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Expresión de p63 y p73 en neurinomas del acústico y estudio de su posible relevancia clínica
Acta Otorrinolaringol Esp. 2012;63(1):9---14
www.elsevier.es/otorrino
ARTÍCULO ORIGINAL
Expresión de p63 y p73 en neurinomas del acústico y estudio de su posible relevancia clínica Xabier Altuna a,∗ , Jesús Algaba a y Weg Ongkeko b a b
Servicio de ORL, Hospital Donostia, San Sebastián, Guipúzcoa, Espa˜ na Department of Otolaryngology and Head and Neck Surgery, University of California, San Diego, San Diego, EE.UU
Recibido el 10 de abril de 2011; aceptado el 5 de agosto de 2011 Disponible en Internet el 13 de octubre de 2011
PALABRAS CLAVE p63; p73; Inmunihistoquímica; Neurinoma acústico; Schwannoma
∗
Resumen Objetivos: Determinar la expresión de p73 y p63 en muestras de neurinomas del acústico y estudiar su posible relevancia clínica. Material y método: Se realiza un estudio retrospectivo de 34 neurinomas del acústico intervenidos durante un período de tres a˜ nos (2001-2003). Se revisan sus historias clínicas y se realiza un estudio inmunohistoquímico para valorar la expresión de p63 y p73 en las muestras histológicas y la correlación con los hallazgos clínicos más relevantes. Resultados: En el 41% de las muestras se observó una sobre-expresión de p63 y p73 siendo la correlación entre ambas proteínas del 100%. La edad de los pacientes con tinción positiva era mayor que la de los pacientes con tinción negativa sin llegar esta diferencia a ser estadísticamente significativa. El tama˜ no tumoral era mayor en los casos positivos, pero la diferencia tampoco ha llegado a niveles significativos. No existe correlación entre la expresión de los marcadores y el sexo, lado anatómico ni audiometría. Discusión y conclusión: Se observa inmunotinción positiva para p63 y p73 en casi la mitad de los neurinomas estudiados. A pesar de encontrar que estas proteínas están más expresadas en casos de mayor edad y mayor tama˜ no, la diferencia no ha llegado a valores significativos, posiblemente por el número limitado de muestras en el análisis. Sin embargo, la expresión de estas proteínas en casi la mitad de los pacientes tratados, puede significar que juegan un papel en el desarrollo y progresión de estos tumores, aunque sería necesario realizar estudios futuros para determinar este papel. © 2011 Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.
Autor para correspondencia. Correo electrónico: [email protected] (X. Altuna).
0001-6519/$ – see front matter © 2011 Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados. doi:10.1016/j.otorri.2011.08.002
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X. Altuna et al
KEYWORDS p63; p73; Immunohistochemistry; Acoustic neuroma; Schwannoma
Expression of p63 and p73 in acoustic neuroma and its possible clinical relevance Abstract Objectives: Assess p63 and p73 expression in acoustic neuroma and its correlation with clinical and radiological findings. Materials and methods: medical records of 34 patients who were operated on for acoustic neuroma during a 3-year period (2001-2003) were evaluated retrospectively. Immunohistochemical analysis of the schwannoma was performed with p63 and p73 antibodies and clinical patient characteristics were correlated with the immunoreactivity results. Results: 41% of the acoustic neuroma specimens showed p63 and p73 staining. Correlation between both proteins was 100%. Age of the patients tended to be older when staining was positive, but no statistical significance was achieved. Likewise, tumour size was bigger for positive tumours but, again, this difference was not statistically significant. There was no correlation between gender and immunostaining. Discussion and Conclusions: Expression of p63 and p73 was demonstrated in almost half of the patients studied. Although both proteins were more prevalent in older patients and bigger tumours, this difference was not statistically significant, probably due to the reduced sample size. No differences were found in laterality, gender or audiogram. However, the expression of these two proteins in almost half of the tumours shows that they can play a role in the development and progression of acoustic neuromas, although further studies are needed. © 2011 Elsevier España, S.L. All rights reserved.
