Etude des hydrolases acides des canaux de Müller de l'embryon de Poulet

DEVELOPMENTAL

Etude

I. Activitks

BIOLOGY,

( 1962)

des hydrolases acides des canaux de I’embryon de Poulet totales et solubles des canaux de 8 & 10 iours d’incub’ationl DENISE

Laboratoire

5, 205-217

de Chimie

SCHEIB-PFLEGER

ET

Physiologique, Accept6

R.

Universite’

le 21 mars

de Miiller

d’embryons

WA~IAUX de Louvain,

Belgique

1962

INTRODUCTION

Les canaux de Miiller (CM) de l’embryon de Poulet mAle offrent un exemple remarquable de I’involution physiologique d’un organe au tours du dkveloppement normal : au 9” jour d’incubation ils entrent en regression et disparaissent en l’espace de 48 heures. Cette rkgression a dkjA fait l’objet de nombreuses recherches qui ont montrk qu’elle est d&clench&e par les hormones miles (Wolff, 1936) et qu’elle rksulte d’une intense autolyse enzymatique ( Scheib-Pfleger, 1956). Sous l’influence de stkroi‘des androgknes, on a pu reproduire in vitro l’involution du canal de Miiller indiflkencik maintenu en culture d’organes (Wolff et toll., 1952), de m&me que l’activation des propri&As cytolytiques de broyats de ces organes (Pfleger, 1952). Si ces recherches ont beaucoup contribuk B &lair& le mtkanisme de la rkgression, on pouvait cependant se demander par quel processus intime les hormones rkalisent ainsi une activation du systkme lysant de la cellule. Par quel phknomkne un organe en pleine prolifkration peut-il brusquement devenir l’auteur de sa propre destruction ? Existe-t-i1 dans les cellules du canal de Miiller un systkme lysant masquk, activa1 Ce travail r&&e de la collaboration entre le Laboratoire d’Embryologie expbrimentale du Coll&ge de France et du Centre National de la Recherche Scientifique A Paris (Directeur Et. Wolff) et le Laboratoire de Chimie Physiologique de la Facul& de M’Cdecine Z+ Louvain ( Directeur C. de Duve). 11 a 6th rendu possible grlce A l’attribution d’une bourse accordee ?I un des auteurs (D.S.P.) au titre des Achanges culturels. 205

206

SCIIEIB-PFLEGER

ET

WATTIAUX

bl e par les androgenes d&s que ceux-ci sont presents a un taux suffisant; ou, par contre, les hormones declenchent-elles une veritable synthese de facteurs lysants et destructeurs ? Les travaux de de Duve et de ses collaborateurs ont montre que dans le foie il existe des enzymes a l’ktat masque mais activables par certains traitements. En effet, de nombreuses hydrolases acides du foie sont sedimentables et appartiennent a une population de granules specifiques, ou lysosomes. L’activite de ces lysosomes ne se manifeste qu’apres rupture spontanee ou pro8voquee de leur membrane et libirration de leur contenu actif, qui devient ainsi accessible au substrat environnant (de Duve, 1959). Si on &end cette notion au canal de Miiller, on peut se demander si la regression ne fait pas intervenir un processus analogue, l’autolyse &ant alors like a une solubilisation rapide des hydrolases initialement confinees dans les lysomsomes. C’est effectivement ce qui paraQt se produire, selon les rksultats obtenus par Brachet et ~011. (1958), qui ont observe une solubilisation importante de trois hydrolases acides (phosphatase, ribonuclease et cathepsine) au tours de la regression des CM. Cependant, ces auteurs signalent egalement que l’activite de ces enzymes “augmente rapidement et fortement lors de la regression : l’accroissement est de 500 p. 100 pour la phosphatase acide, 200 p. 100 pour la cathepsine, 800 p. 100 pour la ribonuclkase” (p. 2045). Tels qu’ils sont d&its par les auteurs, ces resultats permettraient done de supposer que les deux mecanismes envisages ci-dessussolubilisation d’enzymes masques et apport nouveau ou neoformation d’enzymes lysants-interviennent simultanement. C’est afin de preciser cette question que nous avons entrepris une etude approfondie des proprietes enzymatiques des canaux de Miiller de l’embryon de Poulet. MATERIEL

