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Évaluation analytique du dosage de la vitamine B12 et des folates sur Immulite 2000
Immuno-analyse & Biologie spécialisée 1 (2002) 40–47
Techniques au quotidien
Évaluation analytique du dosage de la vitamine B12 et des folates sur Immulite 2000 Analytical evaluation of assays in vitamine B12 and folates on Immulite 2000 Analyzer A. Colombier 1, A. Duflo-Leroy 1,*, J.P. Basuyau 2, A. Lavoinne 1 1
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Laboratoire de biochimie, hôpital Charles Nicolle, 76031 Rouen cedex, France Laboratoire de biologie clinique, centre Henri Becquerel, 76038 Rouen cedex 01, France Reçu le 12 septembre 2001; accepté le 15 novembre 2001
Résumé Les performances analytiques des techniques de dosage de la vitamine B12 et des folates ont été évaluées sur l’analyseur Immulite 2000 (société DPC). Les résultats obtenus démontrent la bonne performance de ces nouvelles techniques de dosage par compétition immunologique en phase solide, tant dans le domaine de la sensibilité que de la linéarité. La comparaison avec les résultats obtenus par les techniques radio-immunologiques antérieurement utilisées montre une très bonne corrélation à la fois pour les dosages de la vitamine B12 et pour ceux des folates plasmatiques. De plus, ces techniques automatisées sont bien adaptées à leur utilisation en routine dans le diagnostic des déficits vitaminiques. © 2002 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. All rights reserved. Abstract The analytical evaluation of assays for vitamin B12 and folates has been performed on DPC’s Immulite 2000 analyzer. The results demonstrated the good performances of this new solid-phase chemiluminesent competitive binding assay. The comparison of the results obtained on Immulite with those obtained using radioimmunoassays revealed a good correlation both for vitamin B12 and plasma folates. These automated techniques may be routinely used in the diagnosis of vitamin deficiency. © 2002 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. All rights reserved. Mots clés: Vitamine B12; Folates plasmatiques; Folates érythrocytaires; Immulite 2000 Keywords: Vitamin B12; Plasma folates; Erythrocyte folates; Immulite 2000
La vitamine B12 et l’acide folique (vitamine B9) sont des nutriments indispensables à l’hématopoïèse et à la synthèse des acides nucléiques. Un déficit en vitamine B12 et/ou en folates peut être responsable d’une anémie macrocytaire caractérisée par une maturation anormale des globules rouges. Le déficit en acide folique est le déficit vitaminique le plus fréquemment rencontré, en particulier dans les
* Auteur correspondant. E-mail address: [email protected] (A. Duflo-Leroy). © 2002 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. All rights reserved. PII: S 0 9 2 3 - 2 5 3 2 ( 0 2 ) 0 1 1 6 5 - 1
syndromes de malnutrition et de malabsorption ; il est alors souvent associé à un déficit en vitamine B12. Ces déficits peuvent entraîner une modification du métabolisme conduisant à une hyperhomocystéinémie qui constitue un facteur de risque d’athérosclérose. Bien que l’homocystéine et l’acide méthylmalonique soient de très bons marqueurs de tels déficits au niveau tissulaire [2,8], les dosages sanguins de la vitamine B12 et de l’acide folique sont les examens les plus couramment prescrits dans le diagnostic d’une carence vitaminique. Le développement de techniques immunologiques « froides » a largement contribué à cette stratégie diagnostique.
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Après un rappel sur les principales méthodologies proposées, nous rapportons dans ce travail l’évaluation des trousses commercialisées par la Société DPC sur l’Immulite 2000 et leur comparaison avec des méthodes radioimmunologiques.
. Matériel et méthodes Tous les patients inclus dans ce travail avaient une demande de dosages de vitamine B12 et de folates par les services cliniques. L’étude des performances analytiques de la technique a été réalisée sur des échantillons sanguins prélevés sur tube hépariné, qu’il s’agisse de la vitamine B12 ou des folates. Les plasmas obtenus par centrifugation du sang à 2 000 g pendant 15 minutes ont été congelés et stockés à – 20 °C pendant 8 jours maximum après les prélèvements. Les folates érythrocytaires ont été dosés sur des hémolysats de sang total obtenus après dilution manuelle au 1/5 des échantillons de sang total dans une solution fraîchement préparée d’acide ascorbique à 1 %. Les hémolysats ont été laissés pendant environ une heure à la température ambiante et à l’obscurité afin de permettre à la conjugase sérique de cliver les polyglutamates, forme essentiellement présente dans les globules rouges, en monoglutamates, seule forme de folate dosable dans la plupart des techniques analytiques utilisées [6] (Fig. 1). Les concentrations érythrocytaires ont été corrigées en utilisant la formule suivante : concentration mesurée × 100 / hématocrite mesuré. Les corrélations entre les techniques Immulite (société DPC) et les techniques radioimmunologiques ont été effectuées sur des échantillons prélevés sur tube EDTA, type de prélèvement recommandé dans les techniques de dosage effectuées en routine au Centre Henri Becquerel. Les dosages radioimmunologiques ont été réalisés avec les trousses SimulTRAC-SNB (ICN Pharmaceuticals) permettant le dosage simultané des deux vitamines, les traceurs utilisés étaient le cobalt 57 pour la vitamine B12 et l’iode 125 pour les folates.
Fig. 1. Structure chimique de l’acide folique et de ses dérivés.