Introducción Los neurinomas del acústico (NA) son tumores raros y de crecimiento lento que se originan de las células de Schwann del VIII par craneal y la mayoría lo hacen a partir del nervio vestibular. Su biología molecular es aún poco conocida y ello dificulta tanto la comprensión de su origen y evolución, como el desarrollo de un eventual tratamiento médico. Un grupo de pacientes que desarrolla NA padecen una enfermedad de carácter hereditario, autosómico dominante, conocida como neurofibromatosis tipo II (NF II), que clínicamente se caracteriza por NA bilaterales y otros tumores intracraneales y medulares. El gen NF2, localizado en el cromosoma 22q1 , es un gen supresor de tumor que funciona como un regulador crítico del crecimiento de las células de Schwann, siendo la inactivación del gen NF2 un paso esencial en la tumorogénesis que ocurre en estos pacientes. La pérdida del cromosoma 22q ha sido demostrada en el 45% de los casos esporádicos2 y la inactivación bialélica en casi el 100% de los NA en enfermos NF23 . Las formas esporádicas suponen el 95% de todos los NA diagnosticados. Además del gen NF2, existen otros genes implicados en la génesis de los NA. Los genes de la familia de la neuregulina parece que actúan como mitógenos de las células de Schwann4 . Estas proteínas actúan vía la familia de receptores c-erb, siendo c-erb 2 y 3 los receptores por excelencia en las células de Schwann5---7 . Los factores de crecimiento fibroblásticos y sus receptores (FGFR) también tienen un efecto mitógeno en las células de Schwann8 habiendo sido descrita una relación entre la expresión de FGFR y el crecimiento tumoral9 . La expresión de diferentes citocinas y otros factores que pueden regular la proliferación de las células de Schwann ha sido descrita en diferentes estudios como se enumera a continuación: estudios sobre el Ki-6710 ,
el antígeno nuclear celular proliferante11 , el receptor del factor de crecimiento nervioso12 , el receptor del factor de crecimiento de transformación, factor de crecimiento fibroblástico, factor de crecimiento endotelial, factor de crecimiento pidérmico6,7,12---16 y ciclina D1 y D317,18 entre otros. Actualmente, el papel que pueda jugar p53, gen supresor de tumores que se encuentra mutado en más del 50% de todos los cánceres, en la génesis de los NA es poco conocido. Mientras varios estudios han demostrado que la contribución de p53 en la génesis de NA es poco probable19,20 , otro estudio reciente indica que la pérdida de heterocigosidad de p53 ocurre en un número significativo de casos estudiados21 . Los genes P63 y p73 pertenecen a la familia del p53 con grandes similitudes estructurales. Su presencia ha sido demostrada en diferentes tipos de tumores humanos y en algunos de ellos como los tumores de mama, vejiga, tumor hepatocelular o leucemia linfoide crónica tipo B con valor pronóstico negativo22 . En el presente estudio hemos querido observar la expresión de p63 y p73 por inmunohistoquímica (IHQ) en muestras de NA intervenidos en nuestro centro. Asimismo hemos querido valorar la posible relación de esta expresión de proteínas con determinados datos obtenidos de las historias clínicas de los pacientes.
Material y métodos Pacientes y revisión de historias clínicas Se revisan las historias clínicas de todos los pacientes diagnosticados e intervenidos de NA en el servicio de Otorrinolaringología del Hospital Donostia de San Sebastián entre enero de 2000 y diciembre de 2002. Se recogen los datos
Expresión de p63 y p73 en neurinomas del acústico y estudio de su posible relevancia clínica demográficos de dichos pacientes: edad, sexo y síntomas, así como la información obtenida de las exploraciones físicas a las que se les sometieron y de la intervención quirúrgica: audiograma, tama˜ no tumoral, abordaje quirúrgico, morbilidad y fecha de la última visita.
Inmunohistoquímica y anticuerpos empleados Los estudios IHQ se realizaron usando anticuerpos monoclonales de ratón desarrollados en el laboratorio del epartamento de Head and Neck Surgery de la Universidad de California San Diego en colaboración con Imgenex, San Diego, California. Ambos anticuerpos se usaron diluídos 1:100 en PBS. Los controles positivos fueron muestras de carcinoma escamoso de cabeza y cuello, los controles negativos se realizaron con el mismo tejido de NA, pero sin a˜ nadir el anticuerpo y como controles normales se empleó tejido nervioso de cadáver (VIII par craneal). Las muestras de tejido se fijaron en solución de formaldehído tamponado al 4% y embebidas en parafina. Se realizaron cortes de 4 micras a partir de los bloques y se montaron en portaobjetos de 3-aminopropyltriethoxysilane especialmente preparados para tinción IHQ. Se incubaron durante una hora a 60 ◦ C, se desparafinizaron en xileno y rehidrataron con etanol de diferentes grados sucesivamente. Se realizó la amplificación antigénica incubando las muestras en una olla a la máxima presión con la solución de DAKO Target Retrieval. La peroxidasa endógena se retiró con H2 O2 al 3%. Con el fin de evitar uniones no específicas se incubaron las muestras en una solución para bloquear la unión no específica de biotina-avidina durante 30 minutos (Protein Block Serum-Free, DAKO, Carpinteria, CA, USA). La tinción de fondo se redujo incubándolo con suero de cabra (1:20) durante 60 minutos. Se colocó el anticuerpo primario y se incubaron durante una hora a temperatura ambiental. Posteriormente se usaron los anticuerpos secundarios conjugados con Strptadivine/HRP (LSAB2, DAKO, Carpinteria, CA, EE.UU.). La contratinción se realizó con hematoxilina de Gill II.
Evaluación de la tinción Los casos se consideraron como positivos si la tinción era al menos dos veces más (2 + ) en una escala de 1 al 4 + y si el 20% o más de las células tumorales estaban te˜ nidas sobre el trasfondo sano o sobre el control negativo. Se evaluaron solo las áreas alejadas de los bordes que no estuvieran cauterizadas ni artefactadas ni excesivamente arrugadas. Se ha evaluado como positiva la inmunotinción nuclear.
Estudio estadístico Cuando quisimos asociar la edad o el tama˜ no tumoral con la expresión de los genes empleamos la prueba t de Student y cuando quisimos evaluar la asociación existente entre el sexo de los pacientes, audiometría o lado anatómico y la expresión de ambos genes se empleó la prueba de Chicuadrado.
