou parasitaire [4-7]. Ainsi, l'activit6 h6molytique du compl6ment activbe selon la voie classique des esp6ces humaine, canine, f61ine, porcine, a ~t6 6valu6e 5. partir d'un syst6me h~molytique faisant intervenir les 6rythrocytes de mouton (EM) et des anticorps anti-EM ou h6molysines (H). Les Crythrocytes de lapin (EL) dont les membranes sont pauvres en acide sialique et qui ont le propri6t6 d'activer le compl6ment de ces esp6ces par la voie alterne, ont servi de substrats pour l'exploration de la vole alterne. Les donn6es sur le syst6me compl6mentaire des herbivores et notamment des bovins sont limit6es et les syst6mes h6molytiques employ6s tr6s vari6s. Le compl6ment bovin a 6re longtemps consid6r6 comme non h6molytique car il pr6sentait une faible activit6 de cytolyse vis-5.-vis du syst6me immunoh~molytique standard repr6sent6 par le syst~me EM-H. D6s 1952, Rice et Boulanger [8] proposaient pour les ruminants un autre syst¢me h6molytique faisant intervenir des EL et des anticorps anti-EL. Depuis, d'autres syst6mes h6molytiques ont 6t6 employbs dans l'6valuation de l'activit6 du compl6ment bovin: des 6rythrocytes de cobaye (EC) [9, 10], des 6rythrocytes humains (EH) [11, 12] mais les EL ont conserv6 la faveur de nombreux exp6rimentateurs [13-17]. Devant la diversit6 des syst6mes h6molytiques utilis6s et compte-tenu de la mise en ~vidence d'une propri~t6 activatrice directe de la voie alterne, des membranes 6rythrocytaires totalement ou partiellement d6pourvues d'acide sialique [18, 19], il nous paraissait important d'engager une 6tude visant 5. comparer les diff6rents syst6mes h6molytiques pour 6valuer l'activit6 immunoh6molytique propre du compl6ment bovin en pr6sence d'6rythrocytes de diverses esp6ces animales.
MATERIEL ET METHODES
SOrums L'etude de l'activit6 h6molytique du compl6ment s6rique de bovins est r6alis6e sur i0 s6rums de sujets femelles de race normande 5.g6es de 3 ans pesant entre 600 et 700 kg. Ces animaux n6s dans le ferme exp6rimentale de I'INRA de Nouzilly ont 6t6 mis en lots d+s le sevrage et soumis depuis aux m6mes conditions d'61evage. Le sang est pr+lev6 5. la jugulaire, laiss~ 60 min 5. 22°C puis centrifugb 30 min 5. 4°C. Les s&ums sont r6partis en aliquots de 1 ml et stock6s 5. -70°C. Les dosages de l'activit6 h6molytique du compl6ment s6rique sont r6alis6s 4 5. 10 jours apr~s le pr616vement. Erythrocytes substrats de l'activit~ hOmolytique Les 6rythrocytes de mouton provenaite de l'Institut Pasteur Production (Paris). Les ~rythrocytes de lapin (EL), cobaye (EC) et poulet (EP) 6taient obtenus 5. partir de pr616vements sanguins r6alis6s 5. la veine marginale de l'oreille du lapin et en intracardiaque pour les deux autres esp6ces et pr~lev6s sur Alsever volume 5. volume. Apr6s un triple lavage dans un tampon isotonique barbital-NaC1 pH 7,2, les h6maties sont stock6es 5. une concentration finale de 2 × l09 cellules/ml dans le tampon d6sir6. Tampons Le dosage apr6s activation du compl6ment selon la voie classique est r6alis6 en tampon isotonique barbital 0,05 M-NaC1 pH 7,3 contenant 0,00015 M CaC12 et 0,001 M MgCl 2. Le dosage de l'activation selon la vole alterne est r6alis6 en tampon phosphate 0.2 M pH
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7,2 renfermant 0.01 M de sel disodique d'6thyl6ne glycol t6traac&ique et 0,007 M de MgCI>
Hbmolysines Dans cette 6tude comparative, nous n'avons pas eu recours ~ des anticorps anti6rythrocytes des esp6ces &udi6es, pr6par6s sp6cialement sur esp6ces h6t6rologues. Nous avons choisi de r+aliser la sensibilisation des 6rythrocytes ~, partir des anticorps naturels anti-6rythrocytes de mouton, de lapin, de cobaye ou de poulet pr6sents dans le strum de bovin. Dans ce but, un pool et s6rums de 10 bovins d'~ges et de races diff6rents, est d6compl6ment6 30' ~t 56°C puis congel6 ~i -20°C. La derni6re dilution de ces h+molysines naturelles permettant d'obtenir un maximum d'h6molyse des diff6rents 6rythrocytes mis en contact avec deux unit6s CH50 de compl6ment bovin (d6finis pr6alablement dans un syst6me standard EM-hbmolysine provenant de Pasteur Production), ont 6t6 de 1/16e pour les EC, 1/10e pour les EP et les EL et de l/Be pour les EM. Au cours de cette exp6rimentation, nous avons conserv6 une dilution unique au 1/10e du pool de s6rums bovins, afin de sensibiliser les 6rythrocytes des 4 esp6ces choisies.
