- Email: [email protected]
Évaluation des performances d'une trousse de dosage de l'ACE (ACE IRMA Immunotech®)
Techniques au quotidien Vl .;:
'"
c:::..
./
Evaluation des performances d'une trousse de dosage de l'ACE (ACE IRMA Immunotech®) P Morel, C Millet, JY Bounaud (Ref'U Ie 17 mars 1998 .. accepte Ie 25 rna; 1998)
resume
Nous presentons les resultats de I'evaluation des criteres de qual ire du dosage de I'antigene carcino-embryonnaire (ACE) realise a I'aide de 10 trousse de dosage immunoradiometrique (IRMA) developpee par les laboratoires Immunotechl!>. Les resultats de notre etude montrent que 10 trousse ACE IRMA Immunotech~ presente sur Ie plan analytique toutes les qual ires que I'on peut attendre d'une bonne trousse de dosage. L'etude des profils d'imprecision montre une erreur relative inferieure a 5 % et 10 limite de detection est de 0,1 ng mL-I. Par ailleurs, 10 comparaison avec Ie dosage immunoradiometrique utilise en routine dans notre laboratoire a montre une correlation satisfaisante. De plus, 10 trousse ACE IRMA Immunotech presente plusieurs avantages : elle est de manipulation aisee, rapidement executable, necessite une foible prise d'essai, il n'y ni interference avec Ie mode de prelevement ni interference en presence de serums hyperlipidemiques. ©1998 Elsevier, Paris.
dosage immunoradiometrique / ACE / Evaluation analytique
summary
Introduction Nous vous presemons ici les resultats de revaluacion des cri• ceres de qualice du dosage de I'ACE realise aI'aide de la crousse de dosage immunoradiomecrique ACE IRMA developpee par les laboracoires [mmunocech. II nous a semble mile de consacrer nocre imroduccion rappel sur I'antigene carcino-embryonnaire.
a bref
Rappe/s concernant /'antigime carcino-embryonnaire L'antigene carcino-embryonnaire (ACE ou CEA) est une glycoproteine d'environ 180-200 kDa ayam ece decrice pour la premiere fois par Gold ec Freedman en 1965 [2]. II s'agic en faic d'une proteine oncofcetale, synthecisee par Ie fcetus, au niveau de I'intestin, du pancreas et du foie. A I'age adulce la synthese de cecce proceine esc cres faible du faic d'une repres• sion du gene fcecal codant pour la symhese de cecce proceine. On admec que chez 95 % des sujecs sains, non fumeurs, les caux d 'ACE som inferieurs a 3 flg L-I aussi bien par des mechodes radioimmunologiques qu'immunoenzymologiques [6] et que rACE esc alors recrouve ala surface des cellules de I'imestin grele, du colon, du rectum, du pancreas, du poumon ec du sein. Les taux d'ACE sont, en revanche, considerable• mem augmentes dans certains processus cumoraux car il exisce dans ce cas une derepression du gene fcetal. Cecce augmenta• cion des concentracions d'ACE a ece mise en evidence par
Evaluation of assay performances of the ACE IRMA Immunotech«> kit (rodioimmunometric dosage). The results of the evaluation of the quality criteria for the dosage of the carcinoembryonic antigen (CEA) ore presented The study, realized with the immunoradlOmetric kit presented by the Immunotech Laboratory, shows that the ACE IRMA Immunotech kit has the analytical advantages that are expected for a satisfying kit. Imprecision profiles demonstrate a relative error rate of less than 5 % and a detection sensitivity of 0 1 ng mL '. Furthermore, a satisfying correlation was obtained when comparing with the immunoradiometric dosage that is commonly used in our laboratory. The ACE IRMA ktl also present several advantages : it is practical to use, the dosage IS rapId, smoll quantity of serum is required, there is no interference eIther WIth the blood drawing method or with the hyperlipidemic serums. © 1998 Elsevier, Paris
immvnometric dosage / ACE / analytical evalvation
Gold ec Freedman dans un excraic de carcinome colique humdin. A I'origine, I'ACE fUc considcre comme un mar• queur specifique de ce eype de cumeur. On saic aujourd'hui qu'il n'en n 'esc rien. Mais I'interec clinique du dosage de I'ACE en cam que marqueur du cancer colorectdl est un faic
ServIce centrol de medecine nuclea're et de blaphys.que, Hopltal Jean-Bernard, BP 577, 86021 Pa,hers cedex
P Morel et 01 •
bien etabli [5.8,9). II presente egalement un interet dans la mise en evidence de carcinomes gastro-intestinaux (3), bron• chiques (4), du sein et de cancers medullaires de la thyro'ide [I). On dose ('ACE: - avant rout traitement de la tumeur, - apres traitement pour verifier I'efficacite de celui-ci, - au cours du suivi de la maladie pour diagnostiquer une recidive ou une metastase. Dans les cancers colorectaux, ('ACE est ainsi considere comme un bon marqueur pour Ie suivi post-therapeutique (7) . Apres resection colique, ('ACE devient habituellement a des valeurs normales dans un delai de 6 semaines (10) .
Principe du dosage de I'antigene carcino-em&ryonnaire par la trousse ACE IRMA IMMUNOTECW' Le dosage de ('Antigene carcino-embryonnaire est base sur 1.1 tech• nique de type .. sandwich .. a deux sites utilisant deux anticorps monoclonaux de souris contre deux epitopes differents de 1.1 mole• cule. Les echantillons adoser ou les standards sont incubes dans des tubes recouverts du premier anticorps monoclonal en presence du deuxieme anticorps monoclonal marque a l'iode 125. Apres incuba• tion, ('exces d'anticorps marque non lie est elimine par lavage. La quantite de radioactivite liee, mesuree dans un compteur gamma est proportionnelle a 1.1 concentration d'ACE.