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Resultados Datos obtenidos de la historia clínica de los pacientes Se estudiaron un total de 34 pacientes (tabla 1). La edad media de la muestra fue de 49,5 a˜ nos (rango: 25-72), con un ratio hombre/mujer de 19:15. Veinte tumores fueron del lado izquierdo y 14 del derecho. No hay casos de tumores bilaterales en esta cohorte de pacientes. El síntoma más frecuente fue el de la pérdida auditiva seguida por tinnitus y desequilibrio. Cuatro pacientes tenían hipoestesia en el área trigeminal en el momento del diagnóstico y en dos casos había parálisis del nervio facial (ambos grado III en la escala de House-Brackmann). Los datos audiométricos han sido encontrados en 31 de los 34 casos estudiados. Todos ellos demostraron hipoacusia neurosensorial asimétrica que en 18 casos era profunda. Los restantes 13 pacientes tenían curvas audiométricas comprendidas entre los 35 y 65 dB. Se realiza audiometría verbal y cálculo del umbral de recepción verbal (URV) en 20 de los 34 casos operados y se observan curvas de URV por debajo de 50 dB 15 de estos 20 casos. En todos los pacientes se realizó resonancia magnética nuclear (RMN) y en 12 casos se realizó también una tomografía axial computarizada (TAC) además de la RMN. El tama˜ no tumoral está representado en la tabla 1 y se observa que la media medida en milímetros fue de 17,1 (3-40 mm de rango) tomando como medida el diámetro máximo tumoral. En 4 pacientes se efectúo abordaje por fosa media, en 10 casos el abordaje fue retrosigmoideo y en los restantes 20 casos el abordaje fue translaberíntico. La elección del abordaje depende del tama˜ no tumoral (tama˜ no mayor de 1 cm o extensión más allá del conducto auditivo interno [CAI] no se realiza abordaje por fosa media), de la audición o posibilidad de conservación de la audición (si existe una audición buena o útil y posibilidad de conservarla, dependiendo del tama˜ no se opta por abordaje por fosa media o retrosigmoideo) y, por último, se tiene en cuenta la extensión lateral del tumor en el CAI (si se extiende lateralmente más allá de la porción media del CAI no optamos por abordaje retrosigmoideo).
Expresión de los supresores de tumores p63 y p73 en los neurinomas del acústico La expresión de p63 en las muestras de NA se observó en 14 de las 34 preparaciones (41,2%) y la expresión de p73 fue exactamente la misma, siendo la concordancia entre ambas proteínas del 100%. Es decir, todos los p63 positivos eran p73 positivos y además lo eran en intensidad casi idéntica (fig. 1A y B). La edad media para los casos de inmunotinción positiva (ambos marcadores, p63 y p73) fue de 53,1 a˜ nos, mientras que en los casos con inmunotinción negativa, la edad media fue menor, 46,9 a˜ nos. No obstante, esta diferencia en expresión relacionada con laedad no llegó a valores estadísticamente significativos (p = 0,22). Al comparar el tama˜ no tumoral en los casos de inmunotinción positiva (19,8 mm) con respecto a los de inmunotinción negativa (15,2 mm), a pesar de encontrar tumores de
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X. Altuna et al
Tabla 1 N.
◦
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
Datos demográficos de los pacientes
Sexo
Edad (a˜ nos)
Lado
M M F F M F M M M F M F F M M M M F M M M F F M F F F M M M F F M F
25 68 45 63 60 28 72 60 56 60 57 45 64 32 59 65 29 51 64 53 57 58 28 61 49 26 25 30 48 59 63 46 42 34
I I I I I I I D I I I D I D I D I D I D D I D D D D I I I D I D I D
Tama˜ no máximo ∅ (mm) 15 10 25 12 10 30 10 20 15 12 40 3 25 8 20 8 15 8 10 7 8 15 30 ¿? ¿? 40 32 25 10 35 8 ¿? 15 10
Audiometría tonal (promedio frecuencias 0,5-1-2 KHz)
Audiometría (URV)
Abordaje
< 90 dB 35 dB 30 dB < 90 dB 35 dB 75 dB 65 dB 80 dB < 90 dB < 90 dB 55 dB < 90 dB 40 dB 45 dB 80 dB 35 dB 20 dB 20 dB < 90 dB < 90 dB < 90 dB 50 dB < 90 dB ¿? ¿? < 90 dB < 90 dB < 90 dB < 90 dB 60 dB 35 dB ¿? 55 dB 50 dB
<90 dB 40 dB 35 dB < 90 dB 50 dB < 80 dB < 80 dB < 80 dB < 90 dB < 90 dB 60 dB < 90 dB 50 dB 50 dB < 90 dB 35 dB 20 dB 20 dB < 90 dB < 90 dB < 90 dB 50 dB < 90 dB ¿? ¿? < 90 dB < 90 dB < 90 dB < 90 dB < 80 dB 60 dB ¿? 60 dB 50 dB
Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Fosa media Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Fosa media Translaberíntico Fosa media Fosa media Translaberíntico Retrosigmoideo Retrosigmoideo Retrosigmoideo Retrosigmoideo Retrosigmoideo Retrosigmoideo Translaberíntico Retrosigmoideo Retrosigmoideo Retrosigmoideo Retrosigmoideo Translaberíntico
mayor tama˜ no entre las muestras que te˜ nían de forma positiva, esta diferencia tampoco llegó a valores significativos (p = 0,19). En cuanto a la lateralidad de los tumores, hay más lados izquierdos que derechos, 20 frente a 14. En los tumores
Figura 1
izquierdos, el 55% eran p63/73 positivos mientras que en los del lado derecho, sólo el 21% eran positivos, sin embargo, esta diferencia no mostró valores significativos. Se dividió a los pacientes en dos grupos dependiendo de la audiometría, en el primer grupo aquéllos donde la media
Expresión de p63 (A) y p73 (B) por inmunohistoquímica en neurinomas del acústico.