Dosage de l'activit~ hOmolytique Apr6s sensibilisation ou non des 6rythrocytes suivant la voie 5, doser, 0,2ml d'une suspension cellulaire ~ 1,5 x 108 cellules/ml sont mis en contact avec le compl6ment contenu dans 0,2 ml de s6rum bovin, dilu6 de 1/2/t 1/200. Chaque dilution est r6alis6e en triple. Apr6s 60 minutes d'incubation /t 37°C, la r6action est arr6t6e par addition de tampon Barbital ~ 4°C. Apr6s centrifugation/t 4°C 5, 2000g, i'intensit~ de l'h+molyse est estim6e sur le surnageant par lecture de la densit6 optique ~ 412 nm au spectrophotom6tre (Beckman CII). EXPRESSION DES RESULTATS Le titres de l'activit6 h6molytique du compl6ment s6rique des bovins sont exprim6s en unit~s CH50/ml de s~rum.
RESULTATS Les r6sultats des analyses visant ~i appr+cier la sensibilit6 des 6rythrocytes de mouton, lapin, cobaye, poulet, du compl6ment s6rique de bovin activ6 selon la voie alterne ou classique, sont pr6sent6s aux Tableaux 1-3 et Figs 1-4. Le titre de l'activit6 h6molytique du compl6ment s6rique des 10 bovins 6tudi6s varie apr+s activation de la voie classique en pr+sence d'+rythrocytes de lapin de 152 h 200 UCH50, en pr6sence d'erythrocytes de mouton de 30 ~ 75 UCH50, en pr6sence d'+rythrocytes de poulet de 172 ~i 313 UCH50 et en pr6sence d'6rythrocytes de cobaye de 500 ~ 833 UCH50 (tableaux 2-3). Le titre de l'activit6 h6molytique du complem6nt s+rique des 10 bovins apr6s activation de la voie alterne varie de 104 h 156 UCH50 en pr6sence d'6rythrocytes de lapin, de 61 147 UCH50 en pr6sence d'6rythrocytes de poulet, de 313 ~t 714 UCH50 en pr6sence d'6rythrocytes de cobaye et est nul en pr6sence d'6rythrocytes de mouton (Tableaux 1 et 3).
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Tableau 1. Titrc (exprim6 en unit6 CH50/ml de s6rum) de l'activit6 h~molytiqae du compl6ment de l0 bovins activ6 selon la vole alterne et dvalu~e avec dcs 6rythrocytes d'esp6ces animales diffcrcntes Bovin no. E r y t h r o c y t e s ' ~ - . ~ no. de ~ Lapin Mouton Poulet Cobaye
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
156 * 147 556
139 * 143 417
106 * 116 333
104 * 119 313
139 * 125 357
167 * 132 625
104 * 61 500
111 * 106 500
106 * 119 455
119 * 116 714
• = ind6tectable ~t une dilution au 1/5e Titre (exprim6 en unit6 CH50/ml de s6rum) de l'activit6 h6molytique du compl6ment de 10 bovins activ6 selon la voie alterne et 6valu6e avec des 6rythrocytes d'espdces animales diff6rentes.
Tableau 2. Titre (exprim6 en unit6 CH50/ml de s6rum) de l'activit6 h6molytique du compl6ment de 10 bovins activ6 selon la voie classique et 6valu6e avec des 6rythrocytes d'esp6ces animales diff6rentes Bovin Erythrocytes~..~ de Lapin Mouton Poulet Cobaye
no. "~
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
179 53 294 625
200 60 313 556
167 26 217 500
122 74 278 500
200 75 151 500
217 31 263 667
156 43 172 556
152 40 268 556
152 30 278 556
172 31 313 833
Titre (exprim6 en unit~ CH50/ml de s~rum) de l'activit~ h~molytique du compl~ment de 10 bovins activ~ selon la voie classique et ~valu~e avec des ~rythrocytes d'espdces animales diffdrentes.
Tableau 3. Moyenne des titres en unit~ (CH50/ml de s~rum) de l'activit6 h6molytique du compl6ment de bovins activ6 selon la vole alterne ou classique et ~valu~e sur des erythrocytes d'esp~ces animales diff~rentes Erythrocytes
Activation selon la vole alterne
Activation selon la voie classique
Lapin Mouton Poulet Cobaye
125 _+ 23 0 118 + 24 477 ± 130
172 +_ 28 46 ± 18 255 ± 56 585 ± 102
Moyenne des titres en unit6 (CH50/ml de s6rum) de l'activit6 h6molytique du compl6ment de bovins activ6 selon la vole alterne ou classique et 6valu6e sur des 6rythrocytes d'espdces animales diff6rentes.