Protocole Apres recueil du sang sur tubes sees ou sur tubes heparines, Ie serum ou Ie plasma est separe par centrifugation. Puis 50 flL d'cchan• tillon sont deposes dans un tube recouvert du premier anticorps monoclonal et 200 flL de traceur sont ajoutCs. Le (Out est incubc 120 min a temperature ambiante sous agitation constante. Puis les tubes sont laves deux fois par 2 mL de solution de lavage et 1.1 radio• activite est mesuree dans un compteur gamma. La courbe d'etalonnage est obtenue en reportant les cpm deteclcs pour cinq concentralions de slandards (gamme de 0 a400 ng mL I).
Methodologie Elle a porte sur ('evalualion des points suivants : Linearite et reproductibilite de 10 courbe standard Les standards 0 et I ng mL I et les standards 5, 20, 100 el 380 ng mL I ont ele doses respeclivcment vingl CI dix filis au COur, d'une meme serie. Le calcul de 1.1 moyenne, de ('ecart-type ainsi que du coefficient de variation a permis d'apprecier 1.1 reproductibililc. Le calcul du seuil de detection a ete effecrue apres dosage des standards o el I. La Ii mile de detection correspond J 1.1 valeur moyenne du signal, augmente de trois ecart-types. Reproductibilite du dosage
Reproductibi/ite intra-essoi Trois pools seriques choisis pour donner de' valeur, basses, moyennes el haules ont ele utilises pour evaluer 1.1 reproductibilitc intra-essai. Chaque pool a ete dose dix fOls dans 1.1 meme serie.
Reproductibilite inter-essoi et inter·lot Les trois memes pools ont ete doses dix fois en double, avec trois lots differents, el par deux personnes differentes. Les memes donnees ont ete regroupees lor par lot pour verifier 1.1 reproductibilite inter• Ior. Vieillissement La courbe slandard et Ie dosage des lrois pools ont CIC realises avec 1.1 meme trousse : - a reception, - en milieu de validile, - a 1.1 date de peremption, - lOa 15 j apres 1.1 dale de peremption. Exactitude Un test de dilution a ete effectue sur trois echantillons prcsentant des valeurs elevees. Chaque echantillon oleIC dilue avec Ie calibrant oU mL I fourni dans chaque lrousse de fa~on aoblenir It·, dilutions suivantes : 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 et Ie dosage a etc realise en double. Trois echantillons de faible concentration en ACE ont CIC rerenus pour realiser un test de surcharge. Chaque echantillon a ele surcharge avec des quantiles croissantes d'ACE en utilisant un serum de concentration tres elevee el dose en double. Derive
Sur 10 distribution Les lrois pools (bas, moyen et haut) ont ele doses lrois fois en double dans 1.1 meme serie en les disrribuant : au debut, au milieu el a 1.1 fin d'une serie d'echantillons ulilisant une trousse complete. Les valeurs oblenues ont ele comparees entre dies el avec celles de ('clude intra-essai.
Sur 10 duree d'incubotion Les lrois pools ont ete doses en double dans trois series successives au cours de 1.1 meme manipulalion, Ie crilCre de chaque scrie Clant 1.1 duree d'incubation : I h 30 ; 2 h (temps habilud), 2 h 30. Les valeurs oblenues ont ete comparees entre dies el avec celles de ('ctude inter-essai. Effet du mode de prelevement Pour mellre en cvidence un cventud elTel des anticoagulants sur Ie dosage de ('ACE, nous avons dosc cinq echantillons prcleves sur cinq patients el recueillis dans des lubes ditlcrents contenant ou non un anticoagulant : - lube sans coagulant (ou lUbe sec) ; - tube sans coagulant mais contenant un gd sl:paraleur (ou lUhe sec + gd scparaleur) ; - lUbe contenant de ('EDTA ; - luhe heparinc ; Influence de la composition du serum Pour evaluer I'influence des Iriglycerides sur Ie dosage de I'ACE par 1.1 trousse ACE Immunmech"", nous avons dosc cinq cchantillons prCleves Ie malin chez des sujers hyperlipidcmiques.
a
Comporaison au dosage de I' ACE I' aide de la trousse CIS bio International~ La lrou,se relenue pour evaluer I'intcrel de 1.1 lrou,se ACE Immunolech'" eSI 1.1 lrousse de dosage immunoradiomcrriqul' de ('ACE des Labor,lloires CIS bio Internalional'" qui eSI ulilisl:l' en rourine au Service central de mcdecine nuclcaire el de biophysique de Hopilal Jean-Bernard J Poi tier-.
•
Techniques au quotidien
-r-----------•
Nous avons compares les concentrations donnees par la trousse ACE ImmunorechG> avec celie obtenues par Ie dosage de I'ACE, consideree comme methode de reference. Les prelevemems (serums) ont ete choisis de fa,
9-r-----------•
10 4
8-r-----------7· . 6 5
Etablissement des valeul'$ normales
4 3
Afin d'erablir les valeurs normales pour Ie dosage de I'ACE, nous avons dose 50 patients (25 femmes et 25 hommes) apparemmem sains de toutes pathologies cancereuses et/ou inflammatoires.
--
2+-----------1 ..
Analyse .tati.tique
0"'t---1---+--~1-----I
Les resultats de chaque evaluation sont exprimes par la moyenne
o
:I: SEM de n observations. L'analyse staristique a ete effectuee par Ie rest Ide 5tudem. resultars om ere consideres comme srarisrique• mem significatif pour une valeur de p < 0,05 ou 0,01 selon Ie cas.
us
Resultats
-----------
100
200
300
400
Concentration en ng/ml Fit 1. Reproductibilite inlrCHlssoi.