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. Principe des méthodes de dosage de la vitamine B12 et des folates . Vitamine B12 La vitamine B12 possède une structure tétrapyrrolique entourant un atome central de cobalt. Différents ligands peuvent être associés à l’atome de cobalt conduisant à des formes différentes de cobalamines dont la vitamine B12. La vitamine B12 englobe elle-même plusieurs formes circulantes avec pour forme prédominante dans le sérum la méthylcobalamine [1]. Les premières techniques de dosage utilisées étaient des techniques microbiologiques (souche Lactobacillus leishmanii). Elles sont actuellement abandonnées en raison de leur longueur au profit de techniques immunologiques par compétition plus rapides et souvent automatisées, qu’il s’agisse de techniques radio-immunologiques ou de techniques « froides ». L’absorption intestinale de la vitamine B12 au niveau de l’iléon distal nécessitant la présence du facteur intrinsèque, glycoprotéine secrétée par les cellules pariétales de l’estomac, cette propriété de liaison entre la vitamine et le facteur intrinsèque est à la base des différents dosages immunologiques de cette vitamine. De plus, ce dosage nécessite un prétraitement afin de transformer les différentes formes présentes en cyanocobalamine. Les techniques radioimmunologiques sont fondées sur la compétition entre la cobalamine présente dans l’échantillon et un traceur isotopique vis à vis de ce facteur intrinsèque ; le traceur le plus utilisé est la cobalamine marquée par le cobalt 57. Plusieurs trousses sont actuellement disponibles [3,6,10,13] différant essentiellement par leur procédure de prétraitement : chaleur en milieu acide [13] ou température ambiante en milieu alcalin (3, trousse SimulTRAC-SNB). S’agissant de techniques par compétition, la quantité de radioactivité mesurée est inversement proportionnelle à la quantité de vitamine présente dans l’échantillon. Les techniques « froides » reposent aussi sur le principe de compétition mais utilisent comme traceur un enzyme, le plus souvent la β-galactosidase ou la phosphatase alcaline. Les techniques actuellement les plus utilisées sont la technique CEDIA, la technique MEIA et la technique récemment développée sur Immulite 2000. La technique CEDIA pour Combinant Enzyme Donor Immuno Assay est une méthode immunoenzymatique en phase homogène fondée sur l’utilisation de fragments enzymatiques recombinants. Pour préparer la β-galactosidase, deux gènes sont surexprimés permettant de synthétiser deux fragments polypeptidiques distincts : un fragment donneur d’enzyme et un fragment accepteur d’enzyme ; ces deux fragments peuvent spontanément se recombiner pour constituer la forme active de l’enzyme. La β-galactosidase est utilisée en raison de la grande variété des substrats disponibles et de son interférence négligeable avec les échantillons biologiques. Des ligands tels que la vitamine B12 peuvent être attachés sur le peptide donneur d’enzyme ; le degré de recombinaison est
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mesuré par fixation d’anticorps anti-ligand sur le conjugué enzyme donneur-ligand. La technologie CEDIA est donc fondée sur la compétition entre le ligand présent dans l’échantillon et le conjugué enzyme donneur-ligand vis-àvis des sites de fixation spécifique de l’anticorps. La liaison de la vitamine B12 sur le facteur intrinsèque de porc inhibe la recombinaison des fragments donneur et accepteur de l’enzyme. La courbe dose-réponse obtenue est linéaire et l’activité enzymatique mesurée est, dans ce cas, proportionnelle à la quantité de vitamine présente dans l’échantillon [5,7]. La technique MEIA pour Microparticular Enzyme Immuno Assay est fondée sur la fixation du facteur intrinsèque sur des microparticules. Dans un deuxième temps, un conjugué vitamine B12-phosphatase alcaline est ajouté, et la révélation effectuée. L’activité enzymatique est inversement proportionnelle à la concentration de vitamine B12 présente dans l’échantillon [12]. La technique automatisée sur l’analyseur Immulite 2000 est une technique par compétition en phase solide avec une révélation par chimiluminescence. Cette technique se déroule en deux étapes. La première étape consiste à séparer la vitamine B12 de ses protéines « acceptrices » et à transformer la vitamine B12 en cyanocobalamine au cours d’un cycle automatisé de 60 minutes à 37 °C par prétraitement de l’échantillon en milieu alcalin, en présence de dithiothréitol et de cyanure de potassium. La seconde étape correspond au dosage immunologique par compétition proprement dit. Ce principe est résumé dans la Fig. 2. Brièvement, l’échantillon prétraité est transféré dans un godet réactionnel contenant une bille de polystyrène recouverte de vitamine B12 ; il est alors mis en présence de facteur intrinsèque de porc purifié (HIF) et d’un anticorps monoclonal anti-facteur intrinsèque de porc marqué par la phosphatase alcaline (phase I). La réaction immunologique est réalisée au cours d’un cycle d’incubation de 60 minutes à 37 °C (phase II) pendant lequel la vitamine B12 présente dans l’échantillon entre en compétition avec la vitamine B12 fixée sur la bille pour se lier avec le facteur intrinsèque de porc purifié (HIF). L’anticorps anti-facteur intrinsèque marqué par la phosphatase alcaline va se fixer à la fois sur le facteur intrinsèque fixé sur la vitamine B12 présente dans l’échantillon et sur celui lié à la vitamine B12 qui recouvre la bille de polystyrène. Un lavage par centrifugation axiale permet de séparer les formes libre (non fixée sur la bille) et liée (fixée sur la bille). Le substrat chimiluminescent est alors ajouté. La quantité de lumière émise est donc inversement proportionnelle à la concentration de vitamine B12 présente dans l’échantillon. . Folates L’acide folique ou acide ptéroylmonoglutamique possède un noyau ptéridine relié à l’acide paraaminobenzoïque et à l’acide glutamique. Les formes réduites de cette molécule sont le dihydrofolate et le tétrahydrofolate. Le terme de folates englobe les différents dérivés du tétrahy-