Expresión de p63 y p73 en neurinomas del acústico y estudio de su posible relevancia clínica de las tres frecuencias (500-1000-2000 Hz) era superior o mejor a 60 dB y el segundo en el que este resultado era peor que 60 dB. En el primer grupo el 46% era positivo para las proteínas estudiadas y en el segundo el 39%. Diferencias no significativas en ninguno de los dos casos. Tampoco existió correlación entre la expresión de los marcadores y el sexo del paciente.
Discusión La biología molecular de los NA es aún poco conocida y sabemos que dicho conocimiento nos haría entender mejor la génesis, desarrollo y progresión de estos tumores. Asimismo, cuanto más se conoce acerca de la biología molecular de los tumores, mayores posibilidades tendríamos de poder desarrollar nuevas terapias6,7,23 . Actualmente, a los pacientes con NA se les ofrece una de las siguientes opciones: 1) extirpación quirúrgica del tumor, 2) radiación estereoatáxica o 3) observación y seguimiento con RMN. En las últimas décadas ha existido un gran desarrollo en las técnicas quirúrgicas, sin embargo, existe un grupo de pacientes con afección de base en los que la cirugía, a pesar de sus progresos, pueda estar contraindicada; asimismo ha crecido el número de pacientes que se diagnostican de manera fortuita y en los que no existe síntoma alguno e incluso pacientes con NA en oído único o NA bilaterales en los que la posibilidad de poder tratarlos de manera farmacológica, podría revolucionar su manejo. Aunque tan solo se consiguiera una respuesta parcial, el hecho de evitar cirugía en este grupo de pacientes determinado sería un éxito y un gran avance. En este estudio hemos demostrado la presencia por IHQ en casi la mitad de los pacientes estudiados (41%) de p63 y p73, genes supresores de tumores de la familia de p53 con la que comparten numerosas similitudes estructurales. Dicha similitud estructural es aún mayor entre ellas mismas, es decir, entre p63 y p73. En este trabajo observamos que su expresión en los 34 casos muestra una concordancia del 100%. Sería necesario conocer mejor la función de cada uno de estos genes en los NA para poder explicar el por qué de esta concordancia, así como conocer qué isoforma de cada una de ellas es la que está actuando en estos tumores. Recientemente ha sido demostrado el papel que p63 y p73 juegan en el desarrollo y regulación de células neurales y en la neurogénesis del sistema nervioso central (SNC)24 . Existen diferentes isoformas de cada uno de los genes que pueden actuar de forma pro-apoptótica (Tap63 y TA p73) o anti-apoptótica (Np63 y Np73). La isoforma TA (transcroptional activation) mimetiza las funciones del p53 e induce apoptosis mientras que la isoforma N suprime a la TA, así como a la p53 consiguiendo así su función oncogénica. En diferentes estudios se ha demostrado que la isoforma TA del p73 (TAp73) determina una sensibilidad de las células tumorales a diversos agentes quimioterápicos en casos de carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello, así como carcinoma anaplásico de tiroides25,26 . Por desgracia, no existe posibilidad por IHQ de diferenciar entre estas dos isoformas de la proteína, por lo que no sabemos cuál de ellas está expresada en el 41% de casos positivos de este estudio27 .
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Hemos querido observar si la expresión de estas proteínas podía jugar un papel clínico o evolutivo de la enfermedad analizando datos de las historias clínicas como tama˜ no tumoral y edad fundamentalmente, así como lado anatómico, datos de la audiometría y sexo de los pacientes. Aunque se ha observado que los casos p63/p73 positivos se correlacionan con pacientes de mayor edad y con tama˜ nos tumorales mayores, ninguna de estas diferencias alcanzó niveles estadísticamente significativos, posiblemente por el número limitado de muestras en el análisis. Asimismo, se han observado un mayor porcentaje de casos positivos entre los tumores del lado izquierdo, pero este hecho además de no llegar a valores significativos, consideramos que carece de interés en nuestra muestra particular a pesar de que en algunas publicaciones se ha intentado relacionar el uso del teléfono móvil con el desarrollo de NA28 y el lado anatómico ha sido por ello objeto de estudio en esos trabajos. Por último, al correlacionar la expresión de las proteínas y audiometría vemos que los datos estudiados no permiten correlacionarlos, al menos de una forma significativa, si bien en esta muestra tampoco el tama˜ no tumoral se correlacionó con peores resultados audiométricos. No obstante, la expresión de estas proteínas en casi la mitad de los pacientes tratados, puede significar que juegan un papel en el desarrollo y progresión de estos tumores, aunque sería necesario realizar estudios futuros para determinar este papel.