Linearite et reproductibi'ite de$ $tandord$
Les moyennes, ecart-types et coefficients de variation, pour les CPM sont presentes dans Ie tableau I. La figur( J montre Ie profil de precision intra-essai. La repetabilite est bonne, les coefficients de variations sont d'environ 5 % des une concentration de 5 ng mL-I. La limite de detection analytique est de 0,1 ng mL-I. Reproducti&i'ite du dO$oge Intra-essai
Les concentrations en ACE, exprimees en ng mL-I, sont en
moyenne de 5,87 ± 0,19 pour les serums bas, de 50,69 ± 0,96 pour les serums moyens et de 131,05 ± 2,28 pour les serums fortS. Les coefficients de variation sont excellents (3,22, 1,89 et 1,74, respectivement pour les serums bas, moyens et forts). Inter-essai et inter-lot
Les concentrations en ACE, exprimees en ng mL-I, sont en moyenne de 5,60 ± 0,25 pour les serums bas, de 47,12 ± 1,98 pour les serums moyens et de 118,41 ± 7,01 pour les serums fortS Le profil de precision inter-essai est reproduit sur la fiK'm 2. Les coefficients de variation sont compris entre 4,2 et 5,9 %.
~
= .S= = 'C
10 9
8
'T'""'----------+--.-----.--..- -.
.
~
- 7+------------• +:----------::;IJII'.....c~::;;..-.... +-.-----.-.---.-- -. .•- +------------QI
~ ~
g: Col
IS
8
6 +---------~~-5 'e.-. ----__ 4 L':_::: .•.•::~~_ ~:::: . 3 2
1
o 1'------+------+:------1: o 50 100 150 Concentration en ng/ml
Fig 2. Raproductibilite intar-essai.
Tableau I. Linearite at raproductibilite des standards. Standard n
M ± a (cpm) CV% DC/C%
o n9 mL-'
1 ng mL-'
5 ng mL-'
20n9 mL'
100 n9 mL-'
20 80 ± 8 9,99
20 335 ± 24 7,25 9,5
10 1357 ± 64 4,69 4,7
10 5623 ± 246 4,38 4,3
10 29107 ± 656 2,25 2,7
380 ng mL
I
10 80675 ± 1976 2,45 2,8
Lo repr~u~tibilit8 ~s .ston~rds 0 ite esti.mee ~n.mesuront 20 ~ois les s~~dords 0 ~t.l ~ mL:' ~u .sein d'une mime sene. Les standords 5, 20, 100 et 380 n9 mL" ont ete mesures due Io,s dons celie meme sene. Les parometres stotost'ques ont ete determ,nes a partir de 10 rodiooctiviti mesuree
P Morel et 01 •
Viei/lissement
250
i
Les resulrats sont presentes dans Ie tab/~au II. Aucune dif• ference significative n'a ete observee entre les dosages realises au cours du vieillissement de la trousse.
i
Exactitude
.e
.SI .S2 .S3
oil 200
c: c: 41 ~
--.=.
Les resultats sont presentes sur les figur~s 3 et 4. Les resultats obtenus sur Ie test de dilution (figure 3) mon• trent que les pourcentages de recuperation varient de 75 a 168 %. Pour certains serums. les concentrations dosees apres dilution montrent que les mesures des serums purs dont la concentration en ACE est comprise entre 100 et 380 ng mI.-I sont sous-estimees. Les resulrats obtenus sur Ie test de surcharge (figur~ 4) mon• trent que les pourcentages de recuperation s'echelonnent de 91 %il 114 %.
ISO
c: til
.i 100 c41: y c:
U=
SO 0 0
Derive Les tests de Student montrent qu'il n'y a pas de difference significative entre les concentrations obtenues (derive sur la distribution). quelque soit Ie temps d'incubation. si la gamme standard et les echantillons incubent pendant la meme duree. EHet du mode de pre/evement
Les resulrats obtenus (M ± (J) sur les cinq echantillons de sang. preleves chez cinq patients. sont : recueil sur tube sec (1.62 ± 1.14 ng ACE mL-I). recueil sec ± gel separateur (1.70 ± 1,06 ng ACE mI.-I). recueil sur tube EDTA (1.72 ± 1.67 ng ACE mL-I) et recueil sur tube heparine (1, '56 ± 1.2'5 ng mL-I). Aucune difference significative n'a etc observee entre les divers echantillons prelevcs sur des tubes differents. Influence de 10 composition du serum
Chez les sujets ayant respectivement une concentration en triglycerides de 3.2 g L-I, 5,13 g L I. 5.37 g L 1,9,21 g L-I et
1
0,5 Dilution
Fi, 3. Tests de dilution. 10,6 g L-1. les concentrations en ACE etaient de 0,2 ng mL I ; 0.8 ng mL-' ; 0,5 ng mL-' ; 2.4 ng mL I ; 1.9 ng mL I. Ces resultats ont ete compares aux concentrations d'ACE obte• nues chez une population de 25 hommes et de 25 temmes egalement exempts de pathologie tumorale (concentrations moyennes respcetives 1.18 ± 0.67 ng mL 1et 1,12 ± 0.73 ng mL 1). Les resultats ne montrent pas de difference significa• tive entre sujets hyperlipidemiques et sujets sains. Correlation
La figure 5 reprcsente la correlation des concentrations ACE Immunotech lACE CIS bio International oo . L'equation de la droite de regression cst: ACE Immunotcch = 0.6 CIS bio International"J + 10.4 (r = 0,896)
Tableau II. Stabilite du Iraceur Serums bas
M
(J
n Analy d varlanc
)0 5,8 0,26 4
5 .rums moyens Fm )1/2 5,8 0,42 4
5,8 0,22 4
)0
+15; 6,15 0,24 4
45,63 0,77
~
4
serums forts Fin
)1/2
44,58 1,22
~
4
43,50 1,23
~
4
F - 2,74 NS
F - 1,37 NS
a
)0
)//2
121,8 4,07
120,5 2,58
4
4
+15, 45,05 1,06
~
4
~
Fin
+15,
121,2 2,24
123,7 2,41
4
4
~
F - 0,90 NS
10 Do$Oges eHecrves avec 10 trovsse ACI Immunoe.ch 10 reception de cene dermere 1 I /2 Dowges eHectuilS avec 10 trovsse ACI ImmunoNch en m,loev de vol,d.te lIon Dowges eHectves avec 10 Irovue ACllmmunoNch a 10 dole de peremption de 10 trousse 1+ 15 Dosages eHeclues avec 10 Irousse ACllmmunoNch 15 lOUrs opres 10 dote de peremption de 10 trousse II n'exlSte oucune diHerence SlgmllColove des concentrations au cours du v,e,IIlSsement de la Irousse ACE ImmunNch (analyse de varlancel.