~OOO
I
2
3
4
5 n °
6
7
8
9
"10
bovins
Fig. 1. Activit~ h ~ m o l y t i q u e c o m p a r ~ e d u c o m p l ~ m e n t s~rique de b o v i n activ~ selon la voie a l t e r n e o u c l a s s i q u e utilisant p o u r cellules cibles des 6 r y t h r o c y t e s d e c o b a y e .
Evaluation du compl6ment bovin par 4 syst~mes h6molytiques
1000
Voie clossique
E
~
Voie
alterne
-~ 5oo 0 tO I 0
2
3
4
5
6
n °
7
8
9
10
bovins
Fig. 2. Activit~ h~molytique compar~e du compl~ment s~rique de bovin activ~ selon la voie alterne ou classique utilisant pour cellules cibles des ~rythrocytes de poulet. 1000
E
-E
500
0 tO
2
~
4
5
6
n °
7
8
9
"10
b o v i r]s
Fig. 3. Activit~ h~molytique compar6e du compl6ment s~rique de bovin activ~ selon la voie alterne ou classique utilisant pour cellules cibles des ~rythrocytes de mouton.
I000
E
5O0 0 tO I
I
2
3
4
5
6 n °
7
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9
10
bovins
Fig. 4. Activit~ h~molytique compar6e du compl~ment s~rique de bovin activ~ selon la voie alterne ou classique utilisant pour cellules cibles dans ~rythrocytes de lapin.
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DISCUSSION Les r6sultats de cette 6tude confirment sur deux points essentiels les donn6es acquises pr6cbdemment sur l'activit6 h6molytique du compl6ment serique des bovins: - - d ' u n e part, le compl6ment bovin r6pondant ~ une m6me voie d'activation pr6sente une activit6 cytolytique tr6s diff6rente sur les 6rythrocytes des 4 esp6ces animales &udi6es. Les observations de cette 6tude r6alis6es ~ partir d'un m~me 6chantillonnage de s6rums bovins dans quatre syst6mes h6molytiques diff6rents, nous conduisent ~ classer la sensibilit6 des 6rythrocytes choisis par ordre dbcroissant: EC, EP, EL, EM, comme Barta et Barta [13] l'avaient en partie d6montr6. Les valeurs moyennes des titres h¢molytiques que nous avons observbes sont conformes ~ celles pr6cedemment publibes pour le compl6ment de bovin adulte. Barta et Barta [14] situaient cette activit~ h6molytique entre 400 et 500 UCH50 sur les EC, la valeur que nous observons est de 585 + 102 UCH50. Renshaw et al., [16] estimaient h 172 + 2 8 UCH50 cette activit6 sur les EL, nous l'observons h 195___24 UCH50. La faible sensibilit6 du syst6me h6molytique standard EM-M est confirm6e ici puisque le titre h6molytique moyen observ6 est de 4 6 _ 18 UCH50. Un 616ment nouveau est apport6 dans cette 6rude par la mise en 6vidence de la bonne sensibilit6 des EP puisque le titre moyen est de 255 +_ 56 UCH50. ~ ' a u t r e part, cette 6tude confirme la dispersion des titres du compl6ment bovin analys6 dans un m6me syst6me hemolytique sur un lot homog6ne de bovins dont les crit~res d'homog~n~it~ retenus ont 6t6: l'fige, la race, le sexe, le mode d'61evage, l'&at physiopathologique. Cette variabilit6 avait +t6 signal6e d6s 1973 par Barta et Barta [14] chez les bovins adultes. Plus r6cemment, divers facteurs intervenant sur l'activit6 hbmolytique du compl6ment bovin ont 6t6 pr6cis6s. Renshaw et Everson [9] ont mis en 6vidence l'influence de l'fige, le titre moyen du compl6ment des veaux &ant de "3.71 + 1.49 fois plus faible" que leur m6re. Kakoma et Kinyangui [15] ont d6fini une variabilit6 li6e ~ la race et Woodward et al. [20] ont d6montr6 l'effet d6presseur d'une malnutrition sur le compl6ment. Enfin, des d6pl6tions du syst6me compl6mentaire sont bien d6crites au cours de diverses affections chez les bovins, d'origine bact6rienne ~i G r a m - - o u d'origine parasitaire [11, 21,22]. Le point important et original mis en bvidence dans cette 6tude porte sur la participation relative de l'h6molyse initi6e fi partir de la voie alterne dans l'activit6 immunoh6molytique mise en 6vidence dans chacun de ces syst6mes faisant intervenir les EM, les EC, les EL et les EP (Figs 1-4). La sensibilit6 diff6rentielle des 6rythrocytes de diffbrentes esp6ces et leur participation dans l'activation de la voie alterne d6pendent notamment de la proportion d'acide sialique