ET

METHODES

Les experiences ont et& faites sur des CM provenant d’oeufs Leghorn blancs, fournis par un eleveur de la region de Louvain, et incubes a 38O C. Les embryons sont prkleves entre le 8” et le lo” jour d’incubation (stades 33 a 37 de Hamburger et Hamilton) et disseques dans du Tyrode. Les CM sont prklevks et immerges dans du saccharose 0,25 M d ace. A la fin du prelevement, on homogknkise les organes avec du saccharose 0.25 M, pendant 2 minutes a 1.000 t./min. dans un tube de Potter et Elvehjem (1936) conique avec piston en Teflon, le tout Ctant

HYDROLASES

ACIDES

DES

CASAUX

DE

MtiLLER

207

maintenu en permanence dans un bain de glace fondante. On transvase dans un tube tare et apres 3 rinqages avec la solution sucree, on Porte a volume par peske (10 CM/ml). On mesure sur l’homogenat ainsi obtenu la teneur en protkines et les activites enzymatiques totales, celles-ci pouvant done etre rapport&es so’it au nombre d’organes utilisb pour le test (activites absolues), soit au taux de proteines (activites specifiques ) . Afin d’apprecier le degre de liaison des hydrolases acides a des particules cytoplasmiques, nous avons effect& les mdmes determinations sur la fraction surnageante et sur le culot obtenus a partir de I’homogenat par une centrifugation de 30 minutes a 125.000 g (Spinco modele L, rotor SW 39). Comme l’a fait remarquer de Duve (1959), cette technique conduit a une sous-estimation, variable d’apres les enzymes, de la proportion de l’activite enzymatique se trouvant rkellement a l’etat libre dans l’homogenat, puisqu’elle fait attribuer a des particules intactes les molecules d’enzyme retenues par adsorption aux constituants du culot. C’etait, cependant, la seule technique applicable aux petites quantites de materiel disponibles. Pour le dosage des hydrolases acides, nous avons utilise une variante des methodes d&rites par Wattiaux et de Duve (1956). On opere essentiellement comme le recommandent ces auteurs, mais en presence de Merthiolate de sodium a 0,018 comme antiseptique et en prolongeant l’incubation durant 16 heures. Nous avons verifie que les activites mesurees dans ces conditions sur notre materiel sont proportionnelles au temps d’incubation entre 4 heures et 16 heures, et B la concentration en enzyme. En moyenne, il faut 2 a 3 CM par test pour la phosphatase acide, la /3-glucuronidase et la cathepsine, et 5 CM pour la ribonuclease acide. Les resultats des determinations enzymatiques ont et8 exprimes en unites (de Duve et toll., 1955), c’est-a-dire en pmoles de phosphate inorganique ( phosphatase ) , de phenolphtaleine (,R-glucuronidase) , d’equivalents de tyrosine (cathepsine) ou de mononucleotides (ribonuclkase ) lib&&es par minute. Les proteines ont ktC dosees par la methode de Lowry et ~011. (1951)) avec de la serum-albumine comme &talon. RESULTATS

Activite’s

totales

Les chiffres consign& au Tableau 1 montrent que chez Tembryon male, la teneur en proteines des CM subit entre le 8” et le lo” jour une

Aac

0 Pase

= phosphatase

IX XV

10

84

XVII

66 72

90 76

86 84

XII XI

IV XIII

74 82

de citnaux

Nombre

acide;

EXZYMATIQCES~

VIII X

S&k

9

8

(jours)

ACTIJT~&

p-Gase

35,0 -

33,2 21,7

28,5

23,8 23,0

26,8 23,7

1

Cat.

= cathepsine;

177 173

170

164

Cat.

RNase

13,8

11,8

RNase

DE L'EMBRYON

absolue (rU/csnal)

TABLEAU DE MILLER

@-GaSe

Activith

CANAL

= /%glucuronidase;

308 305

828 10,l

335 267

290

210

320 267

Pase

DIJ

13,7 10,7

15,P

14,8 15,2

13,7 16,6

I’rot6ines (idcanal)

TOTALES

= ribonuclease

35,0 30,2

24,5 25,0

18,4

13,8

23,4 16,l

PZ%se

Activith

DE POULET

acide.