•
Techniques au quotidien
-.L.E
300
l. 3SO E oil c 300 c 250
.3,2 nglml • 6,8nglml .12 nglml
oil c 250 c~ rJ 200
=
u
-=jg ISO .•...= ...cf
~
Eo-
0
~
u=
..,..
200
:z ISO
;;l
100
..
100
u
50
~ ~
~
C
•
~
SO
~
-<
0 0
100 200 Ajouts en ng/ml
300
AI •
"..
•• • •• •
• •
••
•
0 0
I
100
200
300
400
CIS BIO en ng/ml Fig 4. Tests de surcharge.
Vo/eurs normo/es Les valeurs normales ant ete obtenues par calcul du 97,5< percentile et sont inferieures a3 ng mL-I. II n'existe pas de dif• ference significative entre les valeurs normales obtenues chez la femme et celles obtenues chez I'homme (p> 0,01).
Discussion et conclusion La trousse proposee par les Laboratoires Immunotech pour Ie dosage de I'antigene carcino-embryonnaire dans Ie serum presente, sur Ie plan analytique. toutes les qualites que I'on peut attendre d'une bonne trousse de radio-immunodosage. En effet, I'ensemble des resultats obtenus au cours de cette evaluation montre que Ie dosage immunoradiometrique de I'ACE presente une precision excellente (Ies CV obtenus sont faibles), une bonne sensibilite (limite de detection de 0,1 ng mL-'), et plusieurs autres avantages: Ie test est de mani• pulation aisee. d'execution rapide, exigeant un materiel peu sophistique a I'exception du compteur de radioactivite et necessite une faible prise d'essai. Par ailleurs la correlation avec la rrousse CIS bio International~est correcte. Le dosage de I'ACE par la trousse Immunotech est fiable: I'etude dinique ne montre pas de dif• ference significative entre les hommes et les femmes. et les concentrations ACE ne sont pas influencees par des facteurs techniques (mode de prelevement de I'echantillon sanguin) et physiopathologiques (hyperlipidemie). Le test de dilution, qui a pour but de reveler la presence d'une erreur absolue (source d'inexactitude), montre neanmoins que la mesure des serums purs, dont la concentration en ACE se situe entre 100 et 380 ng mL-'. est sous-estimee et qu'il est preferable de diluer les serums pathologiques a partir de 100 ng mL-',
Fig 5. Correlation avec CIS bio Immunotech - 0,6 CIS bio + 10,4
n - 51; ,- 0,896.
meme si la gamme est etendue jusqu'a 380 ng mL-'. Cette remarque s'applique toutefois de la meme faeron a la trousse Cis bio International@.
References Burtin 1'. us amigenes carcin~mbryonnaires. Path BIoI 1980 . 28 (8) : 489-492 2 Gold 1'. Freedman so. Demonstration of rumor-speCIfic dmigens in human colonic carcinomata by immunologicallOlerance dnd absorpllon technique. J Exp M~d 1965 ; 12 J : H9-462 3 Kim ¥H. Ajani JA. Ota OM. Lynch P. ROlh JA. Value of serial carci• n~mbryonic amigen levels in patiems with resectable adenocarcinoma of the esophagus and slOmach. Canca 1995 ; 75(2) : 451-456 4 K1eisbauer JP. Ca-relnau O. Thomas P. Ramirl'"l J. l..lmedume A, Roux F. Valeur pronostique du taux pretherapeutique de I'antigene carci• noembryonnaire dans les cancel> bronchiques primitif.~. Hull Cimc~r 1995; 82; 1019-1024 S Lucha PA. Rosen l., Olenwine JA. Reed JF, Riether RD. Stasik JJ. Khu~chandani r~. Value of carcinoembryonic anllgen monilOring in curallve surgery for recurrem coloreCldl carcinonu. DIS Colo1l R~etum 1997;40(2) :86(~867 6 Meier R, Raby N. Boussard H. Cham" A. l.'dmigene carcinoembryon• naire. ACE. (yon Pharmauutlqu~ 1991 ; 42 (4) : .i45- ,is I 7 Pelissier E. Bosset JF. Meneveau N. Imeret du dosage sanguan des mar• queurs tumoraux dam Ie depistage de, recidlves du cancer ,olnteCld!. Bull Canur 1994 ; 81 : 1050-1056 8 Villalba Ferrer 1', Bernal Sprekelsen JC Fmler Didna CA, A~emi Perez J. Vazquez Prado A, Garcia Coret MJ. Pill'hades (;il F. Trullen'llle Pens R. Multiple colon rumors. diagnoSiS and fi,llnw-up of 45ll pdlients with colorectal carcinoma. R~v Esp Enftrm [J,X 1997 ; 119 (10) : 759-76j <) ¥uceyar S. Erturk S. Oirican A. Cengil A. Saner II. The rule nf aWle• ph.LSe reaClant proleins. carcinoembrynnic allligen dnd CA 19-9 as d marker in the preoperalive sldging ofwlor"'·I,.1 ,'dn,'~r : .'prosp'·' live cli• nical sludy. 1m Su'X 1996 ; III (2) : I j(~ I j<) III ¥chou M, Rougier Ph. Bidart )11.1, Bdlel D. '1 i{!dlld 1M, Bohunn C. Interct des marqueurs tumnrdUX en canc<'rulngll' dlge'ti"e. S~III Hop Pam 1990; 66 (10) : 527-5.H
'"
c:::..