Conflicto de intereses Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
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PALABRAS CLAVE p63; p73; Inmunihistoquímica; Neurinoma acústico; Schwannoma
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Resumen Objetivos: Determinar la expresión de p73 y p63 en muestras de neurinomas del acústico y estudiar su posible relevancia clínica. Material y método: Se realiza un estudio retrospectivo de 34 neurinomas del acústico intervenidos durante un período de tres a˜ nos (2001-2003). Se revisan sus historias clínicas y se realiza un estudio inmunohistoquímico para valorar la expresión de p63 y p73 en las muestras histológicas y la correlación con los hallazgos clínicos más relevantes. Resultados: En el 41% de las muestras se observó una sobre-expresión de p63 y p73 siendo la correlación entre ambas proteínas del 100%. La edad de los pacientes con tinción positiva era mayor que la de los pacientes con tinción negativa sin llegar esta diferencia a ser estadísticamente significativa. El tama˜ no tumoral era mayor en los casos positivos, pero la diferencia tampoco ha llegado a niveles significativos. No existe correlación entre la expresión de los marcadores y el sexo, lado anatómico ni audiometría. Discusión y conclusión: Se observa inmunotinción positiva para p63 y p73 en casi la mitad de los neurinomas estudiados. A pesar de encontrar que estas proteínas están más expresadas en casos de mayor edad y mayor tama˜ no, la diferencia no ha llegado a valores significativos, posiblemente por el número limitado de muestras en el análisis. Sin embargo, la expresión de estas proteínas en casi la mitad de los pacientes tratados, puede significar que juegan un papel en el desarrollo y progresión de estos tumores, aunque sería necesario realizar estudios futuros para determinar este papel. © 2011 Elsevier España, S.L. Todos los derechos reservados.
Autor para correspondencia. Correo electrónico: [email protected] (X. Altuna).
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X. Altuna et al
KEYWORDS p63; p73; Immunohistochemistry; Acoustic neuroma; Schwannoma
Expression of p63 and p73 in acoustic neuroma and its possible clinical relevance Abstract Objectives: Assess p63 and p73 expression in acoustic neuroma and its correlation with clinical and radiological findings. Materials and methods: medical records of 34 patients who were operated on for acoustic neuroma during a 3-year period (2001-2003) were evaluated retrospectively. Immunohistochemical analysis of the schwannoma was performed with p63 and p73 antibodies and clinical patient characteristics were correlated with the immunoreactivity results. Results: 41% of the acoustic neuroma specimens showed p63 and p73 staining. Correlation between both proteins was 100%. Age of the patients tended to be older when staining was positive, but no statistical significance was achieved. Likewise, tumour size was bigger for positive tumours but, again, this difference was not statistically significant. There was no correlation between gender and immunostaining. Discussion and Conclusions: Expression of p63 and p73 was demonstrated in almost half of the patients studied. Although both proteins were more prevalent in older patients and bigger tumours, this difference was not statistically significant, probably due to the reduced sample size. No differences were found in laterality, gender or audiogram. However, the expression of these two proteins in almost half of the tumours shows that they can play a role in the development and progression of acoustic neuromas, although further studies are needed. © 2011 Elsevier España, S.L. All rights reserved.
Introducción Los neurinomas del acústico (NA) son tumores raros y de crecimiento lento que se originan de las células de Schwann del VIII par craneal y la mayoría lo hacen a partir del nervio vestibular. Su biología molecular es aún poco conocida y ello dificulta tanto la comprensión de su origen y evolución, como el desarrollo de un eventual tratamiento médico. Un grupo de pacientes que desarrolla NA padecen una enfermedad de carácter hereditario, autosómico dominante, conocida como neurofibromatosis tipo II (NF II), que clínicamente se caracteriza por NA bilaterales y otros tumores intracraneales y medulares. El gen NF2, localizado en el cromosoma 22q1 , es un gen supresor de tumor que funciona como un regulador crítico del crecimiento de las células de Schwann, siendo la inactivación del gen NF2 un paso esencial en la tumorogénesis que ocurre en estos pacientes. La pérdida del cromosoma 22q ha sido demostrada en el 45% de los casos esporádicos2 y la inactivación bialélica en casi el 100% de los NA en enfermos NF23 . Las formas esporádicas suponen el 95% de todos los NA diagnosticados. Además del gen NF2, existen otros genes implicados en la génesis de los NA. Los genes de la familia de la neuregulina parece que actúan como mitógenos de las células de Schwann4 . Estas proteínas actúan vía la familia de receptores c-erb, siendo c-erb 2 y 3 los receptores por excelencia en las células de Schwann5---7 . Los factores de crecimiento fibroblásticos y sus receptores (FGFR) también tienen un efecto mitógeno en las células de Schwann8 habiendo sido descrita una relación entre la expresión de FGFR y el crecimiento tumoral9 . La expresión de diferentes citocinas y otros factores que pueden regular la proliferación de las células de Schwann ha sido descrita en diferentes estudios como se enumera a continuación: estudios sobre el Ki-6710 ,