3,98 -

2,42 2,03

1,80

1,61 1,51

1,96 1,43

@-GW

spkifique

MOLE

20,l 17,l

15,9

10,4

-

cat.

(pU/~p

prot)

4 % =I _.-

--

1,29

z

B

4 pd 2 F;

x

0,75

-

-

RNase

u Pam

10

Y

8

Age (jours)

= phosphatase

acide;

@-Gase

D+G

IX xv xv

IV

Droit Gauche

Gauche Gauche Droit

90

XIII XIII

D +G.

DU

35,5 27,7 26,7

34,8

24,6

22,2 24,2

14,8

17,2 17,o 16,2 16,2 16,O

Prot6ines k/cansl)

TOTALES

= p-glucuronidase;

41 48 48

41

56 56

XI

Droit Droit Gauche Droit Gauche

IX

100

VIII X X XVII XVII

Droit

74 53 53 56 56

66ric

c&e

ENZYMATIQIJES~ Nombre de canltux

ACTIVITOS

Cat.

620 466 485

607

423

360 375

255

268 328 302 250 250

Pase

2

= cathepsine;

89,2 --

X2,0

51,2

42,5 43,9

31,5

23,8 30,2 28,7 26,2

@-GaSe

absolue

MUELLER

Activith

DE

TABLEAU CANAL

263 216 211

249

-

RNase

184 201

-

134 129

cat.

--

-

-

DE

17,4 16,8 18,2

17,5

17,2

16,2 15,5

17,2

15,6 19,3 18,6 15,4 15,6

Pase

Activit6

POULET

= ribonuclease

17,9 27,6

2

-13,Y 23 1

RNase

L’EMBRYON

(rU/oanal)

DE

acide.

2,51 --

2,36

2,08

1,92 I ,81

2,13

1,38 1,78 1,77 1,64

&Gase

sphifique

FEMELLB

7,4 7,8 7,9

7,2

-

8,3 8,:~

-

-8,3 8,l

cat.

(pU/Fg

--

-

0,80 1,13

s

1:

F3

2

is (I) n 5

$ G !2 0,86 1,44 -

5

$

g

3

m

-

RNase

prot)

210

SCHEIB-PFLEGER

ET

WATTIAUX

reduction importante, temoin de la regression de ces organes, tandis que les activites absolues des hydrolases acides ne se modifient pas sensiblement. En consequence, les activitks specifiques de ces enzymes augmentent progressivement, atteignant au lo’ jour pres du double de leur valeur initiale. Comme le montre le Tableau 2, la situation est initialement la m&me chez l’embryon femelle, mais elle evolue differemment. La continuation de la croissance des deux canaux se traduit par une augmentation progressive et a peu p&s parallele de la teneur en prot’eines et des activites enzymatiques absolues, avec des modifications nulles ou faibles des activitks spkcifiques. On remarque que jusqu’au 10” jour, aucune difference ne se manifeste entre les proprietes biochimiques des canaux droits et gauches, sauf peut-etre en ce qui concerne la ribonuclkase acide, qui parait plus abondante dans le CM gauche. ACTIVITE NON SEDIMENTABLE % DE L’ACTIVITE TOTALE 60

J’DROIT

I

PHOSPHATASE

1

O-GLUCURONIDASE

+ GAUCHE

I

ACIDE

CATHEPSINE

50

ii

RIBONUCLEASE

r

40

9

DROIT

t

9

J.

ACIDE

IO J.

Q

6

J.

GAUCHE

9 J.

IO

J.