./
Evaluation des performances d'une trousse de dosage de l'ACE (ACE IRMA Immunotech®) P Morel, C Millet, JY Bounaud (Ref'U Ie 17 mars 1998 .. accepte Ie 25 rna; 1998)
resume
Nous presentons les resultats de I'evaluation des criteres de qual ire du dosage de I'antigene carcino-embryonnaire (ACE) realise a I'aide de 10 trousse de dosage immunoradiometrique (IRMA) developpee par les laboratoires Immunotechl!>. Les resultats de notre etude montrent que 10 trousse ACE IRMA Immunotech~ presente sur Ie plan analytique toutes les qual ires que I'on peut attendre d'une bonne trousse de dosage. L'etude des profils d'imprecision montre une erreur relative inferieure a 5 % et 10 limite de detection est de 0,1 ng mL-I. Par ailleurs, 10 comparaison avec Ie dosage immunoradiometrique utilise en routine dans notre laboratoire a montre une correlation satisfaisante. De plus, 10 trousse ACE IRMA Immunotech presente plusieurs avantages : elle est de manipulation aisee, rapidement executable, necessite une foible prise d'essai, il n'y ni interference avec Ie mode de prelevement ni interference en presence de serums hyperlipidemiques. ©1998 Elsevier, Paris.
dosage immunoradiometrique / ACE / Evaluation analytique
summary
Introduction Nous vous presemons ici les resultats de revaluacion des cri• ceres de qualice du dosage de I'ACE realise aI'aide de la crousse de dosage immunoradiomecrique ACE IRMA developpee par les laboracoires [mmunocech. II nous a semble mile de consacrer nocre imroduccion rappel sur I'antigene carcino-embryonnaire.
a bref
Rappe/s concernant /'antigime carcino-embryonnaire L'antigene carcino-embryonnaire (ACE ou CEA) est une glycoproteine d'environ 180-200 kDa ayam ece decrice pour la premiere fois par Gold ec Freedman en 1965 [2]. II s'agic en faic d'une proteine oncofcetale, synthecisee par Ie fcetus, au niveau de I'intestin, du pancreas et du foie. A I'age adulce la synthese de cecce proceine esc cres faible du faic d'une repres• sion du gene fcecal codant pour la symhese de cecce proceine. On admec que chez 95 % des sujecs sains, non fumeurs, les caux d 'ACE som inferieurs a 3 flg L-I aussi bien par des mechodes radioimmunologiques qu'immunoenzymologiques [6] et que rACE esc alors recrouve ala surface des cellules de I'imestin grele, du colon, du rectum, du pancreas, du poumon ec du sein. Les taux d'ACE sont, en revanche, considerable• mem augmentes dans certains processus cumoraux car il exisce dans ce cas une derepression du gene fcetal. Cecce augmenta• cion des concentracions d'ACE a ece mise en evidence par
Evaluation of assay performances of the ACE IRMA Immunotech«> kit (rodioimmunometric dosage). The results of the evaluation of the quality criteria for the dosage of the carcinoembryonic antigen (CEA) ore presented The study, realized with the immunoradlOmetric kit presented by the Immunotech Laboratory, shows that the ACE IRMA Immunotech kit has the analytical advantages that are expected for a satisfying kit. Imprecision profiles demonstrate a relative error rate of less than 5 % and a detection sensitivity of 0 1 ng mL '. Furthermore, a satisfying correlation was obtained when comparing with the immunoradiometric dosage that is commonly used in our laboratory. The ACE IRMA ktl also present several advantages : it is practical to use, the dosage IS rapId, smoll quantity of serum is required, there is no interference eIther WIth the blood drawing method or with the hyperlipidemic serums. © 1998 Elsevier, Paris
immvnometric dosage / ACE / analytical evalvation
Gold ec Freedman dans un excraic de carcinome colique humdin. A I'origine, I'ACE fUc considcre comme un mar• queur specifique de ce eype de cumeur. On saic aujourd'hui qu'il n'en n 'esc rien. Mais I'interec clinique du dosage de I'ACE en cam que marqueur du cancer colorectdl est un faic
ServIce centrol de medecine nuclea're et de blaphys.que, Hopltal Jean-Bernard, BP 577, 86021 Pa,hers cedex
P Morel et 01 •
bien etabli [5.8,9). II presente egalement un interet dans la mise en evidence de carcinomes gastro-intestinaux (3), bron• chiques (4), du sein et de cancers medullaires de la thyro'ide [I). On dose ('ACE: - avant rout traitement de la tumeur, - apres traitement pour verifier I'efficacite de celui-ci, - au cours du suivi de la maladie pour diagnostiquer une recidive ou une metastase. Dans les cancers colorectaux, ('ACE est ainsi considere comme un bon marqueur pour Ie suivi post-therapeutique (7) . Apres resection colique, ('ACE devient habituellement a des valeurs normales dans un delai de 6 semaines (10) .
Principe du dosage de I'antigene carcino-em&ryonnaire par la trousse ACE IRMA IMMUNOTECW' Le dosage de ('Antigene carcino-embryonnaire est base sur 1.1 tech• nique de type .. sandwich .. a deux sites utilisant deux anticorps monoclonaux de souris contre deux epitopes differents de 1.1 mole• cule. Les echantillons adoser ou les standards sont incubes dans des tubes recouverts du premier anticorps monoclonal en presence du deuxieme anticorps monoclonal marque a l'iode 125. Apres incuba• tion, ('exces d'anticorps marque non lie est elimine par lavage. La quantite de radioactivite liee, mesuree dans un compteur gamma est proportionnelle a 1.1 concentration d'ACE.