el antígeno nuclear celular proliferante11 , el receptor del factor de crecimiento nervioso12 , el receptor del factor de crecimiento de transformación, factor de crecimiento fibroblástico, factor de crecimiento endotelial, factor de crecimiento pidérmico6,7,12---16 y ciclina D1 y D317,18 entre otros. Actualmente, el papel que pueda jugar p53, gen supresor de tumores que se encuentra mutado en más del 50% de todos los cánceres, en la génesis de los NA es poco conocido. Mientras varios estudios han demostrado que la contribución de p53 en la génesis de NA es poco probable19,20 , otro estudio reciente indica que la pérdida de heterocigosidad de p53 ocurre en un número significativo de casos estudiados21 . Los genes P63 y p73 pertenecen a la familia del p53 con grandes similitudes estructurales. Su presencia ha sido demostrada en diferentes tipos de tumores humanos y en algunos de ellos como los tumores de mama, vejiga, tumor hepatocelular o leucemia linfoide crónica tipo B con valor pronóstico negativo22 . En el presente estudio hemos querido observar la expresión de p63 y p73 por inmunohistoquímica (IHQ) en muestras de NA intervenidos en nuestro centro. Asimismo hemos querido valorar la posible relación de esta expresión de proteínas con determinados datos obtenidos de las historias clínicas de los pacientes.
Material y métodos Pacientes y revisión de historias clínicas Se revisan las historias clínicas de todos los pacientes diagnosticados e intervenidos de NA en el servicio de Otorrinolaringología del Hospital Donostia de San Sebastián entre enero de 2000 y diciembre de 2002. Se recogen los datos
Expresión de p63 y p73 en neurinomas del acústico y estudio de su posible relevancia clínica demográficos de dichos pacientes: edad, sexo y síntomas, así como la información obtenida de las exploraciones físicas a las que se les sometieron y de la intervención quirúrgica: audiograma, tama˜ no tumoral, abordaje quirúrgico, morbilidad y fecha de la última visita.
Inmunohistoquímica y anticuerpos empleados Los estudios IHQ se realizaron usando anticuerpos monoclonales de ratón desarrollados en el laboratorio del epartamento de Head and Neck Surgery de la Universidad de California San Diego en colaboración con Imgenex, San Diego, California. Ambos anticuerpos se usaron diluídos 1:100 en PBS. Los controles positivos fueron muestras de carcinoma escamoso de cabeza y cuello, los controles negativos se realizaron con el mismo tejido de NA, pero sin a˜ nadir el anticuerpo y como controles normales se empleó tejido nervioso de cadáver (VIII par craneal). Las muestras de tejido se fijaron en solución de formaldehído tamponado al 4% y embebidas en parafina. Se realizaron cortes de 4 micras a partir de los bloques y se montaron en portaobjetos de 3-aminopropyltriethoxysilane especialmente preparados para tinción IHQ. Se incubaron durante una hora a 60 ◦ C, se desparafinizaron en xileno y rehidrataron con etanol de diferentes grados sucesivamente. Se realizó la amplificación antigénica incubando las muestras en una olla a la máxima presión con la solución de DAKO Target Retrieval. La peroxidasa endógena se retiró con H2 O2 al 3%. Con el fin de evitar uniones no específicas se incubaron las muestras en una solución para bloquear la unión no específica de biotina-avidina durante 30 minutos (Protein Block Serum-Free, DAKO, Carpinteria, CA, USA). La tinción de fondo se redujo incubándolo con suero de cabra (1:20) durante 60 minutos. Se colocó el anticuerpo primario y se incubaron durante una hora a temperatura ambiental. Posteriormente se usaron los anticuerpos secundarios conjugados con Strptadivine/HRP (LSAB2, DAKO, Carpinteria, CA, EE.UU.). La contratinción se realizó con hematoxilina de Gill II.
Evaluación de la tinción Los casos se consideraron como positivos si la tinción era al menos dos veces más (2 + ) en una escala de 1 al 4 + y si el 20% o más de las células tumorales estaban te˜ nidas sobre el trasfondo sano o sobre el control negativo. Se evaluaron solo las áreas alejadas de los bordes que no estuvieran cauterizadas ni artefactadas ni excesivamente arrugadas. Se ha evaluado como positiva la inmunotinción nuclear.
Estudio estadístico Cuando quisimos asociar la edad o el tama˜ no tumoral con la expresión de los genes empleamos la prueba t de Student y cuando quisimos evaluar la asociación existente entre el sexo de los pacientes, audiometría o lado anatómico y la expresión de ambos genes se empleó la prueba de Chicuadrado.