8 J.

des hydrolases acides dans les CM de l’embryon FIG. 1. Solubilisation Poulet male entre le 8’ et le 10’ jour d’incubation. Absence de solubilisation ces enzymes dans les CM de l’embryon femelle.

de de

HYDROLASES

Activitb

ACIDES

DES

CANAUX

DE

MiiLLER

211

non se’dimentables

Nous avons represent6 a la Fig. 1 les resultats des mesures effect&es sur les fractions surnageantes (series XI, XII, XIII, XV et XVII), exprimks en :%des valeurs d’activite totale obtenues sur les homogenats Dans ces experiences, la &cup&ration des activites correspondants. enzymatiques dans le surnageant et le culot a varie entre 81 et 108% avec une moyenne de 95%. Les resultats n’auraient done pas et6 significativement differents si on les avait exprimes en % de la somme des activites mesurees sur les deux fractions. On remarque que la repartition des enzymes est essentiellement la m&me au 8” jour chez les embryons males et femelles et se maintient inchangee jusqu’au 10” jour dans les deux canaux de l’embryon femelle. Au contraire, la regression des canaux males s’accompagne dune solubilisation importante des quatre hydrolases etudiees. DISCUSSION

Nous n’insisterons pas sur les donnees biochimiques obtenues sur les CM femelles, celles-ci indiquant simplement une augmentation a peu p&s parallel e d es proteines totales et des diverses activites enzymatiques, en rapport avec la croissance de ces organes. Nos observations ont et6 interrompues trop tot pour qu’apparaissent les differences decrites par Brachet et ~011. (195S), et qui se manifestent a partir du 11” jour. Signalons cependant que le CM gauche parait nettement plus riche en ribonuclease que le droit, ce dernier ayant essentiellement la m&me activite que les deux CM males. Cette difference pourrait, si elle se verifie, etre lice a la destinee particuliere du CM femelle gauche, qui est le seul a poursuivre son dkveloppement, pour donner naissance a l’oviducte. Pour ce qui est des CM males, dont la regression dkbute le ge jour, il convient d’examiner skparkment les activites enzymatiques totales et leur repartition entre culot et surnageant. Activite’s

enzymutiques

totales

Celles-ci conservent dans les CM en regression une valeur sensiblement egale a celle qu’elles avaient avant le declenchement du phenom&e. Par suite de la fonte proteique dont les organes sont le siege, l’activitd specifique des hydrolases acides augmente progressivement et atteint au lo” jour le double de sa valeur au 8r jour.

212

SCHEIB-PFLEGER

ET

WATTIAIJX

Des observations similaires ont et& effect&es sur dautres organes en voie d’autolyse physiologique ou pathologique, notamment sur la queue du tbtard de Xenopus laevis en metamorphose ( Weber, 1957a,b; Weber et Niehus, 1961) , sur le foie de Rats rendus comateux par un jeune prolong& ou un regime hepatotoxique (Beaufay et toll., 1959) et sur le thymus de Rats trait& a l’hydrocortisone (Sachs et toll., 1962). Fait caracteristique, dans ces trois cas, comme dans celui qui nous occupe, les activites totales par organe restent pratiquement constantes, et ce malgre une perte proteique qui peut atteindre, pour la queue du tetard, plus de 95% du taux initial, avec augmentation de plus de 20 fois de l’activite specifique des hydrolases acides. Comme le font remarquer Weber et Niehus ( 1961), on pourrait, a la rigueur, interpreter ces faits en supposant que les hydrolases acides propres des organes disparaissent au m&me rythme que les autres proteines, mais sont remplacees par un apport nouveau equivalent, par exemple par des leucocytes ou des macrophages qui viendraient coloniser les organes en voie de resorption. Pour etre acceptable, cette explication devrait pouvoir s’appliquer a tous les enzymes et organes etudies et elle implique alors un ensemble de comcidences qui la rendent tres peu vraisemblable. Aussi semble-t-i1 plus raisonnable d’admettre que les hydrolases acides echappent tout simplement a la fonte proteique genitralisee et sont ainsi conservkes et progressivement concentrees dans les organes en regression. C’est la, evidemment, ce qu’on devrait attendre si ces enzymes sont des agents de I’autolyse tissulaire. Notons encore que nos resultats ne contredisent pas ceux de Brachet et ~011. (1958) cites au debut de ce travail, car les augmentations d’activite mention&es par ces auteurs concernent les activitks specifiques des enzymes hydrolysants (communication personnelle des auteurs ) . Leurs chiffres depassent cependant nettement ceux que nous rapportons et, de plus, indiquent un taux de concentration different pour les trois enzymes qu’ils ont ktudies. 11 est probable que leurs observations concernent un stade plus avance de la regression, se caracterisant notamment soit par une perte partielle de certains enzymes, soit par un envahissement leucocytaire tardif, venant modifier le spectre des actions enzymatiques. Rkpartition

des activitds

enzymatiques

Outre leur conservation elective, les hydrolases acides du CM en r&gression presentent un changement caractkristique de leur rkparti-