Protocole Apres recueil du sang sur tubes sees ou sur tubes heparines, Ie serum ou Ie plasma est separe par centrifugation. Puis 50 flL d'cchan• tillon sont deposes dans un tube recouvert du premier anticorps monoclonal et 200 flL de traceur sont ajoutCs. Le (Out est incubc 120 min a temperature ambiante sous agitation constante. Puis les tubes sont laves deux fois par 2 mL de solution de lavage et 1.1 radio• activite est mesuree dans un compteur gamma. La courbe d'etalonnage est obtenue en reportant les cpm deteclcs pour cinq concentralions de slandards (gamme de 0 a400 ng mL I).
Methodologie Elle a porte sur ('evalualion des points suivants : Linearite et reproductibilite de 10 courbe standard Les standards 0 et I ng mL I et les standards 5, 20, 100 el 380 ng mL I ont ele doses respeclivcment vingl CI dix filis au COur, d'une meme serie. Le calcul de 1.1 moyenne, de ('ecart-type ainsi que du coefficient de variation a permis d'apprecier 1.1 reproductibililc. Le calcul du seuil de detection a ete effecrue apres dosage des standards o el I. La Ii mile de detection correspond J 1.1 valeur moyenne du signal, augmente de trois ecart-types. Reproductibilite du dosage
Reproductibi/ite intra-essoi Trois pools seriques choisis pour donner de' valeur, basses, moyennes el haules ont ele utilises pour evaluer 1.1 reproductibilitc intra-essai. Chaque pool a ete dose dix fOls dans 1.1 meme serie.
Reproductibilite inter-essoi et inter·lot Les trois memes pools ont ete doses dix fois en double, avec trois lots differents, el par deux personnes differentes. Les memes donnees ont ete regroupees lor par lot pour verifier 1.1 reproductibilite inter• Ior. Vieillissement La courbe slandard et Ie dosage des lrois pools ont CIC realises avec 1.1 meme trousse : - a reception, - en milieu de validile, - a 1.1 date de peremption, - lOa 15 j apres 1.1 dale de peremption. Exactitude Un test de dilution a ete effectue sur trois echantillons prcsentant des valeurs elevees. Chaque echantillon oleIC dilue avec Ie calibrant oU mL I fourni dans chaque lrousse de fa~on aoblenir It·, dilutions suivantes : 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 et Ie dosage a etc realise en double. Trois echantillons de faible concentration en ACE ont CIC rerenus pour realiser un test de surcharge. Chaque echantillon a ele surcharge avec des quantiles croissantes d'ACE en utilisant un serum de concentration tres elevee el dose en double. Derive
Sur 10 distribution Les lrois pools (bas, moyen et haut) ont ele doses lrois fois en double dans 1.1 meme serie en les disrribuant : au debut, au milieu el a 1.1 fin d'une serie d'echantillons ulilisant une trousse complete. Les valeurs oblenues ont ele comparees entre dies el avec celles de ('clude intra-essai.
Sur 10 duree d'incubotion Les lrois pools ont ete doses en double dans trois series successives au cours de 1.1 meme manipulalion, Ie crilCre de chaque scrie Clant 1.1 duree d'incubation : I h 30 ; 2 h (temps habilud), 2 h 30. Les valeurs oblenues ont ete comparees entre dies el avec celles de ('ctude inter-essai. Effet du mode de prelevement Pour mellre en cvidence un cventud elTel des anticoagulants sur Ie dosage de ('ACE, nous avons dosc cinq echantillons prcleves sur cinq patients el recueillis dans des lubes ditlcrents contenant ou non un anticoagulant : - lube sans coagulant (ou lUbe sec) ; - tube sans coagulant mais contenant un gd sl:paraleur (ou lUhe sec + gd scparaleur) ; - lUbe contenant de ('EDTA ; - luhe heparinc ; Influence de la composition du serum Pour evaluer I'influence des Iriglycerides sur Ie dosage de I'ACE par 1.1 trousse ACE Immunmech"", nous avons dosc cinq cchantillons prCleves Ie malin chez des sujers hyperlipidcmiques.
a
Comporaison au dosage de I' ACE I' aide de la trousse CIS bio International~ La lrou,se relenue pour evaluer I'intcrel de 1.1 lrou,se ACE Immunolech'" eSI 1.1 lrousse de dosage immunoradiomcrriqul' de ('ACE des Labor,lloires CIS bio Internalional'" qui eSI ulilisl:l' en rourine au Service central de mcdecine nuclcaire el de biophysique de Hopilal Jean-Bernard J Poi tier-.
•
Techniques au quotidien
-r-----------•
Nous avons compares les concentrations donnees par la trousse ACE ImmunorechG> avec celie obtenues par Ie dosage de I'ACE, consideree comme methode de reference. Les prelevemems (serums) ont ete choisis de fa,
9-r-----------•
10 4
8-r-----------7· . 6 5
Etablissement des valeul'$ normales
4 3
Afin d'erablir les valeurs normales pour Ie dosage de I'ACE, nous avons dose 50 patients (25 femmes et 25 hommes) apparemmem sains de toutes pathologies cancereuses et/ou inflammatoires.
--
2+-----------1 ..
Analyse .tati.tique
0"'t---1---+--~1-----I
Les resultats de chaque evaluation sont exprimes par la moyenne
o
:I: SEM de n observations. L'analyse staristique a ete effectuee par Ie rest Ide 5tudem. resultars om ere consideres comme srarisrique• mem significatif pour une valeur de p < 0,05 ou 0,01 selon Ie cas.
us
Resultats
-----------
100
200
300
400
Concentration en ng/ml Fit 1. Reproductibilite inlrCHlssoi.