entrant dans la constitution de la membrane 6rythrocytaire. Cette mol6cule contribuerait inhiber la fixation du C3b qui se forme en petite quantit6 spontan6ment et qui se fixe par une liaison thioester sur des r6cepteurs de la membrane 6rythrocytaire et constitue la premi6re phase de formation de la Ca convertase initiatrice d'une activation de la voie alterne [23]. Alors que les EL et les EC sont g6n6ralement utilis6s dans l'analyse de l'activit6 du compl6ment de bovin apr6s une activation par la voie classique, nos r6sultats mettent clairement en 6vidence l'importance de l'h6molyse associ6e gt une activation du compl6ment ind6pendante de la voie classique, dans ces deux syst6mes hemolytiques. Une d6faillance de la s6quence C~ C3 qui risque d'avoir des cons6quences graves dans les m6canismes de d6fense immunitaire sera difficilement appr6ciable dans ces syst6mes. Le syst6me h6mo-
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lytique faisant appel aux EP m o i n s sensibles h cette activation spontan6e de la voie alterne a p p o r t e r a i t u n outil de c o m p a r a i s o n plus fin dans u n m6me syst6me 6rythrocytaire. N 6 a n m o i n s , l'absence totale d ' a c t i v a t i o n de la voie alterne d u c o m p l 6 m e n t b o v i n par les globules rouges de m o u t o n n o u s a m i n e ~t privil6gier l'emploi de ces globules rouges darts l ' e x p l o r a t i o n de la s6quence C~-C9. La mise en 6vidence de l'activation de la voie alterne peut 6tre faite soit fi partir d'6rythrocytes c o l l a b o r a n t ~, l ' a c t i v a t i o n de cette voie c o m m e les EL, les EC, les EP, soit partir de l'analyse d u facteur B 6troitement associ6 fi la C3 convertase c o m m e l ' o n t fait P a n g et A s t o n [11] et Tabel [10]. L ' i m p o r t a n c e du r61e d u c o m p l 6 m e n t dans la d&ense de l ' o r g a n i s m e et la diversit~ des m6chanismes activateurs de ce syst~me par deux voies c o r r e s p o n d a n t h deux phases bien differentes de r6sistance aux agents pathog6nes, rend n6cessaire une m6thode d ' ~ v a l u a t i o n pr6cise de la voie impliqu6e. L ' a p p r 6 c i a t i o n de l'integrit6 fonctionnelle de ces deux voies est aussi n6cessaire et doit permettre la mise en 6vidence soit de d6ficit h6r6ditaire ou de d6ficience pathologique, soit de l'action sp6cifique d ' a g e n t s pathog6nes dirig6e contre un ou plusieurs facteurs de chacune des s6quences. U n e 6valuation pr6cise de l'activit~ du c o m p l 6 m e n t activ6 suivant chaque voie est u n outil indispensable p o u r approcher des diff+rents m6chanismes qui participent fi l ' i n f l a m m a t i o n dans les p h 6 n o m 6 n e s de d6fense de l ' o r g a n i s m e chez les bovin. Remerciements--Nous remercions Monsieur M. Etievant de l'Unit6 d'Immunoallergie de l'Institut Pasteur de Paris pour ses conseils et l'attention qu'il a port6 h cette +tude. Nous remerciements s'adressent 6galement fi Mme Villejoubert pour son excellente assistance technique.
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ETUDE COMPAREE DES ERYTHROCYTES DE QUATRE ESPECES ANIMALES DANS LA DETERMINATION DE L'ACTIVITE HEMOLYTIQUE D E S V O I E S C L A S S I Q U E ET A L T E R N E D U COMPLEMENT BOVIN CHANTAL BOULARD et FIFI BENCHARIF I.N.R.A.C.R. de Tours-Nouzilly, Station de Pathologie Aviaire et de Parasitologie 37380, Monnaie, France (Reeu le 1983)
R6sum~--L'activit6 du compl6ment bovin activ6 suivant les voies classique ou alterne dans quatre types de syst6me h~molytique faisant intervenir des 6rythrocytes de mouton, lapin, cobaye et poulet, a 6t6 +tudi6e. L'existence d'une cytolyse importante associ6e ~i une activation directe par la voie alterne dans les immunoh6molyses faisant appeI aux 6rythrocytes de lapin, de cobaye et de poulet, rend ces syst6mes h6molytiques trop impr6cis pour explorer l'int6grit6 fonctionnetle des deux voies d'activation du compl6ment bovin. Nous ne retiendrons que ies 6rythrocytes de mouton pour analyser l'activation du compl6ment selon la voie classique. L'6tude de l'activation via la voie alterne peut ~tre r+alis6e avec les 6rythrocytes des trois autres esp6ces animales. Mots-clefs: Complbment bovin, voie alterne, voie classique, syst6me h6molytique, 6rythrocyte mouton, ~rythrocyte lapin, 6rythrocyte poulet, 6rythrocyte cobaye