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Resultados Datos obtenidos de la historia clínica de los pacientes Se estudiaron un total de 34 pacientes (tabla 1). La edad media de la muestra fue de 49,5 a˜ nos (rango: 25-72), con un ratio hombre/mujer de 19:15. Veinte tumores fueron del lado izquierdo y 14 del derecho. No hay casos de tumores bilaterales en esta cohorte de pacientes. El síntoma más frecuente fue el de la pérdida auditiva seguida por tinnitus y desequilibrio. Cuatro pacientes tenían hipoestesia en el área trigeminal en el momento del diagnóstico y en dos casos había parálisis del nervio facial (ambos grado III en la escala de House-Brackmann). Los datos audiométricos han sido encontrados en 31 de los 34 casos estudiados. Todos ellos demostraron hipoacusia neurosensorial asimétrica que en 18 casos era profunda. Los restantes 13 pacientes tenían curvas audiométricas comprendidas entre los 35 y 65 dB. Se realiza audiometría verbal y cálculo del umbral de recepción verbal (URV) en 20 de los 34 casos operados y se observan curvas de URV por debajo de 50 dB 15 de estos 20 casos. En todos los pacientes se realizó resonancia magnética nuclear (RMN) y en 12 casos se realizó también una tomografía axial computarizada (TAC) además de la RMN. El tama˜ no tumoral está representado en la tabla 1 y se observa que la media medida en milímetros fue de 17,1 (3-40 mm de rango) tomando como medida el diámetro máximo tumoral. En 4 pacientes se efectúo abordaje por fosa media, en 10 casos el abordaje fue retrosigmoideo y en los restantes 20 casos el abordaje fue translaberíntico. La elección del abordaje depende del tama˜ no tumoral (tama˜ no mayor de 1 cm o extensión más allá del conducto auditivo interno [CAI] no se realiza abordaje por fosa media), de la audición o posibilidad de conservación de la audición (si existe una audición buena o útil y posibilidad de conservarla, dependiendo del tama˜ no se opta por abordaje por fosa media o retrosigmoideo) y, por último, se tiene en cuenta la extensión lateral del tumor en el CAI (si se extiende lateralmente más allá de la porción media del CAI no optamos por abordaje retrosigmoideo).
Expresión de los supresores de tumores p63 y p73 en los neurinomas del acústico La expresión de p63 en las muestras de NA se observó en 14 de las 34 preparaciones (41,2%) y la expresión de p73 fue exactamente la misma, siendo la concordancia entre ambas proteínas del 100%. Es decir, todos los p63 positivos eran p73 positivos y además lo eran en intensidad casi idéntica (fig. 1A y B). La edad media para los casos de inmunotinción positiva (ambos marcadores, p63 y p73) fue de 53,1 a˜ nos, mientras que en los casos con inmunotinción negativa, la edad media fue menor, 46,9 a˜ nos. No obstante, esta diferencia en expresión relacionada con laedad no llegó a valores estadísticamente significativos (p = 0,22). Al comparar el tama˜ no tumoral en los casos de inmunotinción positiva (19,8 mm) con respecto a los de inmunotinción negativa (15,2 mm), a pesar de encontrar tumores de
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Tabla 1 N.
◦
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
Datos demográficos de los pacientes
Sexo
Edad (a˜ nos)
Lado
M M F F M F M M M F M F F M M M M F M M M F F M F F F M M M F F M F
25 68 45 63 60 28 72 60 56 60 57 45 64 32 59 65 29 51 64 53 57 58 28 61 49 26 25 30 48 59 63 46 42 34
I I I I I I I D I I I D I D I D I D I D D I D D D D I I I D I D I D
Tama˜ no máximo ∅ (mm) 15 10 25 12 10 30 10 20 15 12 40 3 25 8 20 8 15 8 10 7 8 15 30 ¿? ¿? 40 32 25 10 35 8 ¿? 15 10
Audiometría tonal (promedio frecuencias 0,5-1-2 KHz)
Audiometría (URV)
Abordaje
< 90 dB 35 dB 30 dB < 90 dB 35 dB 75 dB 65 dB 80 dB < 90 dB < 90 dB 55 dB < 90 dB 40 dB 45 dB 80 dB 35 dB 20 dB 20 dB < 90 dB < 90 dB < 90 dB 50 dB < 90 dB ¿? ¿? < 90 dB < 90 dB < 90 dB < 90 dB 60 dB 35 dB ¿? 55 dB 50 dB
<90 dB 40 dB 35 dB < 90 dB 50 dB < 80 dB < 80 dB < 80 dB < 90 dB < 90 dB 60 dB < 90 dB 50 dB 50 dB < 90 dB 35 dB 20 dB 20 dB < 90 dB < 90 dB < 90 dB 50 dB < 90 dB ¿? ¿? < 90 dB < 90 dB < 90 dB < 90 dB < 80 dB 60 dB ¿? 60 dB 50 dB
Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Fosa media Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Translaberíntico Fosa media Translaberíntico Fosa media Fosa media Translaberíntico Retrosigmoideo Retrosigmoideo Retrosigmoideo Retrosigmoideo Retrosigmoideo Retrosigmoideo Translaberíntico Retrosigmoideo Retrosigmoideo Retrosigmoideo Retrosigmoideo Translaberíntico
mayor tama˜ no entre las muestras que te˜ nían de forma positiva, esta diferencia tampoco llegó a valores significativos (p = 0,19). En cuanto a la lateralidad de los tumores, hay más lados izquierdos que derechos, 20 frente a 14. En los tumores
Figura 1
izquierdos, el 55% eran p63/73 positivos mientras que en los del lado derecho, sólo el 21% eran positivos, sin embargo, esta diferencia no mostró valores significativos. Se dividió a los pacientes en dos grupos dependiendo de la audiometría, en el primer grupo aquéllos donde la media
Expresión de p63 (A) y p73 (B) por inmunohistoquímica en neurinomas del acústico.