Linearite et reproductibi'ite de$ $tandord$
Les moyennes, ecart-types et coefficients de variation, pour les CPM sont presentes dans Ie tableau I. La figur( J montre Ie profil de precision intra-essai. La repetabilite est bonne, les coefficients de variations sont d'environ 5 % des une concentration de 5 ng mL-I. La limite de detection analytique est de 0,1 ng mL-I. Reproducti&i'ite du dO$oge Intra-essai
Les concentrations en ACE, exprimees en ng mL-I, sont en
moyenne de 5,87 ± 0,19 pour les serums bas, de 50,69 ± 0,96 pour les serums moyens et de 131,05 ± 2,28 pour les serums fortS. Les coefficients de variation sont excellents (3,22, 1,89 et 1,74, respectivement pour les serums bas, moyens et forts). Inter-essai et inter-lot
Les concentrations en ACE, exprimees en ng mL-I, sont en moyenne de 5,60 ± 0,25 pour les serums bas, de 47,12 ± 1,98 pour les serums moyens et de 118,41 ± 7,01 pour les serums fortS Le profil de precision inter-essai est reproduit sur la fiK'm 2. Les coefficients de variation sont compris entre 4,2 et 5,9 %.
~
= .S= = 'C
10 9
8
'T'""'----------+--.-----.--..- -.
.
~
- 7+------------• +:----------::;IJII'.....c~::;;..-.... +-.-----.-.---.-- -. .•- +------------QI
~ ~
g: Col
IS
8
6 +---------~~-5 'e.-. ----__ 4 L':_::: .•.•::~~_ ~:::: . 3 2
1
o 1'------+------+:------1: o 50 100 150 Concentration en ng/ml
Fig 2. Raproductibilite intar-essai.
Tableau I. Linearite at raproductibilite des standards. Standard n
M ± a (cpm) CV% DC/C%
o n9 mL-'
1 ng mL-'
5 ng mL-'
20n9 mL'
100 n9 mL-'
20 80 ± 8 9,99
20 335 ± 24 7,25 9,5
10 1357 ± 64 4,69 4,7
10 5623 ± 246 4,38 4,3
10 29107 ± 656 2,25 2,7
380 ng mL
I
10 80675 ± 1976 2,45 2,8
Lo repr~u~tibilit8 ~s .ston~rds 0 ite esti.mee ~n.mesuront 20 ~ois les s~~dords 0 ~t.l ~ mL:' ~u .sein d'une mime sene. Les standords 5, 20, 100 et 380 n9 mL" ont ete mesures due Io,s dons celie meme sene. Les parometres stotost'ques ont ete determ,nes a partir de 10 rodiooctiviti mesuree
P Morel et 01 •
Viei/lissement
250
i
Les resulrats sont presentes dans Ie tab/~au II. Aucune dif• ference significative n'a ete observee entre les dosages realises au cours du vieillissement de la trousse.
i
Exactitude
.e
.SI .S2 .S3
oil 200
c: c: 41 ~
--.=.
Les resultats sont presentes sur les figur~s 3 et 4. Les resultats obtenus sur Ie test de dilution (figure 3) mon• trent que les pourcentages de recuperation varient de 75 a 168 %. Pour certains serums. les concentrations dosees apres dilution montrent que les mesures des serums purs dont la concentration en ACE est comprise entre 100 et 380 ng mI.-I sont sous-estimees. Les resulrats obtenus sur Ie test de surcharge (figur~ 4) mon• trent que les pourcentages de recuperation s'echelonnent de 91 %il 114 %.
ISO
c: til
.i 100 c41: y c:
U=
SO 0 0
Derive Les tests de Student montrent qu'il n'y a pas de difference significative entre les concentrations obtenues (derive sur la distribution). quelque soit Ie temps d'incubation. si la gamme standard et les echantillons incubent pendant la meme duree. EHet du mode de pre/evement
Les resulrats obtenus (M ± (J) sur les cinq echantillons de sang. preleves chez cinq patients. sont : recueil sur tube sec (1.62 ± 1.14 ng ACE mL-I). recueil sec ± gel separateur (1.70 ± 1,06 ng ACE mI.-I). recueil sur tube EDTA (1.72 ± 1.67 ng ACE mL-I) et recueil sur tube heparine (1, '56 ± 1.2'5 ng mL-I). Aucune difference significative n'a etc observee entre les divers echantillons prelevcs sur des tubes differents. Influence de 10 composition du serum
Chez les sujets ayant respectivement une concentration en triglycerides de 3.2 g L-I, 5,13 g L I. 5.37 g L 1,9,21 g L-I et
1
0,5 Dilution
Fi, 3. Tests de dilution. 10,6 g L-1. les concentrations en ACE etaient de 0,2 ng mL I ; 0.8 ng mL-' ; 0,5 ng mL-' ; 2.4 ng mL I ; 1.9 ng mL I. Ces resultats ont ete compares aux concentrations d'ACE obte• nues chez une population de 25 hommes et de 25 temmes egalement exempts de pathologie tumorale (concentrations moyennes respcetives 1.18 ± 0.67 ng mL 1et 1,12 ± 0.73 ng mL 1). Les resultats ne montrent pas de difference significa• tive entre sujets hyperlipidemiques et sujets sains. Correlation
La figure 5 reprcsente la correlation des concentrations ACE Immunotech lACE CIS bio International oo . L'equation de la droite de regression cst: ACE Immunotcch = 0.6 CIS bio International"J + 10.4 (r = 0,896)
Tableau II. Stabilite du Iraceur Serums bas
M
(J
n Analy d varlanc
)0 5,8 0,26 4
5 .rums moyens Fm )1/2 5,8 0,42 4
5,8 0,22 4
)0
+15; 6,15 0,24 4
45,63 0,77
~
4
serums forts Fin
)1/2
44,58 1,22
~
4
43,50 1,23
~
4
F - 2,74 NS
F - 1,37 NS
a
)0
)//2
121,8 4,07
120,5 2,58
4
4
+15, 45,05 1,06
~
4
~
Fin
+15,
121,2 2,24
123,7 2,41
4
4
~
F - 0,90 NS
10 Do$Oges eHecrves avec 10 trovsse ACI Immunoe.ch 10 reception de cene dermere 1 I /2 Dowges eHectuilS avec 10 trovsse ACI ImmunoNch en m,loev de vol,d.te lIon Dowges eHectves avec 10 Irovue ACllmmunoNch a 10 dole de peremption de 10 trousse 1+ 15 Dosages eHeclues avec 10 Irousse ACllmmunoNch 15 lOUrs opres 10 dote de peremption de 10 trousse II n'exlSte oucune diHerence SlgmllColove des concentrations au cours du v,e,IIlSsement de la Irousse ACE ImmunNch (analyse de varlancel.