HYDROLASES

ACIDES

DES

CANAUX

DE

MiiLLER

213

tion entre les fractions cellulaires isol&es par centrifugation B partir des Une proportion nettement plus grande des organes homog&is&. activitits se retrouve dans la fraction surnageante, tandis que la fraction skdimentable subit une perte hquivalente. Ces r&ultats sont en parfait accord avec ceux de Brachet et ~011. (1958) et les &endent B un nouvel enzyme, la ,&glucuronidase. La m&me modification de r&partition des hydrolases acides a encore &t& observCe sur des CM droits d’embryons de Poulet femelles, aprirs le 11’ jour d’incubation (Brachet et toll., 1958), sur des organes rendus ischkmiques par ligature du pkdicule vasculaire, foie (de Duve et Beaufay, 1959) et rein (Franklin, 1962) du Rat, sur le foie de Rats soumis a des traitements hkpatotoxiques (Beaufay et toll., 1959) et sur le thymus en involution sous l’influence de l’hydrocortisone (Sachs et toll., 1962). Ici encore, l’interpr6tation reste hquivoque, car la solubilisation des enzymes a &t& mise en kvidence sur des homogknats et pourrait s’&re produite au tours du broyage du tissu et non dans les cellules elles-m&mes. Plaide cependant contre cette possibilit& le fait qu’on a pu observer dans certains cas la diffusion d’une hydrolase acide hors de cellules intactes en souffrance, notamment celle de la phosphatase acide dans le milieu d’incubation a partir de tranches de foie anoxiques (de Duve et Beaufay, 1959) et celle de la ,&glucuronidase dans le sang perfusant aux d&pens de foie perfusk sans oxyg&ne (Mason et toll., 1959). Certaines observations que nous avons effectukes sur des CM rkgressant en culture d’organes suggkrent 6galement une diffusion d’enzymes lytiques. Enfin, on peut rapprocher des r&&tats citBs les observations de Dingle et ~011. (1961) et Lucy et ~011. ( 1961), montrant que des doses toxiques de vitamine A, ajout&es a des kbauches cartilagineuses d’embryon de Poulet cultivkes “in vitro,” y provoquent des l&ions marquCes de la matrice extracellulaire, explicables par la liberation de cathepsine et peut-6tre d’autres enzymes lytiques dans les espaces extracellulaires. La vitamine A, ajoutke a des prkparations de lysosomes de foie de Rat, favorise la lyse de ces granules (Dingle, 1961; de Duve et toll., 1962). Devant ces divers faits, nous crayons avec Brachet et ~011. (1958) pouvoir interprkter les &partitions enzymatiques observkes sur les homog&nats de CM intacts et en rkgression comme indiquant que les hydrolases acides de cet organe sont normalement confinkes dans des granules cytoplasmiques du groupe des lysosomes et qu’elles sont lib&&es g partir de ces granules au tours de la &gression. Ce dernier ph&om&ne rendrait les constituants cellulaires accessibles B I’action