COMPARATIVE STUDY OF FOUR DIFFERENT ANIMAL SPECIES ERYTHROCYTES IN THE DETERMINATION OF HEMOLYTIC ACTIVITY OF BOVINE COMPLEMENT IN CLASSICAL OR ALTERNATIVE PATHWAYS Abstract--The hemolytic activity of bovine complement activated via the classical or alternative pathways was studied employing as target cells, erythrocytes of sheep, rabbit, guinea-pig and chicken. A spontaneous activation of bovine complement via the alternative pathway by rabbit and guinea-pig erythrocytes at a high level and chicken erythrocytes at a lower degree, was observed. Consequently hemolytic activity following activation via the classical pathway reflects activation via the two pathways when erythrocytes of these three species were used. In spite of a low degree of hemolysis, sheep erythrocytes have been chosen for their high specificity in the evaluation of bovine complement activation via the classical pathway. Activation via the alternative pathway can be performed by the erythrocytes of the three other species studied. Key words: Bovine complement, classical pathway, alternative pathway, hemolytic system, sheep erythrocyte, rabbit erythrocyte, chicken erythrocyte, guinea-pig erythrocyte
INTRODUCTION Le syst6me d u c o m p l 6 m e n t , un des p r i n c i p a u x m 6 c h a n i s m e s qui p a r t i c i p e n t fi la d6fense de l ' o r g a n i s m e c h e z les vert6br6s, est e x p l o r ~ c o u r a m m e n t c h e z l ' h o m m e et p l u s i e u r s esp6ces a n i m a l e s . D e s m 6 t h o d e s s t a n d a r d i s 6 e s bas6es n o t a m m e n t sur l'activit6 c y t o l y t i q u e d u c o m p l + m e n t o n t p e r m i s d ' a p p r 6 c i e r le degr6 de p a r t i c i p a t i o n des d e u x voies d ' a c t i v a t i o n 27
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de ce syst6me de d6fense en pr6sence de divers agents pathog~nes d'origine bact~rienne [1], virale [2, 3] ou parasitaire [4-7]. Ainsi, l'activit6 h6molytique du compl6ment activbe selon la voie classique des esp6ces humaine, canine, f61ine, porcine, a ~t6 6valu6e 5. partir d'un syst6me h~molytique faisant intervenir les 6rythrocytes de mouton (EM) et des anticorps anti-EM ou h6molysines (H). Les Crythrocytes de lapin (EL) dont les membranes sont pauvres en acide sialique et qui ont le propri6t6 d'activer le compl6ment de ces esp6ces par la voie alterne, ont servi de substrats pour l'exploration de la vole alterne. Les donn6es sur le syst6me compl6mentaire des herbivores et notamment des bovins sont limit6es et les syst6mes h6molytiques employ6s tr6s vari6s. Le compl6ment bovin a 6re longtemps consid6r6 comme non h6molytique car il pr6sentait une faible activit6 de cytolyse vis-5.-vis du syst6me immunoh~molytique standard repr6sent6 par le syst~me EM-H. D6s 1952, Rice et Boulanger [8] proposaient pour les ruminants un autre syst¢me h6molytique faisant intervenir des EL et des anticorps anti-EL. Depuis, d'autres syst6mes h6molytiques ont 6t6 employbs dans l'6valuation de l'activit6 du compl6ment bovin: des 6rythrocytes de cobaye (EC) [9, 10], des 6rythrocytes humains (EH) [11, 12] mais les EL ont conserv6 la faveur de nombreux exp6rimentateurs [13-17]. Devant la diversit6 des syst6mes h6molytiques utilis6s et compte-tenu de la mise en ~vidence d'une propri~t6 activatrice directe de la voie alterne, des membranes 6rythrocytaires totalement ou partiellement d6pourvues d'acide sialique [18, 19], il nous paraissait important d'engager une 6tude visant 5. comparer les diff6rents syst6mes h6molytiques pour 6valuer l'activit6 immunoh6molytique propre du compl6ment bovin en pr6sence d'6rythrocytes de diverses esp6ces animales.