Expresión de p63 y p73 en neurinomas del acústico y estudio de su posible relevancia clínica de las tres frecuencias (500-1000-2000 Hz) era superior o mejor a 60 dB y el segundo en el que este resultado era peor que 60 dB. En el primer grupo el 46% era positivo para las proteínas estudiadas y en el segundo el 39%. Diferencias no significativas en ninguno de los dos casos. Tampoco existió correlación entre la expresión de los marcadores y el sexo del paciente.
Discusión La biología molecular de los NA es aún poco conocida y sabemos que dicho conocimiento nos haría entender mejor la génesis, desarrollo y progresión de estos tumores. Asimismo, cuanto más se conoce acerca de la biología molecular de los tumores, mayores posibilidades tendríamos de poder desarrollar nuevas terapias6,7,23 . Actualmente, a los pacientes con NA se les ofrece una de las siguientes opciones: 1) extirpación quirúrgica del tumor, 2) radiación estereoatáxica o 3) observación y seguimiento con RMN. En las últimas décadas ha existido un gran desarrollo en las técnicas quirúrgicas, sin embargo, existe un grupo de pacientes con afección de base en los que la cirugía, a pesar de sus progresos, pueda estar contraindicada; asimismo ha crecido el número de pacientes que se diagnostican de manera fortuita y en los que no existe síntoma alguno e incluso pacientes con NA en oído único o NA bilaterales en los que la posibilidad de poder tratarlos de manera farmacológica, podría revolucionar su manejo. Aunque tan solo se consiguiera una respuesta parcial, el hecho de evitar cirugía en este grupo de pacientes determinado sería un éxito y un gran avance. En este estudio hemos demostrado la presencia por IHQ en casi la mitad de los pacientes estudiados (41%) de p63 y p73, genes supresores de tumores de la familia de p53 con la que comparten numerosas similitudes estructurales. Dicha similitud estructural es aún mayor entre ellas mismas, es decir, entre p63 y p73. En este trabajo observamos que su expresión en los 34 casos muestra una concordancia del 100%. Sería necesario conocer mejor la función de cada uno de estos genes en los NA para poder explicar el por qué de esta concordancia, así como conocer qué isoforma de cada una de ellas es la que está actuando en estos tumores. Recientemente ha sido demostrado el papel que p63 y p73 juegan en el desarrollo y regulación de células neurales y en la neurogénesis del sistema nervioso central (SNC)24 . Existen diferentes isoformas de cada uno de los genes que pueden actuar de forma pro-apoptótica (Tap63 y TA p73) o anti-apoptótica (Np63 y Np73). La isoforma TA (transcroptional activation) mimetiza las funciones del p53 e induce apoptosis mientras que la isoforma N suprime a la TA, así como a la p53 consiguiendo así su función oncogénica. En diferentes estudios se ha demostrado que la isoforma TA del p73 (TAp73) determina una sensibilidad de las células tumorales a diversos agentes quimioterápicos en casos de carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello, así como carcinoma anaplásico de tiroides25,26 . Por desgracia, no existe posibilidad por IHQ de diferenciar entre estas dos isoformas de la proteína, por lo que no sabemos cuál de ellas está expresada en el 41% de casos positivos de este estudio27 .
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Hemos querido observar si la expresión de estas proteínas podía jugar un papel clínico o evolutivo de la enfermedad analizando datos de las historias clínicas como tama˜ no tumoral y edad fundamentalmente, así como lado anatómico, datos de la audiometría y sexo de los pacientes. Aunque se ha observado que los casos p63/p73 positivos se correlacionan con pacientes de mayor edad y con tama˜ nos tumorales mayores, ninguna de estas diferencias alcanzó niveles estadísticamente significativos, posiblemente por el número limitado de muestras en el análisis. Asimismo, se han observado un mayor porcentaje de casos positivos entre los tumores del lado izquierdo, pero este hecho además de no llegar a valores significativos, consideramos que carece de interés en nuestra muestra particular a pesar de que en algunas publicaciones se ha intentado relacionar el uso del teléfono móvil con el desarrollo de NA28 y el lado anatómico ha sido por ello objeto de estudio en esos trabajos. Por último, al correlacionar la expresión de las proteínas y audiometría vemos que los datos estudiados no permiten correlacionarlos, al menos de una forma significativa, si bien en esta muestra tampoco el tama˜ no tumoral se correlacionó con peores resultados audiométricos. No obstante, la expresión de estas proteínas en casi la mitad de los pacientes tratados, puede significar que juegan un papel en el desarrollo y progresión de estos tumores, aunque sería necesario realizar estudios futuros para determinar este papel.
Conflicto de intereses Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
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