drofolate [14]. Comme pour la vitamine B12, les premières techniques utilisées étaient des techniques microbiologiques (souche Lactobacillus casei). Ces techniques dosent toutes les formes d’acide folique mais ne peuvent pas être utilisées chez les malades traités par les médicaments antifoliques. Elles sont maintenant complètement abandonnées au profit des techniques immunologiques par compétition. Des formes multiples de folates sont présentes dans le sérum humain, la forme majoritaire étant le méthyltétrahydrofolate. Seule la chromatographie permet la séparation des différentes formes. Les techniques immunologiques par compétition reconnaissent l’ensemble de ces différentes formes. Les techniques radioimmunologiques sont fondées sur la compétition entre les folates présents dans l’échantillon et un traceur isotopique vis-à-vis d’une protéine porteuse ; le traceur le plus utilisé est l’acide folique marqué à l’iode 125 [3,6,13]. Les techniques « froides » reposent aussi sur la compétition vis-à-vis de protéines porteuses ; les plus utilisées sont la technique CEDIA (13) (voir vitamine B12), la technique MEIA [9] (voir vitamine B12), la technique par capture d’ions (IC) [12], la technique par Elisa [4] et la technique récemment développée sur l’Immulite 2000 [11]. Dans la technique par capture d’ions (IC) [12], le folate est marqué par un réactif soluble possédant une affinité pour les polyanions. Les complexes formés avec le folate sont donc chargés négativement et sont capturés par des interactions électrostatiques sur la matrice solide qui est chargée positivement. La détection se fait par la mesure de l’activité du traceur enzymatique (phosphatase alcaline) qui est couplé à un dérivé ou à un analogue du composé à doser [12]. Comme pour la vitamine B12, la technique développée par DPC sur l’Immulite 2000 nécessite deux étapes. La première étape consiste en un prétraitement chimique de l’échantillon (plasma pour les folates plasmatiques, hémolysat de sang total pour les folates globulaires) en milieu alcalin afin de libérer les folates de leurs protéines porteuses ; cette première étape est réalisée au cours de deux cycles de 30 minutes. La seconde étape correspond au dosage immunologique par compétition proprement dit. Ce principe est résumé dans la Fig. 3. Elle nécessite deux cycles : un premier cycle de compétition immunologique (30 minutes) et un deuxième cycle de révélation (30 minutes). Brièvement, l’échantillon prétraité est transféré dans un godet réactionnel contenant une bille recouverte d’un anticorps monoclonal murin dirigé contre la protéine porteuse du folate (FBP) en présence d’acide folique marqué par un « ligand » (phase I). L’acide folique présent dans l’échantillon entre en compétition avec l’acide folique marqué par le « ligand » pour se lier sur la protéine porteuse (phase II). Après lavage, l’anti-« ligand» marqué par la phosphatase alcaline est ajouté (phase III) ; il se fixe sur le folate marqué par le « ligand » , folate qui a été fixé sur la bille pendant la première incubation. Après lavage comme pour la vitamine B12, le substrat chimiluminescent
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Fig. 2. Principe de l’immunodosage de la vitamine B12 sur l’Immulite 2000. Phase I : mise en présence de l’ensemble des différents réactifs. Phase II : incubation avec formation des complexes antigène-anticorps, séparation par lavage et révélation.
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Fig. 3. Principe de l’immunodosage des folates sur l’Immulite 2000. Phase I : mise en présence des différents réactifs. Phase II : incubation avec formation des complexes antigène-anticorps, séparation par lavage. Phase III : addition de l’antiligand marqué par la phosphatase alcaline, incubation, lavage et révélation.
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Tableau 1 Etude de la répétabilité et de la reproductibilité du dosage de la vitamine B12 Pool
Bas
Elevé
Répétabilité (n = 10) Moyenne (pmol/L) Ecart type Coefficients de variation (%) Valeurs extrêmes
193,6 20,0 10,3 169-227
676,6 21,1 3,1 637-713
183,3 12,6 6,9 170-202
657,3 29,4 4,5 603-690
Reproductibilité (n = 10) Moyenne (pmol/L) Ecart type Coefficients de variation (%) Valeurs extrêmes .
est ajouté. La quantité de lumière émise est inversement proportionnelle à la concentration en folates présente dans l’échantillon.
. Performances des techniques de dosage de la vitamine B12 et des folates sur l’Immulite 2000 La répétabilité et la reproductibilité ont été mesurées sur deux pools à différentes concentrations, pools préparés à partir de prélèvements effectués chez des patients admis dans notre hôpital. La répétabilité a été mesurée en effectuant les dosages de chaque pool dix fois de suite dans la même série ; la reproductibilité a été mesurée en effectuant deux dosages quotidiens de chacun des deux pools pendant cinq jours consécutifs. Les résultats obtenus montrent des performances satisfaisantes aussi bien pour la vitamine B12 (Tableau 1) que pour les folates, qu’il s’agisse des folates plasmatiques ou des folates érythrocytaires (Tableau 2). Ainsi, les coefficients de variation obtenus pour la vitamine B12 sont compris entre 3,1 % (pool élevé) et 10,3 % (pool bas). De même, les coefficients de variation sont compris entre 3,8 % et 6,2 % pour les folates plasmatiques, et entre 2,7 % et 11,1 % pour les folates érythrocytaires. La limite de détection de ces techniques a été déterminée par dilutions successives au ½, dans le diluant de la trousse, d’un plasma à 300 pmol/L pour la vitamine B12 et à 3 nmol/L pour les folates plasmatiques. La concentration
Fig. 4. Étude de la linéarité du dosage de la vitamine B12.