MATERIEL ET METHODES
SOrums L'etude de l'activit6 h6molytique du compl6ment s6rique de bovins est r6alis6e sur i0 s6rums de sujets femelles de race normande 5.g6es de 3 ans pesant entre 600 et 700 kg. Ces animaux n6s dans le ferme exp6rimentale de I'INRA de Nouzilly ont 6t6 mis en lots d+s le sevrage et soumis depuis aux m6mes conditions d'61evage. Le sang est pr+lev6 5. la jugulaire, laiss~ 60 min 5. 22°C puis centrifugb 30 min 5. 4°C. Les s&ums sont r6partis en aliquots de 1 ml et stock6s 5. -70°C. Les dosages de l'activit6 h6molytique du compl6ment s6rique sont r6alis6s 4 5. 10 jours apr~s le pr616vement. Erythrocytes substrats de l'activit~ hOmolytique Les 6rythrocytes de mouton provenaite de l'Institut Pasteur Production (Paris). Les ~rythrocytes de lapin (EL), cobaye (EC) et poulet (EP) 6taient obtenus 5. partir de pr616vements sanguins r6alis6s 5. la veine marginale de l'oreille du lapin et en intracardiaque pour les deux autres esp6ces et pr~lev6s sur Alsever volume 5. volume. Apr6s un triple lavage dans un tampon isotonique barbital-NaC1 pH 7,2, les h6maties sont stock6es 5. une concentration finale de 2 × l09 cellules/ml dans le tampon d6sir6. Tampons Le dosage apr6s activation du compl6ment selon la voie classique est r6alis6 en tampon isotonique barbital 0,05 M-NaC1 pH 7,3 contenant 0,00015 M CaC12 et 0,001 M MgCl 2. Le dosage de l'activation selon la vole alterne est r6alis6 en tampon phosphate 0.2 M pH
Evaluation du compl~mentbovin par 4 syst6mesh6molytiques
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7,2 renfermant 0.01 M de sel disodique d'6thyl6ne glycol t6traac&ique et 0,007 M de MgCI>
Hbmolysines Dans cette 6tude comparative, nous n'avons pas eu recours ~ des anticorps anti6rythrocytes des esp6ces &udi6es, pr6par6s sp6cialement sur esp6ces h6t6rologues. Nous avons choisi de r+aliser la sensibilisation des 6rythrocytes ~, partir des anticorps naturels anti-6rythrocytes de mouton, de lapin, de cobaye ou de poulet pr6sents dans le strum de bovin. Dans ce but, un pool et s6rums de 10 bovins d'~ges et de races diff6rents, est d6compl6ment6 30' ~t 56°C puis congel6 ~i -20°C. La derni6re dilution de ces h+molysines naturelles permettant d'obtenir un maximum d'h6molyse des diff6rents 6rythrocytes mis en contact avec deux unit6s CH50 de compl6ment bovin (d6finis pr6alablement dans un syst6me standard EM-hbmolysine provenant de Pasteur Production), ont 6t6 de 1/16e pour les EC, 1/10e pour les EP et les EL et de l/Be pour les EM. Au cours de cette exp6rimentation, nous avons conserv6 une dilution unique au 1/10e du pool de s6rums bovins, afin de sensibiliser les 6rythrocytes des 4 esp6ces choisies.
Dosage de l'activit~ hOmolytique Apr6s sensibilisation ou non des 6rythrocytes suivant la voie 5, doser, 0,2ml d'une suspension cellulaire ~ 1,5 x 108 cellules/ml sont mis en contact avec le compl6ment contenu dans 0,2 ml de s6rum bovin, dilu6 de 1/2/t 1/200. Chaque dilution est r6alis6e en triple. Apr6s 60 minutes d'incubation /t 37°C, la r6action est arr6t6e par addition de tampon Barbital ~ 4°C. Apr6s centrifugation/t 4°C 5, 2000g, i'intensit~ de l'h+molyse est estim6e sur le surnageant par lecture de la densit6 optique ~ 412 nm au spectrophotom6tre (Beckman CII). EXPRESSION DES RESULTATS Le titres de l'activit6 h6molytique du compl6ment s6rique des bovins sont exprim6s en unit~s CH50/ml de s~rum.
RESULTATS Les r6sultats des analyses visant ~i appr+cier la sensibilit6 des 6rythrocytes de mouton, lapin, cobaye, poulet, du compl6ment s6rique de bovin activ6 selon la voie alterne ou classique, sont pr6sent6s aux Tableaux 1-3 et Figs 1-4. Le titre de l'activit6 h6molytique du compl6ment s6rique des 10 bovins 6tudi6s varie apr+s activation de la voie classique en pr+sence d'+rythrocytes de lapin de 152 h 200 UCH50, en pr6sence d'erythrocytes de mouton de 30 ~ 75 UCH50, en pr6sence d'+rythrocytes de poulet de 172 ~i 313 UCH50 et en pr6sence d'6rythrocytes de cobaye de 500 ~ 833 UCH50 (tableaux 2-3). Le titre de l'activit6 h6molytique du complem6nt s+rique des 10 bovins apr6s activation de la voie alterne varie de 104 h 156 UCH50 en pr6sence d'6rythrocytes de lapin, de 61 147 UCH50 en pr6sence d'6rythrocytes de poulet, de 313 ~t 714 UCH50 en pr6sence d'6rythrocytes de cobaye et est nul en pr6sence d'6rythrocytes de mouton (Tableaux 1 et 3).
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Tableau 1. Titrc (exprim6 en unit6 CH50/ml de s6rum) de l'activit6 h~molytiqae du compl6ment de l0 bovins activ6 selon la vole alterne et dvalu~e avec dcs 6rythrocytes d'esp6ces animales diffcrcntes Bovin no. E r y t h r o c y t e s ' ~ - . ~ no. de ~ Lapin Mouton Poulet Cobaye
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
156 * 147 556
139 * 143 417
106 * 116 333
104 * 119 313
139 * 125 357
167 * 132 625
104 * 61 500
111 * 106 500
106 * 119 455
119 * 116 714
• = ind6tectable ~t une dilution au 1/5e Titre (exprim6 en unit6 CH50/ml de s6rum) de l'activit6 h6molytique du compl6ment de 10 bovins activ6 selon la voie alterne et 6valu6e avec des 6rythrocytes d'espdces animales diff6rentes.