214

SCHEIB-PFLEGER

ET

WATTIAUX

lytique des hydrolases et jouerait ainsi un role determinant dans le ddclenchement des processus autolytiques. On peut cependant se demander si cette rupture des lysosomes est une cause ou une consequence de la mort cellulaire. A premiere vue, la regression des CM paraissait se preter particulibrement bien a l’etude de cette question, etant don& qu’on avait pu demontrer une augmentation de l’activite cytolytique de broyats de ces organes sous l’influence d’androgenes ajoutes in vitro (Pfleger, 1952). I1 semble cependant peu vraisemblable, &ant donnk les conditions dans lesquelles cet effet a et& demontre, qu’il puisse s’expliquer simplement par une action des androgbnes sur la membrane des lysosomes. Jusqu’a present, toutes les tentatives que nous avons faites pour mettre en evidence une telle action ont d’ailleurs donnk des resultats nkgatifs. RESUME 1. On a mesure le taux de proteines et les activites totales de la phosphatase acide, de la cathepsine, de la ,&glucuronidase et de la ribonuclease acide dans des homogenats de canaux de Miiller d’embryons de Poulet miles et femelles, entre le 8” et le 101” jour d’incubation. On a egalement ktudi’e la repartition des hydrolases entre les fractions skdimentable et surnageante, isolees a partir de ces homog&-rats par centrifugation a haute vitesse. 2. Dans les deux canaux de Miiller de l’embryon femelle, le taux de proteines et les .activit& enzymatiques croissent parallelement au tours Les quatre hydrolases se retrouvent dans de la periode d’observation. le culot a raison de 70 a 99% et cette repartition reste inchangee du 8” au lo” jour. 3. Dans les canaux de Muller de l’embryon male de 8 jours, la situation est identique a celle observee chez l’embryon femelle du m&me Bge. A partir du 9’ jour, on constate une fonte proteique progressive, temoin de la regression de ces organes. Les hydrolases etudiees maintiennent leur activite initiale et subissent de ce fait une concentration progressive (augmentation de l’activite specifique) . En m&me temps, elles passent partiellement dans la fraction surnageante qui contient au 10” jour, environ la moitik de l’activitk totale de ces enzymes. 4. Ces rksultats sont interpret& comme indiquant que les hydrolases acides du canal de Miiller sont normalement confinees dans des Iysosomes et sont lib&es a part? de ces granules au debut de la

HYDROLASES

ACIDES

regression. Elles deviendraient qui caracterise ce phenomene.

DES

ainsi

CANAUX

DE

les agents

MiiLLER

de l’autolyse

215 massive

SUMMARY

1. Homogenates of Miillerian ducts removed from male and female chick embryos between the 8th and 10th day of incubation have been analyzed for protein and for total acid phosphatase, cathepsin, /3-glucuronidase, and acid ribonuclease activities. The distribution of these enzymes between the sediment and supernatant separated from the homogenates by high-speed centrifugation has also been studied. 2. In the two Miillerian ducts from female embryos, the protein level and the enzymatic activities increase at approximately the same rate during the observation period. Between 70 and 90% of the four hydrolases are recovered in the high-speed sediment, and this distribution remains unchanged between the 8th and 10th day. 3. In the Miillerian ducts from S-day-old male embryos, the situation is identical with that found in female embryos of the same age. AS regression starts on the 9th day, there occurs a gradual loss of protein, while the hydrolases studied maintain their initial activity and become thus progressively concentrated (increase in specific activity). At the same time, they are partially transferred to the supernatant fraction, where they are found on the 10th day to the extent of about half their to’tal activity. 4. These results are interpreted as indicating that the acid hydrolases of Miillerian ducts are normally segregated within lysosomes and are released from these particles when regression is initiated. They would thus become the agents of the massive autolysis characteristic of this phenomenon. REMERCIEMENTS

Ce travail a 6th effectuk B I’aide de subsides de la Fondation Rockefeller, des National Institutes of Health, United States Public Health Service (RG-8705) et de la S. A. RIT, Genval. BIBLIOGRAPHIE H., VAN CAMPENHOUT, E., et DE DIJVE, C. (1959). Tissue fractionation studies. 11. Influence of various hepatotoxic treatments on the state of some bound enzymes in rat liver. Rio&em. J. 73, 617-623. BRACHET, J., DECROLY-BRIERS, M., et HOYEZ, J. ( 1958). Contribution & l’ktude des BEAUFAY,

216 lysosomes 2039-2048.

SCHEJB-PFLECER

au cours

du

developpement

ET

WATTIAUX

embryonnaire.

Bull.

sot.

chim.

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