minimale détectable, définie par la valeur moyenne ± 3 DS, est de 35 pmol/L pour la vitamine B12 et de 0,60 nmol/L pour les folates. Ces valeurs sont très proches de celles données par le fabricant aussi bien pour la vitamine B12 (37 pmol/L) que pour les folates (0,68 nmol/L). La linéarité de ces techniques a été testée par dilution d’un plasma de patient dans le diluant de la trousse. Pour la vitamine B12, nous trouvons une bonne linéarité jusqu’à une valeur de 700 pmol/L comme le montre la Fig. 4. De plus, l’équation de la droite de régression obtenue (y = 694 x + 37, r = 0,992) montre, qu’en l’absence de vitamine B12 détectable (x = 0), l’ordonnée à l’origine est du même ordre de grandeur que la concentration minimale détectable. Pour les folates, nous trouvons une bonne linéarité jusqu’à une valeur de 50 nmol/L comme le montre la Fig. 5. Cependant, contrairement au dosage de la vitamine B12, l’équation de la droite de régression obtenue (y = 48,2 x + 4,2, r = 0,994) montre que l’ordonnée à l’origine correspond à une valeur supérieure à la concentration minimale détectable (0,60 nmol/L) ; cependant, ceci ne remet aucunement en cause les qualités de la trousse pour les dosages de routine. Enfin, dans une dernière approche, nous avons testé l’influence du type de prélèvement (héparine ou EDTA) sur ces dosages. Comme le montrent les Figs 6 et 7 (vitamine B12) (folates), il existe une excellente corrélation entre les
Tableau 2 Etude de la répétabilité et de la reproductibilité du dosage des folates plasmatiques et érythrocytaires Plasma Pool
Bas
Elevé
Erythrocytes (concentrations non corrigées par l’hématocrite) Bas Elevé
Répétabilité (n = 10) Moyenne (pmol/L) Ecart type Coefficients de variation (%) Valeurs extrêmes
4,13 0,19 4,6 3,7-4,4
10,92 0,49 4,5 10,1-11,4
94 5,55 5,9 87-107
341 9,05 2,7 328-356
4,61 0,28 6,2 4,1-5,0
11,88 0,45 3,8 11,0-12,4
86 9,60 11,1 73-107
363 21,80 6,0 327-394
Reproductibilité (n = 10) Moyenne (pmol/L) Ecart type Coefficients de variation (%) Valeurs extrêmes .
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. Comparaison des dosages de la vitamine B12 et des folates sur l’Immulite 2000 avec des techniques de dosage radioimmunologique
Fig. 5. Étude de la linéarité du dosage des folates plasmatiques.
Afin d’apprécier les performances de ces techniques de dosage sur Immulite 2000, nous avons comparé les résultats à ceux obtenus avec des trousses de dosage par radioimmunologie chez des patients hospitalisés pour lesquels une demande de dosage de la vitamine B12 et des folates plasmatiques était faite par les services cliniques. Cette étude a été effectuée sur des échantillons prélevés sur EDTA, type de prélèvement recommandé pour la trousse RIA (SimulTRAC-SNB). Comme le montre la Fig. 8 a, il existe une bonne corrélation entre les deux techniques pour le dosage de la vitamine B12 : B12 Immulite = 1,11 x B12 RIA + 5,1 (n = 116 ; r = 0,968). Le même type de résultat est obtenu pour les folates (Fig. 9 a) : Folates Immulite = 0,87 x Folates RIA + 2,1 (n = 117 ; r = 0,955). En ne considérant que les valeurs obtenues sans dilution, les équations sont respectivement B12 Immulite = 1,01 x B12 RIA + 33,9 (n = 106 ; r = 0,893) (Fig. 8 b) et Folates Immulite = 0,97 x Folates RIA + 0,75 (n = 107 ; r = 0,962) (Fig. 9 b). Ces résultats démontrent une excellente corrélation entre
Fig. 6. Influence du type de prélèvement sur le dosage de la vitamine B12.
Fig. 7. Influence du type de prélèvement sur le dosage des folates.
deux types de prélèvements (r = 0,936 et 0,984 pour la vitamine B12 et les folates, respectivement). Cependant, en ce qui concerne la vitamine B12, les résultats obtenus sont environ 20 % plus élevés sur EDTA que sur héparine. Dans la routine de notre laboratoire, nous utilisons exclusivement des échantillons prélevés sur héparine comme le recommande le fabricant.
Fig. 8. Corrélation entre la vitamine B12, trousse DPC, et la vitamine B12, trousse RIA. Les dosages ont été effectués à partir d’échantillons prélevés sur EDTA a : toutes valeurs confondues (n = 116) ; b : valeurs inférieures à 1 000 pmol/L (n = 106).
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Remerciements Nous remercions la société DPC France de nous avoir fourni gracieusement les trousses de dosage de la vitamine B12 et des folates utilisées dans ce travail.
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ces techniques avec une pente proche de 1 et une ordonnée à l’origine proche de la concentration minimale détectable. Pour les folates, les résultats sont tout à fait comparables à ceux rapportés par Roberts et al. [11]. Dans ce travail, nous n’avons pas établi les valeurs usuelles de ces techniques. À titre indicatif, les valeurs données par la société DPC pour l’Immulite 2000 sont les suivantes : • Vitamine B12 : 162 à 708 pmol/L • Folates plasmatiques : 6 à 39 nmol/L • Folates érythrocytaires : 212 à 1453 nmol/L. En conclusion, les résultats obtenus dans cette étude montrent une bonne performance analytique des trousses DPC pour les dosages de la vitamine B12 et des folates sur l’Immulite 2000, et une excellente concordance avec les techniques radio-immunologiques. De plus, ces nouvelles techniques offrent l’avantage d’être entièrement automatisées et donc faciles à utiliser en routine.