Tableau 2. Titre (exprim6 en unit6 CH50/ml de s6rum) de l'activit6 h6molytique du compl6ment de 10 bovins activ6 selon la voie classique et 6valu6e avec des 6rythrocytes d'esp6ces animales diff6rentes Bovin Erythrocytes~..~ de Lapin Mouton Poulet Cobaye
no. "~
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
179 53 294 625
200 60 313 556
167 26 217 500
122 74 278 500
200 75 151 500
217 31 263 667
156 43 172 556
152 40 268 556
152 30 278 556
172 31 313 833
Titre (exprim6 en unit~ CH50/ml de s~rum) de l'activit~ h~molytique du compl~ment de 10 bovins activ~ selon la voie classique et ~valu~e avec des ~rythrocytes d'espdces animales diffdrentes.
Tableau 3. Moyenne des titres en unit~ (CH50/ml de s~rum) de l'activit6 h6molytique du compl6ment de bovins activ6 selon la vole alterne ou classique et ~valu~e sur des erythrocytes d'esp~ces animales diff~rentes Erythrocytes
Activation selon la vole alterne
Activation selon la voie classique
Lapin Mouton Poulet Cobaye
125 _+ 23 0 118 + 24 477 ± 130
172 +_ 28 46 ± 18 255 ± 56 585 ± 102
Moyenne des titres en unit6 (CH50/ml de s6rum) de l'activit6 h6molytique du compl6ment de bovins activ6 selon la vole alterne ou classique et 6valu6e sur des 6rythrocytes d'espdces animales diff6rentes.
~OOO
I
2
3
4
5 n °
6
7
8
9
"10
bovins
Fig. 1. Activit~ h ~ m o l y t i q u e c o m p a r ~ e d u c o m p l ~ m e n t s~rique de b o v i n activ~ selon la voie a l t e r n e o u c l a s s i q u e utilisant p o u r cellules cibles des 6 r y t h r o c y t e s d e c o b a y e .
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1000
Voie clossique
E
~
Voie
alterne
-~ 5oo 0 tO I 0
2
3
4
5
6
n °
7
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9
10
bovins
Fig. 2. Activit~ h~molytique compar~e du compl~ment s~rique de bovin activ~ selon la voie alterne ou classique utilisant pour cellules cibles des ~rythrocytes de poulet. 1000
E
-E
500
0 tO
2
~
4
5
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n °
7
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"10
b o v i r]s
Fig. 3. Activit~ h~molytique compar6e du compl6ment s~rique de bovin activ~ selon la voie alterne ou classique utilisant pour cellules cibles des ~rythrocytes de mouton.
I000
E
5O0 0 tO I
I
2
3
4
5
6 n °
7
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bovins
Fig. 4. Activit~ h~molytique compar6e du compl~ment s~rique de bovin activ~ selon la voie alterne ou classique utilisant pour cellules cibles dans ~rythrocytes de lapin.
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DISCUSSION Les r6sultats de cette 6tude confirment sur deux points essentiels les donn6es acquises pr6cbdemment sur l'activit6 h6molytique du compl6ment serique des bovins: - - d ' u n e part, le compl6ment bovin r6pondant ~ une m6me voie d'activation pr6sente une activit6 cytolytique tr6s diff6rente sur les 6rythrocytes des 4 esp6ces animales &udi6es. Les observations de cette 6tude r6alis6es ~ partir d'un m~me 6chantillonnage de s6rums bovins dans quatre syst6mes h6molytiques diff6rents, nous conduisent ~ classer la sensibilit6 des 6rythrocytes choisis par ordre dbcroissant: EC, EP, EL, EM, comme Barta et Barta [13] l'avaient en partie d6montr6. Les valeurs moyennes des titres h¢molytiques que nous avons observbes sont conformes ~ celles pr6cedemment publibes pour le compl6ment de bovin adulte. Barta et Barta [14] situaient cette activit~ h6molytique entre 400 et 500 UCH50 sur les EC, la valeur que nous observons est de 585 + 102 UCH50. Renshaw et al., [16] estimaient h 172 + 2 8 UCH50 cette activit6 sur les EL, nous l'observons h 195___24 UCH50. La faible sensibilit6 du syst6me h6molytique standard EM-M est confirm6e ici puisque le titre h6molytique moyen observ6 est de 4 6 _ 18 UCH50. Un 616ment nouveau est apport6 dans cette 6rude par la mise en 6vidence de la bonne sensibilit6 des EP puisque le titre moyen est de 255 +_ 56 UCH50. ~ ' a u t r e part, cette 6tude confirme la dispersion des titres du compl6ment bovin analys6 dans un m6me syst6me hemolytique sur un lot homog6ne de bovins dont les crit~res d'homog~n~it~ retenus ont 6t6: l'fige, la race, le sexe, le mode d'61evage, l'&at physiopathologique. Cette variabilit6 avait +t6 signal6e