•
Techniques au quotidien
-.L.E
300
l. 3SO E oil c 300 c 250
.3,2 nglml • 6,8nglml .12 nglml
oil c 250 c~ rJ 200
=
u
-=jg ISO .•...= ...cf
~
Eo-
0
~
u=
..,..
200
:z ISO
;;l
100
..
100
u
50
~ ~
~
C
•
~
SO
~
-<
0 0
100 200 Ajouts en ng/ml
300
AI •
"..
•• • •• •
• •
••
•
0 0
I
100
200
300
400
CIS BIO en ng/ml Fig 4. Tests de surcharge.
Vo/eurs normo/es Les valeurs normales ant ete obtenues par calcul du 97,5< percentile et sont inferieures a3 ng mL-I. II n'existe pas de dif• ference significative entre les valeurs normales obtenues chez la femme et celles obtenues chez I'homme (p> 0,01).
Discussion et conclusion La trousse proposee par les Laboratoires Immunotech pour Ie dosage de I'antigene carcino-embryonnaire dans Ie serum presente, sur Ie plan analytique. toutes les qualites que I'on peut attendre d'une bonne trousse de radio-immunodosage. En effet, I'ensemble des resultats obtenus au cours de cette evaluation montre que Ie dosage immunoradiometrique de I'ACE presente une precision excellente (Ies CV obtenus sont faibles), une bonne sensibilite (limite de detection de 0,1 ng mL-'), et plusieurs autres avantages: Ie test est de mani• pulation aisee. d'execution rapide, exigeant un materiel peu sophistique a I'exception du compteur de radioactivite et necessite une faible prise d'essai. Par ailleurs la correlation avec la rrousse CIS bio International~est correcte. Le dosage de I'ACE par la trousse Immunotech est fiable: I'etude dinique ne montre pas de dif• ference significative entre les hommes et les femmes. et les concentrations ACE ne sont pas influencees par des facteurs techniques (mode de prelevement de I'echantillon sanguin) et physiopathologiques (hyperlipidemie). Le test de dilution, qui a pour but de reveler la presence d'une erreur absolue (source d'inexactitude), montre neanmoins que la mesure des serums purs, dont la concentration en ACE se situe entre 100 et 380 ng mL-'. est sous-estimee et qu'il est preferable de diluer les serums pathologiques a partir de 100 ng mL-',
Fig 5. Correlation avec CIS bio Immunotech - 0,6 CIS bio + 10,4
n - 51; ,- 0,896.
meme si la gamme est etendue jusqu'a 380 ng mL-'. Cette remarque s'applique toutefois de la meme faeron a la trousse Cis bio International@.
References Burtin 1'. us amigenes carcin~mbryonnaires. Path BIoI 1980 . 28 (8) : 489-492 2 Gold 1'. Freedman so. Demonstration of rumor-speCIfic dmigens in human colonic carcinomata by immunologicallOlerance dnd absorpllon technique. J Exp M~d 1965 ; 12 J : H9-462 3 Kim ¥H. Ajani JA. Ota OM. Lynch P. ROlh JA. Value of serial carci• n~mbryonic amigen levels in patiems with resectable adenocarcinoma of the esophagus and slOmach. Canca 1995 ; 75(2) : 451-456 4 K1eisbauer JP. Ca-relnau O. Thomas P. Ramirl'"l J. l..lmedume A, Roux F. Valeur pronostique du taux pretherapeutique de I'antigene carci• noembryonnaire dans les cancel> bronchiques primitif.~. Hull Cimc~r 1995; 82; 1019-1024 S Lucha PA. Rosen l., Olenwine JA. Reed JF, Riether RD. Stasik JJ. Khu~chandani r~. Value of carcinoembryonic anllgen monilOring in curallve surgery for recurrem coloreCldl carcinonu. DIS Colo1l R~etum 1997;40(2) :86(~867 6 Meier R, Raby N. Boussard H. Cham" A. l.'dmigene carcinoembryon• naire. ACE. (yon Pharmauutlqu~ 1991 ; 42 (4) : .i45- ,is I 7 Pelissier E. Bosset JF. Meneveau N. Imeret du dosage sanguan des mar• queurs tumoraux dam Ie depistage de, recidlves du cancer ,olnteCld!. Bull Canur 1994 ; 81 : 1050-1056 8 Villalba Ferrer 1', Bernal Sprekelsen JC Fmler Didna CA, A~emi Perez J. Vazquez Prado A, Garcia Coret MJ. Pill'hades (;il F. Trullen'llle Pens R. Multiple colon rumors. diagnoSiS and fi,llnw-up of 45ll pdlients with colorectal carcinoma. R~v Esp Enftrm [J,X 1997 ; 119 (10) : 759-76j <) ¥uceyar S. Erturk S. Oirican A. Cengil A. Saner II. The rule nf aWle• ph.LSe reaClant proleins. carcinoembrynnic allligen dnd CA 19-9 as d marker in the preoperalive sldging ofwlor"'·I,.1 ,'dn,'~r : .'prosp'·' live cli• nical sludy. 1m Su'X 1996 ; III (2) : I j(~ I j<) III ¥chou M, Rougier Ph. Bidart )11.1, Bdlel D. '1 i{!dlld 1M, Bohunn C. Interct des marqueurs tumnrdUX en canc<'rulngll' dlge'ti"e. S~III Hop Pam 1990; 66 (10) : 527-5.H