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Techniques au quotidien
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Résumé Les performances analytiques des techniques de dosage de la vitamine B12 et des folates ont été évaluées sur l’analyseur Immulite 2000 (société DPC). Les résultats obtenus démontrent la bonne performance de ces nouvelles techniques de dosage par compétition immunologique en phase solide, tant dans le domaine de la sensibilité que de la linéarité. La comparaison avec les résultats obtenus par les techniques radio-immunologiques antérieurement utilisées montre une très bonne corrélation à la fois pour les dosages de la vitamine B12 et pour ceux des folates plasmatiques. De plus, ces techniques automatisées sont bien adaptées à leur utilisation en routine dans le diagnostic des déficits vitaminiques. © 2002 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. All rights reserved. Abstract The analytical evaluation of assays for vitamin B12 and folates has been performed on DPC’s Immulite 2000 analyzer. The results demonstrated the good performances of this new solid-phase chemiluminesent competitive binding assay. The comparison of the results obtained on Immulite with those obtained using radioimmunoassays revealed a good correlation both for vitamin B12 and plasma folates. These automated techniques may be routinely used in the diagnosis of vitamin deficiency. © 2002 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. All rights reserved. Mots clés: Vitamine B12; Folates plasmatiques; Folates érythrocytaires; Immulite 2000 Keywords: Vitamin B12; Plasma folates; Erythrocyte folates; Immulite 2000
La vitamine B12 et l’acide folique (vitamine B9) sont des nutriments indispensables à l’hématopoïèse et à la synthèse des acides nucléiques. Un déficit en vitamine B12 et/ou en folates peut être responsable d’une anémie macrocytaire caractérisée par une maturation anormale des globules rouges. Le déficit en acide folique est le déficit vitaminique le plus fréquemment rencontré, en particulier dans les
* Auteur correspondant. E-mail address: [email protected] (A. Duflo-Leroy). © 2002 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. All rights reserved. PII: S 0 9 2 3 - 2 5 3 2 ( 0 2 ) 0 1 1 6 5 - 1
syndromes de malnutrition et de malabsorption ; il est alors souvent associé à un déficit en vitamine B12. Ces déficits peuvent entraîner une modification du métabolisme conduisant à une hyperhomocystéinémie qui constitue un facteur de risque d’athérosclérose. Bien que l’homocystéine et l’acide méthylmalonique soient de très bons marqueurs de tels déficits au niveau tissulaire [2,8], les dosages sanguins de la vitamine B12 et de l’acide folique sont les examens les plus couramment prescrits dans le diagnostic d’une carence vitaminique. Le développement de techniques immunologiques « froides » a largement contribué à cette stratégie diagnostique.
A. Colombier et al. / Immuno-analyse & Biologie spécialisée 1 (2002) 40–47
Après un rappel sur les principales méthodologies proposées, nous rapportons dans ce travail l’évaluation des trousses commercialisées par la Société DPC sur l’Immulite 2000 et leur comparaison avec des méthodes radioimmunologiques.
. Matériel et méthodes Tous les patients inclus dans ce travail avaient une demande de dosages de vitamine B12 et de folates par les services cliniques. L’étude des performances analytiques de la technique a été réalisée sur des échantillons sanguins prélevés sur tube hépariné, qu’il s’agisse de la vitamine B12 ou des folates. Les plasmas obtenus par centrifugation du sang à 2 000 g pendant 15 minutes ont été congelés et stockés à – 20 °C pendant 8 jours maximum après les prélèvements. Les folates érythrocytaires ont été dosés sur des hémolysats de sang total obtenus après dilution manuelle au 1/5 des échantillons de sang total dans une solution fraîchement préparée d’acide ascorbique à 1 %. Les hémolysats ont été laissés pendant environ une heure à la température ambiante et à l’obscurité afin de permettre à la conjugase sérique de cliver les polyglutamates, forme essentiellement présente dans les globules rouges, en monoglutamates, seule forme de folate dosable dans la plupart des techniques analytiques utilisées [6] (Fig. 1). Les concentrations érythrocytaires ont été corrigées en utilisant la formule suivante : concentration mesurée × 100 / hématocrite mesuré. Les corrélations entre les techniques Immulite (société DPC) et les techniques radioimmunologiques ont été effectuées sur des échantillons prélevés sur tube EDTA, type de prélèvement recommandé dans les techniques de dosage effectuées en routine au Centre Henri Becquerel. Les dosages radioimmunologiques ont été réalisés avec les trousses SimulTRAC-SNB (ICN Pharmaceuticals) permettant le dosage simultané des deux vitamines, les traceurs utilisés étaient le cobalt 57 pour la vitamine B12 et l’iode 125 pour les folates.
Fig. 1. Structure chimique de l’acide folique et de ses dérivés.