d6s 1973 par Barta et Barta [14] chez les bovins adultes. Plus r6cemment, divers facteurs intervenant sur l'activit6 hbmolytique du compl6ment bovin ont 6t6 pr6cis6s. Renshaw et Everson [9] ont mis en 6vidence l'influence de l'fige, le titre moyen du compl6ment des veaux &ant de "3.71 + 1.49 fois plus faible" que leur m6re. Kakoma et Kinyangui [15] ont d6fini une variabilit6 li6e ~ la race et Woodward et al. [20] ont d6montr6 l'effet d6presseur d'une malnutrition sur le compl6ment. Enfin, des d6pl6tions du syst6me compl6mentaire sont bien d6crites au cours de diverses affections chez les bovins, d'origine bact6rienne ~i G r a m - - o u d'origine parasitaire [11, 21,22]. Le point important et original mis en bvidence dans cette 6tude porte sur la participation relative de l'h6molyse initi6e fi partir de la voie alterne dans l'activit6 immunoh6molytique mise en 6vidence dans chacun de ces syst6mes faisant intervenir les EM, les EC, les EL et les EP (Figs 1-4). La sensibilit6 diff6rentielle des 6rythrocytes de diffbrentes esp6ces et leur participation dans l'activation de la voie alterne d6pendent notamment de la proportion d'acide sialique entrant dans la constitution de la membrane 6rythrocytaire. Cette mol6cule contribuerait inhiber la fixation du C3b qui se forme en petite quantit6 spontan6ment et qui se fixe par une liaison thioester sur des r6cepteurs de la membrane 6rythrocytaire et constitue la premi6re phase de formation de la Ca convertase initiatrice d'une activation de la voie alterne [23]. Alors que les EL et les EC sont g6n6ralement utilis6s dans l'analyse de l'activit6 du compl6ment de bovin apr6s une activation par la voie classique, nos r6sultats mettent clairement en 6vidence l'importance de l'h6molyse associ6e gt une activation du compl6ment ind6pendante de la voie classique, dans ces deux syst6mes hemolytiques. Une d6faillance de la s6quence C~ C3 qui risque d'avoir des cons6quences graves dans les m6canismes de d6fense immunitaire sera difficilement appr6ciable dans ces syst6mes. Le syst6me h6mo-
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lytique faisant appel aux EP m o i n s sensibles h cette activation spontan6e de la voie alterne a p p o r t e r a i t u n outil de c o m p a r a i s o n plus fin dans u n m6me syst6me 6rythrocytaire. N 6 a n m o i n s , l'absence totale d ' a c t i v a t i o n de la voie alterne d u c o m p l 6 m e n t b o v i n par les globules rouges de m o u t o n n o u s a m i n e ~t privil6gier l'emploi de ces globules rouges darts l ' e x p l o r a t i o n de la s6quence C~-C9. La mise en 6vidence de l'activation de la voie alterne peut 6tre faite soit fi partir d'6rythrocytes c o l l a b o r a n t ~, l ' a c t i v a t i o n de cette voie c o m m e les EL, les EC, les EP, soit partir de l'analyse d u facteur B 6troitement associ6 fi la C3 convertase c o m m e l ' o n t fait P a n g et A s t o n [11] et Tabel [10]. L ' i m p o r t a n c e du r61e d u c o m p l 6 m e n t dans la d&ense de l ' o r g a n i s m e et la diversit~ des m6chanismes activateurs de ce syst~me par deux voies c o r r e s p o n d a n t h deux phases bien differentes de r6sistance aux agents pathog6nes, rend n6cessaire une m6thode d ' ~ v a l u a t i o n pr6cise de la voie impliqu6e. L ' a p p r 6 c i a t i o n de l'integrit6 fonctionnelle de ces deux voies est aussi n6cessaire et doit permettre la mise en 6vidence soit de d6ficit h6r6ditaire ou de d6ficience pathologique, soit de l'action sp6cifique d ' a g e n t s pathog6nes dirig6e contre un ou plusieurs facteurs de chacune des s6quences. U n e 6valuation pr6cise de l'activit~ du c o m p l 6 m e n t activ6 suivant chaque voie est u n outil indispensable p o u r approcher des diff+rents m6chanismes qui participent fi l ' i n f l a m m a t i o n dans les p h 6 n o m 6 n e s de d6fense de l ' o r g a n i s m e chez les bovin. Remerciements--Nous remercions Monsieur M. Etievant de l'Unit6 d'Immunoallergie de l'Institut Pasteur de Paris pour ses conseils et l'attention qu'il a port6 h cette +tude. Nous remerciements s'adressent 6galement fi Mme Villejoubert pour son excellente assistance technique.
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