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. Principe des méthodes de dosage de la vitamine B12 et des folates . Vitamine B12 La vitamine B12 possède une structure tétrapyrrolique entourant un atome central de cobalt. Différents ligands peuvent être associés à l’atome de cobalt conduisant à des formes différentes de cobalamines dont la vitamine B12. La vitamine B12 englobe elle-même plusieurs formes circulantes avec pour forme prédominante dans le sérum la méthylcobalamine [1]. Les premières techniques de dosage utilisées étaient des techniques microbiologiques (souche Lactobacillus leishmanii). Elles sont actuellement abandonnées en raison de leur longueur au profit de techniques immunologiques par compétition plus rapides et souvent automatisées, qu’il s’agisse de techniques radio-immunologiques ou de techniques « froides ». L’absorption intestinale de la vitamine B12 au niveau de l’iléon distal nécessitant la présence du facteur intrinsèque, glycoprotéine secrétée par les cellules pariétales de l’estomac, cette propriété de liaison entre la vitamine et le facteur intrinsèque est à la base des différents dosages immunologiques de cette vitamine. De plus, ce dosage nécessite un prétraitement afin de transformer les différentes formes présentes en cyanocobalamine. Les techniques radioimmunologiques sont fondées sur la compétition entre la cobalamine présente dans l’échantillon et un traceur isotopique vis à vis de ce facteur intrinsèque ; le traceur le plus utilisé est la cobalamine marquée par le cobalt 57. Plusieurs trousses sont actuellement disponibles [3,6,10,13] différant essentiellement par leur procédure de prétraitement : chaleur en milieu acide [13] ou température ambiante en milieu alcalin (3, trousse SimulTRAC-SNB). S’agissant de techniques par compétition, la quantité de radioactivité mesurée est inversement proportionnelle à la quantité de vitamine présente dans l’échantillon. Les techniques « froides » reposent aussi sur le principe de compétition mais utilisent comme traceur un enzyme, le plus souvent la β-galactosidase ou la phosphatase alcaline. Les techniques actuellement les plus utilisées sont la technique CEDIA, la technique MEIA et la technique récemment développée sur Immulite 2000. La technique CEDIA pour Combinant Enzyme Donor Immuno Assay est une méthode immunoenzymatique en phase homogène fondée sur l’utilisation de fragments enzymatiques recombinants. Pour préparer la β-galactosidase, deux gènes sont surexprimés permettant de synthétiser deux fragments polypeptidiques distincts : un fragment donneur d’enzyme et un fragment accepteur d’enzyme ; ces deux fragments peuvent spontanément se recombiner pour constituer la forme active de l’enzyme. La β-galactosidase est utilisée en raison de la grande variété des substrats disponibles et de son interférence négligeable avec les échantillons biologiques. Des ligands tels que la vitamine B12 peuvent être attachés sur le peptide donneur d’enzyme ; le degré de recombinaison est
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mesuré par fixation d’anticorps anti-ligand sur le conjugué enzyme donneur-ligand. La technologie CEDIA est donc fondée sur la compétition entre le ligand présent dans l’échantillon et le conjugué enzyme donneur-ligand vis-àvis des sites de fixation spécifique de l’anticorps. La liaison de la vitamine B12 sur le facteur intrinsèque de porc inhibe la recombinaison des fragments donneur et accepteur de l’enzyme. La courbe dose-réponse obtenue est linéaire et l’activité enzymatique mesurée est, dans ce cas, proportionnelle à la quantité de vitamine présente dans l’échantillon [5,7]. La technique MEIA pour Microparticular Enzyme Immuno Assay est fondée sur la fixation du facteur intrinsèque sur des microparticules. Dans un deuxième temps, un conjugué vitamine B12-phosphatase alcaline est ajouté, et la révélation effectuée. L’activité enzymatique est inversement proportionnelle à la concentration de vitamine B12 présente dans l’échantillon [12]. La technique automatisée sur l’analyseur Immulite 2000 est une technique par compétition en phase solide avec une révélation par chimiluminescence. Cette technique se déroule en deux étapes. La première étape consiste à séparer la vitamine B12 de ses protéines « acceptrices » et à transformer la vitamine B12 en cyanocobalamine au cours d’un cycle automatisé de 60 minutes à 37 °C par prétraitement de l’échantillon en milieu alcalin, en présence de dithiothréitol et de cyanure de potassium. La seconde étape correspond au dosage immunologique par compétition proprement dit. Ce principe est résumé dans la Fig. 2. Brièvement, l’échantillon prétraité est transféré dans un godet réactionnel contenant une bille de polystyrène recouverte de vitamine B12 ; il est alors mis en présence de facteur intrinsèque de porc purifié (HIF) et d’un anticorps monoclonal anti-facteur intrinsèque de porc marqué par la phosphatase alcaline (phase I). La réaction immunologique est réalisée au cours d’un cycle d’incubation de 60 minutes à 37 °C (phase II) pendant lequel la vitamine B12 présente dans l’échantillon entre en compétition avec la vitamine B12 fixée sur la bille pour se lier avec le facteur intrinsèque de porc purifié (HIF). L’anticorps anti-facteur intrinsèque marqué par la phosphatase alcaline va se fixer à la fois sur le facteur intrinsèque fixé sur la vitamine B12 présente dans l’échantillon et sur celui lié à la vitamine B12 qui recouvre la bille de polystyrène. Un lavage par centrifugation axiale permet de séparer les formes libre (non fixée sur la bille) et liée (fixée sur la bille). Le substrat chimiluminescent est alors ajouté. La quantité de lumière émise est donc inversement proportionnelle à la concentration de vitamine B12 présente dans l’échantillon. . Folates L’acide folique ou acide ptéroylmonoglutamique possède un noyau ptéridine relié à l’acide paraaminobenzoïque et à l’acide glutamique. Les formes réduites de cette molécule sont le dihydrofolate et le tétrahydrofolate. Le terme de folates englobe les différents dérivés du tétrahy-
drofolate [14]. Comme pour la vitamine B12, les premières techniques utilisées étaient des techniques microbiologiques (souche Lactobacillus casei). Ces techniques dosent toutes les formes d’acide folique mais ne peuvent pas être utilisées chez les malades traités par les médicaments antifoliques. Elles sont maintenant complètement abandonnées au profit des techniques immunologiques par compétition. Des formes multiples de folates sont présentes dans le sérum humain, la forme majoritaire étant le méthyltétrahydrofolate. Seule la chromatographie permet la séparation des différentes formes. Les techniques immunologiques par compétition reconnaissent l’ensemble de ces différentes formes. Les techniques radioimmunologiques sont fondées sur la compétition entre les folates présents dans l’échantillon et un traceur isotopique vis-à-vis d’une protéine porteuse ; le traceur le plus utilisé est l’acide folique marqué à l’iode 125 [3,6,13]. Les techniques « froides » reposent aussi sur la compétition vis-à-vis de protéines porteuses ; les plus utilisées sont la technique CEDIA (13) (voir vitamine B12), la technique MEIA [9] (voir vitamine B12), la technique par capture d’ions (IC) [12], la technique par Elisa [4] et la technique récemment développée sur l’Immulite 2000 [11]. Dans la technique par capture d’ions (IC) [12], le folate est marqué par un réactif soluble possédant une affinité pour les polyanions. Les complexes formés avec le folate sont donc chargés négativement et sont capturés par des interactions électrostatiques sur la matrice solide qui est chargée positivement. La détection se fait par la mesure de l’activité du traceur enzymatique (phosphatase alcaline) qui est couplé à un dérivé ou à un analogue du composé à doser [12]. Comme pour la vitamine B12, la technique développée par DPC sur l’Immulite 2000 nécessite deux étapes. La première étape consiste en un prétraitement chimique de l’échantillon (plasma pour les folates plasmatiques, hémolysat de sang total pour les folates globulaires) en milieu alcalin afin de libérer les folates de leurs protéines porteuses ; cette première étape est réalisée au cours de deux cycles de 30 minutes. La seconde étape correspond au dosage immunologique par compétition proprement dit. Ce principe est résumé dans la Fig. 3. Elle nécessite deux cycles : un premier cycle de compétition immunologique (30 minutes) et un deuxième cycle de révélation (30 minutes). Brièvement, l’échantillon prétraité est transféré dans un godet réactionnel contenant une bille recouverte d’un anticorps monoclonal murin dirigé contre la protéine porteuse du folate (FBP) en présence d’acide folique marqué par un « ligand » (phase I). L’acide folique présent dans l’échantillon entre en compétition avec l’acide folique marqué par le « ligand » pour se lier sur la protéine porteuse (phase II). Après lavage, l’anti-« ligand» marqué par la phosphatase alcaline est ajouté (phase III) ; il se fixe sur le folate marqué par le « ligand » , folate qui a été fixé sur la bille pendant la première incubation. Après lavage comme pour la vitamine B12, le substrat chimiluminescent
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Fig. 2. Principe de l’immunodosage de la vitamine B12 sur l’Immulite 2000. Phase I : mise en présence de l’ensemble des différents réactifs. Phase II : incubation avec formation des complexes antigène-anticorps, séparation par lavage et révélation.
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Fig. 3. Principe de l’immunodosage des folates sur l’Immulite 2000. Phase I : mise en présence des différents réactifs. Phase II : incubation avec formation des complexes antigène-anticorps, séparation par lavage. Phase III : addition de l’antiligand marqué par la phosphatase alcaline, incubation, lavage et révélation.
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Tableau 1 Etude de la répétabilité et de la reproductibilité du dosage de la vitamine B12 Pool
Bas
Elevé
Répétabilité (n = 10) Moyenne (pmol/L) Ecart type Coefficients de variation (%) Valeurs extrêmes
193,6 20,0 10,3 169-227
676,6 21,1 3,1 637-713
183,3 12,6 6,9 170-202
657,3 29,4 4,5 603-690
Reproductibilité (n = 10) Moyenne (pmol/L) Ecart type Coefficients de variation (%) Valeurs extrêmes .
est ajouté. La quantité de lumière émise est inversement proportionnelle à la concentration en folates présente dans l’échantillon.
. Performances des techniques de dosage de la vitamine B12 et des folates sur l’Immulite 2000 La répétabilité et la reproductibilité ont été mesurées sur deux pools à différentes concentrations, pools préparés à partir de prélèvements effectués chez des patients admis dans notre hôpital. La répétabilité a été mesurée en effectuant les dosages de chaque pool dix fois de suite dans la même série ; la reproductibilité a été mesurée en effectuant deux dosages quotidiens de chacun des deux pools pendant cinq jours consécutifs. Les résultats obtenus montrent des performances satisfaisantes aussi bien pour la vitamine B12 (Tableau 1) que pour les folates, qu’il s’agisse des folates plasmatiques ou des folates érythrocytaires (Tableau 2). Ainsi, les coefficients de variation obtenus pour la vitamine B12 sont compris entre 3,1 % (pool élevé) et 10,3 % (pool bas). De même, les coefficients de variation sont compris entre 3,8 % et 6,2 % pour les folates plasmatiques, et entre 2,7 % et 11,1 % pour les folates érythrocytaires. La limite de détection de ces techniques a été déterminée par dilutions successives au ½, dans le diluant de la trousse, d’un plasma à 300 pmol/L pour la vitamine B12 et à 3 nmol/L pour les folates plasmatiques. La concentration
Fig. 4. Étude de la linéarité du dosage de la vitamine B12.
minimale détectable, définie par la valeur moyenne ± 3 DS, est de 35 pmol/L pour la vitamine B12 et de 0,60 nmol/L pour les folates. Ces valeurs sont très proches de celles données par le fabricant aussi bien pour la vitamine B12 (37 pmol/L) que pour les folates (0,68 nmol/L). La linéarité de ces techniques a été testée par dilution d’un plasma de patient dans le diluant de la trousse. Pour la vitamine B12, nous trouvons une bonne linéarité jusqu’à une valeur de 700 pmol/L comme le montre la Fig. 4. De plus, l’équation de la droite de régression obtenue (y = 694 x + 37, r = 0,992) montre, qu’en l’absence de vitamine B12 détectable (x = 0), l’ordonnée à l’origine est du même ordre de grandeur que la concentration minimale détectable. Pour les folates, nous trouvons une bonne linéarité jusqu’à une valeur de 50 nmol/L comme le montre la Fig. 5. Cependant, contrairement au dosage de la vitamine B12, l’équation de la droite de régression obtenue (y = 48,2 x + 4,2, r = 0,994) montre que l’ordonnée à l’origine correspond à une valeur supérieure à la concentration minimale détectable (0,60 nmol/L) ; cependant, ceci ne remet aucunement en cause les qualités de la trousse pour les dosages de routine. Enfin, dans une dernière approche, nous avons testé l’influence du type de prélèvement (héparine ou EDTA) sur ces dosages. Comme le montrent les Figs 6 et 7 (vitamine B12) (folates), il existe une excellente corrélation entre les
Tableau 2 Etude de la répétabilité et de la reproductibilité du dosage des folates plasmatiques et érythrocytaires Plasma Pool
Bas
Elevé
Erythrocytes (concentrations non corrigées par l’hématocrite) Bas Elevé
Répétabilité (n = 10) Moyenne (pmol/L) Ecart type Coefficients de variation (%) Valeurs extrêmes
4,13 0,19 4,6 3,7-4,4
10,92 0,49 4,5 10,1-11,4
94 5,55 5,9 87-107
341 9,05 2,7 328-356
4,61 0,28 6,2 4,1-5,0
11,88 0,45 3,8 11,0-12,4
86 9,60 11,1 73-107
363 21,80 6,0 327-394
Reproductibilité (n = 10) Moyenne (pmol/L) Ecart type Coefficients de variation (%) Valeurs extrêmes .
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. Comparaison des dosages de la vitamine B12 et des folates sur l’Immulite 2000 avec des techniques de dosage radioimmunologique
Fig. 5. Étude de la linéarité du dosage des folates plasmatiques.
Afin d’apprécier les performances de ces techniques de dosage sur Immulite 2000, nous avons comparé les résultats à ceux obtenus avec des trousses de dosage par radioimmunologie chez des patients hospitalisés pour lesquels une demande de dosage de la vitamine B12 et des folates plasmatiques était faite par les services cliniques. Cette étude a été effectuée sur des échantillons prélevés sur EDTA, type de prélèvement recommandé pour la trousse RIA (SimulTRAC-SNB). Comme le montre la Fig. 8 a, il existe une bonne corrélation entre les deux techniques pour le dosage de la vitamine B12 : B12 Immulite = 1,11 x B12 RIA + 5,1 (n = 116 ; r = 0,968). Le même type de résultat est obtenu pour les folates (Fig. 9 a) : Folates Immulite = 0,87 x Folates RIA + 2,1 (n = 117 ; r = 0,955). En ne considérant que les valeurs obtenues sans dilution, les équations sont respectivement B12 Immulite = 1,01 x B12 RIA + 33,9 (n = 106 ; r = 0,893) (Fig. 8 b) et Folates Immulite = 0,97 x Folates RIA + 0,75 (n = 107 ; r = 0,962) (Fig. 9 b). Ces résultats démontrent une excellente corrélation entre
Fig. 6. Influence du type de prélèvement sur le dosage de la vitamine B12.
Fig. 7. Influence du type de prélèvement sur le dosage des folates.
deux types de prélèvements (r = 0,936 et 0,984 pour la vitamine B12 et les folates, respectivement). Cependant, en ce qui concerne la vitamine B12, les résultats obtenus sont environ 20 % plus élevés sur EDTA que sur héparine. Dans la routine de notre laboratoire, nous utilisons exclusivement des échantillons prélevés sur héparine comme le recommande le fabricant.
Fig. 8. Corrélation entre la vitamine B12, trousse DPC, et la vitamine B12, trousse RIA. Les dosages ont été effectués à partir d’échantillons prélevés sur EDTA a : toutes valeurs confondues (n = 116) ; b : valeurs inférieures à 1 000 pmol/L (n = 106).
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Remerciements Nous remercions la société DPC France de nous avoir fourni gracieusement les trousses de dosage de la vitamine B12 et des folates utilisées dans ce travail.
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ces techniques avec une pente proche de 1 et une ordonnée à l’origine proche de la concentration minimale détectable. Pour les folates, les résultats sont tout à fait comparables à ceux rapportés par Roberts et al. [11]. Dans ce travail, nous n’avons pas établi les valeurs usuelles de ces techniques. À titre indicatif, les valeurs données par la société DPC pour l’Immulite 2000 sont les suivantes : • Vitamine B12 : 162 à 708 pmol/L • Folates plasmatiques : 6 à 39 nmol/L • Folates érythrocytaires : 212 à 1453 nmol/L. En conclusion, les résultats obtenus dans cette étude montrent une bonne performance analytique des trousses DPC pour les dosages de la vitamine B12 et des folates sur l’Immulite 2000, et une excellente concordance avec les techniques radio-immunologiques. De plus, ces nouvelles techniques offrent l’avantage d’être entièrement automatisées et donc faciles à utiliser en routine.
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